Способ выделения гликозаминогликанов из вторичных коллагенсодержащих отходов

Изобретение относится к способу выделения гликозаминогликанов из вторичного коллагенсодержащего сырья и может быть применено в медицинской промышленности. Предложенный способ включает очистку и измельчение исходного сырья, промывку фосфатным буфером, ферментативный гидролиз ферментами коллагеназой и папаином в концентрации 200 ед/г в течение 6-10 часов, при температуре 40-50°С, рН 6,5-7,5 с их последовательным внесением, последующим осаждением гликозаминогликанов 96%-ным этанолом и отделением осадка центрифугированием, переосаждение этанолом, высушиванием на распылительной сушилке, разделение и очистку гель-хроматографией с использованием сефадекса G25 и высушиванием на распылительной сушилке. Предложен новый эффективный способ, позволяющий получить высококачественные и высокоочищенные гликозаминогликаны для получения фармацевтических субстанций, которые могут быть использованы для производства биологически активных веществ и лекарственных препаратов. 1 пр., 1 табл.

 

Изобретение относится к медицине, в частности к технологии выделения биологически активных соединений, и может быть использовано для изготовления лекарственных средств или биологически активных веществ, действие которых направлено на улучшение состояния соединительной ткани.

Различные биохимические изменения, наблюдаемые в соединительной ткани с возрастом, непосредственно влияют на процесс старения и возникновение при этом определенных патологических процессов.

Заболевания опорно-двигательного аппарата являются существенной причиной преждевременной потери трудоспособности и инвалидности. В связи с наблюдаемым существенным постарением населения вопросы профилактики и лечения данного заболевания приобретают особую актуальность.

Для остановки разрушения хрящевой ткани и восстановления ее структуры с успехом применяются хондропротекторы - препараты, действие которых направлено на питание и образование новых клеток хрящевой ткани, а также на выработку синовиальной жидкости - смазки сустава.

Гликозаминогликаны (ГАГ), выделяемые из различного сырья, применяются в составе препаратов с целью хондропротекторного действия на соединительную ткань. Доказано, что после 20 лет у человека практически в 6 раз уменьшается обмен гликозаминогликанов в сравнении с новорожденными, что соответственно приводит к развитию заболевание опорно-двигательного аппарата.

На сегодняшний день существуют различные способы выделения гликозаминогликанов. Однако известные технологии продолжительны по времени, а сырье, используемое для выделения, является достаточно дорогим.

Так, известен (RU, патент 2089201, опубл. 10.09.1997) способ выделения гликозаминогликанов из фиброзного хряща путем протеолиза измельченного образца папаином, депротеинизации гидролизата трихлоруксусной кислотой и осаждения гликозаминогликанов этанолом.

Недостатками такого способа является невысокий выход гликозаминогликанов. Также метод не позволяет удалить белковые фракции, что значительно уменьшает чистоту конечного продукта.

Известен способ выделения сульфатированных полисахаридов из животных тканей (RU, патент 2056851, опубл. 27.03.1996). Способ заключается в том, что гидролиз роговиц активированным папаином проводят после добавления 2,5%-ного раствора папаина на 1 кг сырого веса ткани, после чего гидролизат кипятят 10-15 мин, добавляют к нему трихлоруксусную кислоту и после отделения осадка диализуют против смеси 1 н хлористого натрия и спирта в соотношении 7:3, насыщенного хлористого натрия и дистиллированной воды.

Недостатки способа: трудоемкость, использование достаточно дорогого сырья, а также не высокий выход целевого продукта.

Также известен способ выделения сульфатированных гликозаминогликанов из биологических тканей (RU, патент 2273486, опубл. 10.04.2006). Способ включает механическую очистку ткани, размельчение, отмывку буферным раствором, обработку ферментным папаином, диализ, осаждение этанола и центрифугирование, высушивают и фасуют.

К недостаткам способа можно отнести то, что для проведения ферментативного гидролиза сырья используется один фермент папин, который не обеспечивает максимального выхода гликозаминогликанов из биологических тканей.

Известен способ выделения гликозаминогликанов из минерализованной соединительной ткани (RU, патент 2325902, опубл. 10.06.2008). Способ включает ферментативный гидролиз ферментом пепсином, депротеинизацию сульфатом аммония, осаждение 4%-ным ацетатом калия в 96% этаноле, переосаждение этанолом и лиофильную сушку.

Недостатком способа является высокая продолжительность ферментативного гидролиза, что значительно увеличивает время проведения исследований.

Наиболее близким аналогом изобретения является способ выделения сульфатированных гликозаминогликанов (RU, патент 2304441, опубл. 20.08.2007), который заключается в механической очистке биологических тканей, промывкой фосфатным буфером, отмывке, гидролизе отмытой ткани активированным папаином, осаждении этанолом, отделение осадка и высушивание.

Данный способ не обеспечивает максимального выхода гликозаминогликанов из сырья, за счет использования одного фермента при проведении ферментативного гидролиза.

Задачей настоящего изобретения является разработка технологии выделения гликозаминогликанов высокого качества из дешевого вторичного коллагенсодержащего сырья.

Технический результат, достигаемый при реализации разработанного способа, состоит в получении выхода до 98% гликозаминогликанов высокой степени очистки.

Технический результат достигается тем, что были подобраны такие технологические режимы переработки биологической ткани, которые позволяют уменьшить продолжительность процесса выделения ГАГ, увеличить выход ГАГ из сырья с высокой степенью очистки, а также снизить стоимость готового продукта по сравнению с известными аналогами за счет использования более дешевого сырья для выделения ГАГ.

Для достижения указанного технического результата предложено использовать разработанный способ, согласно которому биологическую ткань, являющуюся отходами животноводства (шкуры, жилки, фасции, хрящи и т.п.), очищают от примесей и измельчают через мясорубку или нарезанием на небольшие кусочки, измельченную ткань промывают фосфатным буфером и подвергают ферментативному гидролизу выбранными ферментами, осаждают ГАГ 96%-ным этиловым спиртом, после чего осадок отделяют центрифугированием и переосаждают этанолом, снова собирают и высушивают на распылительной сушилке Mini Spray Dryer В-290, после чего проводят очистку ГАГ с помощью гель-хроматографии.

Разработанный способ реализуют следующим образом.

Вторичное коллагенсодержащее сырье (шкуры, жилки, фасции, хрящи и т.п.) удаляют от посторонних примесей и измельчают. Затем измельченную ткань промывают 0,1 М фосфатным буфером рН 5,8-6,0 при температуре 60-65°С в соотношении 1:2 в течение 20-30 минут. Данная стадия использована для того, чтобы обеспечить больший выход ГАГ из сырья и уменьшить время воздействия ферментов на сырье. Далее проводят ферментативный гидролиз выбранными ферментами (коллагеназа и папаин) в концентрации 200 ед/г в течение 6-10 часов при температуре 40°С и рН 6,5-7,5. При этом ферменты вносятся последовательно, что обеспечивает полное разрушение ткани и высокий выход ГАГ. Далее ГАГ осаждают 96%-ным этиловым спиртом, осадок центрифугируют, переосаждают этанолом, осадок собирают и высушивают на распылительной сушилке. После чего проводят разделение и очистку ГАГ с помощью гель-хроматографии, что позволяет достичь величин степени очистки ГАГ от балластных веществ и белковых фракций до 98%.

Пример выполнения

Вторичное коллагенсодержащее сырье очищают от посторонних примесей и измельчают на мясорубке или нарезанием на мелкие кусочки, размером не более 5×5 мм. Очищенную и измельченную ткань промывают 0,1 М фосфатным буфером рН 5,8-6,0 при температуре 60-65°С в соотношении 1:2 в течение 20-30 минут.

Промытую ткань подвергают ферментативному гидролизу ферментами (коллагеназа и папаин). Ферментативный гидролиз проводят при последовательном добавлении ферментов. Сначала гидролиз ведут при внесении фермента коллагеназы в концентрации 200 ед/г при рН 7,5 и температуре 40-50°С в течение 3-5 часов, а затем вносят папаин в концентрации 200 ед/г и проводят гидролиз при рН 6,5 и температуре 40-50°С в течение 3-5 часов. Ферментативный гидролиз ведут при постоянном перемешивании. Далее ГАГ осаждают 96%-ным этиловым спиртом при температуре 20-25°С в течение 1,0-3,0 часов, а осадок отделяют центрифугированием при 3000 об/мин в течение 10-30 минут.

Полученный осадок отбирают и проводят переосаждение этанолом, для чего осадок промывают 96%-ным этилом спиртом 3-6 раз, а затем осадок фильтруют для отделения от спирта и снова центрифугируют в течение 5-10 минут.

Осадок высушивают на распылительной сушилке Mini Spray Dryer В-290 при следующих параметрах: температура входа - 250-300°С, температура выхода - 180-220°С, скорость воздушного потока - 45-55 м3/ч, скорость подачи раствора - 35-40 мл/мин.

Очистку полученных ГАГ осуществляют гель-хроматографией с использованием сефадекса G25. Элюирование проводят дистиллированной водой со скоростью 6 мл/мин. Регистрация гликозаминогликанов осуществляется путем определения оптической плотности элюата спектрофотоместрически на детекторе при длине волны λ=220 нм. Полученные после проведения гель-хроматографии фракции ГАГ высушивают на распылительной сушилке. Степень очистки фракций составляет до 98%, при этом содержание белка либо не определялось, либо не превышает 0,03%, что существенным образом не повлияет на качество конечного продукта.

Сравнение разработанного способа выделения ГАГ из вторичного коллагенсодержащего сырья для обоснования достижения указанного технического результата проведено с ближайшим аналогом.

Таким образом, установлено, что предлагаемый способ выделения ГАГ из биологических тканей позволяет получить высококачественные и высокоочищенные ГАГ для использования в медицине для создания биологически активных веществ или лекарственных препаратов.

Способ выделения гликозаминогликанов из вторичного коллагенсодержащего сырья, включающий промывку и очистку исходного сырья, ферментативный гидролиз, осаждение этанолом, отличающийся тем, что после очистки и измельчения сырье промывают 0,1 М фосфатным буфером рН 5,8-6,0 при температуре 60-65°C в соотношении 1:2 объема буфера в течение 20-30 минут, затем проводят ферментативный гидролиз в течение 6-10 часов при 40-50°C и рН 6,5-7,5, используя ферменты коллагеназу и папаин в концентрации 200 ед/г, вносимые последовательно, осаждение гликозаминогликанов проводят 96%-ным этиловым спиртом при температуре 20-25°C в течение 1,0-3,0 часов, переосаждают этанолом, высушивают на распылительной сушилке при температуре входа 250-300°C, температуре выхода 180-220°C, скорость воздушного потока 45-55 м3/ч, скорость подачи раствора 35-40 мл/мин, разделяют и очищают гликозаминогликаны на гель-хроматографии с использованием сефадекса G25 и высушивают на распылительной сушилке.



 

Похожие патенты:

Настоящее изобретение относится к наночастицам на основе кордицепина/О-карбоксиметилхитозана, пригодным для использования в медицине, и способу их получения. Предложены наночастицы на основе кордицепина/О-карбоксиметилхитозана размером 100-200 нм, полученные способом, который включает диспергирование кордицепина в растворе на основе хлорида натрия, содержащем О-карбоксиметилхитозан, добавление к полученной системе раствора триполифосфата натрия, центрифугирование, промывание и вакуумное высушивание.

Настоящее изобретение относится к гелю на основе поперечно сшитой гиалуроновой кислоты. Гель на основе поперечно сшитой гиалуроновой кислоты получают в результате поперечного сшивания гиалуроновой кислоты или ее соли в присутствии по меньшей мере эффективного количества по меньшей мере одного эндогенного полиамина в качестве поперечно сшивающего агента.

Группа изобретений относится к биотехнологии. Заявлена группа изобретений: способ получения природного биополимера апизана и применение апизана в качестве добавки в питательную среду.

Изобретение относится к конъюгату хитозана для стабилизации липосомальных суспензий и способу его получения, которые могут быть использованы в фармацевтической промышленности.

Изобретение относится к производству формованного продукта из поперечно-сшитой гиалуроновой кислоты. Способ предусматривает получение субстрата гиалуроновой кислоты, растворенной в первой жидкой среде, которая представляет собой водный раствор, без какого-либо сшивания, осаждение субстрата гиалуроновой кислоты, подвергая его воздействию второй жидкой среды, содержащей один или более первых водорастворимых органических растворителей в количестве, обеспечивающем условия осаждения гиалуроновой кислоты без какого-либо сшивания.

Настоящее изобретение относится к способу получения гидрофобизированной гиалуроновой кислоты (формула I). Причем R представляет собой H+ или Na+ и R1 представляет собой H или -С(=O)CxHy или -C(=O)CH=CH-het, где x представляет собой целое число в диапазоне от 5 до 17, и y представляет собой целое число в диапазоне от 11 до 35, и CxHy представляет собой неразветвленную или разветвленную, насыщенную или ненасыщенную C5-C17 цепь, и het представляет собой гетероциклическую или гетероароматическую группу с произвольным содержанием атомов N, S или О, по меньшей мере с одной повторяющейся единицей, содержащей одну или несколько R1 -С(=O)CxHy или -C(=O)CH=CH-het групп, и где n находится в диапазоне от 12 до 4000.

Группа изобретений относится к области косметологии, а именно к композиции кожного наполнителя для лечения морщин на коже, содержащей гиалуроновую кислоту, поперечно-сшитую с диаминным сшивателем, выбираемым из лизина или метилового эфира лизина, и карбодиимидный связывающий агент; к способу получения указанной композиции, согласно которому проводят поперечное сшивание гиалуроновой кислоты с диаминным сшивателем, выбираемым из лизина или метилового эфира лизина, в присутствии карбодиимидного связывающего агента; а также к способу лечения тонких линий на коже, включающему введение данной композиции в дермальную область пациента.
Изобретение относится к области химии биополимеров. Описан способ получения низкомолекулярного хитозана и олигомеров хитозана методом химической деполимеризации, включающий гидролиз хитозана в присутствии кислоты с последующими фильтрацией, фракционированием, очисткой и сушкой продуктов, отличающийся тем, что гидролиз хитозана проводят 2,5-12,5% разбавленной азотной кислотой при температуре 70°С с последующим разделением гидролизата на две фракции - осадок низкомолекулярного хитозана и маточный раствор, далее из маточного раствора при добавлении изопропилового спирта и охлаждении осаждают олигомеры хитозана, затем оба продукта промывают изопропиловым спиртом и высушивают на воздухе, окончательно продукты деполимеризации хитозана перерастворяют в воде и высушивают лиофильно.

Изобретение относится к способам получения нанокристаллитов низкомолекулярного хитозана и может быть использовано в химическом производстве для создания нановолокнистых полимерных материалов, пленок, гранул, волокон, в качестве стабилизатора в пищевой промышленности, в косметологии и в сельском хозяйстве.

Изобретение относится к сельскому хозяйству. Предложен способ получения хитозана, включающий измельчение пупариев насекомых, щелочную обработку хитинсодержащего сырья с постоянным перемешиванием при повышенной температуре и дальнейшее отмывание остатка дистиллированной водой.

Группа изобретений относится к области химико-фармацевтической промышленности, а именно к концентрированной фармацевтической композиции и способу ее получения. Способ получения композиции заключается в том, что жидкую фракцию 2 антисептика стимулятора Дорогова наливают тонким слоем в поддон, изготовленный из неподверженного коррозии материала, помещают поддон на греющую поверхность, сушат в течение нескольких часов, после чего сливают в приемную емкость.

Группа изобретений относится к области медицины, а именно к ветеринарии, и предназначена для лечения мастита у коров. Состав для лечения мастита у коров включает йод, АСД ф-2, янтарную кислоту, йодистый калий, поливиниловый спирт, глицерин и дистиллированную воду.
Изобретение относится к области медицины, хирургии. Моделируют пластику эпителиального дефекта стенки трахеи тканеинженерной слизистой реципиента на полимерной основе.

Изобретение относится к области медицины, а именно к способу получения децеллюляризированных матриксов почек кролика или крыс. Способ получения децеллюляризированных матриксов почек кролика или крыс с помощью метода детергентно-ферментативной децеллюляризации с использованием высокопроизводительной системы перфузии, которая представлена модулем для децеллюляризации, образованным резервуарами для перфузируемого раствора и паренхиматозного органа, системой силиконовых трубок с внутренним диаметром '' и 1/8'', перистальтических трубок с тремя маркированными стопперами для подключения к картриджам насоса Ismatec и системой люэр-фиттингов, который в собранном виде подключается к проточному биореактору EBERS ТЕВ500 MasterUnit, после подключения модуля децеллюляризации к биореактору проводят последовательную перфузию почек растворами определенного состава.

Группа изобретений относится к области химико-фармацевтической промышленности, а именно к порошкообразной фармацевтической композиции и способу ее получения. Способ получения порошкообразной фармацевтической композиции заключается в том, что жидкую фракцию 2 антисептика стимулятора Дорогова смешивают с карбонатом аммония в массовом соотношении 1:0,5–1:2,0 и с порошкообразным сорбентом в массовом соотношении 1:0,04–1:0,1, после чего сушат.
Изобретение относится к медицине, в частности к восстановительной и спортивной медицине, и может быть использовано для повышения работоспособности организма в условиях физических и психологических нагрузок, в том числе в период интенсивных тренировок.

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к способу получения лекарственного средства из тимуса телят. Способ получения лекарственного средства из тимуса телят включающий, измельчение и гомогенизацию ткани тимуса телят в возрасте до 12 месяцев, при этом экстракцию гомогената проводят 3%-ным раствором уксусной кислоты в течение 24±2 часов при температуре +37±3°C при соотношении сырья к экстрагенту 1:2 с добавлением хлорида цинка из расчета 5 г хлорида цинка на 1 кг сырья, далее проводится осветляющая фильтрация с применением вспомогательного вещества - 10% кизельгура с отделением последнего на нутч-фильтре через фильтровальный картон, стабилизация пептидов происходит с помощью глицина 40±10% мг на 1 мл раствора для лиофилизации, далее проводят сублимационную сушку.

Изобретение относится к ветеринарии и касается способа получения биогенного стимулятора для лечения и профилактики заболеваний сельскохозяйственных животных, включающего промывание селезенки проточной водой, очищение от соединительнотканных и жировых элементов, выдержку селезенки в асептических условиях, гомогенизацию с добавлением дистиллированной воды, дальнейшую выдержку, ультрафильтрацию полученной смеси.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно предложен высокостабильный Т-клеточный рецептор, что может быть использовано в медицине. Полученный Т-клеточный рецептор, имеющий мутации в своем гидрофобном коровом домене, используют в составе фармацевтической композиции для лечения опухоли.

Изобретение относится к области нанотехнологии, в частности к способу получения нанокапсул, и описывает способ получения нанокапсул антисептика-стимулятора Дорогова 2 фракция (АСД) в оболочке из альгината натрия.

Изобретение относится к способу выделения гликозаминогликанов из вторичного коллагенсодержащего сырья и может быть применено в медицинской промышленности. Предложенный способ включает очистку и измельчение исходного сырья, промывку фосфатным буфером, ферментативный гидролиз ферментами коллагеназой и папаином в концентрации 200 едг в течение 6-10 часов, при температуре 40-50°С, рН 6,5-7,5 с их последовательным внесением, последующим осаждением гликозаминогликанов 96-ным этанолом и отделением осадка центрифугированием, переосаждение этанолом, высушиванием на распылительной сушилке, разделение и очистку гель-хроматографией с использованием сефадекса G25 и высушиванием на распылительной сушилке. Предложен новый эффективный способ, позволяющий получить высококачественные и высокоочищенные гликозаминогликаны для получения фармацевтических субстанций, которые могут быть использованы для производства биологически активных веществ и лекарственных препаратов. 1 пр., 1 табл.

Наверх