Способ определения индекса фрагментации днк сперматозоидов у животных-производителей



G01N1/30 - Исследование или анализ материалов путем определения их химических или физических свойств (разделение материалов вообще B01D,B01J,B03,B07; аппараты, полностью охватываемые каким-либо подклассом, см. в соответствующем подклассе, например B01L; измерение или испытание с помощью ферментов или микроорганизмов C12M,C12Q; исследование грунта основания на стройплощадке E02D 1/00;мониторинговые или диагностические устройства для оборудования для обработки выхлопных газов F01N 11/00; определение изменений влажности при компенсационных измерениях других переменных величин или для коррекции показаний приборов при изменении влажности, см. G01D или соответствующий подкласс, относящийся к измеряемой величине; испытание

Владельцы патента RU 2657609:

Федеральное государственное бюджетное учреждение "Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов" ФГБУ "ВГНКИ" (RU)
Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии - МВА имени К.И. Скрябина" (ФГБОУ ВО МГАВМиБ - МВА имени К.И. Скрябина) (RU)

Изобретение относится к области биотехнологии и предназначено для определения индекса фрагментации ДНК сперматозоидов у животных-производителей. Осуществляют подготовку мазка спермопробы к окрашиванию и приготовление красителя смешиванием раствора лимонной кислоты, гидрофосфата натрия и 1%-го акридин оранжевого. Погружают образец в краситель. Выполняют микроскопию. Подсчитывают сперматозоиды с фрагментированной ДНК и нормальных, при этом сперматозоиды с фрагментированной ДНК окрашиваются в красный, желтый или оранжевый цвета, нормальные - в зеленый цвет. При выявлении индекса фрагментации более 30% спермопроба выбраковывается и не допускается для искусственного осеменения животных. Изобретение обеспечивает простой, доступный способ определения индекса фрагментации ДНК.

 

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для определения индекса фрагментации ДНК сперматозоидов в замороженной сперме животных-производителей.

Данный метод является технологически современным анализом маркеров апоптоза и играет важную роль в регуляции фертильности, которую нужно учитывать как при естественном осеменении, так и при искусственном осеменении сельскохозяйственных животных.

Фрагментация ДНК в сперматозоидах характеризуется двухцепочечными и одноцепочечными разрывами молекулы ДНК. Это связано с дефицитом содержания в хромосомах специальных транспортных белков-протаминов, защищающих ДНК от внешних повреждений. Фрагментация ДНК сперматозоидов оказывает влияние не только на фертильность, но и на ранние этапы эмбрионального развития плода, особенно на формирование бластоцисты в предимплантационный период эмбрионального развития (т.е. до нидации зародыша к стенке матки).

Заявленный способ позволяет определить степень повреждения нитей ДНК (измерения количества разрывов ДНК) в сперматозоидах.

Исследование структуры хроматина проводят с помощью окрашивания ДНК флюрохромами. Окрашивание клеток флуоресцентными красителями, т.е. ДНК флюрохромами, происходит благодаря способности флюрохрома избирательно окрашивать двуспиральные нуклеиновые кислоты в самом сперматозоиде. Окрашивание сперматозоидов осуществляют акридиновым оранжевым.

Уровень техники, аналоги. Существует аналогичный метод в медицине, описанный в руководстве ВОЗ «Руководство ВОЗ по исследованию и обработке эякулята человека» пятое издание 2012 г., с. 164, но в ветеринарной медицине аналогов нет. Особенность заявленного изобретения заключается в том, что способ позволяет определить индекс фрагментации ДНК у животных-производителей.

В настоящее время стандартным методом для исследования фрагментации ДНК в сперматозоидах является определение структуры хроматина по Эвенсону (SCSA: Sperm Chromatin Staicture Assay; Evenson et al., 1980; 2000; Evenson and Jost, 1994). Исследование структуры хроматина проводят с помощью окрашивания ДНК флюрохромами. Окрашивание клеток флуоресцентными красителями, т.е. ДНК флюрохромами, происходит благодаря способности флюрохрома избирательно окрашивать двуспиральные нуклеиновые кислоты в самом сперматозоиде. Данный метод выбран нами в качестве ближайшего аналога.

Метод SCSA, хотя и является надежным и высоко воспроизводимым, является дорогим методом, трудным для выполнения и не очень подходящим для рутинных лабораторных исследований (De Jonge, 2002). По этой причине качество ДНК сперматозоидов до сих пор широко не определяется, несмотря на то, что подтверждено его клиническое значение при изучении бесплодия.

Техническим результатом заявленного изобретения является возможность определения индекса фрагментации ДНК, простота, доступная стоимость, минимальные манипуляции с клетками.

Технический результат заявленного изобретения достигается за счет того, что спермопробу размораживают, подготавливают мазок к исследованию, фиксируют мазок спиртовым раствором уксусной кислоты в течение 1 часа в холодильной камере при постоянной температуре +5°С. Приготавливают краситель смешиванием 40 мл раствора лимонной кислоты, 2,5 мл раствора гидрофосфата натрия и 10 мл 1%-ного акридин оранжевого. Образцы погружают в краситель на 5-7 мин, далее мазок подсушивают на воздухе в течение 1-2 мин, микроскопируют. Проводят отдельный подсчет сперматозоидов с фрагментированной ДНК и нормальных, при этом сперматозоиды с фрагментированной ДНК окрашиваются в красный, желтый или оранжевый цвета, нормальные - в зеленый цвет. Количество сперматозоидов с фрагментированными участками ДНК IFn, % вычисляют по формуле , где С+ - количество сперматозоидов, окрашенных в красный, желтый и оранжевые цвета, шт; С- - количество сперматозоидов, окрашенных в зеленый цвет, шт. За окончательный результат принимают среднеарифметическое значение результатов не менее чем трех измерений, при выявлении индекса фрагментации более 30% спермопроба выбраковывается и не допускается для искусственного осеменения животных.

Заявленный способ основан на метахроматических свойствах красителя, который изменяет флюоресценцию от зеленого до красного. Он заключается в окрашивании клеток ДНК флюрохромом, после - индуцированной слабой кислотой. Клетки флюоресцируют зеленым при связывании красителя с нормальной двунитевой молекулы ДНК и красным при взаимодействии с однонитевыми ДНК и РНК. При индексе фрагментации ДНК более 30% сперматозоидов уровень фертильности семени значительно снижается.

Осуществление изобретения.

Проводят размораживание спермопробы, подготавливают мазок спермопробы к исследованию.

Капля спермы должна быть небольшой и соразмерна так, чтобы весь мазок помещался на стекле, не доходя 1-1,5 см до его края. После приготовления мазки следует быстро высушить на воздухе до исчезновения влажного блеска. Фиксацию мазка производят спиртовым раствором уксусной кислоты (1 часть уксусной кислоты ледяной и 3 части 96%-ного этилового спирта) в течение 1 часа в холодильной камере при постоянной температуре +5°C.

Приготовление красителя.

В мерной колбе вместимостью 100 см3 смешивают 40 мл раствора лимонной кислоты, 2,5 мл раствора гидрофосфата натрия и 10 мл 1%-го акридин оранжевого.

Срок хранения раствора в темном месте при комнатной температуре - не более 5 дней.

Проведение анализа.

Погружаем образец в краситель на 5-7 мин. Споласкиваем дистиллированной водой 2-3 мин. Мазок подсушиваем на воздухе в течение 1-2 мин. Затем микроскопируем с использованием УФ-фильтра со спектром длины волны 530 нм при увеличении 300×, 600×. Необходимо исследовать 100 сперматозоидов, посчитывая отдельно сперматозоиды с фрагментированной ДНК и нормальные, подсчет проводится визуально. Сперматозоиды с фрагментированной ДНК окрашиваются в красный, желтый или оранжевый цвета, нормальные - в зеленый цвет.

Проводим учет результатов.

Количество сперматозоидов с фрагментированными участками ДНК IFn, % вычисляют по формуле

,

где С+ - количество сперматозоидов, окрашенных в красный, желтый и оранжевые цвета, шт;

С- - количество сперматозоидов, окрашенных в зеленый цвет, шт.

За окончательный результат, округленный до третьего десятичного знака, принимают среднеарифметическое значение результатов не менее чем трех измерений, выполненных в условиях повторяемости по ГОСТ ИСО 5725-1. Допускаемые расхождения между результатами определений не должны превышать 10%.

При выявлении индекса фрагментации более 30% спермопроба выбраковывается и не допускается для искусственного осеменения животных.

Источники информации

1. ГОСТ 32277-2013 Средства воспроизводства. Сперма. Методы испытаний физических свойств и биологического, биохимического, морфологического анализов.

2. Иолчиев Б.С, Багиров В.А, Кленовицкий П.М., Кононов В.П., Таджиева А.В. Индекс фрагментации ДНК хроматина сперматозоидов при оценке качества семени у быков-производителей. Сельскохозяйственная биология №4, 2012 г.

3. С.А. Руднева, Е.Е. Брагина, Е.А. Арифулин, Т.М. Сорокина, Л.В. Шилейко, С.А. Ермолева, Л.Ф. Курило, В.Б. Черных. Фрагментация ДНК в сперматозоидах и ее взаимосвязь с нарушением сперматогенеза. 2014 г.

Способ определения индекса фрагментации ДНК сперматозоидов у животных-производителей, включающий размораживание спермопробы, подготовку мазка спермопробы к исследованию, фиксацию мазка спиртовым раствором уксусной кислоты в течение 1 часа в холодильной камере при постоянной температуре, приготовление красителя смешиванием 40 мл раствора лимонной кислоты, 2,5 мл раствора гидрофосфата натрия и 10 мл 1%-го акридин оранжевого, погружение образца в краситель, микроскопию, отдельный подсчет сперматозоидов с фрагментированной ДНК и нормальных, при этом сперматозоиды с фрагментированной ДНК окрашиваются в красный, желтый или оранжевый цвета, нормальные - в зеленый цвет, количество сперматозоидов с фрагментированными участками ДНК IFn, % вычисляют по формуле , где С+ - количество сперматозоидов, окрашенных в красный, желтый и оранжевые цвета, шт; С- - количество сперматозоидов, окрашенных в зеленый цвет, шт., при этом за окончательный результат принимают среднеарифметическое значение результатов не менее чем трех измерений, при выявлении индекса фрагментации более 30% спермопроба выбраковывается и не допускается для искусственного осеменения животных.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к способу детекции комплекса Mycobacterium tuberculosis. Способ детекции комплекса Mycobacterium tuberculosis, включает иммунологический анализ специфического для комплекса Mycobacterium tuberculosis белка, где внеклеточную секрецию указанного белка осуществляют посредством термической обработки биологического образца, содержащего комплекс Mycobacterium tuberculosis, при 45-50°C в течение от 15 до 60 минут.
Изобретение относится к медицине, а именно к профболезням, и может быть использовано для предотвращения заболевания шахтера антракосиликозом. Для этого в забое проводят отбор углепородных проб по сечению забоя бороздами, измеряют запыленность рудничного воздуха во время работы горной машины по разрушению углепородного массива, дополнительно отбирают пробы воздуха в рабочей зоне машины и устанавливают в нем дисперсный состав кремниевой пыли, при этом опасность заболевания шахтера антракосиликозом устанавливают по стажу работы в запыленном кремниевыми частицами воздухе и количеству поглощенной его легкими опасной для здоровья тонкодисперсной кремниевой пыли.
Изобретение относится к медицине, а именно к стоматологии, и может быть использовано для прогнозирования осложнений дентальной имплантации. Для этого при подготовке пациента к дентальной имплантации в его слюне определяют содержание конечных продуктов перекисного окисления липидов и при их значении более 0,015 прогнозируют неблагоприятный результат дентальной имплантации.

Изобретение относится к области медицины, а именно к репродуктивной медицине, и может быть использовано для оценки риска невынашивания беременности. Способ оценки риска невынашивания беременности у женщин с привычным невынашиванием, отличающийся тем, что у пациентки определяют цитотоксическую активность NK-клеток периферической крови в секреторной фазе менструального цикла в отношении клеток трофобласта линии Jeg-3 по формуле: ЦЭпац=СЦЭпац-СБГэксп+оБГ, где ЦЭпац - цитотоксическая активность NK-клеток у пациентки, %; СЦЭпац - средняя цитотоксическая активность NK-клеток в отношении клеток трофобласта; СБГэксп - средняя базовая гибель клеток трофобласта в каждом эксперименте; оБГ - общая базовая гибель клеток трофобласта, где: СБГэксп={(Хн/Xобщ)1+(Хн/Хобщ)2+…+(Хн/Хобщ)n}×100%/n, где Хн - количество нежизнеспособных клеток трофобласта, инкубированных в культуральной среде без добавления мононуклеаров; Хобщ - общее количество клеток трофобласта, инкубированных в культуральной среде без добавления мононуклеаров; n - количество повторов; СЦЭпац={(Yн/Yобщ)1+(Yн/Yобщ)2+…+(Yн/Yобщ)n}×100%/n, где Yн - количество нежизнеспособных клеток трофобласта, инкубированных с мононуклеарами периферической крови в каждой лунке; Yобщ - общее количество клеток трофобласта, инкубированных с мононуклеарами периферической крови; n - количество повторов.

Изобретение относится к области медицины, ветеринарии и иммунологии. Способ прижизненной диагностики микобактериозов крупного рогатого скота включает определение индуцированной люминолзависимой хемилюминесценции в сыворотке от положительно реагирующего на ППД-туберкулин крупного рогатого скота из благополучных по туберкулезу хозяйств, при этом в качестве основного индуктора хемилюминесценции используют комплексный аллерген из атипичных микобактерий.

Предложенная группа изобретений относится к области медицины. Предложен способ диагностики и/или определения у субъекта предрасположенности к развитию острого повреждения почек, включающий определение уровня экспрессии по меньшей мере miR-26b и сравнение указанного уровня экспрессии с контрольным значением, где снижение экспрессии является показателем острого повреждения почек или предрасположенности к развитию острого повреждения почек.

Изобретение относится к области измерительной техники и может быть использовано для измерения содержания жиров в жидкости. В настоящем изобретении предлагается способ определения присутствия жиров в телесной жидкости путем фотографирования капли телесной жидкости и расчета изменения площади контакта капли телесной жидкости и коэффициента диффузии площади контакта.

Группа изобретений относится к области биохимии. Предложен способ ультравысокопроизводительного скрининга клеток или микроорганизмов, а также представляющее собой биосовместимую двойную эмульсию вода-масло-вода средство для ультравысокопроизводительного скрининга клеток или микроорганизмов.
Изобретение относится к медицине, а именно к офтальмологии, и предназначено для проведения бактериологического исследования интраокулярного содержимого. Для проведения бактериологического исследования при хирургическом лечении послеоперационного эндофтальмита с учетом этиологии заболевания проводят раннюю витрэктомию с забором интраокулярного содержимого.

Группа изобретений относится к области медицинской техники, конкретнее к устройству кюветы для коагулиметра. Кювета для определения времени свертывания текучего образца включает боковую стенку и дно, образующие емкость, и выполнена с возможностью размещения внутри нее шарика для перемешивания текучего образца и индикации изменения вязкости образца, нижняя часть внутренней поверхности кюветы имеет цилиндрическую форму, а внутри емкости, сформирована по меньшей мере одна область шероховатости.

Изобретение относится к области геологии. Заявленное решение включает выполнение проверочного испытания на устройстве с использованием ряда эталонных флюидов, при этом устройство имеет калиброванный оптический датчик, установленный в нем, который содержит один или более оптических элементов.

Изобретение относится к нефелометрам. Устройство для оптического исследования образца, содержит: оптический источник оптического сигнала, по меньшей мере один первый детектор для получения оптического сигнала, пропущенного непосредственно через кювету, расположенную в устройстве, выполненном с возможностью размещения в нем кюветы с суженной нижней частью и широкой верхней частью, причем периметр широкой верхней части больше периметра нижней суженной части; и второй детектор для получения оптического сигнала от оптического источника, рассеянного содержимым в нижней части кюветы, причем поверхность второго детектора проходит приблизительно параллельно оптическому пути, проходящему от оптического источника к первому детектору.
Изобретение относится к области создания визуальных эффектов. Способ создания стабильного и долговременного художественного визуального эффекта диффузного свечения поверхности художественно-архитектурного объекта под воздействием внешнего возбуждающего УФ-А (365-385 нм) и/или ИК-А (760-1000 нм) излучения включает нанесение нескольких оптически прозрачных полимерных слоев, в состав прилегающего к поверхности слоя/слоев входят оптически прозрачная полимерная основа, содержащая органические и/или неорганические люминофор/люминофоры, имеющие флуоресценцию с положительным сдвигом Стокса, до 100 нм, и/или с аномально большим сдвигом Стокса, свыше 100 нм, и/или люминофоры, имеющие антистоксовую флуоресценцию, т.е.

Изобретение относится к способам анализа элементного состава веществ. Способ определения элементного состава капельных жидкостей включает: возбуждение плазменного разряда, доставку в зону разряда частиц анализируемой жидкости, регистрацию и обработку спектров излучения анализируемой жидкости, причем возбуждение плазменного разряда проводят при атмосферном давлении, основными носителями заряда в плазме являются электроны, генерируемые катодом плазменной горелки или каким-либо другим источником заряженных элементарных частиц.

Изобретение относится к технологиям визуально-измерительного контроля (ВИК), позволяющим по зарегистрированным изображениям обнаружить искомые элементы поверхности контролируемых объектов в труднодоступных внутренних полостях различных технических устройств и сооружений и измерить геометрические характеристики этих элементов.

Способ заключается в том, что объект освещают широкополосным светом, формируют пучок излучения, переносящий изображение объекта, делят его на два идентичных пучка, один из которых пространственно фильтруют, формируя волну с известной формой волнового фронта, совмещают направления распространения волновых фронтов, осуществляют спектральную фильтрацию этих пучков и регистрируют двумерное спектральное интерференционное изображение.

Изобретение относится к квантовой технике. Способ самоорганизации оптически активного ансамбля диамагнитных наночастиц электрон-ион заключается в создании объема когерентности, где на каждую молекулу резонансно по энергии воздействуют векторной суммой коллектива полей, состоящего из электрического и магнитного поля, индуцированного в молекулах упругим столкновением с уширяющими частицами, электрического и магнитного поля бигармонического излучения накачки на частотах ω1, ω2, электрического и магнитного поля релеевского рассеяния.

Настоящее изобретение относится к устройству, применяемому для детектирования аффинностей связывания, а также способу детектирования аффинностей связывания согласно соответствующему независимому пункту.

Изобретение относится к области генерации оптического излучения и касается способа получения фотолюминесценции отдельных центров окраски в алмазе. Способ включает в себя воздействие на алмазный образец возбуждающим излучением и сбор излучения центров окраски с лицевой поверхности образца с помощью оптической системы.

Изобретение относится к технике измерения электрических токов и может быть использовано для градуировки и исследования характеристик бесконтактных волоконно-оптических датчиков электрического тока на основе кристаллов BSO.

Изобретение может быть использовано океанологических и инженерно-гидрогеологических исследованиях в придонном слое моря в зоне интенсивного волнения и обрушения волн.

Изобретение относится к области биотехнологии и предназначено для определения индекса фрагментации ДНК сперматозоидов у животных-производителей. Осуществляют подготовку мазка спермопробы к окрашиванию и приготовление красителя смешиванием раствора лимонной кислоты, гидрофосфата натрия и 1-го акридин оранжевого. Погружают образец в краситель. Выполняют микроскопию. Подсчитывают сперматозоиды с фрагментированной ДНК и нормальных, при этом сперматозоиды с фрагментированной ДНК окрашиваются в красный, желтый или оранжевый цвета, нормальные - в зеленый цвет. При выявлении индекса фрагментации более 30 спермопроба выбраковывается и не допускается для искусственного осеменения животных. Изобретение обеспечивает простой, доступный способ определения индекса фрагментации ДНК.

Наверх