Способ получения гиалуронидазы из семенников крупного рогатого скота

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ получения гиалуронидазы из семенников крупного рогатого скота. Способ включает экстракцию измельченного сырья 0,1н раствором уксусной кислоты в течение 4 ч. Затем экстракт последовательно подвергают центрифугированию/сепарированию, ионообменной сорбции на макропористом сульфокатионите с последующей элюцией фермента с носителя аммиачным элюентом рН 10.0-11.0 при скорости элюции 80-120 мл/см2ч. Изобретение обеспечивает увеличение выхода и улучшение качества целевого продукта. 5 з.п. ф-лы, 4 пр.

 

Предлагаемое изобретение относится к производству ферментов, а именно к способу получения гиалуронидазы из животного сырья - семенников крупного рогатого скота (КРС).

Известны способы получения отдельных ферментов из животного сырья с использованием экстракционных, сорбционных и других методов выделения [1, 2].

Наиболее близким к предлагаемому изобретению по технической сущности и достигаемому эффекту является промышленный способ получения гиалуронидазы из семенников крупного рогатого скота путем экстракции в течение 4 ч с последующим отделением от жмыха, дробным осаждением и фильтрацией, промывкой ацетоном осадка и подсушиванием [3].

Недостатком указанного способа получения гиалуронидазы является использование ацетона крепости 99% на стадии осаждения в экстракте балластных белков с последующим сепарированием, на стадии осаждения целевого продукта ацетоном с отстаиванием в течение 4 ч и последующей фильтрацией на нутч-фильтре, на стадии промывки полученного осадка целевого продукта ацетоном на нутч-фильтре до тех пор, пока продукт не будет комковаться с последующей окончательной сушкой под вытяжным шкафом в течение 5-7 дней до полного удаления запаха. Следовательно, производственный участок относится к категории А по взрывопожароопасности, а условия труда являются вредными. Длительность процесса составляет в среднем 3-4 недели. Указанные недостатки значительно сокращают эффективность и экономичность технологического процесса.

Целью предлагаемого изобретения является проведение процесса без использования органических растворителей для осаждения балластных веществ и целевого продукта, сокращение времени процесса получения фермента, увеличение его выхода и улучшение качества за счет отсутствия в технологии взрыво- и пожароопасных веществ.

Цель достигается использованием способа получения гиалуронидазы, который включает следующие стадии. Подготовленное сырье измельчают и экстрагируют 0,1н раствором уксусной кислоты в соотношении 1:2 (сырье:экстрагент) при перемешивании и пониженной температуре в течении 4 ч. Гомогенат центрифугируют/сепарируют. Прозрачный экстракт подают на ионообменную колонну с сорбентом с определенной скоростью, сорбцию целевого продукта ведут из экстракта на макропористых сульфокатионитах - сополимерах стирола и дивинилбензола. Увеличение и уменьшение скорости сорбции вне указанного интервала существенно не влияет на процесс. Катеонит предварительно уравновешивают раствором с рН 4,0-4,5, содержащим ионы аммония. После завершения сорбции катеонит промывают буферным раствором/подкисленной водой с рН=3,5-4,5 с определенной скоростью в количестве, равном пяти свободным объемам колонны. Затем осуществляют десорбцию фермента с ионита путем подачи сверху вниз элюента с рН 10.0-11.0 с определенной скоростью. Уменьшение скорости подачи элюента и изменение рН элюента меньше 10,0 приводит к "размыванию" целевого пика, увеличению его объема, что не дает достаточной степени концентрирования. Изменение рН элюента больше 11,0 приводит к десорбции с ионита примесей и, как следствие, к ухудшению качества продукта.

Предпочтительно изобретение относится к описанному выше способу, в котором для отделения балластных белклов и коцентрирования целевого продукта применен сорбционно-хроматографический метод на макропористых сорбентах различных марок: КУ-23, Nuvia S, Macro Prep.

Отличительными признаками предложенного способа от прототипа является:

1. Концентрирование целевого продукта на сульфокатионитах.

2. Отсутствие стадий: а) осаждения ацетоном: балластных белков и целевого продукта; б) промывки ацетоном

3. Отсутствие длительной стадии удаления паров ацетона в вытяжном шкафу. Положительный эффект от предложенного технического решения состоит в следующем:

1. Сокращение технологического цикла получения фермента в 2 раза.

2. Увеличение съема фермента с единицы сырья в 1,5-2 раза.

3. Улучшение качества готового продукта и условий труда работников за счет исключения использования ацетона.

Способ иллюстрируется следующими примерами:

Пример 1

Взвешивают 150 г семенников КРС. Измельченное сырье помещают в колбу объемом 500 мл, добавляют 300 мл экстрагента - 0,1н уксусной кислоты. Ставят экстрагироваться на холоду (2-8°С) на 4 ч при перемешивании на шейкере. Гомогенат центрифугируют (3000 об/мин, 20 мин, 2-8°С). Катеонит предварительно уравновешивают 0,1н раствором NH4Cl с рН=4,3. После отделения осадка проводят сорбцию целевого продукта из экстракта на макропористом сульфокатионите КУ-23 со скоростью 220 мл/см2ч до проскока целевого продукта. После завершения сорбции катионит КУ-23 промывают подкисленной водой с рН=3,5. Элюцию проводят 1н раствором сульфата аммония с рН=10,5 со скоростью 80 мл/см2ч. Отбирают пробы в количестве 10 мл и определяют концентрацию белка по методу Лоури. Сорбент промывают водой и регенерируют.

Общий выход по белку на стадии десорбции составил 91%. Степень концентрирования по активности при использовании в качестве сорбента КУ-23 составила 1,05.

Пример 2

Взвешивают 100 г семенников КРС. Измельченное сырье помещают в колбу объемом 500 мл, добавляют 200 мл экстрагента - 0,1н уксусной кислоты. Ставят экстрагироваться на холоду (2-8°С) на 4 ч при перемешивании на шейкере. Гомогенат центрифугируют (3000 об/мин, 20 мин, 2-8°С). После отделения осадка проводят сорбцию целевого продукта из экстракта в количестве 25 мл на макропористом сульфокатионите Nuvia S со скоростью 210 мл/см2ч до проскока целевого продукта. После завершения сорбции катионит Nuvia S промывают ацетатным буфером с рН 4.0-4,5 со скоростью 210 мл/см2ч. Элюцию проводят аммиачным раствором с рН 10.0-11.0 со скоростью 105 мл/см2ч. Отбирают пробы в количестве 1 мл и определяют концентрацию белка биуретовым методом. Сорбент промывают водой и регенерируют.

Общий выход на белку на стадии десорбции составил 67%. Степень концентрирования по активности при использовании в качестве сорбента Nuvia S составила 2,16.

Пример 3

Взвешивают 100 г семенников КРС. Измельченное сырье помещают в колбу объемом 500 мл, добавляют 200 мл экстрагента - 0,1н уксусной кислоты. Ставят экстрагироваться на холоду (2-8°С) на 4 ч при перемешивании на шейкере. Гомогенат центрифугируют (3000 об/мин, 20 мин, 2-8°С). После отделения осадка проводят сорбцию целевого продукта из экстракта в количестве 25 мл на макропористом сульфокатионите Macro Prep со скоростью 210 мл/см2ч до проскока целевого продукта. После завершения сорбции катионит Macro Prep промывают ацетатным буфером с рН 4.0-4,5 со скоростью 210 мл/см2ч. Элюцию проводят аммиачным раствором с рН 10.0-11.0 со скоростью 105 мл/см2ч. Отбирают пробы в количестве 1 мл и определяют концентрацию белка биуретовым методом. Сорбент промывают водой и регенерируют.

Общий выход на белку на стадии десорбции составил 63%. Степень концентрирования по активности при использовании в качестве сорбента Macro Prep составила 1,0.

Источники информации

1. Патент 2495672 РФ Способ получения комплекса биологически активных веществ из печени рыб тресковых пород / Забозлаев А.А. (RU), Пожарицкая О.Н (RU), Шиков А.Н. и др. // Опубл. 20.10.2013.

2. Патент 2570631 РФ Способ получения пероксидазы / Иванов В.Н. (RU), Глазова Н.В. (RU), Серкова А.Н. (RU) и др. // Опубл. 20.04.2015.

3. Патент 827068 СССР Способ получения лидазы / Лазарева И.В., Сидорова Н.Д., Чайка О.В. и др. // Опубл. 07.05.1981.

1. Способ получения гиалуронидазы из семенников крупного рогатого скота, заключающийся в экстракции предварительно измельченного сырья 0,1н раствором уксусной кислоты в соотношении 1:2 в течение 4 ч при температуре 2°C-8°C с последующим сепарированием/центрифугированием для получения прозрачного экстракта, сорбции полученного экстракта на ионообменной колонне с макропористым сульфокатионитом со скоростью 180-220 мл/см2ч с последующей промывкой подкисленной водой или буферным раствором с рН=3,5-4,5 в количестве, равном пяти свободным объемам колонны, и элюции аммиачным элюентом с рН=10-11 со скоростью 80-120 мл/см2ч для получения элюата.

2. Способ по п. 1, при котором в качестве макропористого сульфокатионита используют сорбент марки КУ-23.

3. Способ по п. 1, при котором в качестве макропористого сульфокатионита используют сорбент марки Nuvia S.

4. Способ по п. 1, при котором в качестве макропористого сульфокатионита используют сорбент марки Macro Prep.

5. Способ по любому из пп. 1-4, при котором в качестве элюента используют аммиачный раствор с рН 10,0-11,0.

6. Способ по любому из пп. 1-4, при котором в качестве элюента используют сульфат аммония с рН 10,0-11,0.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к фармацевтической промышленности и представляет собой способ получения стабильной и гомогенной жидкой композиции, подходящей для энтерального введения, содержащей продукт панкрелипазных ферментов и питательные вещества из питательной смеси, включающий следующие стадии: получение суспензии панкрелипазных ферментов в водном растворе, включающее стадии: уменьшение размера продукта панкрелипазных ферментов, добавление водного раствора, имеющего нейтральный рН, в количестве менее 10 мл, смешивание с образованием суспензии и выдерживание ее в течение периода времени более чем 5 минут и смешивание суспензии с жидкой питательной смесью с образованием стабильной и гомогенной жидкой композиции, где питательная смесь имеет общее содержание жировых, белковых и углеводных питательных веществ от 10 до 35 г/100 мл, или имеет общее содержание жировых и белковых питательных веществ от 4,5 до 11,5 г/100 мл, или имеет общее содержание жировых питательных веществ от 3,0 до 7,0 г/100 мл, или имеет общее содержание белковых питательных веществ от 1,3 до 6,3 г/100 мл, и водный раствор представляет собой очищенную воду, деионизированную воду, стерильную воду, физиологический раствор, 0,9% NaCl или водопроводную воду.

Группа изобретений относится к области биотехнологии. Представлен способ получения молекулярного комплекса, обладающего активностью GAA (кислой альфа-глюкозидазы), включающий контактирование полипептида с активностью GAA с протеазой из гриба вида Aspergillus oryzae, при этом указанная протеаза расщепляет указанный полипептид в одном или более сайтах между аминокислотой 50 и аминокислотой 74 последовательности указанного полипептида.

Изобретение относится к области биохимии, генной инженерии и биотехнологии, в частности к способу получения белка с помощью микроорганизма. Настоящий способ включает введение экспрессионной конструкции в микроорганизм, которая содержит промотор и нуклеиновую кислоту, кодирующую белок, и экспрессию белка в микроорганизме.

Изобретение относится к биотехнологии и медицине и представляет собой фармацевтический состав для расщепления гиалуроновой кислоты in vivo, содержащий эффективное количество выделенного белка гиалуронидазы, который имеет молекулярный вес 44±1 кДа и содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную последовательности SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 4, и фармацевтически приемлемый эксципиент, носитель, разбавитель или вспомогательный агент.

Изобретение относится к области биохимии. Представлено применение модифицированной протеазы в качестве средства для повышения стабильности при хранении амилазы в жидком моющем или чистящем средстве, включающем амилазу и протеазу.

Группа изобретений относится к биотехнологии. Предложены гранула для применения в порошковых моющих средствах и композиция гранулированного моющего средства.

Настоящее изобретение относится к способу предоставления вариантов протеазы или амилазы со значением эффективности, по меньшей мере, в одном интересующем тесте, превышающим показатель эффективности для указанного фермента дикого типа.

Изобретение относится к области биохимии и биотехнологии. Представлена гиалуронидаза из Streptomyces koganeiensis АТСС 31394, включающая N-концевую аминокислотную последовательность AGENGATTTFDGPVA и имеющая молекулярную массу 21,6 кДа, изоэлектрическую точку (pI) в диапазоне от 4,4 до 4,8 и ферментативную активность свыше 40000 МЕ/мг и менее 50000 МЕ/мг.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к полипептиду, обладающему амилазной активностью, происходящему от родительского полипептида, являющегося не-мальтогенной экзоамилазой дикого типа, имеющей по меньшей мере 90% идентичность SEQ ID NO: 13.
Изобретение относится к медицине, конкретно к фармакологии и клеточным технологиям. .

Изобретение относится к области биохимии и биотехнологии, в частности к рекомбинантной плазмидной ДНК pET15/N-Dest+. Указанная плазмидная ДНК предназначена для экспрессии в клетках Escherichia coli гена дестабилазы медицинской пиявки Hirudo medicinalis.

Предложены штамм мицелиального гриба Trichoderma Longibrachiatum TW-14-220T - продуцент комплекса ферментов эндоглюканаз, бета-глюканаз и ксиланаз, разрушающих некрахмальные полисахариды, и способ получения кормового ферментного препарата с использованием штамма мицелиального гриба Trichoderma longibrachiatum TW-14-220T.

Изобретение относится к области биохимии, генной инженерии и биотехнологии, в частности к генетической конструкции для обеспечения экспрессии целевых гомологичного и гетерологичного генов в клетках реципиентного гриба Penicillium verruculosum.

Группа изобретений относится к биотехнологии. Предложен рекомбинантный штамм гриба Penicillium verruculosum PVERINU13 BКПMF-1292 и штамм гриба Penicillium verruculosum PVERINU18 BКПMF-1291.

Группа изобретений относится к биотехнологии. Предложен рекомбинантный штамм гриба Penicillium verruculosum PVERINU13 BКПMF-1292 и штамм гриба Penicillium verruculosum PVERINU18 BКПMF-1291.

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен рекомбинантный штамм мицелиального гриба Penicillium canescens СL14 ВКМ F-4706D, продуцирующий бактериальную термофильную целлюлазу Cel5L из Clostridium thermocellum с молекулярной массой 48 кДа.

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен рекомбинантный штамм мицелиального гриба Penicillium canescens СL14 ВКМ F-4706D, продуцирующий бактериальную термофильную целлюлазу Cel5L из Clostridium thermocellum с молекулярной массой 48 кДа.

Группа изобретений относится к области биотехнологии. Представлен способ получения молекулярного комплекса, обладающего активностью GAA (кислой альфа-глюкозидазы), включающий контактирование полипептида с активностью GAA с протеазой из гриба вида Aspergillus oryzae, при этом указанная протеаза расщепляет указанный полипептид в одном или более сайтах между аминокислотой 50 и аминокислотой 74 последовательности указанного полипептида.

Группа изобретений относится к области биотехнологии. Представлен способ получения молекулярного комплекса, обладающего активностью GAA (кислой альфа-глюкозидазы), включающий контактирование полипептида с активностью GAA с протеазой из гриба вида Aspergillus oryzae, при этом указанная протеаза расщепляет указанный полипептид в одном или более сайтах между аминокислотой 50 и аминокислотой 74 последовательности указанного полипептида.

Изобретение относится к области биохимии, генной инженерии и биотехнологии, в частности к способу получения белка с помощью микроорганизма. Настоящий способ включает введение экспрессионной конструкции в микроорганизм, которая содержит промотор и нуклеиновую кислоту, кодирующую белок, и экспрессию белка в микроорганизме.

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ получения гиалуронидазы из семенников крупного рогатого скота. Способ включает экстракцию измельченного сырья 0,1н раствором уксусной кислоты в течение 4 ч. Затем экстракт последовательно подвергают центрифугированиюсепарированию, ионообменной сорбции на макропористом сульфокатионите с последующей элюцией фермента с носителя аммиачным элюентом рН 10.0-11.0 при скорости элюции 80-120 млсм2ч. Изобретение обеспечивает увеличение выхода и улучшение качества целевого продукта. 5 з.п. ф-лы, 4 пр.

Наверх