Способ прижизненного определения цитопролиферативного фактора (фактора старения) у животных

Изобретение относится к области биохимии. Описана группа изобретений, включающая способ прижизненного определения уровня цитопролиферативного фактора (фактора старения) у млекопитающего, исключая человека, способ прижизненного определения уровня цитопролиферативного фактора у собаки и способ прижизненного определения уровня цитопролиферативного фактора у кошки. В одном из вариантов способ включает в себя стадии: получение сыворотки крови при помощи центрифугирования, разведение и прогрев на водяной бане 30 минут при 60°С, с последующим повторным центрифугированием; инкубация сыворотки в течение 96 часов при 37°С неспециализированных сингенных клеток; добавление смеси версена с химопсином; подсчет клеток. Изобретение расширяет арсенал способов прогнозирования продолжительности жизни млекопитающих, в частности собак и кошек, путем определения в сыворотках крови цитопролиферативного фактора с использованием неспециализированных сингенных клеток. 3 н. и 5 з.п. ф-лы, 4 ил., 6 табл., 1 пр.

 

Изобретение относится к биотехнологии и ветеринарии. Изобретение основано на использовании не специализированных клеток млекопитающих для определения цитопролиферативного фактора (фактора старения). Изобретение может быть использовано для прогнозирования продолжительности жизни млекопитающих, в частности собак и кошек, путем определения в сыворотках крови цитопролиферативного фактора (фактор старения - ФС) с использованием неспециализированных сингенных клеток. При этом ФС у собак определяют с использованием клеток MDCK (клетки, полученные из почки собаки), стволовых клеток костного мозга собак, клеток глиального происхождения или нейронов собак (первично трипсинизированных или перевиваемых). У кошек ФС определяют на эмбриональных фибробластах кошки или на клетках глиального происхождения или нейронах кошек (первично трипсинизированных или перевиваемых). Клетки рассевают в 24-луночные планшеты в концентрации 50000 клеток в 1 мл в объеме 900 мкл в лунку и в те же лунки добавляют по 100 мкл прогретой сыворотки в 3 повторах. Планшеты инкубируют 96 часов при 37°C. После инкубации из каждой лунки отбирают надосадок и в лунку добавляют по 200 мкл смеси версена с химопсином. После сползания клеток добавляют надосадок и среду до 1000 мкл. Подсчет клеток производят с помощью ручного автоматизированного счетчика клеток Scepter™ Millipore™ (Германия). Фактор старения рассчитывают по индексу пролиферации, т.е. по соотношению: количество клеток в опыте/количество клеток в контроле. Способ позволяет определить наличие цитопролиферативного фактора в организме млекопитающего, в частности собак и кошек, при их жизни.

Несколько лет назад в ткани головного мозга стареющих мышей был обнаружен фактор, резко стимулирующий пролиферацию глиальных клеток в культуре [1]. Такой цитопролиферативный фактор был обнаружен в сыворотке крови стареющих мышей и стареющих людей. Он накапливается, начиная с конца первой трети средней продолжительности жизни животных и людей с последующим прогрессивным нарастанием его активности. В результате активной пролиферации глиальных клеток формируются два кардинальных признака процесса старения мозга млекопитающих - гибель нейронов и глиоз. Причинная роль фактора в процессе старения доказана опытами ускоренного искусственного старения молодых мышей после введения им мозговых экстрактов или сыворотки крови старых животных [3]. В этих условиях у мышей уже к 5-у месяцу их жизни регистрировалось быстрое и повышенное накопление в крови указанного фактора и развитие клинических признаков старения - вялость движений, вялая реакция на пищу и поседение (мыши линии C57Black/6). Более того, морфометрический анализ головного мозга таких 5-месячных мышей позволил обнаружить у них кардинальные морфологические признаки старения - выраженный глиоз и резко выраженную гибель нейронов [4]; [5].

Поэтому обнаруженный цитопролиферативный фактор был обозначен как «фактор старения». Он отличается видовой специфичностью действия, низкой молекулярной массой (около 10 кД), устойчивостью к повышенной температуре, трипсину, ультразвуку, ультрафиолету и высокой чувствительностью к протеазе К. Подобный фактор обнаруживается в сыворотке крови людей, начиная с их 25-летнего возраста с последующим увеличением его концентрации с возрастом [4], [5].

Широкое распространение домашних животных среди населения сопровождается естественным желанием владельцев увеличить продолжительность жизни своих питомцев, используя для этого различные схемы кормления или имеющиеся в продаже препараты. Для объективной оценки эффективности принимаемых мер может быть использован способ по настоящему изобретению.

Из уровня техники известен способ прижизненного определения цитопролиферативного фактора в организме стареющих млекопитающих и человека, характеризующийся тем, что прижизненно берут сыворотку крови, прогревают ее 30 мин при 90°C, центрифугируют для удаления свернувшихся белков, добавляют к надосадочной жидкости сингенные клетки в виде первичных или перевиваемых культур и инкубируют 72-96 ч при 37°C в атмосфере CO2 с последующим подсчетом клеток в камере Горяева [2].

Указанный способ является ближайшим аналогом заявленного изобретения.

Как показали исследования по определению цитопролиферативного фактора (фактор старения, ФС), в сыворотках крови собак и кошек с использованием разных клеточных линий, эффективность определения ФС у собак и кошек, зависит от происхождения клеточных культур. Неожиданно было обнаружено, что ФС наиболее эффективно определять с использованием неспециализированных сингенных клеток, у собак, например, с использованием клеток MDCK (клетки, полученные из почки собаки) или стволовых клеток костного мозга собак, а у кошек, например, на клетках эмбриональных фибробластах кошки, в частности на клетках СС-81.

Техническим результатом является повышение эффективности - точности диагностирования цитопролиферативного фактора в организме млекопитающих, в частности собак и кошек, при жизни. То есть точно диагностировать увеличивают ли продолжительность жизни питомцев, используемые для этого схемы кормления или препараты.

Заявленный способ отличается от ближайшего аналога использованием именно не высоко неспециализированных клеток, а также снижением температуры прогрева сыворотки с 90 до 60°C. Неожиданно было установлено, что данные признаки влияют на повышение точности диагностики цитопролиферативного фактора.

Примеры

Животные. Обследовано 16 кошек и 20 собак разного возраста (ветеринарная клиника «Рыжий лис»).

Пробы сывороток. Пробы свернувшейся крови животных доставлялись из ветеринарной клиники «Рыжий лис». Кровь центрифугировали при 1500g 15 минут. Отобранную сыворотку разводили в 10 раз средой 199 и прогревали на водяной бане 30 минут при 60°C. После повторного центрифугирования при 1500g в течение 15 минут надосадок хранили при температуре -20°C.

Культуры клеток. В работе использовали культуры клеток: собаки MDCK (почка собаки) и Cf2Th (тимус собаки), а также кошки СС81 (эмбриональные фибробласты кошки) и CRFK (почка кошки), полученные из музея клеточных культур Института вирусологии им. Д.И. Ивановского Федерального государственного бюджетного учреждения «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи» МЗ РФ. Кроме того, использовали стволовые клетки собаки, полученные из отдела иммунологии ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» от доктора медицинских наук Р.К. Чайлахяна.

Питательные среды и растворы. Клетки культивировали в питательной среде Игла MEM (производства ПИПВЭ им. М.П. Чумакова, Россия) с добавлением эмбриональной телячьей сыворотки (Gibco, South America). Для разведения сыворотки использовали ту же среду. Для обработки клеток использовали 0,02% раствор версена (ГНЦ ВБ «Вектор», Россия) и раствор химопсина из расчета 0,1 мг/мл (ООО Самсон-мед, Россия).

Определение фактора старения. Клетки рассевали в 24-луночные планшеты в концентрации 50000 клеток в 1 мл в объеме 900 мкл в лунку и в те же лунки добавляли по 100 мкл прогретой сыворотки в 3 повторах. Планшеты инкубировали 96 часов при 37°C. После инкубации из каждой лунки отбирали надосадок и в лунку добавляли по 200 мкл смеси версена с химопсином. После сползания клеток добавляли надосадок и среду до 1000 мкл. Подсчет клеток производили с помощью ручного автоматизированного счетчика клеток Scepter™ Millipore™ (Германия).

Фактор старения рассчитывали по индексу пролиферации, т.е. по соотношению: количество клеток в опыте/количество клеток в контроле [3].

РЕЗУЛЬТАТЫ

В первой серии использовали 20 сывороток собак разного возраста и разных пород (табл. 1).

Результаты определения фактора старения животных с использованием культуры клеток почки собак (MDCK) отдельно представлены на фиг. 1. Как видно из данных фиг. 1, у большинства животных в возрасте до 6 лет не удается обнаруживать фактор старения, в то время как он определяется у животных более старшего возраста. Однако у молодых животных мы наблюдали 2 исключения (фиг. 1), что может свидетельствовать либо об ускоренном старении данных особей, либо, наоборот, об особо интенсивном накоплении фактора старения у собак данной породы, у которых даже в молодом возрасте уровень фактора старения является несколько повышенным, в то время как к старости он может быть еще более высоким. Из 10 особей старшей возрастной группы у 8 - уровень фактора старения оказался значительно повышен, однако у двух животных - 8-и и 12-и лет - фактор старения обнаружить не удалось (фиг. 1).

Испытания сывороток этой же группы собак на культуре клеток тимуса собак (Cf2Th) практически оказались неэффективными (табл. 2).

В третьей части этого раздела обследовали сыворотки крови собак с использованием культуры стволовых клеток собак. С этой целью были использованы 8 из оставшегося набора сывороток (табл. 3).

Пять животных были старше 6-летнего возраста и 3 - моложе этого возраста. Характерно, что показатели фактора старения у 5 животных и при использовании культуры клеток MDCK, и при использовании культуры стволовых клеток практически совпадали (табл. 4).

Вместе с тем, в группе собак старше 6 лет также регистрировались показатели ниже таковых в контроле (фиг. 2).

Также были испытаны 16 сывороток крови кошек разного возраста и разных пород. Результаты определения фактора старения животных с использованием культуры фибробластов эмбриона кошки (СС81) представлены в табл. 5.

Как видно из данных таблицы 5, у 8 кошек породы «британ» фактор старения не определялся вне зависимости от их возраста. Вместе с тем, у остальных 8 кошек породы «метис», «скотишфолд», «священная бирма» и «бенгал» накопление фактора старения оказывалось характерным для млекопитающих в зависимости от возраста, т.е. с постепенным нарастанием активности в раннем возрасте с последующим снижением ее при вхождении животных в более зрелый возраст (фиг. 3).

Несколько сходные результаты получены при обследовании сывороток кошек с использованием культур клеток почки кошки (CRFK) (фиг. 4, табл. 6).

Как видно из данных фиг. 4 и табл. 6, у животных породы «британ», так же как и при использовании культуры клеток СС81, фактор старения не определялся вне зависимости от возраста кошек. В то же время у кошек других пород («метис», «скотишфолд», «священная бирма» и «бенгал») в возрасте от 1,5 до 5 лет фактор старения определялся.

Анализ результатов определения фактора старения у собак с большой вероятностью свидетельствует об определенной закономерности, связанной с появлением фактора в сыворотке крови животных после 6-летнего возраста (фиг. 1 и 2). При этом, конечно, нельзя не отметить единичных случаев определения повышенных значений фактора у животных в молодом возрасте, что наблюдали у 15% животных при использовании культуры клеток MDCK и у 12,5% животных при использовании культуры стволовых клеток.

Ранее результаты определения фактора старения у мышей показали, что достаточно эффективными оказываются культуры, представляющие собой эмбриональные фибробласты того же животного (Зуев и др., 2000 [1]). Именно поэтому в представленных результатах наиболее демонстративная динамика накопления фактора старения в сыворотках кошек различного возраста представлена (хотя и на примере небольшой выборки) при использовании культуры клеток СС81 - эмбриональных фибробластов кошки (фиг. 3). Использование культур высокоспециализированных клеток не позволяет рассчитывать на положительный результат, как это, например, мы наблюдали при использовании культуры клеток CRFK - почка кошки, или культуры клеток Cf2Th - тимус собаки.

Таким образом, не смотря на то, что порода животных играет определенную роль, однако заявленный способ применим к большинству пород для достоверно прижизненного определения уровня цитопролиферативного фактора (фактора старения) в организме.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1. Определение цитопролиферативного фактора в сыворотках крови собак с использованием культуры клеток MDCK

Фиг. 2. Определение цитопролиферативного фактора в сыворотках крови собак с использованием культуры стволовых клеток костного мозга собак

Фиг. 3. Определение цитопролиферативного фактора в сыворотках крови кошек с использованием культуры клеток СС-81

Фиг. 4. Определение цитопролиферативного фактора в сыворотках крови кошек с использованием культуры клеток CRFK

Примечание для фиг. 1, 2, 3, 4: ось абсцисс - возраст животных (год), ось ординат - цитопролиферативный фактор (Ед)

Список литературы

1. Зуев В.А., Викторов И.В., Бородина Н.П., Игнатова Н.Г., Быковская С.И., Халанский А.С. - Накопление в стареющем мозге млекопитающих фактора, резко стимулирующего пролиферативную активность глии // Бюл. экспер. биол и мед., 2000, т. 129, №3, с. 317-320.

2. Зуев В.А., Игнатова Н.Г. - Способ прижизненного определения цитопролиферативного фактора в организме стареющих млекопитающих и человека // Патент №2204135 от 10.05.2003 г.

3. Зуев В.А., Автандилов Г.Г., Игнатова Н.Г., Быковская С.И. - Искусственное старение мышей // Бюл. экспер. биол. и мед., 2003, т. 135, №9, с. 325-327.

4. Зуев В.А., Игнатова Н.Г., Автандилов Г.Г. - Накопление фактора старения в организме млекопитающих, включая человека // Успехи геронтологии - 2005, вып. 17, с. 108-116.

5. Zuev V.A., Mezentseva M.V., Schaposchnikova G.M. - Apotential new biological marker of the biological age // Frontiers in Genetics, 2013, vol. 4, P. 1-3.05.

1. Способ прижизненного определения уровня цитопролиферативного фактора (фактора старения) у млекопитающего, исключая человека, включающий:

- получение сыворотки крови, для чего кровь центрифугируют, затем отобранную сыворотку разводят и прогревают на водяной бане 30 минут при 60°С, после осуществляют повторное центрифугирование;

- использование полученной сыворотки для инкубации в течение 96 часов при 37°С неспециализированных сингенных клеток;

- добавление смеси версена с химопсином;

- осуществление после сползания клеток их подсчета, при этом цитопролиферативный фактор (фактор старения) рассчитывают по индексу пролиферации, т.е. по соотношению количество клеток в опыте/количество клеток в контроле, где индекс более единицы указывает на наличие цитопролиферативного фактора (фактора старения), при этом, чем выше индекс, тем больше присутствует в организме цитопролиферативного фактора (фактора старения).

2. Способ прижизненного определения уровня цитопролиферативного фактора у собак, включающий:

- получение сыворотки крови, для чего кровь центрифугируют, затем отобранную сыворотку разводят и прогревают на водяной бане 30 минут при 60°С, после осуществляют повторное центрифугирование;

- использование полученной сыворотки для инкубации в течение от 24 часов до 8 суток при 37°С культуры клеток MDCK (клетки, полученные из почки собаки), стволовых клеток костного мозга собак, клеток глиального происхождения или нейронов собак (первично трипсинизированных или перевиваемых);

- добавление смеси версена с химопсином;

- осуществление после сползания клеток их подсчета, при этом цитопролиферативный фактор рассчитывают по индексу пролиферации, т.е. по соотношению количество клеток в опыте/количество клеток в контроле, где индекс более единицы указывает на наличие цитопролиферативного фактора (фактора старения), при этом, чем выше индекс, тем больше присутствует в организме цитопролиферативного фактора.

3. Способ прижизненного определения уровня цитопролиферативного фактора (фактора старения) у кошек, включающий:

- получение сыворотки крови, для чего кровь центрифугируют, затем отобранную сыворотку разводят и прогревают на водяной бане 30 минут при 60°С, после осуществляют повторное центрифугирование;

- использование полученной сыворотки для инкубации в течение от 24 часов до 8 суток при 37°С культуры клеток эмбриональных фибробластов кошки, клеток глиального происхождения или нейронов кошек (первично трипсинизированных или перевиваемых);

- добавление смеси версена с химопсином;

- осуществление после сползания клеток их подсчета, при этом цитопролиферативный фактор (фактора старения) рассчитывают по индексу пролиферации, т.е. по соотношению количество клеток в опыте/количество клеток в контроле, где индекс более единицы указывает на наличие цитопролиферативного фактора, при этом, чем выше индекс, тем больше присутствует в организме цитопролиферативного фактора (фактора старения).

4. Способ по пп. 1-3, где сыворотку разводят предпочтительно в 10 раз средой 199.

5. Способ по пп. 1-3, где сыворотку получают центрифугированием при 1500g 15 минут свернувшейся крови.

6. Способ по пп. 1-3, где повторное центрифугирование осуществляют при 1500g 15 минут.

7. Способ по пп. 1-3, где используют 0,02% раствор версена.

8. Способ по пп. 1-3, где клетки рассевают в 24-луночные планшеты в концентрации 50000 клеток в 1 мл в объеме 900 мкл в лунку и в те же лунки добавляют по 100 мкл прогретой сыворотки в 3 повторах, а после инкубации из каждой лунки отбирают надосадок и в лунку добавляют по 200 мкл смеси версена с химопсином, после сползания клеток добавляют надосадок и среду до 1000 мкл.



 

Похожие патенты:

Группа изобретений относится к медицине, а именно к трансплантологии, и может быть использована для лечения субъекта, нуждающегося в несингенном клеточном или тканевом трансплантате.

Группа изобретений относится к медицине, а именно к акушерству, и может быть использована при вспомогательной репродукции для профилактики неудачного исхода имплантации в матку самки млекопитающего.

Изобретение относится к области ветеринарии и представляет собой способ активации эритропоэза лабораторных животных после лучевой нагрузки, отличающийся тем, что лабораторным животным проводят внутривенную аллогенную трансплантацию мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК) в количестве 5,9 млн клеток/кг и гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) в количестве 295 тыс.

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к генетически-модифицированным TCR-дефицитным Т-клеткам, и может быть использовано в медицине для лечения рака.

Изобретение относится к области биохимии. Изобретение представляет собой способ культивирования выделенных клеток, полученных из ткани пуповины человека, в культуральной среде, содержащей аминокислоты, витамины, соли, нуклеозиды, инсулин, трансферрин, этаноламин и натрия селенит, где культуральная среда обогащена сывороткой.

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способам скрининга чувствительности клеток лейкоза ex vivo к действию различных веществ, в частности препаратов и перспективных лекарственных субстанций, а также их сочетаний, что может быть использовано в медицине.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к соединению для применения в лечении комплемент-опосредованного расстройства. Также раскрыта композиция, содержащая указанное соединение, для лечения комплемент-опосредованного расстройства.

Изобретение относится к области клеточной биологии и биотехнологии, конкретно к созданию биорезорбируемого клеточного скаффолда на основе фибрина плазмы крови. Способ включает смешивание плазмы крови или криопреципитата плазмы крови с раствором коллагена I типа, имеющим рН 7,4, введение суспензии животных клеток и добавление тромбин-кальциевой смеси в соотношении 3,94:2,86:1:1,09 соответсвенно.

Изобретение относится к области клеточной биологии и биотехнологии, конкретно к получению биодеградируемых скаффолдов на основе тканей из натурального шелка. Способ включает обработку ткани из натурального шелка водно-спиртовым раствором хлорида кальция при молярном соотношении хлорида кальция, этилового спирта и воды 1:2:8 соответственно, при 20-80°С в течение 10-120 минут, нанесение на ткань из натурального шелка по меньшей мере одного вещества, способного к адгезии и пролиферации клеток млекопитающего.

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ определения способности микобактерий туберкулеза к размножению в альвеолярных макрофагах пациентов после противотуберкулезной терапии.

Группа изобретений относится к биотехнологии и медицине, а именно к безвекторной микрожидкостной платформе для внутриклеточной доставки в цитозоль эукариотической клетки соединения или композиции.

Изобретение относится к области биомедицины и касается способа получения ростовой добавки к среде для культивирования клеток человека из тромбоцитарной массы доноров.

Изобретение относится к области биохимии, генной инженерии и биотехнологии, в частности к конъюгату рекомбинантной бутирилхолинэстеразы человека и окисленной каламиновой кислоты со средней молекулярной массой 27 кДа.

Изобретение относится к области биохимии. Предложен биореактор для выращивания тканеинженерных конструкций.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к индуцирующему иммунитет агенту, содержащему эффективное количество по меньшей мере одного полипептида, обладающего индуцирующей иммунитет активностью, который индуцирует цитотоксические Т-клетки, способные уничтожать опухолевые клетки, экспрессирующие полипептид CAPRIN-1.
Изобретение относится к области биотехнологии и вирусологии. .

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способу получения хондро-остеогенных клеток in vitro и их применению. .

Изобретение относится к медицине, в частности к способу отбора кардиомиоцитов из содержащей кардиомиоциты смеси клеток без генетического изменения кардиомиоцитов, к способу отбора кардиомиоцитов из содержащей кардиомиоциты смеси клеток без генетического изменения кардиомиоцитов, к способу увеличения содержания кардиомиоцитов в содержащей кардиомиоциты смеси клеток без генетического изменения, к способу получения кардиомиоцитов без генетического изменения кардиомиоцитов, к способу оценки содержания кардиомиоцитов в содержащей кардиомиоциты смеси клеток.

Изобретение относится к области клеточной биологии и биотехнологии, конкретно к способам получения клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для панкреатических эндокринных клеток, включения экспрессии и индуцирования PDX1, NKX6.1 и HB9. Способы включают дифференцировку плюрипотентных клеток, полученных без разрушения эмбриона, плюрипотентных клеток неэмбрионального происхождения, линии эмбриональных стволовых клеток Н1, линии эмбриональных стволовых клеток Н7, линии эмбриональных стволовых клеток Н9, индуцибельных плюрипотентных клеток или перепрограммированных плюрипотентных клеток, или клеток дефинитивной энтодермы, полученных из них, в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для панкреатических клеток-предшественников передней кишки. Полученные клетки дифференцируют в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для панкреатических эндокринных клеток, путем обработки по меньшей мере ингибитором ALK5 и/или гормоном щитовидной железы, выбранным из трииодотиронина, тироксина, аналогов трииодотиронина, аналогов тироксина или их смеси, и культивируют в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия. Изобретение позволяет повысить выход панкреатических эндокринных клеток. 4 н. и 48 з.п. ф-лы, 13 табл., 69 ил., 14 пр.

Изобретение относится к области биохимии. Описана группа изобретений, включающая способ прижизненного определения уровня цитопролиферативного фактора у млекопитающего, исключая человека, способ прижизненного определения уровня цитопролиферативного фактора у собаки и способ прижизненного определения уровня цитопролиферативного фактора у кошки. В одном из вариантов способ включает в себя стадии: получение сыворотки крови при помощи центрифугирования, разведение и прогрев на водяной бане 30 минут при 60°С, с последующим повторным центрифугированием; инкубация сыворотки в течение 96 часов при 37°С неспециализированных сингенных клеток; добавление смеси версена с химопсином; подсчет клеток. Изобретение расширяет арсенал способов прогнозирования продолжительности жизни млекопитающих, в частности собак и кошек, путем определения в сыворотках крови цитопролиферативного фактора с использованием неспециализированных сингенных клеток. 3 н. и 5 з.п. ф-лы, 4 ил., 6 табл., 1 пр.

Наверх