Способ получения белковой кормовой добавки

Изобретение относится к сельскому хозяйству и биотехнологии и может быть использовано в животноводстве для получения функциональной белковой белковой кормовой добавки. Способ получения добавки включает: подготовку питательной среды путем ферментативного гидролиза и осахаривания крахмалсодержащего сырья с последующим добавлением хлорида кобальта и диаммоний фосфата и доведения рН до значения 6,5; подготовку посевного материала путем последовательного раздельного пересева штаммов микроорганизмов, входящих в состав комбинированной бактериальной закваски, в малый посевной аппарат, а оттуда в большой посевной аппарат, ферментацию приготовленной питательной среды комбинированной бактериальной закваской; разделение полученной культуральной жидкости путем глубокого центрифугирования. Центрифугирование представляет собой два последовательных процесса на двух аппаратах - декантере и сидекантере. Фугат возвращают в производство, а отделенный твердый осадок подвергают двухступенчатой низкотемпературной сушке при температуре не более 76°С с получением готового продукта. При этом используемая закваска содержит штаммы пропионовокислых бактерий Propionibacterium freudenreichii subsp. freudenreichii RCAM04257 и молочнокислых бактерий Lactobacillus reuteri RCAM03194 и/или Lactobacillus salivarius RCAM03193. Использование изобретения позволит получить продукт с хорошей перевариваемостью и длительным сроком хранения. 5 пр.

 

Изобретение относится к сельскому хозяйству и биотехнологии и может быть использовано в животноводстве для получения функциональной белковой бактериальной кормовой добавки.

Известен способ получения пробиотической кормовой добавки для животных, содержащей микроорганизмы с повышенным потенциалом роста [1]. Скармливание известной кормовой добавки позволяет улучшить состояние здоровья животных и улучшить их рост. Однако способ не обеспечивает получения высокобелковой кормовой добавки.

Известен способ силосования растительного сырья с использованием закваски, содержащей штаммы молочнокислых и пропионовокислых бактерий, с получением корма с повышенным содержанием сырого протеина и витаминов [2]. Известный способ не предусматривает получения бактериальной кормовой добавки, обогащенной биологически активными компонентами.

Известен способ биоконверсии сельскохозяйственных целлюлозных остатков в кормовые продукты, содержащие микробную биомассу [3].

Известно совместное использование бактерий видов Lactobacillus acidophilus и Propionibacterium freudenreichii для производства пробиотических препаратов, обеспечивающих профилактику нарушений микробиоценоза желудочно-кишечного тракта и дисбактериозов различной этиологии [4].

Известен способ получения белково-витаминного продукта из зернового сырья [5]. В качестве природного сырья в данном известном способе используют измельченное зерно, которое подвергают ферментативному гидролизу с получением ферментолизата для приготовления питательной среды для выращивания дрожжей Saccaromyces cerevisiae с целью получения спирта. Однако этот процесс требует значительных энергозатрат, так как дрожжи выращивают в аэробных условиях, что требует подачи воздуха в среду для их инкубации. Перед использованием полученной биомассы в корм ее подвергают термической обработке, приводящей к плазмолизу дрожжей. Такая обработка также требует значительных энергозатрат и сопровождается разрушением части биологически активных компонентов корма.

Известны способы, в которых смешанные культуры молочнокислых и пропионовокислых бактерий используются для переработки вторичного растительного сырья, например барды [6]. В данном известном способе используются штаммы бактерий, отобранные по способности перерабатывать послеспиртовую барду, выращиваемые совместно. Это дает достаточно высокий выход биомассы, но исключает возможность управлять процессом ферментации и составом готового продукта в полной мере.

Наиболее близким к данному изобретению является способ получения белково-витаминного корма, заключающийся в инкубации микроорганизмов на питательной среде с получением корма, богатого протеином и витаминами и содержащего живые клетки молочнокислых и пропионовокислых бактерий [7]. В данном способе получения корма из отходов производств по переработке природного сырья используются штаммы молочнокислых и пропионовокислых бактерий Lactobacillus acidophilus 1660/02, Lactobacillus plantarum 578/25, Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii 103/12, Propionibacterium acnes 1450/28. При этом молочнокислые и пропионовокислые бактерии выращиваются совместно, что не позволяет длительно использовать одну закваску в процессе производства из-за невозможности поддержания чистоты культуры микроорганизмов, их деградации, что приводит к перерождению состава закваски и влияет на состав конечного продукта.

Целью предложенного изобретения является разработка эффективного способа промышленного получения функционального бактериального белкового вещества для кормов длительного хранения, адаптированного к процессу усвоения и перевариваемости по мере прохождения по желудочно-кишечному тракту сельскохозяйственных животных, обогащающего микрофлору желудочно-кишечного тракта животных живыми пробиотическими бактериями. Данный способ можно использовать, в том числе, для переработки растительного и животного сырья и отходов производств, использующих растительное сырье различной сортности, на основе безотходного, экологически чистого, энергосберегающего, стабильного, управляемого экономически рационального процесса.

Раскрытие изобретения

Данное изобретение обеспечивает расширение круга способов получения функциональных белковых кормовых продуктов путем переработки различных видов растительного сырья. Способ предусматривает использование закваски, представляющей собой консорциум пробиотических микроорганизмов. В состав закваски входят штаммы молочнокислых бактерий Lactobacillus reuteri RCAM03194, Lactobacillus salivarius RCAM03193, и пропионовокислых бактерий Propionibacterium freudenreichii subsp. freudenreichii RCAM04257. Данные штаммы входят в состав закваски в различных комбинациях либо парой Lactobacillus- и Propionibacterium в соотношении 0,8:1,2, либо одновременно все штаммы в соотношении L.reuteri:L.salivarius:Pr.freudenreichii subsp. freudenreichii 0,5:0,3:1,2

Штаммы, входящие в закваску, отобраны из штаммов молочнокислых и пропионовокислых бактерий, являющихся естественными обитателями ЖКТ животных, и способны к активному совместному росту в условиях, моделирующих условия ЖКТ животных.

Все указанные штаммы депонированы в Ведомственной коллекции полезных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения Россельхозакадемии (RCAM) г. Пушкин, Санкт-Петербург.

Предложенный способ обеспечивает эффективную переработку углеводсодержащего растительного сырья в функциональное белковое кормовое вещество, содержащее легко доступные сбалансированные по аминокислотному составу белки, живые пробиотические микроорганизмы с целевыми функциональными свойствами, витамины, микро- и макроэлементы, ферментные комплексы, биологически активные компоненты. пребиотики и органические кислоты, являющиеся естественными консервантами полученного продукта.

Предложенный способ получения функционального бактериального белкового кормового продукта включает следующие этапы:

1) Подготовка питательной среды путем ферментативного гидролиза и осахаривания крахмалсодержащего сырья с добавлением хлорида кобальта и диаммоний фосфата и доведения рН до значения 6,5.

2) Подготовка посевного материала для засева, включающая в себя раздельный последовательный пересев каждого из штаммов закваски в малый посевной аппарат, а оттуда в большой посевной аппарат в приготовленную питательную среду. В качестве питательной среды используют среду MRS следующего состава (г/л): пептон из казеина 10,0; мясной экстракт 8,0; дрожжевой экстракт 4,0; глюкоза 20,0; фосфат калия двузамещенный 2,0; твин-80 1,0; аммоний лимоннокислый двузамещенный 2,0; ацетат натрия 5,0; сульфат магния 0,2; сульфат марганца 0,04; вода очищенная - до 1000 мл;

или среду MRS-агар следующего состава (г/л): пептон из казеина 10,0; мясной экстракт 8,0; дрожжевой экстракт 4,0; глюкоза 20,0; фосфат калия двузамещенный 2,0; твин-80 1,0; аммоний лимоннокислый двузамещенный 2,0; ацетат натрия 5,0; сульфат магния 0,2; сульфат марганца 0,04; агар микробиологический - 7,5-14,0; вода очищенная - до 1000 мл.

Отличительной особенностью данного способа является раздельное выращивание компонентов закваски в малых и больших аппаратах, то есть многореакторная схема ведения культуры. При установившемся режиме работы культура поддерживается для следующего цикла путем отъема 10-30 % по объему из большого посевного аппарата текущего цикла в аналогичный посевной аппарат следующего цикла. Выращивание производственной культуры молочнокислых штаммов закваски (Lactobacillus reuteri RCAM03194, Lactobacillus salivarius RCAM03193) ведется 24-48 ч при 37°С, рН 5,5-6,5, пропионовокислых (Propionibacterium freudenreichii subsp. freudenreichii RCAM04257) 24-72 ч при 31-33°С, рН 6,7+0,2 анаэробно, при редком перемешивании.

Многореакторная схемы ведения производственной культуры микроорганизмов имеет ряд преимуществ. В многореакторной схеме ведения культуры по сравнению с однореакторной при кажущейся сложности достигается более стабильный и эффективный процесс раздельного выращивания микроорганизмов с соблюдением оптимальных условий роста для каждой культуры. При достижении максимальной раздельной биомассы путем бесконфликтного объединения биологических сред становится возможным наращивание показателей по протеину в получаемом продукте микробного синтеза. Процесс является более стабильным, контролируемым и менее зависимым от случайных факторов производства.

3) Совместная ферментация питательной среды, подготовленной как указано в пункте 1) с использованием смешанной культуры закваски, содержащей штаммы пропионовокислых бактерий Propionibacterium freudenreichii subsp. freudenreichii RCAM04257 и молочнокислых бактерий Lactobacillus reuteri RCAM03194 и/или Lactobacillus salivarius RCAM03193. Инокулят (закваска) представляет собой содержимое больших аппаратов выращивания, объем вносимого инокулята составляет 10-30% рабочего объема ферментера. Необходимо отметить, что эффективнее сначала вносить молочнокислую составляющую закваски, а через 3-6 ч - пропионовокислую составляющую. Ферментацию ведут до 24 ч при 32-37°С, рН 6,7+0,2, анаэробно, при редком перемешивании.

4) Разделение культуральной жидкости путем глубокого центрифугирования, представляющего собой два последовательных процесса на двух аппаратах. Данный этап является отличительной особенностью предложенного способа. Последовательное применение декантера и сидекантера позволяет максимально извлечь полезные вещества (твердый осадок) из фугата, увеличив производительность процесса по готовому продукту и уменьшив содержание по сухому веществу в растворенном виде. Это позволяет максимально эффективно повторно использовать фугат в основном производстве, снизив показатели потребности элементов, предназначенных для снижения кислотности среды.

5) Двухступенчатая низкотемпературная сушка отделенного твердого осадка. Данный этап также является отличительной особенностью предложенного способа. Для сушки используют последовательное извлечение жидкости на первом этапе с 65% до 25%, на втором этапе с 25% до 10%. Сушка осуществляется при температуре не более 76°С, что обеспечивает высокую и стабильную степень выживаемости полезных бактерий при обеспечении отсутствия обсеменением патогенными и другими вредными микроорганизмами. Жидкость, выделяемая в процессе сушки, также поступает в первичный контур производства для повторного использования. Процесс сушки осуществляется за счет нагревания третьего тела, без контакта с продуктами горения топлива, обеспечивающего создание необходимых температурных условий, что исключает попадание посторонних примесей в высушиваемый материал.

6) Использование фугата в производстве на стадии подготовки питательной среды вместо воды.

Данный способ получения функционального бактериального белкового вещества для кормов представляет собой эффективный стабильный процесс, отличающийся многореакторной схемой выращивания микроорганизмов закваски для совместной ферментации подготовленной питательной среды, глубоким двухступенчатым разделением культуральной жидкости, двухступенчатой низкотемпературной сушкой, сохраняющей жизнеспособность микроорганизмов, и возвращением фугата в производственный процесс. Наличие пропионовокислых бактерий в составе закваски, вырабатывающих в процессе роста пропионовую кислоту, исключает необходимость на заключительном этапе формирования вещества применение плазмолиза и позволяет сохранять высокую степень биологической активности микроорганизмов.

Примеры осуществления изобретения

Пример 1.

В размолотое зерно пшеницы с измельчением 0,8-1.0 мм добавляют воду в соотношении 1:3 при температуре 50-60°С, тщательно перемешивают. Затем вносят 1,4-1,7 ед./г условного крахмала термостабильной альфа-амилазы, выдерживают 55-60 мин при рН 5,8-6,5 и температуре 55-60°С, затем еще 25-35 мин при температуре 85-95°С. Затем охлаждают смесь до 50-55°С, вносят в нее 0,4-0,7 ед./г альфа-амилазы и 5,5-6,5 ед./г условного крахмала глюкоамилазы и выдерживают в течение 35-60 мин до достижения содержания редуцирующих веществ 7-10%. Затем в полученный ферментолизат вводят CoCl₂ до концентрации 1 мг/л.

Подготовленная таким образом питательная среда засевается бактериальными культурами закваски, содержащей штаммы пропионовокислых бактерий Propionibacterium freudenreichii subsp. freudenreichii RCAM04257 и молочнокислых бактерий Lactobacillus reuteri RCAM03194 и/или Lactobacillus salivarius RCAM03193. Культивирование молочнокислого и пропионовокислого компонентов закваски проводится раздельно для каждого компонента и заключается в последовательном выращивании культур сначала в малом посевном аппарате, а затем в большом. Посевным материалом для большого аппарата служит культуральная жидкость малого аппарата. Выращивание производственной культуры молочнокислых штаммов закваски ведется 24-48 ч при 37°С, рН 5,5-6,5, пропионовокислых 24-72 ч при 31-33°С, рН 6,7+0,2 анаэробно, при редком перемешивании. Полученные таким образом бактериальные культуры из больших аппаратов выращивания используются при засеве ферментеров для дальнейшей совместной ферментации. Объем инокулята составляет 10-30% от объема питательной среды в ферментере. Ферментация ведется до 24 ч при 32-37°С, рН 6,7+0,2, анаэробно, при редком перемешивании. Полученный таким образом белковый продукт, содержащий 35-45% протеина, живые пробиотические микроорганизмы, аминокислоты, витамины группы В и Е, микро/макроэлементы, ферментные комплексы, биологически активные компоненты, пребиотики и органические кислоты, может быть использован для отпоя молодняка сельскохозяйственных животных.

Пример 2.

Подготовленную, как указано в пункте 1), питательную среду из ячменя засевают бактериальными культурами закваски, содержащей штаммы пропионовокислых бактерий Propionibacterium freudenreichii subsp. freudenreichii RCAM04257 и молочнокислых бактерий Lactobacillus reuteri RCAM03194 и/или Lactobacillus salivarius RCAM03193 и проводят раздельное выращивание в малых и больших аппаратах по примеру 1. Полученные таким образом культуры используют в качестве посевного материала при засеве ферментера для совместной ферментации. Целесообразно вносить в ферментер сначала молочнокислый компонент инокулята, а через 3-6 ч пропионовокислый компонент. Ферментация ведется в условиях, как и в примере 1. Полученная культуральная жидкость подвергается глубокому двухступенчатому центрифугированию. Твердая фаза подвергается низкотемпературной сушке до влажности конечного продукта 10-12%.

Полученный таким образом белковый продукт, содержащий 35-45% протеина, живые пробиотические микроорганизмы, аминокислоты, витамины, микро/макроэлементы, ферментные комплексы, биологически активные компоненты, пребиотики и органические кислоты, может быть использован в качестве полноценного корма или кормовых добавок для сельскохозяйственных животных, птиц и рыб.

Пример 3.

В послеспиртовую барду добавляют 1,1 мг/л CoCl₂ при 45°С и засевают чистыми культурами закваски, содержащей штаммы пропионовокислых бактерий Propionibacterium freudenreichii subsp. freudenreichii RCAM04257 и молочнокислых бактерий Lactobacillus reuteri RCAM03194 и/или Lactobacillus salivarius RCAM03193, выращенными раздельно (как в примере 1). Инокулят составляет 10-20% от объема питательной среды. Ферментацию проводят при 37-40°С, рН 6,0-6,5 в течение 24 ч при редком перемешивании. По окончании ферментации полученную культуральную жидкость подвергают центрифугированию, как указано в примере 2, с последующей низкотемпературной сушкой до влажности 10-12%. Фильтрат может быть возвращен в технологический цикл производства спирта и переработки послеспиртовой барды. Полученный сухой продукт, содержащий 37-39% белка по с.в., 28% аминокислот по с.в., витамины, микро- и макроэлементы, биологически активные компоненты, органические кислоты, может быть использован при кормлении всех видов животных, птиц, молодняка, для приготовления комбикормов и других кормовых целей.

Пример 4.

Пивную дробину разводят водой в соотношении 1:1, доводят рН до 5,9-6,2, температуру до 58-60°С. Затем вносят 1,4 ед./г условного крахмала альфа-амилазы, выдерживают 55-60 мин, затем еще 55-60 мин при температуре 73-75°С. Затем охлаждают смесь до 50-55°С, последовательно вносят в нее 0,4 ед./г альфа-амилазы и 5,5 ед./г условного крахмала глюкоамилазы и выдерживают при рН 5,0-5,3 в течение 55-60 мин до получения показателя 7-10% редуцирующих веществ. Затем вводят CoCl₂ до концентрации 1 мг/л или CoSO₄ до концентрации 1,1 мг/л.

Полученная смесь используется в качестве питательной среды для раздельного выращивания бактериальных культур закваски, содержащей штаммы пропионовокислых бактерий Propionibacterium freudenreichii subsp. freudenreichii RCAM04257 и молочнокислых бактерий Lactobacillus reuteri RCAM03194 и/или Lactobacillus salivarius RCAM03193. Затем осуществляют ферментации полученной питательной среды, разделение компонентов с последующей двухступенчатой низкотемпературной сушкой отделенного твердого осадка, как и в примере 2. На первой ступени происходит высушивание с влажности 65% до 25%, на второй ступени - с влажности 25% до 7-10%.

Полученный таким образом белковый продукт, содержащий 35-49% протеина по св., аминокислоты 42-44%, живые пробиотические микроорганизмы, витамины, микро- и макроэлементы, ферментные комплексы, биологически активные компоненты, пребиотики и органические кислоты, может быть использован в качестве корма или кормовых добавок для сельскохозяйственных животных, птиц и рыб.

Пример 5.

В крупноразмолотое зерно пшеницы, тритикале, ячменя, кукурузы влажностью 10% добавляется 60% воды по весу и аммоний - фосфатный буфер до конечной концентрации 0,02 М (20 мл 1 м нитратного буфера на 1 литр), а также раствор соли CoCl₂ до концентрации 1 мг/л. Полученная смесь нагревается до 85°С, добавляется препарат термостабильной амилазы в количестве 3 мл/л и в течение 20 минут проводится гидролиз остаточного крахмала. После этого смесь охлаждается до 50°С, добавляется препарат термостабильной β-глюканазы и смеси пентозаназ в количестве 3 мл/л каждого и в течение 1 часа проводится гидролиз смеси. Полученная смесь с содержанием редуцирующих веществ 7-10% используется в качестве питательной среды для раздельного выращивания бактериальных культур закваски, содержащей штаммы пропионовокислых бактерий Propionibacterium freudenreichii subsp. freudenreichii RCAM04257 и молочнокислых бактерий Lactobacillus reuteri RCAM03194 и/или Lactobacillus salivarius RCAM03193. Затем осуществляют ферментацию подготовленной питательной среды комбинированной закваской, проводят центрифугирование и сушку готового продукта, как в примере 4.

Полученный таким образом белковый продукт, содержащий 35-45% протеина, живые пробиотические микроорганизмы, аминокислоты, витамины, микро- и макроэлементы, ферментные комплексы, биологически активные компоненты, пребиотики и органические кислоты, может быть использован в качестве полноценного корма или кормовых добавок для сельскохозяйственных животных, птиц и рыб.

Источники информации

1. WO 0041576 A1, 20.07.2000.

2. KZ 24804 A4, 15.11.2011.

3. US 4401680 A1, 30.08.1983.

4. Е.А. ПОДВЕСКО, Е.П. КАМЕНСКАЯ. Оптимизация условий совместного культивирования propionibacterium freudenreichii и lactobacillus acidophilus. // Технологии и оборудование химической, биотехнологической и пищевой промышленности: материалы VIII Всероссийской научно-практической конференции студентов, аспирантов и молодых ученых с международным участием (20-22 мая 2015 г., г. Бийск) / Алт. гос. техн. ун-т, БТИ. - Бийск: Изд-во Алт. гос. техн. ун-та, 2015. - С. 321-325.

5. RU 2183666 С2, 20.06.2002.

6. RU 2250265 С2, 20.04.2005.

7. RU 2243678 С1, 10.01.2005.

Способ получения функциональной белковой кормовой добавки, включающий: подготовку питательной среды путем ферментативного гидролиза и осахаривания крахмалсодержащего сырья с последующим добавлением хлорида кобальта и диаммоний фосфата и доведения рН до значения 6,5; подготовку посевного материала путем последовательного раздельного пересева штаммов микроорганизмов, входящих в состав комбинированной бактериальной закваски, в малый посевной аппарат, а оттуда в большой посевной аппарат; ферментацию приготовленной питательной среды комбинированной бактериальной закваской; разделение полученной культуральной жидкости путем глубокого центрифугирования, представляющего собой два последовательных процесса на двух аппаратах - декантере и сидекантере, фугат возвращают в производство, а отделенный твердый осадок подвергают двухступенчатой низкотемпературной сушке при температуре не более 76°С с получением готового продукта, при этом используемая закваска содержит штаммы пропионовокислых бактерий Propionibacterium freudenreichii subsp. freudenreichii RCAM04257 и молочнокислых бактерий Lactobacillus reuteri RCAM03194 и/или Lactobacillus salivarius RCAM03193.