Синергетические композиции и способы
Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к фармацевтической композиции, обладающей противораковой и противовоспалительной активностью. Фармацевтическая композиция, предназначенная для перорального введения, обладающая противораковой и противовоспалительной активностью, содержащая терапевтически эффективное количество олеосмолы томатов, содержащей ликопин в количестве от 6 до 15 мас.%, фитоен и фитофлуен в количестве от 1,0 до 5 мас.%, токоферол в количестве от 1,5 до 4 мас.%, бета-каротин в количестве от 0,2 до 1,0 мас.%, жирные кислоты в количестве от 50 до 90 мас.% и фитостерин в количестве, где отношение количества указанного ликопина к указанному фитостерину составляет менее 5:1 и где указанные фитостерины включают 300-1200 мг/100 г олеосмолы томатов бета-ситостерина, 300-1300 мг/100 г олеосмолы томатов кампестерина и 500-1700 мг/100 г олеосмолы томатов стигмастерина. Состав вышеописанной композиции обеспечивает синергетическое ингибирование продуцирования NO. 4 з.п. ф-лы, 6 ил., 3 табл., 2 пр.
ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
Эта заявка является частичным продолжением заявки на патент U.S. № 13/081643, поданной 7 апреля 2011 г., раскрытие которой включено в настоящее изобретение в качестве ссылки.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
Настоящее изобретение относится к специфическим каротиноидам, которые в основном обнаруживаются в томатах. Настоящее изобретение более предпочтительно относится к комбинациям специфических каротиноидов и фитостеринов, обычно обнаруживаемых в различных пищевых продуктах, включая томаты. Настоящее изобретение еще более предпочтительно относится к комбинациям этих соединений, применяющимся в фармацевтических композициях и проявляющих синергетические свойства, в особенности применительно к подавлению роста клеток предстательной железы.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Каротиноиды являются группой пигментов, которые характеризуются цветом, находящимся в диапазоне от желтого до красного. Каротиноиды обычно вырабатываются в самых различных растительных материалах и чаще всего связаны с такими растениями, как томаты, морковь и перцы.
Ликопин и его предшественники, фитоен и фитофлуен, обычно содержатся в томатах и ликопин является главной причиной ярко-красного цвета, связанного с томатами. Фитоен является предшественником фитофлуена, ликопина и других каротиноидов и также содержится в больших концентрациях в томатах. Ликопин обычно содержится в плазме организма человека. Известно, что каротиноиды обладают антиоксидантными свойствами и поэтому оказывают разное благоприятное влияние на здоровье, включая снижение потенциальной опасности сердечно-сосудистых заболеваний и раковых заболеваний, а также замедление и/или обращение дегенеративного влияния старения на различные типы физиологической активности человека.
Фитостерины (растительные стерины) являются группой стероидных спиртов, или фитохимическими соединениями, которые в природе содержатся в растениях и являются аналогами холестерина, содержащегося в животных продуктах. Структура с небольшими изменениями сходна со структурой холестерина. Эти изменения включают боковую цепь и включают добавление двойной связи и/или метильной или этильной группы. Самыми распространенными пищевыми фитостеринами являются β-ситостерин, кампестерин и стигмастерин. Западная диета содержит 80 мг β-ситостерина/сутки. Финская диета содержит 140-175 мг/сутки (см. Valsta et al. British Journal of Nutrition (2004), 92, 671-678), тогда как вегетарианская и японская диеты содержат 345 и 400 мг/сутки соответственно. Наилучшими пищевыми источниками фитостеринов являются нерафинированные растительные масла, семена, орехи и бобовые. Обработка растительных масел (такая как рафинирование и дезодорирование) уменьшает содержание фитостерина, но потери различны в зависимости от типа масла. Однако гидрирование рафинированных масел мало влияет на содержание фитостерина.
Растительные стерины и станолы эффективно уменьшают содержание ЛНП (липопротеины низкой плотности) холестерина в сыворотке и атеросклероза (1). Кроме того, остаются необъясненными возможные влияния растительных стеринов и станолов на другие метаболические процессы (2).
Фитостерины не образуются в организме путем эндогенного синтеза и поэтому они поступают только из пищи путем всасывания в кишечнике. Содержание фитостерина в плазме ткани млекопитающего обычно является очень низким, в первую очередь вследствие очень плохого всасывания в кишечнике и более быстрого выведения из печени по сравнению с холестерином (3). Хотя всасывание растительных стеринов и станолов (0,02-3,5%) мало по сравнению с холестерином (35-70%), небольшие количества обнаруживаются в крови и они могут повлиять на некоторые физиологические функции. Всасывание фитостерина в кишечнике является селективным; у животных кампестерин всасывается лучше, чем β-ситостерин, тогда как стигмастерин всасывается лишь в минимальной степени. При нормальных условиях в сыворотке человека обнаруживается только 0,3-1,7 мг/дл фитостеринов, несмотря на поступление с пищей, составляющее 160-360 мг/сутки. Полные концентрации растительного стерина в плазме здоровых взрослых составляют от 7 мкмоль/л до 24 мкмоль/л, что составляет менее 1% от полной концентрации стерина в плазме (4). Другие исследователи сообщали, что β-ситостерин и кампестерин являются единственными двумя фитостеринами, обнаруживаемыми в крови (1,5).
Фитостеринами, содержащимися в олеосмоле томатов в наибольшем количестве, являются β-ситостерин, кампестерин и стигмастерин, как это показано ниже в таблице 1, где значения определяли по методике, приведенной в примере 2 в настоящем изобретении.
| Таблица 1 Содержания фитостеринов в олеосмоле томатов |
|
| Всего фитостеринов (мг/100 г) | 650-1100 |
| Кампестерин (мг/100 г) | 150-220 |
| Стигмастерин, (мг/100 г) | 250-480 |
| β-Ситостерин, (мг/100 г) | 250-400 |
Воспалительный процесс, который образует важную часть неспецифической иммунной системы, характеризуется сложным набором химических и клеточных изменений, которые важны для защиты хозяина от микробных агентов и других потенциально вредных факторов окружающей среды. Макрофаги играют важную роль в защите хозяина от вредных веществ и участвуют в различных патологических процессах, включая аутоиммунные заболевания, инфекции и воспалительные нарушения. Воспалительные стимулы, такие как ЛПС и IFN-γ, активируют макрофаги с образованием множества провоспалительных цитокинов, таких как TNF-α и IL-1β, а также других воспалительных медиаторов, включая PGE2 и оксид азота (NO), которые синтезируются циклооксигеназой-2 (COX-2) и индуцируемой синтазой оксида азота (iNOS) соответственно. Все они важны для защиты хозяина, однако их увеличенное высвобождение может стимулировать возникновение воспалительного состояния и вызвать связанное со стрессом окислительное повреждение клеток. Во многих случаях воспаление может быть инициировано некстати, и/или может протекать в такой степени, которая становится вредной для хозяина. В таких случаях может потребоваться подавление или предупреждение развития одного или большего количества аспектов воспалительного процесса, в особенности в случае неинфекционных воспалительных заболеваний.
Показано, что в развитии и регулировании воспалительного процесса участвует очень большое количество различных химических медиаторов. Недавние исследования, проведенные в целом ряде разных лабораторий, установили, что оксид азота (NO) является важным модулятором различных острых и хронических воспалительных нарушений, включая различные типы артрита, желудочно-кишечные заболевания, воспалительные патологические состояния центральной нервной системы и некоторые формы астмы. В результате было предположено, что ингибирование продуцирования NO может обеспечить полезный терапевтический механизм для лечения и/или ведения этих воспалительных нарушений. Кроме того, также показано, что ингибирование синтеза NO полезно для некоторых патологических состояний, которые по природе в основном не являются воспалительными. Так, например, установлено, что ингибирование синтеза NO уменьшает поступление глюкозы в ткани конечностей при физической нагрузке у индивидуумов, страдающих диабетом типа 2.
Также показано, что некоторые другие соединения, включая целый ряд натуральных продуктов, ингибируют продуцирование NO. Последняя группа включает такие соединения, как лютеин [Rafi M.M. et al Mol Nutr Food Res. 2007 Mar; 51(3):333-40; Choi, J.S. Nutrition. 2006 Jun; 22(6):668-71] и ликопин [Rafi, M.M. et al. J Food Sci. 2007 Jan; 72(l):S069-74]. Однако показано, что эффективность и активность многих натуральных продуктов - ингибиторов NO не особенно высока. Поэтому необходимы улучшенные композиций природного происхождения, ингибирующие продуцирование NO.
Другим очень важным воспалительным медиатором является фактор некроза опухоли-альфа (TNF-α), который представляет собой цитокин, продуцируемый клетками разных типов, включая макрофаги, нейтрофилы и лимфоциты. TNF-α играет ключевую роль на ранней стадии воспалительного процесса и обеспечивает стимулирование продуцирования и активацию широкого диапазона провоспалительных генов. Таким образом, вследствие его ключевой провоспалительной роли, ясно, что TNF-α является потенциально важной терапевтической мишенью для противовоспалительных средств.
Неконтролируемое продуцирование реакционноспособных кислородсодержащих частиц (РКЧ) и метаболитов арахидоновой кислоты (АК) способствует патогенезу сердечно-сосудистого заболевания и рака. Воспалительные клетки, инфильтрованные в атеросклеротические бляшки или опухоль, являются главным источником РКЧ и эйкозаноидов. Поэтому исследовали влияние бета-ситостерина, фитостерина из оливкового масла, на содержание РКЧ, таких как супероксидный анион (O2(-)), пероксид водорода (H2O2) и оксид азота (*NO) (6). Также исследовали высвобождение АК и продуцирование эйкозаноидов макрофагами (клетки RAW 264.7), стимулированными сложными эфирами форбола (PMA). Показано, что бета-ситостерин уменьшает продуцирование O2(-) и (H2O2), индуцированное с помощью PMA, и усиливает его влияние через 3-6 ч после предварительной инкубации. Бета-ситостерин также уменьшает высвобождение *NO, индуцированное с помощью PMA, что коррелирует с уменьшением содержания индуцируемой синтазы оксида азота (iNOS) (6).
Рак предстательной железы и доброкачественная гиперплазия предстательной железы (ДГП) являются связанными с возрастом патологическими состояниями, которые влияют на физиологию предстательной железы и ухудшают функционирование мочевых путей у мужчин. По мере старения мужчин предстательные железы медленно увеличиваются, что приводит к (a) обструктивным симптомам, примерами которых являются слабые и/или перемежающиеся потоки мочи, ощущение оставшейся мочи в мочевом пузыре после опорожнения, капание или подтекание в конце мочеиспускания и/или (b) симптомам раздражения, примерами которых являются неотложный позыв к мочеиспусканию, увеличенная частота мочеиспускания и энурез. Обструктивные симптомы и симптомы раздражения обычно называют симптомами нижних мочевыводящих путей (СНМП). Современные средства лечения рака предстательной железы, устранения симптомов ДГП и СНМП включают лекарственную терапию и в крайних случаях требуют полостную операцию. Двумя основными классами использующихся лекарственных средств являются альфа-блокаторы и ингибиторы 5-альфа-редуктазы, которые для обеспечения устойчивой эффективности следует принимать пожизненно. При проведении оперативного вмешательства результаты обычно положительные, но существует определенный риск, связанный с такими оперативными вмешательствами.
В публикации патента US 2005/0031557 ("публикация 557") описана пероральная композиция содержащая β-каротин, лютеин и ликопин, и в качестве возможных дополнительных ингредиентов содержащая фитоен и фитофлуен, предназначенная для применения в качестве солнцезащитного средства. В этой публикации не указаны конкретные предпочтительные содержания фитоена или фитофлуена по сравнению с содержанием лютеина или любого из приведенного ниже перечня фитохимических соединений, включающего альфа-каротин, астаксантин, альфа-криптоксантин, бета-криптоксантин, зеаксантин, фитоен, фитофлуен, гамма-каротин и нейроспорин. В публикации 557 не указаны причины включения какого-либо из представителей этого перечня в композицию.
Эпидемиологические и экспериментальные исследования показывают, что пищевые фитостерины могут обеспечить защиту жителей Запада от большинства типов рака, таких как рак толстой кишки, молочной железы и предстательной железы. Возможные механизмы, с помощью которых фитостерины обеспечивают эту защиту, могут включать воздействие фитостеринов на структуру мембран, функцию опухоли и ткань хозяина, пути передачи сигналов, которые регулируют рост опухоли и апоптоз (8), и иммунную функцию (9) хозяина. Кроме того, метаболизм холестерина у хозяина, добавление бета-ситостерина, уменьшение содержания холестерина и других липидов в мембране опухолевой клетки (10). Кроме того, в приведенной ниже таблице 2 приведены результаты некоторых исследований in vitro влияния фитостеринов на линии раковых клеток человека:
| Таблица 2 Исследования in vitro различных линий раковых клеток |
|||||
| Линия клеток | Ткань | Фитостерин | Концентрация (мкМ) | Параметр | Литература |
| HT-29 | рак прямой кишки человека | β-ситостерин | 16 | подавление роста | (10) |
| LNCaP | рак предстательной железы человека | β-ситостерин | 16 | подавление роста; уменьшение содержания простатоспецифичного антигена | (11) |
| MDA-MB-231 | рак молочной железы человека | β-ситостерин кампестерин холестерин |
16 16 16 |
подавление роста рост = не изменился рост = не изменился |
(12) |
| MCF-7 | рак молочной железы человека | β-ситостерин | от 0,001 до 150 | рост усилился | (13) |
Проведены дополнительные исследования для выявления возможных механизмов, по которым два распространенных фитохимических соединения, ресвератрол и бета-ситостерин, подавляют рост рака предстательной железы человека (14). При этих исследованиях к клеткам рака предстательной железы человека (клетки PC-3) добавляли 50 мкМ ресвератрола или 16 мкМ бета-ситостерина, по отдельности или в комбинации, в течение до 5 дней (14). Комбинация этих двух соединений приводила к более значительному подавлению роста, чем любое соединение по отдельности. На основании этих данных сделан вывод о том, что эти фитохимические соединения могут вызвать подавление роста опухоли путем стимулирования апоптоза и остановки развития клеток на разных фазах клеточного цикла и что механизм может включать изменения продуцирования РКЧ и простагландина (14).
Другие публикации также показывают, что комбинация фитостеринов и омега-3 жирных кислот (n-3) дополнительно уменьшает факторы риска сердечно-сосудистых заболеваний (15).
Сообщают, что растительные стерины и станолы уменьшают в плазме концентрации содержащих углеводородные цепи каротиноидов, но не оксигенированных каротиноидов и токоферолов (3,16). В одном сообщении способность сложных эфиров растительного стерина (СРС) в приправе к салату изменять содержание липидов и каротиноидов в плазме определили у 26 мужчин и 27 женщин, которые потребляли сохраняющую массу тела низкокалорийные диеты (17). Установлено, что потребление 3,6 г СРС приводило к уменьшению содержания ЛНП холестерина (9,7%) и триглицеридов (7,3%), но не меняло содержания ЛВП (липопротеины высокой плотности) холестерина. При потреблении СРС полное содержание каротиноидов в плазме уменьшалось на 9,6%. Точнее, значительно уменьшалось содержание бета-каротина, альфа-каротина и бета-криптоксантина. Содержание каротиноидов в плазме при всех диетах находилось в нормальных диапазонах. Данные другого исследования показывают, что свободные растительные стерины и СРС уменьшают биологическую доступность бета-каротина примерно на 50% и альфа-токоферола примерно на 20% (18).
Несмотря на описанные исследования, сохраняется необходимость в фармацевтических композициях, содержащих каротиноиды, например, ликопин, предназначенных для применения в терапии.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В соответствии с настоящим изобретением открыта фармацевтическая композиция, предназначенная для перорального введения, содержащая терапевтически эффективное количество синергетической комбинации по меньшей мере одного каротиноида, предпочтительно ликопина, бета-каротина, лютеина или астаксантина и наиболее предпочтительно ликопина, и по меньшей мере одного фитостерина, в которой отношение количества каротиноида, такого как ликопин, к количеству по меньшей мере одного фитостерина в фармацевтической композиции максимально составляет примерно 5:1. Предпочтительно, если эта композиция дополнительно включает фитоен, фитофлуен и токоферолы. В предпочтительном варианте осуществления отношение количества ликопина к количеству по меньшей мере одного фитостерина составляет примерно от 0,9:1 до 4,7:1. Предпочтительно, если отношение количества ликопина к количеству по меньшей мере одного фитостерина составляет менее примерно 4,0:1, более предпочтительно менее примерно 3,5:1 и наиболее предпочтительно менее примерно 3:1.
В соответствии с одним вариантом осуществления фармацевтической композиции, предлагаемой в настоящем изобретении, композиция содержит ликопин в количестве, составляющем от примерно 2 до 10 масс.% в комбинации по меньшей мере с одним фитостерином в количестве, составляющем от 1 до 5 масс.%.
В соответствии с другим вариантом осуществления фармацевтической композиции, предлагаемой в настоящем изобретении, ликопин содержится в олеосмоле томатов в количестве, составляющем примерно 6-15 масс.%, и по меньшей мере один фитостерин содержится в количестве, составляющем не менее примерно 1 масс.%. Предпочтительно, если фармацевтическая композиция содержит от примерно 1,0 до 5 масс.% и предпочтительно от примерно 1,5 до 3 масс.% комбинации фитоена и/или фитофлуена. Предпочтительно, если фармацевтическая композиция представляет собой экстракт томатов (олеосмолу). В предпочтительном варианте осуществления по меньшей мере один фитостерин представляет собой бета-ситостерин, кампестерин, бета-октастерин, стигмастерин и их смеси. Предпочтительно, если по меньшей мере один фитостерин представляет собой смесь этих фитостеринов.
В соответствии с другим вариантом осуществления настоящего изобретения открыта фармацевтическая композиция, предназначенная для перорального введения, содержащая терапевтически эффективное количество синергетической комбинации ликопина и по меньшей мере одного фитостерина, где отношение количества ликопина к количеству по меньшей мере одного фитостерина в фармацевтической композиции максимально составляет примерно 5:1 и где комбинация приводит к синергетическому подавлению роста клеток предстательной железы. В предпочтительном варианте осуществления отношение количества ликопина к количеству по меньшей мере одного фитостерина составляет примерно от 0,9:1 до 4,7:1. Предпочтительно, если отношение количества ликопина к количеству по меньшей мере одного фитостерина составляет менее примерно 4,0:1, более предпочтительно менее примерно 3,5:1 и наиболее предпочтительно менее примерно 3:1.
В соответствии с одним вариантом осуществления фармацевтической композиции, предлагаемой в настоящем изобретении, композиция содержит ликопин в количестве, составляющем от примерно 2 до 10 масс.% в комбинации по меньшей мере с одним фитостерином в количестве, составляющем от 1 до 5 масс.%.
В соответствии с другим вариантом осуществления фармацевтической композиции, предлагаемой в настоящем изобретении, ликопин содержится в олеосмоле томатов в количестве, составляющем примерно 6-15 масс.%, и по меньшей мере один фитостерин содержится в количестве, составляющем не менее примерно 1 масс.%. Предпочтительно, если фармацевтическая композиция содержит от примерно 1,0 до 5 масс.% и предпочтительно от примерно 1,5 до 3 масс.% комбинации фитоена и фитофлуена. Предпочтительно, если фармацевтическая композиция представляет собой экстракт томатов (олеосмолу). В предпочтительном варианте осуществления по меньшей мере один фитостерин представляет собой бета-ситостерин, кампестерин, бета-октастерин, стигмастерин и их смеси. Предпочтительно, если по меньшей мере один фитостерин представляет собой смесь этих фитостеринов.
В соответствии с другим вариантом осуществления настоящего изобретения открыта фармацевтическая композиция, предназначенная для перорального введения, содержащая терапевтически эффективное количество олеосмолы томатов, содержащей ликопин в количестве, составляющем от примерно 6 до 15 масс.%, фитоен и/или фитофлуен в количестве, составляющем от примерно 1,0 до 5,0 масс.%, токоферолы в количестве, составляющем от примерно 1,5 до 4,0 масс.%, бета-каротин в количестве, составляющем от примерно 0,2 до 1,0 масс.%, обладающей полным содержанием жирных кислот, составляющим от примерно 50 до 90 масс.%, содержащей и по меньшей мере один фитостерин в количестве, таком что отношение количества ликопина к количеству по меньшей мере одного фитостерина составляет менее примерно 5:1. В предпочтительном варианте осуществления отношение количества ликопина к количеству по меньшей мере одного фитостерина приводит к синергетическому подавлению роста клеток предстательной железы. Предпочтительно, если отношение количества ликопина к количеству по меньшей мере одного фитостерина составляет примерно от 0,9:1 до 4,7:1, более предпочтительно менее примерно 4:1, более предпочтительно менее примерно 3:1, и в предпочтительном варианте осуществления от примерно 0,05:1 до 2,1:1. В предпочтительном варианте осуществления по меньшей мере один фитостерин представляет собой бета-ситостерин, кампестерин, бета-октастерин, стигмастерин и их смеси.
В соответствии с одним вариантом осуществления фармацевтической композиции, предлагаемой в настоящем изобретении, концентрация по меньшей мере одного фитостерина в фармацевтической композиции составляет примерно от 2,0 до 50 масс.%.
В соответствии с другим вариантом осуществления фармацевтической композиции, предлагаемой в настоящем изобретении, композиция дополнительно содержит гамма-каротин, дельта-каротин и витамин E.
В соответствии с другим вариантом осуществления фармацевтической композиции, предлагаемой в настоящем изобретении, отношение количества ликопина к количеству по меньшей мере одного фитостерина составляет примерно от 0,1:1 до 3:1.
В соответствии с настоящим изобретением предложен способ получения фармацевтической композиции, предназначенной для перорального введения, включающей получение экстракта томатов, содержащего олеосмолу, содержащую ликопин в количестве, составляющем от примерно 6 до 15 масс.%, фосфолипиды в количестве, составляющем не менее примерно 0,01 масс.%, смесь моно- и диглицеридов в количестве, составляющем от примерно 2 до 6 масс.%, и по меньшей мере один фитостерин в количестве, составляющем от примерно 1 до 1,5 масс.%, в которой отношение количества ликопина к количеству по меньшей мере одного фосфолипида составляет примерно 2:1, и добавление достаточного дополнительного количества по меньшей мере одного фитостерина, так чтобы уменьшить отношение количества ликопина к количеству по меньшей мере одного фитостерина до составляющего менее примерно 3:1 и предпочтительно от примерно 0,1 до 3:1, так чтобы обеспечить синергетическое подавление роста клеток предстательной железы.
В соответствии с другим вариантом осуществления настоящего изобретения компоненты ликопин и фитостерин фармацевтических композиций, предлагаемых в настоящем изобретении, предпочтительно являются природными и предпочтительно экстрагированы из мякоти томатов. Мякоть томатов предпочтительно экстрагируют с получением олеосмолы, которую можно превратить в композиции, предлагаемые в настоящем изобретении, например, путем включения в нее дополнительных количеств фитостеринов, и затем можно переработать в зернышки или сухой порошкообразный материал. В различных вариантах осуществления эти композиции предпочтительно капсулируют в капсулы из мягкого геля или, альтернативно, в капсулы с "твердой оболочкой", или необязательно, превращают в таблетки, или, если это желательно, в пакеты-саше и т.п.
Поэтому, в соответствии с одним вариантом осуществления настоящего изобретения можно получить олеосмолу томатов, которая в отличие от известных олеосмол томатов, как это показано в таблице 1, теперь содержит следующие количества фитостеринов (и в этом случае значения определяли по методике, приведенной в примере 2 в настоящем изобретении):
| Таблица 3 Содержания фитостеринов в олеосмолах томатов, предлагаемых в настоящем изобретении |
|
| Всего фитостеринов (мг/100 г) | 1600-6300 |
| Кампестерин (мг/100 г) | 300-1300 |
| Стигмастерин (мг/100 г) | 500-1700 |
| β-Ситостерин (мг/100 г) | 300-1200 |
В соответствии с другим вариантом осуществления настоящего изобретения олеосмолы томатов, представляющие собой композиции, предлагаемые в настоящем изобретении, в дополнение к ликопину и фитостеринам могут содержать компоненты фитоен и фитофлуен, а также один или большее количество из следующих: бета-каротин, гамма-каротин и дельта-каротин, токоферолы и фосфолипиды.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Объект настоящего изобретения станет лучше понятным после рассмотрения приведенного ниже подробного описания, в котором используются чертежи, на которых представлено следующее:
На Фиг.1A приведено графическое представление подавления роста клеток, основанное на выраженной в процентах степени уничтожения клеток LNCaP в результате обработки β-ситостерином (-o-) и комбинацией β-ситостерина с 0,4 мкМ ликопина (-•-);
На Фиг.1B приведено графическое представление подавления роста клеток, основанное на выраженной в процентах степени уничтожения клеток LNCaP в результате обработки β-кампестерином и комбинацией β-кампестерин (-o-) с 0,4 мкМ ликопина (-•-);
На Фиг.1С приведено графическое представление подавления роста клеток, основанное на выраженной в процентах степени уничтожения клеток LNCaP в результате обработки β-октостерином (-o-) и комбинацией β-октостерина с 0,4 мкМ ликопина (-•-);
На Фиг.1D приведено графическое представление подавления роста клеток, основанное на выраженной в процентах степени уничтожения клеток LNCaP в результате обработки β-стигмастерином (-o-) и комбинацией β-стигмастерина с 0,4 мкМ ликопина (-•-);
На Фиг.1E приведено графическое представление подавления роста клеток, основанное на выраженной в процентах степени уничтожения клеток LNCaP в результате обработки ликопином при различных концентрациях;
На Фиг.2 приведено графическое представление синергетического подавления пролиферации клеток андроген-зависимого рака предстательной железы человека in vitro в присутствии комбинации ликопина и фитостерина кампестерина. В этих экспериментах клетки LNCaP повторно инкубировали в течение 24 ч в 0,5% сыворотке и затем рост (количественно определяли путем измерения степени включения тимидина) стимулировали с помощью 1 нМ ДГТ (дигидротестостерон). Стимулированные клетки в течение 3 дней обрабатывали использующимися в указанных концентрациях фитостерином (0,4 мкМ) по отдельности, ликопином по отдельности (0,4 мкМ) или комбинацией фитостерина и ликопина. Представленные данные являются средними значениями ± СП (стандартная погрешность) 2-3 независимых экспериментов, проведенных по 4 раза;
На Фиг.3А приведено графическое представление выраженного в процентах ингибирования продуцирования NO для продукта Lyc-O-Mato®, обладающего отношением ликопин/фитостерин, равным более 5,5;
На Фиг.3В приведено графическое представление выраженного в процентах ингибирования продуцирования NO для смеси Lyc-O-Mato® и фитостерина, обладающей отношениями ликопин/фитостерин, равными от 3,6 до 3,68;
На Фиг.3C приведено графическое представление выраженного в процентах ингибирования продуцирования NO для смеси Lyc-O-Mato® и фитостерина, обладающей отношениями ликопин/фитостерин, равными от 1,17 до 1,58;
На Фиг.4A приведено графическое представление выраженного в процентах ингибирования продуцирования TNF-α для продукта Lyc-O-Mato®, обладающего отношением ликопин/фитостерин, равным более 5,5;
На Фиг.4B приведено графическое представление выраженного в процентах ингибирования продуцирования TNF-α для смеси Lyc-O-Mato® и фитостерина, обладающей отношениями ликопин/фитостерин, равными от 3,6 и 3,68;
На Фиг.4C приведено графическое представление выраженного в процентах ингибирования продуцирования TNF-α для смеси Lyc-O-Mato® и фитостерина, обладающей отношениями ликопин/фитостерин, равными от 1,17 до 1,58;
На Фиг.5A приведено графическое представление выраженного в процентах ингибирования продуцирования NO для фитостеринов по отдельности;
На Фиг.5B приведено графическое представление выраженного в процентах ингибирования продуцирования NO для смеси Lyc-O-Mato® и фитостерина, обладающей различными отношениями ликопин/фитостерины;
На Фиг.6A приведено графическое представление выраженного в процентах ингибирования продуцирования TNF-α для фитостеринов по отдельности; и
На Фиг.6B приведено графическое представление выраженного в процентах ингибирования продуцирования TNF-α для смеси Lyc-O-Mato® и фитостерина, обладающей различными отношениями ликопин/фитостерин.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Хотя описание заканчивается формулой изобретения, подробно описывающей и ясно заявляющей настоящее изобретение, предполагается, что настоящее изобретение будет лучше понято с помощью приведенного ниже описания.
Термины, такие как "примерно", "обычно", "в основном" и т.п., предназначены для модификации термина или значения, так чтобы он не являлся абсолютным, а не включал предшествующий уровень техники. Такие термины будут определяться в соответствии с обстоятельствами и термины, которые ими модифицируются, являются терминами, понятными специалистам в данной области техники. Это включает, по меньшей мере степень, экспериментальной погрешности, технической погрешности и инструментальной погрешности для данной методики, использующейся для измерения величины.
Все выраженные в процентах, частях значения и отношения при использовании в настоящем изобретении являются массовыми в пересчете на массу всей композиции, если не указано иное. Все такие массы, если они относятся к перечисленным ингредиентам, основаны на содержании активного вещества и поэтому не включают растворители или побочные продукты, которые могут содержаться в имеющихся в продаже материалах, если не указано иное. Все измерения проводятся при 25°C и нормальном давлении, если не указано иное. Все температуры приведены в градусах Цельсия, если не указано иное.
Числовые диапазоны при использовании в настоящем изобретении включают каждое число и подгруппы чисел, находящихся в этом диапазоне, независимо от того, указано ли это специально. Кроме того, эти числовые диапазоны следует понимать, как обеспечивающие поддержку утверждения, относящегося к любому числу или подгруппе чисел, находящихся в этом диапазоне. Например, раскрытие вида от 1 до 10 следует понимать, как включающие диапазон от 2 до 8, от 3 до 7, 5, 6, от 1 до 9, от 3,6 до 4,6, от 3,5 до 9,9 и т.п. Все диапазоны, указанные в настоящем изобретении, включают конечные значения, включая те, которые указывают диапазон "между" двумя значениями.
Все указания на характеристики или ограничения в единственном числе, приведенные в настоящем изобретении, включают соответствующие характеристики или ограничения во множественном числе и наоборот, если не указано иное или ясно не подразумевается иное в контексте, в котором приведено указание. Таким образом, если не указано иное, то при использовании в настоящем изобретении термин в единственном числе включает термин во множественном числе, например, "фитостерин" может означать более чем один фитостерин.
Все комбинации стадий способа или процесса при использовании в настоящем изобретении можно проводить в любом порядке, если не указано иное или ясно не подразумевается иное в контексте, в котором приведена указанная комбинация.
Фармацевтические композиции и соответствующие способы, предлагаемые в настоящем изобретении, могут включать, состоять из или состоять в основном из существенных элементов и ограничений описанного изобретения, а также включать дополнительные или необязательные ингредиенты, компоненты или ограничения, описанные или иным образом использующиеся в настоящем изобретении. При использовании в настоящем изобретении "включающие" означает указанные элементы или их эквивалент в структуре или функции с добавлением любого другого элемента или элементов, которые не указаны. Термины "содержащий" и "включающий" также следует понимать, как допускающие изменения, если из контекста не следует иное.
Настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащим каротины, такие как ликопин, взятые из самых различных источников, включая синтетические или другие натуральные источники, такие как взятые из томатов, полученные путем ферментации или из водорослей или грибов, и один или большее количество фитостеринов, предназначенным для терапевтического применения. Как предполагается в настоящем изобретении, ликопин и его предшественники фитоен и фитофлуен могут находиться в олеосмоле, полученной из плодов томатов. Подходящие плоды томатов производятся не подвергнутыми генетическим изменениям или измененными с помощью генной инженерии растениями и предпочтительно обладают большими концентрациями ликопина, и как отмечено выше, также содержат фитостерины. Однако содержание фитостеринов в этих известных композициях является низким и приводит к отношениям количество ликопина и фитостерина, составляющим примерно 5:1 и более. Поэтому для получения композиций, предлагаемых в настоящем изобретении, из этих олеосмол томатов, необходимо дополнительно добавить фитостерин (фитостерины) для уменьшения отношения количества ликопина к количеству фитостерина. Когда после этого получают композиции, предлагаемые в настоящем изобретении, их предпочтительно помещают в капсулу из мягкого геля и они могут дополнительно содержать пищевое масло, примерами которого являются соевое масло, тыквенное масло, виноградное масло и т.п. В объем настоящего изобретения входят дополнительные подходящие методики доставки и они известны специалисту в данной области техники.
Показано, что композиции, предлагаемые в настоящем изобретении, обладают существенными благоприятными терапевтическими воздействиями. Данные, приведенные в настоящем изобретении, изначально показали наличие важного, неожиданного и синергетического воздействия применительно к подавлению роста клеток предстательной железы. Таким образом, их использование для лечения рака является довольно важным применением. Кроме того, также показано, что эти композиции оказывают неожиданное и синергетическое влияние на ослабление воспалительных патологических состояний. Это, разумеется, расширяет всю область возможного применения композиций. Кроме того, эти композиции также применимы для лечения различных сердечно-сосудистых патологических состояний, например, для окисления ЛНП холестерина и т.п.
Хотя наиболее предпочтительный вариант осуществления настоящего изобретения включает ликопин в качестве каротина вместе с фитостерином, заявители установили, что можно использовать и другие каротины, в особенности те, которые обладают структурой, сходной со структурой ликопина. Таким образом, в дополнение к ликопину они включают, бета-каротин, лютеин и астаксантин. Таким образом, заявители установили, что эти дополнительные каротины обладают сходными синергетическими воздействиями, такими как противовоспалительные воздействия, рассмотренные выше. Таким образом, хотя в оставшейся части настоящего раскрытия особое значение придано ликопину, следует понимать, что эти дополнительные каротины, в особенности включая бета-каротин, лютеин и астаксантин, могут заменить ликопин, указанный в настоящем изобретении.
Компоненты ликопин и фитостерин предпочтительно извлекают из плодов томатов в экстракты. Компоненты можно сконцентрировать путем удаления воды из мякоти томатов и тем самым получить загущенную мякоть, которая обладает более значительными концентрациями фитостеринов, таких как компоненты ликопин, фитоен и фитофлуен, а также бета-каротин, гамма-каротин, дельта-каротин, витамин E и фосфолипиды. Затем загущенную мякоть можно переработать в олеосмолу, которую после этого можно обработать и получить эмульсию на основе олеосмолы. Экстракт олеосмолы томатов можно капсулировать в капсулы из мягкого геля, содержащие соевое масло или, альтернативно, тыквенное масло. Экстракты томатов необязательно можно переработать в зернышки, которые при желании можно упаковать в пакеты-саше или, альтернативно, диспергировать в подходящих носителях (олеосмола является жидкой и ее нельзя высушить) и переработать в порошки, которые необязательно можно капсулировать или, альтернативно, таблетировать.
Неограничивающие примеры предпочтительных источников ликопина включают олеосмолу, полученную из томатов, известную под названием Lyc-O-Mato®, в жидкой, диспергированной в масле форме и ее выпускает фирма LycoRed Ltd., Bear Sheba, Israel, в соответствии с их способом извлечения обогащенной ликопином олеосмолы из мякоти томатов, описанном в патенте U.S. № 5837311, который включен в настоящее изобретение в качестве ссылки.
Таким образом, обогащенную ликопином олеосмолу можно получить из мякоти томатов путем проводимой обычным образом предварительной обработки самих томатов, проведения термической обработки, разделения измельченных томатов на сыворотку и мякоть, содержащую не менее 2000 част./млн и предпочтительно от 1600 до 4500 част./млн ликопина, и предпочтительно обладающей влажностью, составляющей не более 85%, проведения экстракции мякоти растворителем для экстрагирования олеосмолы, содержащей ликопин, отделение отработанной мякоти и отделения экстракта ликопина от растворителей с получением олеосмолы, содержащей ликопин и другие растворимые в масле фитохимические соединения, и регенерацию растворителей. Полученная таким образом олеосмола содержит от примерно 6% до 15 масс.% ликопина, от примерно 1,0 до 5 масс.% фитоена и/или фитофлуена, от примерно 1,5 до 4 масс.% токоферолов, от примерно 0,2 до 1 масс.% бета-каротина, от примерно 50 до 70 масс.% всех жирных кислот, а также по меньшей мере один фитостерин в количестве, составляющем от примерно 1 до 1,5 масс.%, так что отношение количества ликопинов к количеству по меньшей мере одного фитостерина составляет не менее примерно 4:1. Затем фармацевтические композиции, предлагаемые в настоящем изобретении, можно получить из этой олеосмолы путем добавления достаточного дополнительного количества по меньшей мере одного фитостерина, так чтобы уменьшить отношение количества ликопина к количеству по меньшей мере одного фитостерина до составляющего менее 4:1 и наиболее предпочтительно менее 3:1, так чтобы обеспечить синергетическое роста клеток предстательной железы. Эти композиции также могут содержать не менее примерно 0,01% и предпочтительно от примерно 9,0 до 4,5% фосфолипидов и не менее примерно 0,01% и предпочтительно от примерно 2 до 6% смеси моно- и диглицеридов.
Поэтому в соответствии с известной композицией, такой как продукт Lyc-O-Mato®, содержащий от 6 до 15% ликопина и от 0,6 до 1,1% фитостеринов, для этих композиций отношение количества ликопина к количеству фитостеринов находятся в диапазоне от 5,5 до 25,0, как это указано ниже:
| Ликопин | 6% | 7% | 8% | 9% | 10% | 11% | 12% | 13% | 14% | 15% |
| Фитостерин | 0,6% | 0,6% | 0,6% | 0,6% | 0,6% | 0,6% | 0,6% | 0,6% | 0,6% | 0,6% |
| Отношение | 10,0 | 11,7 | 13,3 | 15,0 | 16,7 | 18,3 | 20,0 | 21,7 | 23,3 | 25,0 |
| Фитостерин | 1,1% | 1,1% | 1,1% | 1,1% | 1,1% | 1,1% | 1,1% | 1,1% | 1,1% | 1,1% |
| Отношение | 5,5 | 6,4 | 7,3 | 8,2 | 9,1 | 10,0 | 10,9 | 11,8 | 12,7 | 13,6 |
С другой стороны, при добавлении фитостеринов, предлагаемых в настоящем изобретении, к этим же композициям, так что они будут содержать от 6 до 15% ликопина и от 1,6 до 6,5% фитостеринов, отношение количества ликопина к количеству фитостеринов станет находиться в диапазоне от 0,9 до примерно 4,7 или менее чем примерно 5,0, как это указано ниже:
| Ликопин | 6% | 7% | 8% | 9% | 10% | 11% | 12% | 13% | 14% | 15% |
| Фитостерин | 3% | 3% | 3% | 3% | 3% | 3% | 3% | 3,2% | 3,2% | 3,2% |
| Отношение | 2,0 | 2,33 | 2,67 | 3,0 | 3,33 | 3,67 | 4,0 | 4,06 | 4,37 | 4,7 |
| Фитостерин | 6,5% | 6,5% | 6,5% | 6,5% | 6,5% | 6,5% | 6,5% | 6,5% | 6,5% | 6,5% |
| Отношение | 0,92 | 1,08 | 1,23 | 1,38 | 1,54 | 1,69 | 1,85 | 2,0 | 2,15 | 2,31 |
В еще одном способе получения фармацевтических композиций, предлагаемых в настоящем изобретении, используется масло, содержащее фитостерин, и добавление источника ликопина к этой композиции фитостерина. Таким образом, фитостерины могут находиться в форме масляных композиций, содержащих примерно 95% фитостеринов. Из числа фитостеринов типичное фитостериное масло содержит примерно до 10% брассикастерина, от 15 до 30% кампестерина, от 15 до 30% стигмастерина и не менее примерно 40% бета-ситостерина. К этой масляной композиции фитостерина можно добавить ликопин или источник ликопина. Источником ликопина могут являться олеосмолы томатов, рассмотренные выше, или чистый ликопин, полученный ферментацией, или ликопин из синтетических источников. В любом случае к фитостериновому маслу следует добавить достаточное количество ликопина, так чтобы вся композиция предпочтительно содержала от примерно 5 до 10% ликопина. Таким образом, оставшиеся от 90 до 95% композиции представляют собой фитостериновое масло, содержащее конкретные фитостерины, обычно в количествах, рассмотренных выше. Во всей композиции отношение количества ликопина к количеству фитостерина обычно намного меньше, чем рассмотренное выше, такое как составляющее от примерно 0,05:1 до примерно 0,1:1.
Аналогичным образом, фармацевтические композиции, предназначенные для перорального введения, содержащие терапевтически эффективное количество синергетической комбинации ликопина и по меньшей мере одного фитостерина, описанные в настоящем изобретении, а также фармацевтические композиции, предназначенные для перорального введения, содержащие терапевтически эффективное количество экстракта томатов, содержащего олеосмолу, содержащую ликопин в количестве, составляющем примерно от 6 до 15 масс.%, фосфолипиды в количестве, составляющем не менее примерно 0,01 масс.%, смесь моно- и диглицеридов в количестве, составляющем примерно от 2 до 6 масс.%, и по меньшей мере один фитостерин в количестве, таком что отношение количества ликопина к количеству по меньшей мере одного фитостерина составляет менее примерно 5:1, предпочтительно менее примерно 4:1, и более предпочтительно менее примерно 3,5:1, такое как менее примерно 3:1, и в которых отношение количества ликопина к количеству по меньшей мере одного фитостерина приводит к синергетическому подавлению роста клеток предстательной железы, как, в частности, предложено в настоящем изобретении, можно получить по обычным методикам, известным специалисту в данной области техники.
Поэтому синергетические фармацевтические композиции, предлагаемые в настоящем изобретении, включая приведенные в качестве примеров формулы и отношения, описанные в настоящем изобретении, можно получить по любым из множества известных или в ином отношении эффективных методик или технологий, известных специалисту в данной области техники.
Эти способы чаще всего включают первоначальное получение экстракта томатов или указанной выше олеосмолы Lyc-O-Mato®, последующее добавление источника необходимых добавляемых фитостеринов, последующее разбавление, например, пищевыми маслами с обеспечением необходимой концентрации ликопина, фитоена, фитофлуена, лютеина и фитостеринов. Кроме того при использовании в настоящем изобретении "в основном содержащая" означает, что композиция, предлагаемая в настоящем изобретении, содержит другие компоненты, не являющиеся специально указанными, но они оказывают пренебрежимо малое влияние или не оказывают влияние на объекты настоящего изобретения. Так, хорошо известно, что экстракт томатов Lyc-O-Mato® может содержать в композициях, предлагаемых в настоящем изобретении, много компонентов, не являющихся специально указанными, но указанный экстракт томатов в основном не содержит другие компоненты или не обладает особыми соотношениями компонентов, влияющих на объекты настоящего изобретения. В настоящем изобретении также предполагается, что различные другие растворы, смеси или другие материалы можно добавить к искомому разбавленному экстракту томатов до, во время или после обработки. Например, разбавленный экстракт томатов в дополнение к расфасовке в капсулы из мягкого геля можно дополнительно разбавить, подвергнуть термической обработке и упаковать в виде готовой к принятию или концентрированной жидкости или можно подвергнуть термической обработке и затем обработать и упаковать в виде восстанавливаемого порошка, например, путем распылительной сушки вместе с подходящим носителем, перемешать в сухом виде или агломерировать.
Как подразумевается в настоящем изобретении, фитостерины, предназначенные для использования в настоящем изобретении, включают один или большее количество фитостеринов, выбранных из группы, включающей β-ситостерин, кампестерин, β-октастерин и стигмастерин и их смеси.
Фосфолипиды, предназначенные для использования с фармацевтическими композициями, раскрытыми в настоящем изобретении, например, в количестве, составляющем не менее примерно 0,01 масс.% включают, например, фосфатидилхолин, фосфатидилэтаноламин, фосфатидилсерин, фосфатидилинозит, церамид-фосфорилхолин (сфингомиелин), церамид-фосфорилэтаноламин и церамид-фосфорилглицерин.
При использовании в настоящем изобретении "смесь моно- и диглицеридов", предназначенная для использования с композициями, раскрытыми в настоящем изобретении, включает, например, 1-пальмитоил-2-олеоилглицерин, 1-стерил-1-олеоилглицерин и 1-пальмитоил-2-стеарилглицерин.
Хотя настоящее изобретение описано с помощью конкретных вариантов осуществления, следует понимать, что эти варианты осуществления являются в основном иллюстрациями принципов и применения настоящего изобретения. Поэтому следует понимать, что в иллюстративные варианты осуществления можно внести многочисленные изменения и что можно предложить другие структуры без отклонения от сущности и объема настоящего изобретения, определяемых прилагаемой формулой изобретения.
ПРИМЕРЫ
Пример 1: Совместное противораковое воздействие фитостеринов и ликопина
Задачей этого исследования являлось изучение влияния различных фитостеринов по отдельности и в комбинации с ликопином в небольших концентрациях на пролиферацию клеток рака предстательной железы человека.
Методики:
Культура клеток и исследование пролиферации клеток: LNCaP, клетки андроген-зависимого рака предстательной железы человека, приобретали у American Type Culture Collection (Rockwell, MD). Клетки выращивали в среде RPMI1640, содержащей 0,6 мкг/мл инсулина. Во все культуральные среды добавляли L-глутамин (2 мМ), пенициллин (100 Ед/мл), стрептомицин (0,1 мг/мл), нистатин (12,5 мкг/мл) и 10% ФТС (фетальная телячья сыворотка). Клетки высевали в среду, содержащую 3% ФТС или в среду 3% DCC, не содержащую феноловый красный, и 10 мМ HEPES (4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновая кислота) в 96- и 6-луночные планшеты (4-7×103 и 1,7×105 клеток/лунка соответственно). На следующий день среду заменяли на содержащую 0,5% ФТС или 0% среду и инкубировали в течение еще одного дня. Затем среду заменяли на среду, содержащую питательные микроэлементы (фитостерины, каротиноиды, фосфолипиды и т.п.) в указанных концентрациях, и инкубирование продолжали в течение 1-3 дней. Для обеспечения постоянного наличия агента во время продолжительной инкубации среду ежедневно заменяли на содержащую свежие каротиноиды. Ликопин растворяли в тетрагидрофуране при концентрации, равной 2 мМ, и хранили при -20°C. Непосредственно перед экспериментом к среде клеточной культуры добавляли исходный раствор. Конечную концентрацию ликопина в среде измеряли с помощью спектрофотометрии после экстракции 2-пропанолом смесью н-гексан:дихлорметан и исследование включения [3H]тимидина проводили в 96-луночных планшетах. Клетки инкубировали вместе с 1,25-2,50 мкКи/лунка [3H]тимидина (удельная радиоактивность равна 5 мкКи/ммоль) в течение от 1 до 4 ч. Включение нуклеотида останавливали путем добавления немеченого тимидина (0,5 мкмоль). Затем клетки трипсинизировали и собирали на фильтре из стекловолокна с использованием устройства для сбора клеток (Inotech). Радиоактивность определяли с помощью анализатора изображений радиоактивных веществ (BAS 1000, Fuji).
Все процедуры проводили при слабом освещении для предотвращения разложения каротиноида.
Результаты: Клетки LNCaP рака предстательной железы инкубировали в присутствии фитостеринов в физиологической концентрации (0-50 мкМ), указанной на Фиг.1. При исследовании по отдельности β-ситостерин подавлял пролиферацию клеток рака предстательной железы зависимым от дозы образом (незачерненные кружочки, Фиг.1A), тогда как другие исследованные фитостерины, кампестерин, β-октастерин и стигмастерин (незачерненные кружочки, Фиг. 1B-1D соответственно) не подавляли рост клеток при исследованных концентрациях. Однако в комбинации с ликопином при концентрации, равной 0,4 мкМ (который сам не подавлял пролиферацию in vitro при этой концентрации (как видно на Фиг.1E)), все 4 исследованных фитостерина обеспечивали синергетическое подавление роста клеток предстательной железы in vitro. Кроме того, на Фиг.1E представлены результаты исследования ликопина, использованного по отдельности.
Фиг. 1A-1E. Клетки LNCaP предварительно инкубировали в течение 24 ч в 0,5% сыворотке и затем рост (включение тимидина) стимулировали с помощью 1 нМ ДГТ. Стимулированные клетки в течение 3 дней обрабатывали использующимися в указанных концентрациях фитостеринами по отдельности или в комбинации с 0,4 мкМ ликопина. Представленные данные являются средними значениями ± СП 2-3 независимых экспериментов, проведенных по 4 раза.
Пример 2: Исследовали противовоспалительное воздействие комбинации фитостеринов и ликопина. Задачей этого исследования являлось изучение влияния фитостеринов и ликопина на воспалительные патологические состояния.
Методики:
Выделение макрофагов и культура клеток - Брюшинные макрофаги собирали из брюшной полости обладающих возрастом от 6 до 8 недель самцов мышей ICR (участок контроля импринтинга) (Harlan, Israel), в которую за 4 дня до сбора с помощью внутрибрюшинной инъекции вводили 4 мл тиогликолятного бульона (4%). Брюшинные макрофаги трижды промывали с помощью ЗФФ (забуференный фосфатом физиологический раствор) и при необходимости проводили гипотонический лизис эритроцитов и получали продукт чистотой от 90 до 95%. Макрофаги идентифицировали путем анализа с помощью СКАФ (сортировка клеток с активированной флуоресценцией) с использованием конъюгированных с FITC (флуорсецеинизотиоцианат) крысиных антител к мышиному F4/80 (MCA497F) (Serotec, Oxford, England) с помощью проточной микрофлуориметрии с использованием СКАФ (Becton Dickinson, Mountain View, CA). Для каждого образца исследовали 10000 отобранных с помощью светорассеяния живых клеток. Брюшинные макрофаги выращивали в среде RPMI 1640, содержащей 10% ФТС, 2 мМ L-глутамин; 100 Ед/мл пенициллин; 100 (мкг/мл стрептомицин (Beit-Haemek, Israel) в 96-луночных планшетах (2×105 клеток/лунка). К клеткам добавляли смеси Lyc-O-Mato® + фитостерин, ликопин, фитостерины и комбинации ликопина и фитостеринов (растворенные в ДМСО (диметилсульфоксид) и обработанные ультразвуком). Через 1 ч добавляли ЛПС (липополисахарид) (1 мкг/мл) и макрофаги выращивали при 37°C в атмосфере 5% CO2 в течение 24 ч. К контрольным образцам добавляли соответствующие объемы ДМСО и/или этанола и рассчитывали выраженное в процентах подавление в каждой пробирке по сравнению с контрольной пробиркой.
Исследование продуцирования NO - Содержание NO в надосадочных жидкостях культур клеток оценивали путем определения содержания нитрит-иона с использованием реагента Гриесса и нитрита натрия в качестве стандарта.
Продуцирование TNF-α - Концентрации TNF-α в надосадочных жидкостях культур клеток количественно определяли с использованием наборов для иммуноферментного анализа (Biolegend Inc., San Diego, CA).
Статистический анализ. Данные приведены в виде средних значений ± СПС (стандартная погрешность среднего). Статистическую значимость для сравнения групп определяли с помощью парного двустороннего критерия t Стьюдента.
Результаты:
Синергетическое ингибирование продуцирования NO и продуцирования TNF-α смесью ликопин + фитостерины (Фиг. 3 и 4).
Исследовали две группы смесей, обладающих разными отношениями Lyc-O-Mato®/фитостерин.
Одна группа включала 2 смеси, обладающие отношениями ликопин/фитостерин, равными 3,6 и 3,68, и вторая группа включала смеси, обладающие отношениями ликопин/фитостерин, равными 1,17, 1,3, и 1,58.
Результаты для каждой группы смесей объединяли. Результаты представлены в виде выраженного в процентах ингибирования продуцирования NO (Фиг.3) и продуцирования TNF-α (Фиг.4) и представляют собой средние значения ± СПС для трех независимых экспериментов.
Исследовали влияние дозы ликопина, фитостеринов и смесей обоих на продуцирование NO и продуцирование TNF-α и результаты представлены на Фиг.3 и 4 соответственно.
Фитостерины не приводят к какому-либо ингибированию продуцирования NO или продуцирования TNF-α при всех исследованных концентрациях (Фиг.5A и 6A), тогда как Lyc-O-Mato® приводит к зависимому от дозы ингибированию продуцирования NO, как это представлено на Фиг.3А, и продуцирования TNF-α, как это представлено на Фиг.4A. Концентрации ликопина, указанные по оси X, означает концентрации ликопина, обусловленные его содержанием в Lyc-O-Mato® в каждой пробирке.
Зависимый от дозы эффект обеих групп смесей представлен на Фиг. 3 и 4.
Рассчитывали концентрацию ликопина и фитостеринов для всех исследуемых групп и ее откладывали по оси X. Приведенные концентрации фитостеринов являются средними значениями концентраций фитостеринов в разных смесях в каждой группе.
Как показано на Фиг. 3 и 4, существует значительное зависимое от дозы ингибирование продуцирования NO и продуцирования TNF-α обеими группами смесей и наибольший эффект наблюдается для второй группы, обладающей отношением ликопин/фитостерин, равным от 1,17 до 1,58 (Фиг. 3C и 4C).
Обе смеси приводят к статистически значимому (p<0,001) синергетическому ингибирующему воздействию, который наиболее значителен при использовании 2 мкМ ликопина.
При концентрации, равной 2 мкМ, смеси, обладающие отношениями ликопин/фитостерин, равными 3,6 и 3,68, приводили к в 3,25 раз большему ингибированию по сравнению с использованием только ликопина (19,5+3,7 и 6+2,1% ингибирование продуцирования NO смесью и ликопином соответственно). В то же время смеси, обладающие отношениями ликопин/фитостерин, равными (1,17-1,58) приводили к в 4 раза большему ингибированию (24,1+3 и 6+2,1% ингибирования смесью и ликопином соответственно). Аналогичные результаты получали для ингибирования продуцирования TNF-α, как это представлено на Фиг.6.
Ингибирование и синергетический эффект для смесей, которые обладали более значительными содержаниями фитостеринов (отношения, равные 1,17-1,58), были более значительными и это показывает, что увеличение содержания фитостеринов в смесях увеличивало ингибирующее воздействие на продуцирование NO.
Для проверки этого предположения и подтверждения результатов исследовали влияние смесей ликопин + фитостерины в разных соотношениях.
Синергетическое ингибирование продуцирования NO смесями ликопин + фитостерины (Фиг.5):
Макрофаги в течение 1 ч инкубировали с разными комбинациями: 2 мкМ ликопин и разные концентрации фитостеринов, затем добавляли ЛПС и инкубировали в течение 16 ч при 37°C. Измеряли продуцирование NO и рассчитывали и представляли ингибирование в %. Результаты представляют собой средние значения + СПС для трех независимых экспериментов.
Как показано на Фиг.4B, разные комбинации представлены двумя путями: (1) концентрация ликопина и фитостеринов и (2) отношение ликопин/фитостерин. Инкубирование макрофагов с комбинациями ликопин/фитостерин приводило к ингибированию продуцирования NO (Фиг.5B) и продуцирования TNF-α (Фиг.6B), которое постепенно усиливалось при увеличении содержания фитостерина.
Фитостерины при концентрациях, использованных в разных смесях, не ингибируют продуцирование NO (Фиг.5A) или продуцирование TNF-α (Фиг.6A), тогда как ликопин при концентрации, равной 2 мкМ, приводит к составляющему 9,8++2,1% ингибированию NO (Фиг.5B) и 23,2++2,6% ингибированию TNF-α (Фиг.6B).
Различные комбинации ликопин/фитостерин приводили к статистически значимому (p<0,001) синергетическому ингибированию продуцирования NO и продуцирования TNF-α, которое постепенно усиливалось при увеличении содержания фитостерина.
Заключение:
Хотя при использовании по отдельности фитостерины не приводят к какому-либо ингибированию продуцирования NO или продуцирования TNF-α, их добавление к ликопину или к Lyc-O-Mato® приводит к статистически значимому (p<0,001) синергетическому ингибированию продуцирования NO, которое становилось более эффективным при увеличении содержания фитостеринов в смесях.
Хотя настоящее изобретение описано с помощью конкретных вариантов осуществления, следует понимать, эти варианты осуществления являются в основном иллюстрациями принципов и применения настоящего изобретения. Поэтому следует понимать, что в иллюстративные варианты осуществления можно внести многочисленные изменения и что можно предложить другие структуры без отклонения от сущности и объема настоящего изобретения, определяемых прилагаемой формулой изобретения.
1. Фармацевтическая композиция, предназначенная для перорального введения, обладающая противораковой и противовоспалительной активностью, содержащая терапевтически эффективное количество олеосмолы томатов, содержащей ликопин в количестве от 6 до 15 мас.%, фитоен и фитофлуен в количестве от 1,0 до 5 мас.%, токоферолы в количестве от 1,5 до 4 мас.%, бета-каротин в количестве от 0,2 до 1,0 мас.%, жирные кислоты в количестве от 50 до 90 мас.% и фитостерины в количестве, где отношение количества указанного ликопина к указанному фитостерину составляет менее 5:1 и где указанные фитостерины включают 300-1200 мг/100 г олеосмолы томатов бета-ситостерина, 300-1300 мг/100 г олеосмолы томатов кампестерина и 500-1700 мг/100 г олеосмолы томатов стигмастерина.
2. Фармацевтическая композиция по п.1, в которой указанное отношение указанного ликопина к указанным фитостеринам составляет от 0,9:1 до 4,7:1.
3. Фармацевтическая композиция по п.1, в которой указанное отношение указанного ликопина к указанным фитостеринам составляет менее 4:1.
4. Фармацевтическая композиция по п.1, в которой указанное отношение указанного ликопина к указанным фитостеринам составляет менее 3:1.
5. Фармацевтическая композиция по п.1, в которой указанное отношение указанного ликопина к указанным фитостеринам составляет от 0,05:1 до 0,1:1.
