Способ измерения концентрации циркулирующих модифицированных липопротеидов низкой плотности в сыворотке крови человека



Владельцы патента RU 2659211:

Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии" (RU)

Изобретение относится к медицине и клинической биохимии и может быть использовано в лабораторной диагностике для определения циркулирующих модифицированных липопротеидов низкой плотности (цмЛПНП) с диагностическими и терапевтическими целями. Способ количественного определения содержания циркулирующих модифицированных липопротеидов низкой плотности в крови больных включает измерение уровня десиалированного апобелка В-100 методом иммуноферментного анализа с использованием агглютинина рицина РКА 120, связывающегося с терминальной галактозой в десиалированном апобелке В-100. 2 пр.

 

Изобретение относится к медицине и клинической биохимии и может быть использовано в лабораторной диагностике для определения циркулирующих модифицированных липопротеидов низкой плотности (цмЛНП) с диагностическими и терапевтическими целями.

Одним из наиболее ранних проявлений атеросклеротического поражения является аккумуляция липидов клетками интимы артерий человека. Показано, что основным источником липидов являются липопротеиды низкой плотности (ЛНП) [1-4]. Обнаруженные в крови человека модифицированные ЛНП (мЛНП), обладающие пониженным, по сравнению с нативными липопротеидами, содержанием сиаловой кислоты, были названы "десиалированными" ЛНП. Именно десиалированные липопротеиды, в отличие от нативных, вызывают аккумуляцию липидов (в частности, эфиров холестерина) в клетках интимы артерий человека и макрофагах, т.е. являются атерогенными [5-6]. К настоящему времени убедительно экспериментально доказано существование в крови человека цмЛНП, обладающих атерогенными свойствами [7-10]. Известно, что цмЛНП содержат апобелок В-100. Этот апопротеин имеет большое сходство с плазминогеном - белком, который участвует в процессе тромбообразования. Большая концентрация цмЛНП с Апо В-100 в крови говорит о значительном риске атеросклеротических поражений. В клетках-потребителях холестерина существуют рецепторы для цмЛНП. Взаимодействие рецепторов с цмЛНП происходит с помощью Апо В-100, после чего цмЛНП путем эндоцитоза поглощается клеткой. Поскольку ЛНП являются также гликопротеинами, в их состав (а именно в состав апобелка В-100) входят также манноза, галактоза, фруктоза, глюкоза, глюкозамин и сиаловая кислота. Десиалирование Апо В-100 осуществляется присутствующей в крови человека транс-сиалидазой, переносящей сиаловую кислоту между гликоконъюгатами липопротеидов, гликопротеидов и ганглиозидов плазмы и клеток крови. Таким образом, учитывая важную патогенетическую роль цмЛНП в атеросклерозе, остается актуальной разработка наиболее информативных и в то же время относительно простых, доступных для клинических лабораторных исследований способов определения цмЛНП. В настоящее время в лабораторной практике недостаточно доступных для рутинных исследований методов определения содержания атерогенных цмЛНП в сыворотке крови человека. Более того, многие предлагаемые способы не учитывают как сложность фракционного состава ЛНП, так и многофакторный, многостадийный характер их модификации, начальным звеном которой является именно процесс десиалирования.

Известен способ определения мЛНП [11], отличающийся тем, что, с целью упрощения определения за счет сокращения числа стадий, супернатант после первого центрифугирования крови инкубируют с красителем. После этого проводят электрофоретическое разделение липидов из фракций крови. Способ включает следующие процедуры: к 1 мл сыворотки крови добавляют 40 мл 8% ПЭГ-6000, инкубируют 1 ч при комнатной температуре и центрифугируют 40 мин при 2800 g. Часть полученного супернатанта повторно центрифугируют 40 мин при 25000 g. Осадок промывают 0,25 мл раствора преципитата после первого и второго центрифугирования и используют для электрофоретического исследования. Разделение проводят в геле агарозы на пластинах, при этом в пробах супернатанта после первого центрифугирования определяют модифицированные липопротеиды высокой плотности, а после второго центрифугирования - модифицированные липопротеиды низкой и очень низкой плотности. Недостатком этого способа являются низкая избирательность метода по отношению как к ЛНП в целом, так и к мЛНП, а также трудоемкость и длительность проведения исследования.

Наиболее интенсивно разрабатываемыми методами определения мЛНП являются иммуноферментные тесты с использованием моноклональных антител к мЛНП [12]. Многостадийность, трудоемкость и длительность иммуноферментного теста, выявление только эпитопов, характерных для искусственно модифицированных ЛНП (неспецифичность), а также высокая себестоимость реагентов затрудняет использование их в рутинных исследованиях.

Известен способ экспресс-определения атерогенности крови [13], который состоит в определении множественно модифицированных липопротеидов низкой плотности (ммЛНП) в плазме крови человека путем обработки ее буфером, содержащим поливинилпирролидон 12600±2700, и последующей визуальной регистрацией помутнения по сравнению с контрольной пробой. Наличие помутнения, обусловленной агрегацией ммЛНП, свидетельствует об атерогенности крови. Недостатком этого способа является то, что он выявляет только ммЛНП, которые быстро элиминируются из кровотока при взаимодействии со скавенджер-рецепторами. К тому же ммЛНП связываются с аутоантителами к ним с образованием иммунных комплексов, которые при ряде условий не агрегируются и поэтому у некоторых больных с тяжелым атеросклерозом данный тест дает отрицательный результат.

Известен способ определения минимально модифицированных липопротеидов низкой плотности (Мм-ЛНП) в сыворотке или плазме крови человека [14], который наиболее близок к заявляемому способу по существенным признакам и был выбран в качестве прототипа. При его применении МмЛНП агрегируют из сыворотки или плазмы крови путем обработки буфером, содержащим поливинилпирролидон (ПВП) с мол. массой 12600±2700, при конечной концентрации ПВП от 11,3% до 14,2% в пробе. После инкубации в течение 10 мин измеряют светопоглощение в опытной и контрольной пробах, вычисляют разность и при величине разности более 10 ЕД констатируют атерогенность крови у обследуемого человека за счет повышенного уровня Мм-ЛНП. Этот способ также на лишен недостатков, указанных выше, акцентирован на анализе окисленных ЛНП и не позволяет определить содержание в крови цмЛНП.

Таким образом, существует потребность в способе определения, который лишен вышеуказанных недостатков и обеспечивает условия для количественного определения цмЛНП в крови человека.

Задача решается новым способом, который включает определение уровня цмЛНП путем измерения уровня десиалированного апобелка В-100 в сыворотке крови твердофазным лектин-иммуноферментным методом (ИФА) с использованием агглютинина РКА 120, связывающегося с терминальной галактозой в десиалированном апобелке B-100.

Описание способа определения уровня цмЛНП в сыворотке крови.

Для определения содержания цмЛНП в качестве связывающих молекул используют иммобилизованный в планшетах для ИФА на пластиковую подложку рицин-агглютинин РКА 120 (лектин, биологический лиганд к десиалированным гликопротеидам). Наносят сыворотку крови человека с титрованием в разведениях от 1:300 до 1:4800 и инкубируют в течение 2 часов. После инкубации планшеты отмывают для удаления несвязавшихся белков и связавшиеся с лектином десиалированные липопротеиды проявляют поликлональными антителами против апоВ-100 человека, конъюгированными с пероксидазой или биотином. Параллельно определяют общее содержание ЛНП в тех же образцах сыворотки крови традиционным методом ИФА, для чего сыворотку крови человека в разведении 1:8000 наносят на иммобилизованные на пластиковую подложку поликлональные антитела к апоВ-100 и связавшиеся с антителами липопротеиды проявляют поликлональными антителами против апоВ-100 человека, конъюгированными с пероксидазой или биотином. Рассчитывают содержание цмЛНП, общих ЛНП, и затем долю цмЛНП в общем пуле ЛНП. При содержании цмЛНП более 18% от общего пула ЛНП выносят суждение о наличии в крови повышенного уровня цмЛНП и, следовательно, о предрасположенности к развитию атеросклероза.

Преимуществом и существенным отличием предлагаемого метода по сравнению с известными аналогами является прямое количественное определение цмЛНП, а также определение их доли в общем пуле ЛНП. Вторым преимуществом и существенным отличием предлагаемого метода по сравнению с известными аналогами является использование галактозо-специфического лектина в качестве связывающих молекул, избирательно взаимодействующих исключительно с десиалированными гликопротеидами, в число которых входит дегликозилированный (десиалированный) апоВ-100, являющийся гликопротеидным компонентом цмЛНП.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами его осуществления.

Пример 1. Было проведено измерение содержания цмЛНП и общих ЛНП в 130 образцах сыворотки крови (63 мужчины в возрасте от 27 до 77 лет и 67 женщин в возрасте от 30 до 85 лет) с использованием описанного способа. Количественная диагностика атеросклероза у участников исследования проводилась методом ультразвукового сканирования сонных артерий в режиме высокого разрешения с последующим выявлением атеросклеротических бляшек в бассейне сонных артерий и измерением толщины интимо-медиального комплекса сонных артерий. По результатам ультразвукового исследования 62 участника исследования были отнесены к группе здоровых лиц, то есть не имели атеросклеротических бляшек в бассейне сонных артерий. К группе больных атеросклерозом, то есть имевших атеросклеротические бляшки в бассейне сонных артерий, были отнесены 68 участников исследования. Среди больных атеросклерозом 35 человек имели клинические проявления атеросклероза в форме ишемической болезни сердца. У здоровых лиц доля цмЛНП в общем пуле ЛНП составила в среднем 12,1% (стандартное отклонение 6,7). У больных атеросклерозом доля цмЛНП в общем пуле ЛНП составила в среднем 27,5% (стандартное отклонение 9,3). Содержание цмЛНП не коррелировало ни с одним из традиционных факторов риска сердечно-сосудистых заболеваний. Эти данные говорят о том, что содержание цмЛНП в сыворотке крови является независимой дискриминантой для диагностики заболеваний атеросклеротического генеза. Методом построения кривых операторского теста было установлено пограничное значение доли цмЛНП в общем пуле ЛНП, которое составило 18% и позволяло наилучшим образом дифференцировать участников исследования по наличию атеросклеротических бляшек в бассейне сонных артерий как инструментального признака атеросклероза.

Пример 2. Была изучена способность нативных ЛНП из крови здоровых доноров вызывать накопление холестерина в первичной культуре моноцитов-макрофагов из крови здоровых доноров. Нативные ЛНП (100 мкг/мл культуральной жидкости) не приводили к увеличению содержания холестерина в клетках. Десиалированные ЛНП, полученные путем обработки нативных ЛНП нейраминидазой, в концентрации 100 мкг/мл культуральной жидкости вызывали 2,4-кратное увеличение содержания холестерина в клетках. Затем исследовали влияние смеси нативных и десиалированных ЛНП (100 мкг/мл культуральной жидкости) на содержание холестерина в клетках при доле десиалированных ЛНП 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25% и 50%. Смеси ЛНП, содержащие 1-15% десиалированных ЛНП, не приводили к увеличению содержания холестерина в клетках. Смеси ЛНП, содержащие 20-50% десиалированных ЛНП, приводили к значимому увеличению содержания холестерина в клетках, и этот эффект был дозозависимым. Методом экстраполяции было установлено пограничное значение доли десиалированных ЛНП в общем пуле ЛНП, при котором смесь ЛНП приобретает способность вызывать накопление в клетках, и это значение составило 18%.

Литература

1. Ohlsson, L. Dairy products and plasma cholesterol levels. // Food. Nutr. Res. - 2010. - 54.

2. Forrester, J.S. Redefining normal low-density lipoprotein cholesterol: a strategy to unseat coronary disease as the nation's leading killer. // J. Am. Coll. Cardiol. - 2010. - Vol. 56. - P. 630-636.

3. Feeman, W.E. Cholesterol guidelines. // Ann. Intern. Med. - 1989. - Vol. 111. - P. 1047-1048.

4. Packard, C.J, Shepherd, J. Low density lipoprotein metabolism. // Prog. Clin. Biol. Res. - 1988. - Vol. 255. - P. 117-123.

5. Tertov V.V., Bittolo-Bon G., Sobenin I.A. et al. Naturally occurring modified low density lipoproteins are similar if not identical: more electronegative and desialylated lipoprotein subtractions. Exp Mol Pathol. 1995; 62(3): 166-172.

6. Tertov V.V., Orekhov A.N., Sobenin I.A. и др. Carbohydrate composition of protein and lipid components in sialic acid-rich and -poor low density lipoproteins from subjects with and without coronary artery disease. J Lipid Res. 1993; 34(3): 365-375.

7. Orekhov A.N., Tertov V.V., Mukhin D.N. Desialylated low density lipoprotein - naturally occurring lipoprotein with atherogenic potency. Atherosclerosis. 1991; 86: 153-161.

8. Harada L.M. Carvalho M.D., Passarelli M., Quintao E.C. Lipoprotein desialylation simultaneously enhances the cell cholesterol uptake and impairs the reverse cholesterol transport system: in vitro evidences utilizing neuraminidase-treated lipoproteins and mouse peritoneal macrophages. Atherosclerosis. 1998; 139(1): 65-75.

9. Harada L.M. Carvalho M.D., Passarelli M., Quintao E.C. Lipoprotein desialylation simultaneously enhances the cell cholesterol uptake and impairs the reverse cholesterol transport system: in vitro evidences utilizing neuraminidase-treated lipoproteins and mouse peritoneal macrophages. Atherosclerosis. 1998; 139 (1): 65-75.

10. Lindbohm N., Gylling H., Miettinen Т.Е., Miettinen T.A. Statin treatment increases the sialic acid content of LDL in hypercholesterolemic. Atherosclerosis. 2000; 151(2): 545-550.

11. Карпов P.C., Канская H.B., 1992. Способ определения модифицированных липопротеидов крови (RU 1720015): СОЮЗ СОВЕТСКИХ СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ РЕСПУБЛИК (я)5 G01N 33/92, ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ ПРИ ГКНТ СССР.

12. Virella G., Derrick MB., Pate V. et al. Development of capture assay for different modification of human low-density lipoprotein // Clinical and Diagnostic Lab. Immunol. - 2005. - V. 12, №1. - P. 68-75.

13. Шойбонов Б.Б., Баронец В.Ю., Панченко Л.Ф., Кубатиев А.А. Способ экспресс-определения атерогенности крови. Патент РФ №2437098 от 20.12.2011 г., Бюл. №35.

14. Шойбонов Б.Б. Способ определения минимально модифицированных липопротеинов низкой плотности в сыворотке или плазме крови человека. Патент РФ №2501013. Официальная публикация патента 10.12.2013.

Способ количественного определения содержания циркулирующих модифицированных липопротеидов низкой плотности в крови больных, при котором методом иммуноферментного анализа измеряется уровень десиалированного апобелка В-100, с использованием агглютинина рицина РКА120, связывающегося с терминальной галактозой в десиалированном апобелке В-100.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к медицинской биотехнологии и может быть использовано в системах водообеспечения длительно функционирующих автономных гермозамкнутых космических и наземных обитаемых объектов.

Изобретение относится к медицинской биотехнологии и может быть использовано в системах водообеспечения длительно функционирующих автономных гермозамкнутых космических и наземных обитаемых объектов.

Изобретение относится к области медицины и молекулярной биологии, а именно к фтизиатрии, и может быть использовано в лабораторной диагностике туберкулеза легких. Способ выделения ДНК клинических изолятов Mycobacterium tuberculosis из ткани легкого заключается в добавлении к образцу ткани легкого, находящемуся в пробирке, содержащей стеклянные шарики, деконтаминирующего лизирующего буфера состава 5 М GuSCN, 100 мМ TRIS HCl рН 8.0, 10 мМ EDTA рН 8.0, 100 мМ NaCl, 0,5% SDS, с последующими центрифугированием и осаждением спиртом.

Изобретение относится к медицине, в частности к гигиене труда, профпатологии и иммунологии. Определяют концентрации IgE, IgA, IgM, IgG в сыворотке крови, фагоцитарную активность лейкоцитов, проводят спонтанный и стимулированный варианты НСТ теста.
Изобретение относится к медицине и может быть использовано для сбора и первичного посева жидкости назального лаважа пациентов с муковисцидозом для проведения микробиологического исследования.

Биосенсор // 2658557
Изобретение может быть использовано для осуществления анализа образца, неинвазивно отобранного из человеческого организма. Биосенсор согласно изобретению содержит вещество-идентификатор, которое связывается с детектируемым веществом, электрод, заряженный зарядом вещества-идентификатора, биосенсор также содержит ингибитор, который подавляет присоединение недетектируемого вещества к по меньшей мере одному из вещества-идентификатора и электрода; причем вещество-идентификатор контактирует с электродом; ингибитор получен из полимерного соединения, содержащего более длинную молекулярную цепь, чем вещество-идентификатор; а на поверхности электрода образуется самособирающийся монослой из вещества-идентификатора и ингибитора; и биосенсор способен детектировать изменение плотности заряда электрода, вызванное связыванием детектируемого вещества с веществом-идентификатором.

Изобретение относится к медицине и экологии. В биосредах человека определяют содержание йода, цинка, никеля, марганца, хрома и свинца.

Изобретение относится к области медицины, в частности онкологии, и раскрывает способ оценки риска рецидивирования рака яичников у пациентов после окончания комбинированной терапии.

Изобретение относится к медицине, а именно к кардиологии, и может быть использовано для прогнозирования риска развития фибрилляции предсердий у женщин с ишемической болезнью сердца.

Изобретение относится к области медицины и представляет собой способ оценки вероятности исходов безэритемной формы иксодового клещевого боррелиоза и сочетанного течения боррелиозно-энцефалитной инфекции, включающий определение значений лабораторных показателей пациента: в остром периоде заболевания в сроки 10-14 дней от начала заболевания – IgM и IgG, в период реконвалесценции в сроки 21-25 дней от начала заболевания – ИЛ-8; отличающийся тем, что оценивают значения лабораторных показателей пациента в баллах: IgM при значении >2,38 г/л – 7 баллов, IgG при значении <4,79 г/л – 32 балла, ИЛ-8 при значении >84,96 пг/л – 12 баллов; иные значения показателей оцениваю как 0 баллов; подсчитывают сумму баллов; при сумме >16 баллов оценивают вероятность развития хронического течения инфекционных заболеваний равной 77,24+0,14%; при сумме ≤16 баллов оценивают вероятность выздоровления равной 85,51+0,04%.

Изобретение относится к медицинской биотехнологии и может быть использовано в системах водообеспечения длительно функционирующих автономных гермозамкнутых космических и наземных обитаемых объектов.

Группа изобретений относится к обнаружению и мониторингу газов и паров в окружающем воздухе. Представлен сенсорный блок для обнаружения газа, снабженный герметичным измерительным каналом, газовым входом для ввода газа в измерительный канал, газовым выходом для вывода газа из измерительного канала и насосным блоком для создания разрежения в измерительном канале, при этом измерительный канал включает в себя датчик газа для обнаружения газа и нагревательный блок для нагревания датчика газа, при этом сенсорный блок выполнен с возможностью эксплуатации в измерительном режиме и в режиме регенерации, и при этом в режиме регенерации в измерительном канале создается разрежение и нагревается датчик газа.

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии и касается нового штамма вируса ящура Aphtae epizooticae типа О сем. Picornaviridae, рода Aphtovirus, депонированного в коллекции штаммов микроорганизмов ФГБУ «ВНИИЗЖ» под регистрационным номером штамм ВЯ О №2311/Забайкальский/2016 (производственный), (контрольный КРС - К-КРС), (контрольный свиной - К-СВ).

Группа изобретений относится к биотехнологии и медицине. Предложены способы прогнозирования ответа субъекта-человека, страдающего, предположительно страдающего раком эндометрия, или с риском развития рака эндометрия, на терапию, включающую ленватиниб или его фармацевтически приемлемую соль (варианты).

Изобретение относится к нагревательному устройству для прибора для измерения методом спектрометрии. Данное нагревательное устройство отличается тем, что оно выполнено в виде мягкого оптического элемента (1), который включает в себя мягкую гибкую опору (10) с верхней стороной (10a) и нижней стороной (10b).
Изобретение относится к области медицины и предназначено для диагностики миелодиспластического синдрома. В мононуклеарных фракциях клеток пациентов определяют экспрессию VEGF-A, VEGFR1 и VEGFR2.

Изобретение относится к области медицины и биологии. Способ выявления у детей ранних нарушений физиологической функции сердца в условиях контаминации фенолом включает отбор пробы крови у ребенка и определение в пробе содержания фенола, отбор пробы буккального эпителия и осуществление выделения из указанной пробы дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), генотипирование полиморфизма генов MTHFR и SULTIAI, исследование генотипов гена MTHFR С677Т (rs1801133) и гена SULTIAI G2663A (rs9282861), при одновременном выполнении следующих условий: наличие вариантного гомозиготного или гетерозиготного генотипов гена MTHFR С677Т (rs1801133) и гена SULTIAI G2663A (rs9282861), и при превышении концентрации фенола в крови выше фонового уровня более чем в 1,5 раза, диагностируют у ребенка наличие ранних нарушений физиологической функции сердца в виде функциональной кардиопатии, связанной с контаминацией фенолом.
Изобретение относится к иммунологии, вирусологии, биотехнологии и лабораторной диагностике в медицине и может быть использовано для диагностики параметров врожденного иммунитета и при различных заболеваниях инфекционной (вирусной, бактериальной, грибковой) и неинфекционной (аллергической, аутоиммунной, онкологической) этиологии.

Изобретение относится к области медицины и предназначено для прогнозирования наличия хромосомных аномалий в эмбрионах удовлетворительного и плохого качества в программе экстракорпорального оплодотворения (ЭКО).

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к способу детекции комплекса Mycobacterium tuberculosis. Способ детекции комплекса Mycobacterium tuberculosis, включает иммунологический анализ специфического для комплекса Mycobacterium tuberculosis белка, где внеклеточную секрецию указанного белка осуществляют посредством термической обработки биологического образца, содержащего комплекс Mycobacterium tuberculosis, при 45-50°C в течение от 15 до 60 минут.

Изобретение относится к гигиене труда и медицине, в частности к способам оценки эффективности проведенных медико-профилактических мероприятий по снижению профессионального риска здоровью, обусловленного артериальной гипертензией (АГ) у работников, занятых на выполнении подземных горных работ. Способ включает определение в пробе крови группы работников до и после проведения медико-профилактических мероприятий лабораторных показателей: уровня малонового диальдегида, антиоксидантной активности, содержания липопротеинов высокой плотности, гомоцистеина; индекса атерогенности; определение состояния эндотелия сосудов через установление степени снижения прироста диаметра плечевой артерии, сопоставление показателей с физиологической нормой и отнесение их к профессионально обусловленным, если они характеризуются RR>1,5 и EF>33%, произведение расчета профессионального риска здоровью до мероприятий и после мероприятий, установление снижения риска в процентах, по которому судят о степени эффективности проведенных мероприятий. 3 табл., 1 пр.

Изобретение относится к медицине и клинической биохимии и может быть использовано в лабораторной диагностике для определения циркулирующих модифицированных липопротеидов низкой плотности с диагностическими и терапевтическими целями. Способ количественного определения содержания циркулирующих модифицированных липопротеидов низкой плотности в крови больных включает измерение уровня десиалированного апобелка В-100 методом иммуноферментного анализа с использованием агглютинина рицина РКА 120, связывающегося с терминальной галактозой в десиалированном апобелке В-100. 2 пр.

Наверх