Фармацевтическая композиция для пассивной иммунизации против бешенства, фармацевтический набор, способ применения фармацевтического набора

Группа изобретений относится к медицине, а именно к иммунологии, и может быть использована для получения фармацевтического набора для пассивной иммунизации против бешенства. Фармацевтический набор, помещенный в приемлемую упаковку, включает: 1) фармацевтическую композицию, содержащую вируснейтрализующие антирабические однодоменные антитела в эффективном количестве и фармацевтически приемлемый буферный раствор до 1 мл, при этом вируснейтрализующие антирабические однодоменные антитела имеют аминокислотную последовательность SEQ ID NO.1; причем эффективной дозой вируснейтрализующих антирабических однодоменных антител является доза - не менее 150 ME активности, в лиофилизированном виде; 2) фармацевтическую композицию, содержащую рекомбинантные псевдоаденовирусные частицы, несущие ген вируснейтрализующих антирабических однодоменных антител в эффективном количестве, фармацевтически приемлемый буферный раствор до 1 мл; при этом рекомбинантные псевдоаденовирусные частицы, несущие ген вируснейтрализующих антирабических однодоменных антител, имеют нуклеотидную последовательность генетической вставки SEQ ID NO.3, и эффективная доза рекомбинантных псевдоаденовирусных частиц, несущих ген вируснейтрализующих антирабических однодоменных антител, составляет не менее 5×108 БОЕ в 1 мл фармацевтически приемлемого растворителя; 3) инструкцию для введения этого фармацевтического набора. Группа изобретений относится также к применению фармацевтического набора для пассивной иммунизации против бешенства. Использование данной группы изобретений позволяет проводить экстренную профилактику бешенства путем пассивной иммунизации с использованием полученных фармацевтических композиций, действие которых начинается с 6 часов введения в организм и продолжается до 7 дней. 2 н.п. ф-лы, 12 пр., 4 табл., 6 ил.

 

Область техники

Настоящее изобретение относится к области вирусологии, иммунологии, биотехнологии и медицины. Предложенная фармацевтическая композиция для пассивной иммунизации против бешенства, нейтрализующая вирус бешенства, позволяет обеспечить эффективную экстренную постэкспозиционную профилактику бешенства у покусанных животными людей.

Предшествующий уровень техники

Бешенство - остропротекающее инфекционное заболевание животных и человека, вызываемое вирусом бешенства Rabies virus, относящегося к роду Lyssavirus семейства Rhabdoviridae. Бешенство встречается более чем в 150 странах и территориях и, по оценке ВОЗ, входит в пятерку инфекционных зоонозов, наносящих наибольший экономический ущерб. Ежегодно в мире от бешенства умирают 45-60 тысяч человек, в основном, в Азии и Африке.

Источником вируса бешенства являются больные животные (лисицы, волки, собаки, летучие мыши, кошки, крысы, домашний скот и другие теплокровные). В организм человека вирус бешенства может проникать при укусе больного животного, чаще всего бродячими или домашними собаками и кошками, и попадании слюны на кожу, пораженную микротравмами. В редких случаях возможно заражение при вдыхании аэрозолей, содержащих вирус или при трансплантации инфицированного органа [11].

В подавляющем большинстве случаев смерти людей от бешенства источником инфекции являются собаки (99%). Около 10 миллионов людей, получивших повреждения от животных, обращаются за антирабической помощью, при этом 40%, подвергшихся укусам бешеных животных, составляют дети в возрасте до 15 лет [11]. Например, в странах Азии и Африки постконтактная профилактика помогает предотвратить 330304 смертей [10].

В России, по данным Роспотребнадзора, ежегодно за антирабической помощью обращается около 400 тысяч человек (в среднем 300,0 на 100 тысяч населения), из них около 250 тысяч человек нуждаются в проведении специфического лечения. Доля детей до 17 лет, пострадавших от укусов животными, остается постоянной и составляет 28-30% ежегодно. В 2015 г. количество человек, обратившихся по поводу нападений и укусов животными, составило 392586, из них дети до 17 лет - 114622. При этом от диких животных пострадали 9950 человек.

По ориентировочным расчетам экспертов Роспотребнадзора, в 2015 г. экономический ущерб для страны от укусов, ослюнения, оцарапывания животными составил 3542144,2 тыс. руб. В 2015 г. в 5 субъектах Российской Федерации (Липецкая, Ярославская, Владимирская, Нижегородская области и Ставропольский край) было зарегистрировано 6 случаев бешенства (в 2014 г. - 3, в 2013 г. - 6), в т.ч. один - у ребенка в возрастной группе от 3 до 6 лет

К сожалению, до настоящего времени эффективных средств и методов лечения уже развившегося заболевания бешенством еще не разработано. Однако даже после контакта с подозрительным животным медицинские специалисты все-таки могут надежно предотвратить заболевание бешенством с помощью особой методики, называемой «постэкспозиционная профилактика» (или экстренная, ПЭП). Возможность ее осуществления основана на длительном инкубационном периоде, во время которого после введения антирабических препаратов вырабатывается иммунитет и заболевания человека бешенством не происходит.

Инкубационный период является особенностью патогенеза бешенства и составляет в среднем 1-3 месяца, но иногда встречается менее 1 недели или более одного года [11]. Близость места проникновения вируса к центральной нервной системе увеличивает вероятность более короткого инкубационного периода. Так, наиболее короткий инкубационный период наблюдается при укусах лица и головы, а наиболее длительный - при укусах нижних конечностей и туловища. Предполагаемая скорость миграции вируса составляет 15-100 мм в день [17].

Таким образом, исходя из знаний патогенеза, важнейшим условием эффективной постэкспозиционной профилактики является ее незамедлительное начало и соблюдение схем введения препаратов укушенному человеку, благодаря чему можно предотвратить наступление симптомов заболевания и смертельный исход.

Согласно позиции ВОЗ основными компонентами постэкспозиционной профилактики являются:

- курс иммунизации мощной и эффективной вакциной против бешенства, отвечающей рекомендациям ВОЗ,

- при наличии показаний (контактах II и III категорий) введение антирабического иммуноглобулина (пассивная иммунизация) [11].

При проведении вакцинации для индукции гуморального ответа требуется время, что не отвечает требованиям экстренности при осуществлении постэкспозиционной профилактики бешенства. Поэтому в схему ПЭП и добавляется введение антирабического иммуноглобулина, действие которого наступает практически с момента введения, так как препарат содержит готовые антирабические антитела.

Используемые схемы ПЭП включают антирабический иммуноглобулин (АИГ), который применяется при всех контактах категории III и контактах категории II (у лиц с иммунодефицитом). При контактах категории III пациенту вводят АИГ в рану или вокруг нее и 4-5 доз вакцины.

Под контактами подразумеваются:

- Категория II - мелкие укусы непокрытых участков кожи, незначительные царапины или ссадины без кровотечения, ослюнение поврежденных кожных покровов;

- Категория III - укус или царапина или множественные укусы или царапины с повреждением кожи, попадание слюны животного на слизистые оболочки, контакт с летучими мышами [10].

В отношении контактов категорий II и III рекомендуемый лечебно-профилактической курс предусматривает введение 5 доз антирабической вакцины в дни 0, 3, 7, 14 и 28 курса постэкспозиционной профилактики. Антирабический иммуноглобулин для пассивной иммунизации вводится лишь единожды, предпочтительно к началу иммунизации (в день 0) или, по возможности, сразу после ее начала. ВОЗ обращает особое внимание на то, что после 7-го дня применение АИГ не показано, поскольку предполагается, в организме выработались активные антитела в ответ на антирабическую вакцину [5, 8].

Важнейшим моментом, определяющим защиту от бешенства после иммунизации, является наличие минимального защитного титра антирабических антител. Согласно рекомендациям ВОЗ минимальный титр антирабических антител в сыворотке крови иммунизированного должен составлять 0,5 МЕ/мл (определяется в тесте быстрого ингибирования фокусов флуоресценции (RFFIT) или в реакции нейтрализации вируса флюоресцентными антителами (FAVN)).

Существующие в настоящее время препараты антирабических иммуноглобулинов основаны на использовании сывороток человеческого или животного происхождения, содержащих высокий титр специфичных к вирусу бешенства иммуноглобулинов. Рекомендуемая доза антирабического человеческого (гомологичного) иммуноглобулина составляет 20 МЕ/кг массы тела, а лошадиного (гетерологичного) иммуноглобулина антирабического - 40 МЕ/кг массы тела [16].

Известен препарат лошадиного (гетерологичного) антирабического иммуноглобулина (Патент РФ 2339401) для внутривенного и внутримышечного введения, в котором в качестве исходного сырья используют высокоспецифичную антирабическую сыворотку, полученную от иммунизации животных-продуцентов очищенным вирусом бешенства, выращенным на культуре клеток Vero или ПСХ. Содержание γ-глобулиновой фракции в препарате составляет не менее 90%, молекулярно-массовое распределение: агрегаты не более 1,0%, димеры и мономеры менее 10,0%, F(ab)2-фрагменты не менее 84,0%, Fab- и Fc-фрагменты менее 5,0%, низкая антикомплементарная активность, специфическая активность не менее 150 МЕ/мл. Осмолярность готового препарата находится в пределах 250-350 мОсм/кг. Изобретение обеспечивает получение высокоочищенного гетерологичного антирабического иммуноглобулина, стабильного при хранении и транспортировке.

Описанный аналог имеет существенный недостаток, не позволяющий считать гетерологичный (лошадиный) иммуноглобулин предпочтительным препаратом при осуществлении постэкспозиционной профилактики бешенства. Являясь чужеродным белком для организма человека, гетерологичный антирабический иммуноглобулин реактогенен, может вызывать тяжелые аллергические реакции, в том числе анафилактический шок и сывороточную болезнь.

Лишены вышеуказанных недостатков человеческие (гомологичные) иммуноглобулины.

Известен человеческий антирабический иммуноглобулин высокой степени очистки (патент CN 101450967A «High-purity rabies human immunoglobulin and raw material production method thereof» - Антирабический человеческий иммуноглобулин высокой степени очистки и сырье для его получения, методы использования).

Данное техническое решение, как наиболее близкое к заявляемому по составу действующего вещества и способу его использования выбрано авторами настоящего изобретения за прототип.

Полученный по такому способу препарат характеризуется тем, что содержание иммуноглобулина составляет более 98% от общего содержания белка; титр антирабических антител - равен или больше, чем 150 МЕ/мл, содержание белка - меньше, чем 120 г/л. При этом содержание мономера и димера иммуноглобулина Ig G составляет более чем 99%. Процесс получения такого иммуноглобулина достаточно трудоемок и включает несколько этапов: 1) подготовка сырья на основе крови с титром антирабических антител 10 МЕ/мл крови; 2) фракционирование холодным этанолом, очистка; 3) ионообменная хроматография; (4) инактивация вирусов инкубацией при низком pH; (5) мембранная фильтрация для удаления вирусов; (6) ультрафильтрация, дозирование, стерилизация.

Представленный прототип имеет существенные недостатки из-за содержания в своем составе человеческих иммуноглобулинов.

- антирабические глобулины из сыворотки крови человека является дефицитным и дорогим препаратом, требуются иммунизированные люди-доноры;

- так как препарат получают из крови доноров, не исключена потенциальная возможность контаминации инфекционными агентами;

- пассивные антирабические антитела снижают эффективность антирабической вакцины, что может привести к заболеванию бешенством и, в конечном итоге, к смерти человека.

Известно, что присутствие пассивных антирабических антител на срок более 7 суток в крови иммунизированного иммуноглобулином снижает эффективность вакцинации из-за наличия тормозящего действия пассивных антител на образование активных антител [18]. Данные свидетельствуют, что образование активных антител происходит уже на 7 день после введения вакцины [1, 2], а время полувыведения человеческого антирабического иммуноглобулина составляет около 21 дня [3].

- из-за наличия тормозящего эффекта классических антител на индукцию вакцинных, не допускается введение иммуноглобулинов позднее 7 суток после предыдущей антирабической вакцинации, что является прямым противопоказанием к введению иммуноглобулинов покусанному пациенту, если ему менее чем за 7 суток до инцидента была введена вакцина с профилактической целью [5, 8];

- вируснейтрализующие действие человеческих антирабических иммуноглобулинов реализуется медленнее, в течение 24 часов с пиком на 2-13 день, по сравнению с однодоменными антителами, концентрация которых достигает пика на 4-й час после внутримышечного введения [9].

На сегодняшний день в России для экстренной профилактики бешенства применяются всего два типа препаратов - лошадиный (гетерологичный) антирабический иммуноглобулин, а также человеческий (гомологичный) импортного производства. Оба препарата применяются достаточно давно и имеют определенные недостатки. Исходя из современного уровня техники, очевидна необходимость в разработке инновационных препаратов для экстренной профилактики бешенства, способных нейтрализовывать вирус бешенства и заменить классические антирабические иммуноглобулины в стандартной схеме лечебно-профилактической иммунизации.

Раскрытие изобретения

Задача заявляемого изобретения направлена на создание препарата для быстрой нейтрализации вируса бешенства в организме зараженного человека, безопасного и не снижающего эффективность антирабической вакцины в схеме экстренной постэкспозиционной профилактики бешенства.

Техническая задача решается за счет того, что создана фармацевтическая композиция для пассивной иммунизации против бешенства, в виде лиофилизатов во флаконах и раствора для инъекций, помещенных в приемлемую упаковку, включающая вируснейтрализующие антирабические однодоменные антитела и рекомбинантные псевдоаденовирусные частицы, несущие ген вирус-нейтрализующих антирабических однодоменных антител в фармакологически эффективных дозах.

Вируснейтрализующие антирабические однодоменные антитела имеют аминокислотную последовательность SEQ ID NO.1.

Эффективной дозой вирус-нейтрализующих антирабических однодоменных антител является доза - не менее 150 ME активности, в лиофилизированном виде.

Рекомбинантные псевдоаденовирусные частицы, несущие ген вирус-нейтрализующих антирабических однодоменных антител имеют нуклеотидную последовательность генетической вставки SEQ ID NO.3.

При этом эффективная доза рекомбинантных псевдоаденовирусных частиц, несущих ген вирус-нейтрализующих антирабических однодоменных антител составляет не менее 5×108 акт.ед. в 1 мл фармацевтически приемлемого растворителя.

Фармацевтический набор для пассивной иммунизации против бешенства, помещенный в приемлемую упаковку, включает фармацевтическую композицию в виде лиофилизатов во флаконах и раствора для инъекций, содержит вирус-нейтрализующие антирабические однодоменные антитела и рекомбинантные псевдоаденовирусные частицы, несущие ген вируснейтрализующих антирабических однодоменных антител в фармакологически эффективных дозах и инструкцию для одновременного администрирования компонентов этого фармацевтического набора.

Способ применения фармацевтического набора для пассивной иммунизации против бешенства заключается в следующем: лиофилизат вирус-нейтрализующих антирабических однодоменных антител восстанавливают путем смешивания лиофилизата с фармацевтически приемлемым растворителем, затем вводят субъекту, инфицированному вирусом бешенства, в дозе не менее 20 МЕ/кг, сразу после этого вводят рекомбинантные псевдоаденовирусные частицы, несущие ген вирус-нейтрализующих антирабических однодоменных антител - не менее 5×108 акт.ед. в растворителе.

Из литературных данных известно, что лишены указанных в прототипе недостатков, свойственных традиционным иммуноглобулинам, препараты рекомбинантных однодоменных антител, полученных на основе антител животных семейства Верблюдовых. Данные антитела состоят из димера только одной укороченной (без первого константного района CH1) тяжелой цепи иммуноглобулина и полнофункциональны в отсутствие легкой цепи иммуноглобулина. Для специфического узнавания и связывания антигена при этом необходим и достаточен лишь один вариабельный домен этого антитела. Известен пример использования рекомбинантного однодоменного антитела для специфического связывания и нейтрализации вируса бешенства с высокой эффективностью in vitro (патент РФ №2533802 C1 «Trimerised single - domain antibody that specifically binds with glycoprotein G of rabies virus, neutralizing rabies virus» - «Тримеризованное однодоменное антитело, специфически связывающееся с гликопротеином G вируса бешенства, нейтрализующее вирус бешенства»).

Полным эквивалентом термина «однодоменное антитело» является вошедшее в широкое употребление обозначение «нанотело», «NANOBODY», а также «наноантитело» и «однодоменное наноантитело».

Преимуществами рекомбинантных однодоменных антител по сравнению с прототипными классическими иммуноглобулинами являются:

1) Наличие высокоэффективного способа генерирования и селекции, для получения препаратов однодоменных антител не нужны люди-доноры.

2) Малый размер, ~2×4 нм, 13-15 кДа, позволяет в отличие от классических антител проникать в нервные клетки, которые являются местом локализации вируса бешенства. Однодоменные антитела способны находиться в нервной ткани в эффективной концентрации и нейтрализовать там вирус бешенства, что крайне важно при покусах вблизи головы, когда время для проникновения вируса сокращено и он может ускользать от воздействия классических антител, находящихся в других тканях кроме нервной.

3) Отсутствие тормозящего влияния на образование активных (вакцинных) антител, так как выведение организмом однодоменных антител осуществляется ранее 7 дней и не накладывается на период их индукции.

4) Отсутствие тормозящего влияния на индукцию вакцинных антител также происходит за счет отсутствия Fc фрагмента у однодоменных антител, что позволяет вводить их недавно вакцинированным с профилактической целью людям, даже позднее 7 дней после вакцинации.

5) При введении препаратов однодоменных антител экспериментальным животным (или пациентам) противовирусное действие оказывается немедленно, в отличие от классических антител, максимальная концентрация которых наблюдается только через 2-3 дня [15, 6, 13]. Это отличие позволяет однодоменным антителам быстрее реализовывать вируснейтрализующую функцию в организме инфицированного, что невероятно важно при осуществлении экстренной профилактики бешенства.

6) Структурные особенности (способность образовывать необычные для классических антител паратопы, позволяющие связываться с углублениями и активными центрами белков); могут использоваться для выявления «скрытых» эпитопов или эпитопов, которые не могут быть узнаны существенно более крупными обычными антителами.

7) Высокая растворимость и стабильность (в широком диапазоне температур и кислотности среды) позволяет разрабатывать различные решения готовых лекарственных форм.

8) Высокий экспрессионный выход, экономичность наработки в больших количествах. Обычно однодоменные антитела нарабатывают в периплазме бактерий E. coli (в количестве 1-10 мг из 1 литра культуры). Продемонстрирована возможность их эффективной наработки в дрожжах, растениях и клетках млекопитающих.

9) Простота всевозможных генно-инженерных манипуляций, адаптаций для конкретных задач, возможность создания многовалентных и многофункциональных производных.

10) Низкая иммуногенность; возможность экономично «гуманизировать» антитела без заметной потери их специфической активности.

Будучи высокоэффективными препаратами, однодоменные антитела однако имеют короткое время жизни в организме (не более 2-4 дней), что не позволяет использовать препарат антирабических антител в схеме ПЭП бешенства в качестве замены классическим иммуноглобулинам. Повторные инъекции однодоменных антител удорожают курс иммунизаций, требуют трудозатрат медперсонала, многократных посещений клиники пациентом и травмирование мышцы в месте введения. Для увеличения периода действия препарата на основе однодоменных антител предложено пролонгировать их действие за счет использования рекомбинантного аденовируса, обеспечивающего постоянный синтез антирабических антител непосредственно в клетках организма. Однократное введение данного препарата снижает стоимость проводимой ПЭП, (не требуется производство и введение готовых антител, они нарабатываются самим организмом), многократные инъекции заменяются однократным введением препарата рекомбинантных псевдоаденовирусных частиц в 0 день курса. Период продукции ими целевого белка составляет несколько дней и хорошо вписывается в общую схему экстренной профилактики бешенства, так как присутствует в организме вплоть до образования вакцинных антител. Подобный подход по успешному пролонгированию действия белкового препарата рекомбинантными псевдоаденовирусными частицами был описан в Патенте РФ №2488406 (Фармацевтическая композиция для терапии острых токсических состояний). Безопасность и эффективность данного типа векторов доказана в ходе целого ряда доклинических и клинических испытаний, проводимых во всем мире, в том числе и в России [14]. Кроме того, на сегодняшний момент разработаны быстрые и гибкие технологии получения данного типа векторов, позволяющие реализацию масштабного производства различных терапевтических средств на их основе (Заявка на патент РФ 2012107702; Патент РФ 2219241). Особенно важной способностью является возможность поддержания эффективной концентрации антирабических однодоменных антител прямо в нервной ткани за счет проникновения аденовирусного вектора и экспрессии генов однодоменных антител [7].

Исходя из вышесказанного, авторы предложили в качестве средства для экстренной профилактики бешенства фармацевтическую композицию для пассивной иммунизации против бешенства, в виде лиофилизатов во флаконах и раствора для инъекций, помещенных в приемлемую упаковку, включающая вирус-нейтрализующие антирабические однодоменные антитела (Препарат 1), специфичные к гликопротеину G вируса бешенства (действует с 0,5 часов вплоть до 12 часов) и рекомбинантные псевдоаденовирусные частицы, несущие ген вирус-нейтрализующих антирабических однодоменных антител в фармакологически эффективных дозах (Препарат 2), действие которых начинается с 6-ти часов после введения в организм и продолжается вплоть до 7 дней.

Способ получения фармацевтической композиции для пассивной иммунизации против бешенства для экстренной постэкспозиционной профилактики бешенства включает следующие принципиальные этапы:

1) Получение препарата антирабических однодоменных антител (Препарат 1) путем получения библиотеки вариабельных доменов неканонических одноцепочечных антител, селекции однодоменных антител, специфически узнающих вирус бешенства (гликопротеин G), их тримеризация (модификация, форматирование) и дальнейшая их наработка в Е.coli (штамм BL21), с активностью в готовой форме Препарата 1 от 150 до 250 ME на флакон.

2) Получение препарата рекомбинантных псевдоаденовирусных частиц, несущих ген вирус-нейтрализующих антирабических однодоменных антител (Препарат 2) путем конструирования рекомбинантной псевдоаденовирусной частицы, несущей ген вирус-нейтрализующего антирабического однодоменного антитела и их получения с активностью в готовой форме Препарата 2 от 5×108 до 5×109 БОЕ /мл (доза).

3) Компоновка готового фармацевтического набора для пассивной иммунизации против бешенства, помещенный в приемлемую упаковку, включающего фармацевтическую композицию в виде лиофилизатов во флаконах и раствора для инъекций, содержащую вирус-нейтрализующие антирабические однодоменные антитела (Препарат 1) и рекомбинантные псевдоаденовирусные частицы, несущие ген вирус-нейтрализующих антирабических однодоменных антител (Препарат 2) в фармакологически эффективных дозах и инструкцию для одновременного администрирования компонентов этого фармацевтического набора.

4) Готовый фармацевтический набор для пассивной иммунизации против бешенства комплекта препаратов для экстренной профилактики бешенства, состоит из препаратов 1 и 2. Количество флаконов препарата 1 регулируется требуемой эффективностью, и может состоять из 9 флаконов с активностью от 150 до 250 ME на флакон, или меньшим количеством флаконов с увеличением активности и объема флаконов, например 300-500 ME на флакон; или 1500-5000 ME на флакон, но не ограничивается указанными вариациями. Препарат 1 представлен в виде лиофилизата. Препарат 2 входит в состав комплекта в виде раствора в количестве 1 флакон объемом 1 см3.

5) Способ применения фармацевтического набора для пассивной иммунизации против бешенства заключается в следующем: лиофилизат вирус-нейтрализующих антирабических однодоменных антител восстанавливают путем смешивания лиофилизата с фармацевтически приемлемым растворителем, затем вводят субъекту, инфицированному вирусом бешенства, в дозе не менее 20 МЕ/кг, сразу после этого вводят рекомбинантные псевдоаденовирусные частицы, несущие ген вирус-нейтрализующих антирабических однодоменных антител - не менее 5×108 акт.ед. в растворителе.

Каждый из препаратов обладает рядом положительных свойств.

Полученные по изобретению антирабические однодоменные антитела характеризуются следующими улучшенными свойствами [13]: 1) Наличие отработанного заявителем способа получения и селекции однодоменных антител, в основе которого лежит получение нуклеотидных последовательностей генов неканонических антител животных семейства верблюдовых (Camelidae); 2) Возможность экономичной наработки в больших количествах, так как продуцентом является бактерия E.coli, что говорит о промышленной применимости изобретения; 3) Биологическая безопасность антител, так как культура бактерии E.coli не может контаминироваться патогенами эукариотов; 4) Низкая иммуногенность, так как однодоменное антитело состоит только из вариабельного фрагмента тяжелой цепи, ответственного за связывание с антигеном и не содержит других доменов, на которые образуются нежелательные иммунные реакции; 5) Однодоменные антитела имеют улучшенную проницаемость в клетки, в том числе нервные, за счет малого размера (~2×4 нм, 13-15 кДа), что очень важно при инфицировании вирусом бешенства; 6) Отсутствует влияние на вакцинный иммунный ответ, что повышает эффективность антирабической вакцинации в составе ПЭП; 7) Высокая растворимость и стабильность (в широком диапазоне температур и кислотности среды) позволяет готовить на их основе однодоменных антител препараты для медицинского применения; 8) Возможность пролонгирования действия за счет применения рекомбинантных аденовирусных частиц со вставкой гена антирабических однодоменных антител, экспрессирующих трансген непосредственно в организме пациента.

Основным преимуществом применения препарата 2 на основе рекомбинантных псевдоаденовирусных частиц является пролонгирование наработки в организме и поддержание протективного уровня однодоменных антител, начиная с 6 часов до 7-ми дней после инъекции препарата 2 в организм. Такой эффект достигается путем того, что введение рекомбинантных псевдоаденовирусных частиц, несущих ген антирабических вируснейтрализующих мини-антител приводит к экспрессии гена антирабического однодоменного антитела непосредственно в клетках организма, в связи с чем не требуются дополнительные инъекции препарата однодоменных антител для поддержания эффективной концентрации однодоменных антител в организма, в том числе в нервной ткани [7].

Описание фигур

На фиг. 1

SEQ ID NO: 1 - аминокислотная последовательность отобранного тримеризованного однодоменного антитела, способного специфически связывать и нейтрализовать вирус бешенства.

SEQ ID NO: 2 нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность тримеризованного однодоменного антитела, способного специфически связывать и нейтрализовать вирус бешенства.

В указанной последовательности SEQ ID NO: 1 выделены жирным и подчеркнуты соответственно (слева направо, от N- к C-концу) гипервариабельные участки CDR1, CDR2 и CDR3, которые являются определяющими (особенно важен CDR3) для специфического узнавания данным однодоменным антителом поверхностного белка вируса бешенства. В аминокислотной последовательности выделены (серым цветом) также два остатка цитозина, которые, исходя из многих предшествующих структурных исследований подобных молекул, могут образовывать дополнительную неканоническую Cys- Cys-связь и таким образом существенно стабилизировать структуру антитела. Добавленные при модификации (адаптации) исходного полученного однодоменного антитела последовательности содержат линейный участок (линкерный район, соответствующий длинному шарнирному участку особого верблюжьего антитела («hinge», h) без цистеиновых остатков, принципиально важный для усиления нейтрализующей вирус функции тримеризующийся домен (вариант мотива «лейциновой молнии», ILZ, выделен серым цветом), а также (на самом конце) участки, кодирующие два олигопептидных тага: HA-таг и (His)6-таг. На конце находится терминирующий кодон TAA (в аминокислотной последовательности ему соответствует звездочка).

На фиг. 2

Представлены данные анализа очищенного тримеризованного однодоменного антитела, специфически связывающегося с вирусом бешенства, с помощью электрофореза по Лэммли в разделяющем 14% полиакриламидном геле в денатурирующих и восстановительных условиях (с додецилсульфатом натрия, SDS, и с дитиотреитолом, ДТТ). В левой дорожке нанесен маркер молекулярного веса.

Тримеризованное однодоменное антитело было наработано в периплазме бактерий и затем почищено (в том числе с помощью аффинной металл-хелатной хроматографии и последующей гель-фильтрационной хроматографии) до практически индивидуально белкового продукта, мигрирующего в геле в зоне белков размером примерно 28 кДа (реальный размер - примерно 23,4 кДа; антитело движется в геле замедленно вследствие особенностей структуры, в частности из-за наличия концевых положительно заряженных шести остатков гистидина (His-таг)).

На фиг. 3

Показан профиль гель-фильтрационной хроматографии очищенного тримеризованного однодоменного антитела, пропущенного через колонку Sephacryl S-100 HR 1.5x50 в стандартном буферно-солевом растворе PBS (в нормальных физиологических условиях без денатурации). Белки с известным молекулярным весом были использованы как маркеры: Бычий сывороточный альбумин, БСА - 67 кДа; Овальбумин, ОВА - 45 кДа; Лизоцим, ЛЦ - 14,4 кДа. Препарат антитела элюируется во фракциях, соответствующих тримеризованному антителу.

На фиг. 4

Проиллюстрированы результаты иммуноферментного анализа (ИФА) связывания созданного антирабического однодоменного антитела с иммобилизованным в лунке планшета препаратом белка гликопротеина G вируса бешенства.

Антиген (гликопротеини G) иммобилизовали в лунках в объеме 50-100 мкл из раствора (в PBS) с концентрацией примерно 5 мкг/мл. Проверяемое мини-антитело использовали в разведениях кратных 4 (1:4), начиная с 40 мкг/мл (1) и заканчивая примерно 40 нг/мл (6). В одном из контролей использовали лунку без первичного антитела (7). В области наиболее достоверного анализа активности антитела, в лунке (4), где использовали мини-антитело в концентрации примерно 0,6 мкг/мл. результирующая оптическая плотность при 405 нм была около 0,85 о.е.

На фиг. 5

Представлен SEQ ID NO: 3 - нуклеотидная последовательность экспрессирующей кассеты рекомбинантной псевдоаденовирусной частицы (РПАН), несущая ген тримеризованного вирус-нейтрализующего антирабического однодоменного антитела Б3. Дополнительными элементами конструкции являются ATG - старт-кодон, igk leader - лидерный пептид, осуществляющий транспорт наработанного пептида из клетки, hinge-ILZ-HA таг - линейный участок (линкерный район, соответствующий длинному шарнирному участку особого верблюжьего антитела («hinge», h) без цистеиновых остатков, принципиально важный для усиления нейтрализующей вирус функции тримеризующийся домен (вариант мотива «лейциновой молнии», ILZ), олигопептидный таг: HA-таг. Заканчивается последовательность стоп-кодоном ТАА.

На фиг. 6

Изображена совокупная фармакокинетическая кривая уровня вирус-нейтрализующих антирабических антител после однократного внутримышечного введения мышам антирабических препаратов 1 и 2 по изобретению в схеме экстренной профилактики бешенства. В день 0 вначале вводили вирус-нейтрализующие антирабические однодоменные антитела (Препарат 1) и сразу же рекомбинантные псевдоаденовирусные частицы, несущие ген вируснейтрализующих антирабических однодоменных антител (РПАН) - (Препарат 2), в разные группы мышц. Сразу же после этого вводили официальную антирабическую вакцину. На горизонтальной оси отложен защитный уровень антирабических антител по стандарту ВОЗ, соответствующий 0,5 ME на мл крови.

Вид кривой свидетельствует о том, что защитный титр вируснейтрализующих антирабических антител (выше 0,5 ME) в сыворотке крови иммунизированного субъекта наблюдается при предложенной схеме введения препаратов 1 и 2 комплекта в период от 0,5 часа до 168 часов (7 дней), после чего происходит эффективное образование вакцинных антирабических антител. Таким образом, тормозящего эффекта однодоменных антител на образование классических антирабических антител не отмечается.

При этом из-за невозможности отличить однодоменные антитела Препарата 1 и Препарата 2 их уровень отмечен одинаковой пунктирной линией с седьмого дня начинают образовываться вакцинные антитела

Реализация изобретения

Реализация данного изобретения проиллюстрирована в нижеприведенных примерах.

Пример 1

Получение однодоменных антител, нейтрализующих вирус бешенства (препарат 1).

Процесс получения однодоменных антител для Препарата 1 является известным специалисту в данной области и детально описан в ряде открытых источников (например, Патент РФ 2533802. Тримеризованное однодоменное антитело, специфически связывающееся с гликопротеином G вируса бешенства, нейтрализующее вирус бешенства). Основными его стадиями являются:

1) Получение библиотеки вариабельных доменов неканонических однодоменных антител.

2) Селекция однодоменных антител, специфически узнающих вирус бешенства, их тримеризация (модификация, форматирование).

3) Наработка антирабических однодоменных антител, специфически узнающих вирус бешенства.

В ходе осуществления данных работ было получено уникальное однодоменное антитело, специфически связывающееся с вирусом бешенства.

Аминокислотная последовательность отобранного антирабического однодоменного антитела представлена на Фигуре 1, SEQ ID NO: 1.

Для того чтобы повысить эффективность выделения и детекции однодоменного антитела, а также с целью значительно усилить биологическую активность исходно отобранного однодоменного антитела, была использована разработанная ранее эффективная процедура тримеризации (форматирования, модифицирования аминокислотной последовательности антитела), подробно описанная в работе Тиллиба и соавт. [12]. Эта процедура включала присоединение к С-концу исходно отобранного антитела четырех дополнительных аминокислотных участков (доменов), представленных на фиг. 1: линкерного линейного участка (соответствующего верхнему удлиненному шарнирному участку особых иммуноглобулинов IgG2a верблюда), - специального тримеризующегося домена - "ILZ" ("isoleucine zipper domain", или, в переводе, «изолейциновой молнии»), - HA-тага (пептида из белка гемагглютинина, к которому есть коммерческие антитела) и His-тага (шести остатков гистидина на самом C-конце белка для эффективной очистки белка с помощью металл-хелатной хроматографии.

В результате проведенных работ было получено уникальное связывающееся с вирусом бешенства однодоменное антитело по изобретению.

Получаемый препарат 1 антирабического однодоменного антитела на различных стадиях анализировали с помощью электрофореза в 14% SDS-полиакриламидном геле (фиг. 2). Очищенные антитела хранили в аликвотах при 4°C или, после добавления 50% глицерина, при -20°C. Для более долгого хранения антитела лиофилизировали.

После проведения гель-фильтрационной хроматографии очищенного тримеризованного однодоменного антитела, пропущенного через колонку Sephacryl S-100 HR 1.5x50 в стандартном буферно-солевом растворе PBS (в нормальных физиологических условиях без денатурации), было установлено, что препарат однодоменного антитела элюируется во фракциях, соответствующих тримеризованному антителу (Фиг. 3).

Пример 2

Демонстрация специфического связывания полученного по изобретению антирабического однодоменного антитела с вирусом бешенства in vitro (препарат 1).

Демонстрация специфического связывания полученного по изобретению антирабического однодоменного антитела с вирусом бешенства in vitro (препарат 1).

Способность полученного однодоменного антитела связывать белок вируса бешенства, гликопротеин G и анализ активности созданного тримеризующегося однодоменного антитела изучали с помощью ИФА-анализа.

Для ИФА в ячейки стандартной 96-луночной иммунологической плашки (из полистирола, Microlon 600 hi-binding, фирмы Greiner bio-one) наносили в объеме 50-100 мкл разбавленный (в PBS в концентрации примерно 5 мкг/мл) материал антигена. Иммобилизацию проводили в течение ночи при +4°C. Затем ячейки отмывали (в PBS) от несвязавшегося антигена и блокировали лунки раствором 1% бычьего сывороточного альбумина (БСА) или 1% казеина в PBS в течение 2 часов при комнатной температуре. Ячейки снова отмывали в PBS и PBS с 0.05% Твеен-20, после чего добавляли растворы с проверяемыми мини-антителами (содержащими HA-таг на С-конце) в последовательных разведениях, кратных 4-м, начиная с концентрации 40 мкг/мл. После инкубации (при перемешивании) в течение 2 часов при комнатной температуре ячейки вновь отмывали, как описано выше, и затем инкубировали с разведенными в 2000 раз (в PBS с 0.1% БСА) вторичными антителами цыпленка к HA-тагу, конъюгированными с пероксидазой хрена (CHGT-45P-Z, ICL, Inc., USA). Инкубацию проводили в течение 1 часа при комнатной температуре. После тщательной отмывки проводили детекцию активности фермента пероксидазы хрена, используя в качестве хромогенного субстрата ABTS (2,2'-азино-бис(3-этилбензотиазолин-6-сульфонат). Оптическую плотность измеряли при длине волны 405 нм с помощью планшетного флюориметра или сканировали и сохраняли изображение в формате TIF. Контрольные лунки не содержали исследуемый антиген или содержали иной иммобилизованный белок, они были блокированы и процессированы параллельно с основными экспериментальными ячейками. На фиг. 4 можно видеть, что в области наиболее достоверного анализа активности антитела, в лунке (4), где использовали мини-антитело в концентрации примерно 0,6 мкг/мл. результирующая оптическая плотность при 405 нм была около 0,85 о.е.

Представленные результаты свидетельствуют о специфическом связывании тримеризованного антирабического однодоменного антитела с вирусом бешенства.

Пример 3

Демонстрация вируснейтрализующей активности антирабических однодоменных антител (Препарат 1) in vivo.

Целью исследования была оценка способности антирабических однодоменных антител, являющихся активным веществом препарата 1, нейтрализовать вирус бешенства.

Количественная оценка и определение вируснейтрализующей активности антирабических однодоменных антител проводились в реакции вирус-нейтрализации по широко известному для специалистов методу P. Atanasiu [20].

Суть метода состоит в нейтрализации постоянной дозы предварительно протитрованного инфицирующего вируса и инокуляции исследуемого препарата мышам.

Эксперимент проводили следующим образом - препарат антирабических однодоменных антител брали в объеме 50 мкл (исходя из предварительно определенной активности in vitro), добавляли 250 мкл PBS и объединяли с 300 мкл суспензии вируса CVS с активностью 250 ЛД50.

В качестве положительного контроля был взят коммерческий препарат Ребинолин (Камада Лтд, Израиль) с активностью 180 МЕ/мл, представляющий собой поликлональный антирабический иммуноглобулин человека. Основными недостатками классических глобулинов являются: не технологичный и дорогой способ производства с использованием людей-доноров с возможностью контаминации инфекционными агентами; тормозящий эффект на индукцию вакцинных антител, приводящий к снижению эффективности антирабической вакцинации; неспособность проникать в нервные ткани.

Коммерческий человеческий иммуноглобулин брали в объеме 300 мкл и объединяли с 300 мкл суспензии вируса. Отрицательным контролем служил фосфатно-солевой буфер (PBS).

Смесь вируса с коммерческим иммуноглобулином или антирабическими однодоменными антителами выдерживали при 37°C 1 час для осуществления реакции нейтрализации.

После инкубации каждую смесь вводили 10 мышам массой 8-10 г интрацеребрально, в объеме 30 мкл.

Через две недели после заражения был проведен учет результатов реакции.

Результаты эксперимента по оценке вируснейтрализующей активности на мышах отражены в таблице 1.

Как следует из таблицы, при исследовании вируснейтрализующих свойств антирабических однодоменных антител в реакции вирус-нейтрализации на мышах было установлено, что антирабические однодоменные антитела обладают вируснейтрализующими (протективными) свойствами в отношении вируса бешенства штамма CVS (культуральный) с активностью 250 ЛД50, из 10 мышей в опыте выжили все 10, т.е. выживаемость составила 100%, что сравнимо с положительным контролем. В группе отрицательного контроля все животные умерли от бешенства, так как им не был введен ни коммерческий антирабический иммуноглобулин, ни антирабические однодоменные антитела.

Таким образом, установлено, что антирабические однодоменные антитела, входящие в комплект в составе препарата 1, обладают вирус-нейтрализующими (протективными) свойствами в отношении вируса бешенства.

Пример 4

Получение рекомбинантных псевдоаденовирусных частиц, несущих ген однодоменного антитела против вируса бешенства (препарат 2).

Основными стадиями работ по получению рекомбинантных псевдоаденовирусных частиц, несущих ген однодоменного антитела против вируса бешенства являются:

1) Конструирование рекомбинантной псевдоаденовирусной частицы, несущей ген вирус-нейтрализующего антирабического однодоменного антитела.

2) Выращивание на специализированной культуре эукариотических клеток (в частности, на культуре клеток HEK293),

3) Очистка и формулирование.

Конструирование рекомбинантной псевдоаденовирусной частицы (РПАН), со вставкой гена вирус-нейтрализующего антирабического однодоменного антитела проводили на основе генома аденовируса человека 5 серотипа (размером 70-80 нм).

Получение конструкции РПАН со вставкой гена вирус-нейтрализующего антирабического однодоменного антитела проводится известными среднему специалисту методами. Причем, полученная конструкция рекомбинантной псевдоаденовирусной частицы должна обеспечивать при введении в организм субъекта в эффективном количестве экспрессию гена вируснейтрализующего антирабического однодоменного антитела в титре не ниже защитного (0,5 ME на мл сыворотки крови иммунизированного) на протяжении не менее 7 дней. Примерами подобного получения эффективных конструкций РПАН со вставками трансгена могут являться патенты РФ 2523599, 2507258 (например, Патент №2488406. Фармацевтическая композиция для терапии острых токсических состояний; Патент №2507258).

При конструировании такой частицы трансгеном являлась нуклеотидная последовательность однодоменного антитела SEQ ID NO: 2, предварительно подвергнутая оптимизации кодонов по общеизвестной методике для усиления экспрессии в клетках человека. В процессе конструирования в экспрессирующую кассету также были встроены дополнительные элементы, влияющие на процесс экспрессии антирабического однодоменного антитела. Таким образом, в результате получили рекомбинантную псевдоаденовирусную частицу, имеющую нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 3, представленную на фигуре 5, экспрессирующую однодоменное антирабическое антитело с SEQ ID NO: 1.

Количество рекомбинантных псевдоаденовирусных частиц способных трансдуцировать (активность) клетки линии НЕК293 определяли с помощью стандартного метода титрования по бляшкам, в результате получали титр частиц, выраженный в бляшкообразующих единицах на мл (БОЕ/мл). Синонимом обозначения БОЕ являются единицы активности - акт.ед.

В дальнейшем для получения готовой формы Препарата 2 с целью формирования комплекта, рекомбинантные псевдоаденовирусные частицы многостадийно очищали, формулировали, разливали и передавали на стадию упаковки. Детально данный процесс описан в известных источниках, например в патенте РФ 2489168.

Полученный стерильный концентрат РПАН, экспрессирующих ген антирабического однодоменного антитела полностью соответствовал требованиям фармацевтического качества. В дальнейшем он разливался во флаконы и являлся препаратом 2 комплекта для экстренной (постэкспозиционной) профилактики бешенства.

Пример 5

Демонстрация вируснейтрализующей активности антирабических однодоменных антител, экспрессируемых рекомбинантными псевдоаденовирусными частицами (Препарат 2)

Целью данного исследования было определение вируснейтрализующей свойств антирабических однодоменных антител, экспрессируемых рекомбинантными псевдоаденовирусными частицами.

Препарат 2 комплекта содержит в качестве активного вещества рекомбинантные псевдоаденовирусные частицы со вставкой гена антирабических однодоменных антител. Механизм действия заключается в экспрессии рекомбинантными псевдоаденовирусными частицами антирабических однодоменных антител в организме человека после его иммунизации. Наработанные антирабические однодоменные антитела нейтрализуют вирус бешенства в организме инфицированного человека и не дают развиться в последующем заболеванию бешенством.

Для проведения исследования применялась общеизвестная специалистам реакция вируснейтрализации в культуре клеток (FAVN) [4].

Перед проведением реакции была осуществлена работа по получению экспериментального материала. Для этого клетки линии HEK293 рассевали на культуральные чашки диаметром 3 см в количестве 2×105 кл/см2, инкубировали 24 часа, а затем инфицировали полученными рекомбинантными аденовирусами в дозе 10 БОЕ/кл. В качестве отрицательного контроля использовали клетки, инфицированные рекомбинантным аденовирусом Ad5-null, не несущим трансгена. Экспрессию генов антирабических однодоменных антител определяли в культуральной среде и лизатах клеток культуры, образцы которых были отобраны через 48 часов после инфекции. Для подготовки клеточных лизатов к анализу экспрессии антител, клетки обрабатывали RIPA буфером (50 мМ Трис - HCl pH 8, 150 мМ NaCl, 1% NP-40, 0.5% натрия дезоксихолат, набор ингибиторов протеаз (например, «Roche», Швейцария). Перед анализом в пробах измеряли концентрацию суммарного белка спектрофотометрически с помощью реактива Бредфорда (например, «Sigma-Aldrich», США). Полученные препараты исследовали в одинаковой концентрации. Сравнение проводили со стандартом ВОЗ.

Результаты эксперимента представлены в таблице 2.

Результаты в таблице свидетельствуют о наличии экспрессии гена вируснейтрализующего антирабического однодоменного антитела рекомбинантными псевдоаденовирусными частицами в супернатанте среды и в супернатанте клеточного лизата культуры клеток HEK293 в высоких титрах, в отрицательном контроле однодоменных антител не было обнаружено.

Таким образом, в примере показано, что Препарат 2 комплекта содержит рекомбинантные псевдоаденовирусные частицы со вставкой гена антирабических однодоменных антител, которые способны при заражении ими эукариотических клеток нарабатывать антирабические однодоменные антитела, обладающие вируснейтрализующими свойствами в отношении вируса бешенства.

Пример 6

Фармакокинетика

Целью исследования было изучение фармакокинетики препаратов 1 и 2 на лабораторных животных для подбора эффективных доз и схем введения.

Для оценки результатов теста применялась известная реакция вируснейтрализации в культуре клеток (FAVN) [4].

Критериями оценки являлось значение титра антител к вирусу бешенства в сыворотке крови иммунизированных мышей. В качестве широко используемого опорного уровня принимался требуемый ВОЗ минимальный титр 0,5 ME на мл сыворотки крови.

Исследование состояло из двух частей:

1) изучение фармакокинетики (длительности пребывания) вируснейтрализующих антирабических однодоменных антител в организме иммунизированных мышей.

2) изучение фармакокинетики (накопления) вируснейтрализующих антирабических однодоменных антител, экспрессированных рекомбинантными псевдоаденовирусными частицами.

1) Фармакокинетика вируснейтрализующих антирабических однодоменных антител (Препарат 1).

Исследование проводилось на линейных мышах Balb/c, самках. Группы включали по 6 животных. Кровь брали из хвостовой вены.

Препарат 1 комплекта вводили однократно внутримышечно в дозе 20 МЕ/кг с учетом эквивалентного переноса на мышь. Было проведено 2 опыта с разным содержанием антирабических однодоменных антител - 150 ME и 250 ME во флаконе. Лиофилизированный препарат перед введением растворяли в 1 мл воды для инъекций. Контрольным животным вводили воду для инъекций в качестве отрицательного контроля.

Согласно результатам исследования, указанным в таблице 3, период персистирования вируснейтрализующих однодоменных антител в крови мышей составляет от 0,5 часа до 96 часов после введения препарата 1, с содержанием антирабических однодоменных 150 ME на флакон. Защитный титр антирабических антител при этом (более 0,5 МЕ/мл сыворотки крови) наблюдался от 0,5 часа вплоть до 12 часов после введения, что было учтено при разработке схемы введения.

При использовании препарата с активностью 250 ME во флаконе для соблюдения дозирования препарата вводили меньший объем препарата - 125 мкл, растворенного в 1 мл воды для инъекций, и получили достоверно сходные с препаратом 150 ME результаты по длительности персистирования однодоменных антител. Таким образом, препарат как с активностью 150 ME, так и 250 ME являются эффективными при дозировании 20 МЕ/кг пациента.

В итоге, была получена фармакокинетическая кривая для препаратов вируснейтрализующих однодоменных антител при использовании препарата с разной активностью во флаконе: 150 ME и 250 ME. В обоих случаях персистирование антирабических вируснейтрализующих однодоменных антител продолжалось не более 96 часов с пиком на 4-й час после введения препарата 1 комплекта. Защитный титр антирабических однодоменных антител более 0,5 МЕ/мл сыворотки крови наблюдался на протяжении 12 часов после введения.

2) Исследование проводилось на линейных мышах Balb/c, самках. Группы включали по 6 животных. Кровь брали из хвостовой вены.

Препарат 2 комплекта вводили однократно в дозах 5×108 БОЕ, 5×109 БОЕ, и 7×109 БОЕ в эквивалентных мышиных дозах, внутримышечно. Контрольным животным вводился фосфатно-солевой буфер в качестве отрицательного контроля.

Указанные в таблице 4 результаты исследования показывают наличие экспрессии и накопление вируснейтрализующих антирабических однодоменных антител рекомбинантными псевдоаденовирусными частицами в крови иммунизированных животных при введении препарата 2:

в дозе 5×108 БОЕ - на протяжении 4 дней,

в дозах 5×109 БОЕ и 7×109 БОЕ - на протяжении 7 дней.

Однако при использовании дозировки 7×109 БОЕ возникала обратимая отечность в месте введения у подопытных животных, поэтому в дальнейшем данная доза не рассматривалась в качестве эффективной.

Полученные при этом титры антирабических антител были не ниже стандарта ВОЗ, который определяет минимальный защитный титр антирабических антител в 0,5 ME на мл сыворотки крови иммунизированного субъекта.

Таким образом, было установлено, что препарат эффективен в диапазоне доз 5×108-7×109 БОЕ на человека. Полученные данные были учтены при разработке дозы готовой формы препарата и схемы его введения.

Пример 10

Компоновка фармацевтического набора для пассивной иммунизации против бешенства. Состав набора препаратов антирабических однодоменных антител для экстренной профилактики бешенства

При компоновке набора для экстренной профилактики вируса бешенства учитывались фармакокинетические профили и эффективные дозы препаратов 1 и 2, полученные в предыдущем примере.

Таким образом, был подобран состав готового набора для экстренной профилактики бешенства, который включает в себя:

1) Препарат 1 - препарат однодоменных антител, нейтрализующих вирус бешенства, содержащий вирус-нейтрализующие антирабические однодоменные антитела - в эффективной дозе. Количество флаконов препарата 1 в комплекте регулируется требуемой эффективностью, и может состоять из 9 флаконов с активностью от 150 до 250 ME на флакон, или меньшим количеством флаконов с соответствующим увеличением активности и объема флаконов, например 300-500 ME на флакон; или 1500-5000 ME на флакон, но не ограничивается указанными вариациями. Препарат 1 может быть представлен в виде лиофилизата. Препарат 2 входит в состав комплекта в виде раствора в количестве 1 флакон объемом 1 см3. Дозировка однодоменных антител на флакон была выбрана из удобства для использования людям разного возраста и веса. Возможна комплектация двумя флаконами Препарата 2.

2) Препарат 2 - препарат рекомбинантных псевдоаденовирусных частиц, несущих ген вирус-нейтрализующих антирабических однодоменных антител - 5×108-5×109 БОЕ в 1 мл фармацевтически приемлемого растворителя - 1 флакон. Возможна комплектация двумя флаконами Препарата 2.

3.) Набор помещен в приемлемую упаковку.

4.) Набор содержит также инструкцию для одновременного администрирования компонентов этого фармацевтического набора.

Каждый из полученных препаратов после прохождения контроля качества соответствовал требованиям российской фармакопеи.

Препарат 1 по внешнему виду представлял собой аморфную массу белого цвета; восстановленный препарат из лиофилизированного - бесцветный или с желтоватым оттенком слегка опалесцирующий раствор. Антирабическое антитело специфически связывалось с гомологичным антигеном и не связывалось с неспецифическими антигенами. При определении прозрачности восстановленный препарат выдерживал сравнение с эталоном № IV, был бесцветным. По наличию механических включений выдерживал требования РД 42-501-98, количество невидимых частиц размером ≥5 мкм - не более 6000; размером ≥25 мкм - не более 600). pH раствора восстановленного препарата находился в пределах pH от 7,0 до 7,5. Препарат был стерильным, нетоксичным, апирогенным. Содержал от 150 до 250 ME антирабического антитела во флаконе. Потеря в массе при высушивании была не более 2,5%. Содержимое ампулы полностью растворялось в 1 мл воды для инъекций при встряхивании в течение 2 минут.

Препарат 2 по внешнему виду представлял собой бесцветный или с желтоватым оттенком слегка опалесцирующий раствор. Содержал геном аденовируса человека пятого серотипа и последовательности гена однодоменного антитела против вируса бешенства, молекулярная масса фрагмента амплифицированной ДНК в препарате соответствовала молекулярной массе фрагмента амплифицированной ДНК в положительном контроле. При определении прозрачности выдерживал сравнение с эталоном IV. Был бесцветным. По наличию механических включений препарат 2 выдерживал требования РД 42-501-98, количество невидимых частиц размером ≥5 мкм - не более 6000; размером ≥25 мкм - не более 600). pH раствора находился в пределах от 6,0 до 8,0. Извлекаемый объем препарата 2 - не менее номинального. Был стерильным. Содержал менее 7×103 репликативно-компетентных аденовирусов на дозу. Был не токсичным; апирогенным. Содержал 5×108-5×109 БОЕ на 1 мл (доза).

Готовый фармацевтический набор препаратов для экстренной профилактики бешенства хранили в защищенном от света месте при температуре от +2 до +8°C. Не замораживали. Срок хранения определен в 2 года.

Пример 11

Безопасность препаратов фармацевтического набора.

Так как назначением фармацевтического набора является экстренная профилактика бешенства у человека, все препараты комплекта должны быть безопасными.

Препараты 1 и 2 комплекта прошли требуемый спектр доклинических исследований безопасности, которые включали исследования: острой токсичности, хронической токсичности, исследования репродуктивной токсичности, исследования иммунотоксичности и аллергезирующих свойств, мутагенной активности.

При проведении исследований были использованы: Препарат 1 с содержанием антирабических однодоменных антител 150-250 ME во флаконе; Препарат 2 - с содержанием рекомбинантных псевдоаденовирусных частиц со вставкой гена антирабического однодоменного антитела - 5×108-5×109 акт.ед. в 1 мл буферного раствора.

Дозы препарата при исследовании острой токсичности на мышах и крысах, превышали рекомендованную иммунизирующую дозу для человека до 308 раз, в хронической - до 31 раза.

Проведенные доклинические исследования безопасности не выявили негативных эффектов, препятствующих клиническому исследованию в заявленной готовой лекарственной форме.

Таким образом, фармацевтический набор препаратов для экстренной профилактики бешенства соответствует требованиям безопасности - не обладает токсичностью и реактогенностью, соответствует требованиям 4 класса опасности «вещества малоопасные».

Пример 12

Способ применения.

Способ применения фармацевтического набора для пассивной иммунизации против бешенства заключается в следующем: лиофилизат вирус-нейтрализующих антирабических однодоменных антител восстанавливают путем смешивания лиофилизата с фармацевтически приемлемым растворителем, затем вводят субъекту, инфицированному вирусом бешенства, в дозе не менее 20 МЕ/кг, сразу после этого вводят рекомбинантные псевдоаденовирусные частицы, несущие ген вирус-нейтрализующих антирабических однодоменных антител - не менее 5×108 акт.ед. в растворителе.

В данном примере показан способ применения фармацевтического набора препаратов антирабических однодоменных антител в схеме постэкспозиционной (экстренной) профилактики бешенства.

Оказание экстренной профилактики бешенства в РФ осуществляется в строгом соответствии с требованиями ВОЗ и нормативной документации. Назначением зарегистрированных антирабических иммуноглобулинов является экстренная профилактика бешенства в комбинации с антирабической вакциной в условии III категории контакта (единственный или множественные трансдермальные укусы или царапины, облизывание поврежденной кожи; загрязнение слизистых оболочек слюной при облизывании, контакты с летучими мышами) и контактах категории II (мелкие укусы непокрытых участков кожи, незначительные царапины или ссадины без кровотечения, ослюнение поврежденных кожных покровов), если речь идет о лицах с иммунодефицитом, с больным или подозрительным по заболеванию бешенством животным.

Для обоснования схемы применения препаратов 1 и 2 фармацевтического набора был проведен эксперимент, в котором в общепринятой схеме постэкспозиционной профилактики бешенства традиционные антирабические иммуноглобулины были заменены на препараты однодоменных антител по изобретению. Эффективность проводимого курса оценивалась по уровню антирабических однодоменных антител, персистирующих в сыворотке крови лабораторного животного.

Для оценки результатов теста применялась известная реакция вируснейтрализации в культуре клеток (FAVN). (Cliquet F. et al. Development of a fluorescent antibody virus neutralisation test (FAVN test) for the quantitation of rabies-neutralising antibody, Journal of Immunological Methods, 212, 1998, 79-87 - Усовершенствование реакции нейтрализации вируса флуоресцентными антител (FAVN тест) [4].

Выбранная доза препаратов антирабических однодоменных антител 20 МЕ/кг соответствует применяемой дозе для человеческих иммуноглобулинов, также показавшей свою эффективность при изучении иммуногенных свойств Препарата 1 в экспериментах на мышах.

Исследование проводилось на линейных мышах Balb/c, самках. Группы включали по 6 животных. Кровь брали из хвостовой вены.

Ход исследования был следующим:

в день 0 мышам опытной группы вводили три препарата по очереди:

1) Препарат 1 комплекта антирабических однодоменных антител - в дозе 20 МЕ/кг внутримышечно;

2) Сразу же после, Препарат 2 комплекта с рекомбинантными псевдоаденовирусными частицами, несущими ген антирабических однодоменных антител - в дозе 20 МЕ/кг внутримышечно;

3) Сразу же после этого, официнальную антирабическую вакцину (например, Рабипур, Германия) в дозе, согласно инструкции по применению, внутримышечно.

4) Возможно дополнительное введение Препарата 2 комплекта с рекомбинантными псевдоаденовирусными частицами, несущими ген антирабических однодоменных антител - в дозе 20 МЕ/кг внутримышечно, если требуется пролонгация периода присутствия пассивных антител в случае применения вакцин, защитный титр в ответ на которые образуется на 14 день после иммунизации в день 0. В данной ситуации используют Фармацевтический набор, который содержит два флакона препарата 2.

Внутримышечные введения препаратов осуществлялись в различные места. Далее у мышей проводили взятие проб крови в часы: 0,5, 1, 2, 4, 6, 8, 12, 24, 48, 72, 96, 168, 336 для определения тиров антирабических антител. Полученные результаты эксперимента отражены на фиг. 6.

Указанный способ применения Препаратов 1 и 2 комплекта соответствует общепринятой схеме экстренной профилактики бешенства человека. Обязательной составляющей схемы антирабической экстренной профилактики является введение официнальной антирабической вакцины после введения классического антирабического иммуноглобулина. В случае использования комплекта для экстренной профилактики бешенства, Препараты 1 и 2 служат альтернативой официнальному (классическому) иммуноглобулину. Таким образом, введение антирабической вакцины осуществляют как можно раньше после введения Препарата 1 и Препарата 2 комплекта, но не позднее 15 минут после их введения. Дальнейшее введение вакцины осуществляют по общепринятым клиническим схемам и не рассматриваются в рамках данного изобретения, так как ни каким образом не влияют на применение заявляемого изобретения.

Вакцинные антитела, образующиеся в ответ на введение официнальной вакцины, в защитном титре появляются на 7 день.

Способ применения по изобретению не тормозит индукцию вакцинных антител, которые, как известно, могут появляться уже на 7 день после введения антирабической вакцины [1, 19].

В схеме экстренной профилактики бешенства, введение Препарата 1 и Препарата 2, осуществляемое перед введением официнальной антирабической вакцины позволяет добиться защитного уровня вируснейтрализующих антирабических антител (не менее 0,5 МЕ/мл) в сыворотки крови иммунизированного пациента с момента введения на протяжении 7 дней. Далее с 7-го дня отмечено появление защитного уровня антител, которые образовались в ответ на введение официнальной антирабической вакцины. Таким образом, показано, что введение комплекта препаратов по изобретению не снижает эффективности вакцинации и не создает «иммунологической дыры» у пациента. При этом уровень защитных антител не опускается ниже защитного (0,5 ME на мл крови) на протяжении рассматриваемого периода постэкспозиционной (экстренной) профилактики бешенства.

Следовательно, изобретен способ для пассивной иммунизации против бешенства путем применения фармацевтического набора препаратов вируснейтрализующих антирабических однодоменных антител для экстренной профилактики бешенства, способный предотвратить заболевание бешенством у покусанного подозрительным животным человека.

Промышленная применимость

Все приведенные примеры подтверждают решение поставленной задачи, а именно, создание препарата для быстрой нейтрализации вируса бешенства в организме зараженного человека, безопасного и не снижающего эффективность антирабической вакцины в схеме экстренной постэкспозиционной профилактики бешенства с быстро наступающим и пролонгированным действием, а также промышленную применимость заявленного по изобретения комплекта препаратов для экстренной профилактики бешенства.

Перечень сокращений

BSA - бычий сывороточный альбумин

CVS - культуральный штамм вируса бешенства

FAVN - реакция нейтрализации вируса флюоресцентными антителами

ILZ - «isoleucine zipper domain», «изолейциновая молния»

PBS - фосфатно-солевой буфер

RFFIT - тест быстрого ингибирования фокусов флуоресценции

RIPA - буфер для радиоиммуноосаждения

SDS - додецилсульфат натрия

АИГ - антирабический иммуноглобулин

БОЕ - единицы активности - акт.ед.

ВОЗ - всемирная организация здравоохранения

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ДТТ - дитиотреитол

ЛД50 - 50% летальная доза

ME - международные единицы

ПЭП - постэкспозиционная (экстренная) профилактика

РД - руководящий документ

РПАН - рекомбинантная псевдоаденовирусная частица

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1. Bose A. et al. A randomized non-inferiority clinical study to assess post-exposure prophylaxis by a new purified vero cell rabies vaccine (Rabivax-S) administered by intramuscular and intradermal route, Vaccine, 2016 Sep 14, 34(40), 4820-4826 - Рандомизированное, незавершенное клиническое исследование для оценки постэкспозиционной профилактики с помощью новой очищенной вакцины против бешенства на клетках Vero (Рабивакс-S) для внутримышечного и внутрикожного.

2. Both L. et al. Passive immunity in the prevention of rabies, Lancet Infect Dis., 2012, May, 12(5), 397-407 - Пассивный иммунитет в борьбе с бешенством.

3. Cabasso V.J. et al. Rabies immune globulin of human origin: preparation and dosage determination in non-exposed volunteer subjects, Bull World Health Organ, 1971, 45, 303-315 - Антирабический иммуноглобулин человеческого происхождения: получение и определение дозы у добровольцев, не подвергавшихся воздействию бешенства.

4. Cliquet F., Development of a fluorescent antibody virus neutralisation test (FAVN test) for the quantitation of rabies-neutralising antibody, Journal of Immunological Methods, 212, 1998, 79-87 - Усовершенствование реакции нейтрализации вируса флуоресцентными антител (FAVN тест) для количественного определения антирабических нейтрализующих антител.

5. Final for WER 9 Jul 2010 Антирабические вакцины Документ, излагающий позицию ВОЗ fs099/en/.

6. Hassanzadeh-Ghassabeh Gh. et al. Nanobodies and their potential applications, Nanomedicine, 2013, 8(6), 1013-1026. - Нанотела и возможности их применения.

7. Hui Kuo et al. Retrograde transfer of replication deficient recombinant adenovirus vector in the central nervous system for tracing studies. Brain Research, Volume 705, Issues 1-2, 24 December 1995, Pages 31-38.

8. Khawplod P. et al. What is an acceptable delay in rabies immune globulin administration when vaccine alone had been given previously? Vaccine, 1996, 14, 389-391 - Сколько составляет приемлемое «время ожидания» при введении антирабического иммуноглобулина при раннем отдельном введении вакцины?

9. Nigg A.J., Walker P.L. Overview, prevention, and treatment of rabies, Pharmacotherapy, October 2009, 29(10), 1182-1195.

10. Rabies vaccines WHO position paper, Weekly Epidemiological Record, 2007, Vol. 82, NO. 49/50, 7 December 2007, 425-436 - Позиция ВОЗ в отношении вакцин против бешенства fs099/en/

11. Rabies, Fact Sheet, March 2016, №99. - Бешенство, Информационный бюллетень. http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs099/en/.

12. Tillib et al. Formatted single-domain antibodies can protect mice against infection with influenza virus (H5N2), 2013, Antiviral Res, 97, 245-254 - Форматированные однодоменные антитела могут защитить мышь от инфицирования вирусом гриппа (H5N2).

13. Tillib S.V. «Camel Nanoantibody» is an efficient tool for research, diagnostics and therapy, Molecular Biology, 2011, 45, №1, 66-73. - «Верблюжьи антитела» - эффективный инструмент для исследований, диагностики и терапии.

14. Thomas С.Е., Ehrhardt A., Kay М. Progress and problems with the use of viral vectors for gene therapy, Nature Reviews Genetics, May 2003, 4, 346-358. - Прогресс и проблемы при использовании вирусных векторов для генной терапии.

15. Wesolowski J. et al. Single domain antibodies: Promising experimental and therapeutic tools in infection and immunity, Med. Microbiol. Immunol., 2009, Vol. 198, P. 157-174. - Однодоменные антитела: Перспективное средство для диагностики и терапии инфекций и иммунитета.

16. WHO Expert Consultation on Rabies. WHO Technical Report Series 982. Second report. Geneva, Switzerland, WHO, 2013 - Консультация экспертов ВОЗ по бешенству Серия технических докладов ВОЗ. Второй доклад.

17. WHO Expert Consultation on Rabies: first report, WHO technical report series, 931, 2004, Geneva, Switzerland - Экспертное совещание ВОЗ по бешенству: первый доклад, серия технических докладов ВОЗ 931.

18. Wiktor T.J., Lerner R.A., Koprowski Н. Inhibitory Effect of Passive Antibody on Active Immunity Induced Against Rabies by Vaccination, Bull World Health Organ. 1971, 45(6), 747-753 - Ингибирующее действие пассивного антитела на активный иммунитет, индуцированный против бешенства путем вакцинации/.

19. Use of a Reduced (4-Dose) Vaccine Schedule for Postexposure Prophylaxis to Prevent Human Rabies: Recommendations of the Advisory Committee on Immunization Practices/Recommendations and Reports. March 19, 2010/59 (RR02); 1-9.

20. Kaplan M., Koprowski H. Laboratory techniques in rabies, 3rd ed., Geneva, WHO, 1973, 314-318 - Методы лабораторных исследований по бешенству.

1. Фармацевтический набор фармацевтических композиций для пассивной иммунизации против бешенства, помещенный в приемлемую упаковку, включающий:

- фармацевтическую композицию, содержащую:

вируснейтрализующие антирабические однодоменные антитела в эффективном количестве, при этом вируснейтрализующие антирабические однодоменные антитела имеют аминокислотную последовательность SEQ ID NO.1, причем эффективной дозой вируснейтрализующих антирабических однодоменных антител является доза - не менее 150 ME активности, в лиофилизированном виде,

- фармацевтическую композицию, содержащую:

рекомбинантные псевдоаденовирусные частицы, несущие ген вируснейтрализующих антирабических однодоменных антител в эффективном количестве, при этом рекомбинантные псевдоаденовирусные частицы, несущие ген вируснейтрализующих антирабических однодоменных антител, имеют нуклеотидную последовательность генетической вставки SEQ ID NO.3, причем эффективная доза рекомбинантных псевдоаденовирусных частиц, несущих ген вируснейтрализующих антирабических однодоменных антител составляет не менее 5×108 БОЕ в 1 мл фармацевтически приемлемого растворителя,

фармацевтически приемлемый буферный раствор до 1 мл;

- инструкцию для введения этого фармацевтического набора.

2. Способ применения фармацевтического набора фармацевтических композиций для пассивной иммунизации против бешенства по п. 1, заключающийся во введении по очереди фармацевтической композиции, содержащей вируснейтрализующие антирабические однодоменные антитела и сразу же после фармацевтической композиции, содержащей рекомбинантные псевдоаденовирусные частицы, несущие ген вируснейтрализующих антирабических однодоменных антител, при этом лиофилизат фармацевтической композиции, содержащей вируснейтрализующие антирабические однодоменные антитела восстанавливают путем смешивания лиофилизата с водой для инъекций в объеме 1 мл, затем вводят субъекту, инфицированному вирусом бешенства, в дозе не менее 20 МЕ/кг, сразу после этого вводят фармацевтическую композицию, содержащую рекомбинантные псевдоаденовирусные частицы, несущие ген вируснейтрализующих антирабических однодоменных антител в фармацевтически приемлемом растворителе - в пределах 5×108-5×109 БОЕ; сразу после этого вводят официнальную антирабическую вакцину в соответствии с инструкцией по ее применению.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к композиции для лечения или профилактики инфекции, связанной с папилломавирусом. Фармацевтическая композиция для лечения или профилактики инфекции, связанной с папилломавирусом, или поражения или заболевания, связанного с папилломавирусной инфекцией, включающая соединение общей формулы (I): или его фармацевтически приемлемую соль, в комбинации с растворителем и усиливающим вязкость агентом, где указанным растворителем является пропиленгликоль и указанным усиливающим вязкость агентом является гидроксипропилцеллюлоза, где указанная композиция имеет форму геля, и где гель имеет вязкость от 5000 до 50000 мП.

Настоящая группа изобретений относится к медицине, а именно к онкологии, и касается применения сложного форболового эфира. Для этого вводят эффективное количество 12-О-тетрадеканоилфорбол-13-ацетата (ТРА) или композиции, содержащей ТРА.

Группа изобретений относится к области фармацевтической промышленности, а именно к фармацевтической композиции (и к ее применению) для устранения дозозависимой токсичности и повышения терапевтической активности фармакологически активного соединения в терапии инфекционных и неинфекционных заболеваний, включающей дисульфид глутатиона или его фармацевтически приемлемую органическую или неорганическую соль и глутатион дисульфид S-оксида или его фармацевтически приемлемую органическую или неорганическую соль; а также к фармакологической комбинации (и к ее применению), содержащей указанную композицию и фармакологически активное соединение, выбранное из антикоагулянта, ингибитора фактора Ха, антимикробного или противовирусного средства, ингибитора кальциевых каналов; к лекарственному средству, включающему терапевтически эффективное количество указанных композиции или комбинации совместно с фармацевтически приемлемыми эксципиентами.

Настоящее изобретение относится к сложному эфиру филлигенина и ибупрофена с общей структурной формулой, представленной формулой (I): (I).Также предложены способ получения сложного эфира (I), его антивирусное применение и противовирусный медикамент.

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии, и касается комбинированной вакцины для иммунопрофилактики кори, эпидемического паротита и краснухи. Вакцина содержит штамм вируса кори, штамм вируса эпидемического паротита, штамм вируса краснухи и стабилизирующий агент.

Настоящее изобретение относится к медицине, конкретно к фармацевтической композиции, содержащей атропин или его соль; аконитин и цианид ртути для применения в способе лечения вирусной инфекции, вызванной вирусом герпеса, респираторно-синцитиальным вирусом человека (RSV), риновирусами и/или энтеровирусами.

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности и представляет собой фармацевтический аэрозольный состав ингибитора протеаз с озон-сберегающим пропеллентом, состоящий из гомогенной смеси водного раствора активного вещества из группы белковых и полипептидных ингибиторов протеаз, содержащего 0,05-250 мг протеазного ингибитора на мл раствора, и ингредиентов трехкомпонентной выталкивающей системы, а именно: глицерола, этанола и водонерастворимого озон-сберегающего пропеллента, с соотношением водного раствора и трехкомпонентной системы 0,05-5 и 95,0-99,95 объемных %, которую получали поэтапным последовательным смешиванием каждого из перечисленных компонентов с раствором активного вещества, и позволяющий генерировать аэрозоль активного протеазного ингибитора за счет выталкивающей силы пропеллента при распылении полученного состава из аэрозольного устройства с клапаном.

Изобретение относится к новым изомерным формам производного дигидропиримидина, соответствующего формуле (I) или (Ia), или его фармацевтически приемлемой соли. Соединения обладают свойствами ингибитора вирусной активности гепатита В и могут быть использованы при лечении заболеваний, вызванных инфекцией гепатита В, которая является циррозом или гепатоцеллюлярным раком.

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии, и может быть использовано для получения вакцинной композиции для введения в ротовую полость человека или животного.

Изобретение относится к области органической химии, а именно к новому биологически активному веществу - 2-[2-(3-хлорадамантан-1-ил)-2-оксоэтилиденгидразино]-4-(2,4-диметоксифенил)-4-оксо-2-бутеновой кислоте формулы 1.

Изобретения относятся к области иммунологии и вирусологии. Представленные однодоменые и олигомерные антитела содержат антигенсвязывающую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, на основе которых созданы композиции, предназначенные для профилактики и лечения инфекции млекопитающих, вызванной вирусом Эбола.

Изобретение касается фармацевтической композиции и способа лечения. Представленная композиция содержит лиганд анти-MSRV/HERV-W Env и по меньшей мере одно лекарственное средство, ингибирующее радикал окиси азота, причем указанный лиганд содержит каждый из участков, определяющих комплементарность (CDR), указанных в SEQ ID NО: 1, SEQ ID NО: 2, SEQ ID NО: 3, SEQ ID NО: 4, SEQ ID NО: 5 и SEQ ID NО: 6, а указанное лекарственное средство, ингибирующее радикал окиси азота, выбрано из группы, состоящей из Ng-нитро-L-аргинин метилового эфира (L-NAME), S-метил-изотиомочевины (SMT), фумаровой кислоты и диметилфумарата (DMF).

Изобретение относится к области биотехнологии и иммунологии. Описаны моноклональные антитела и их фрагменты, которые являются перекрестно реактивными с множеством кладов вируса гриппа, включая представителей как группы 1, так и группы 2.

Изобретение относится к способу получения гипериммунной сыворотки для производства лечебного иммуноглобулина против лихорадки Эбола и может быть использовано в медицине для экстренной профилактики лихорадки Эбола.

Изобретение относится к биохимии. Описаны моноклональные нейтрализующие антитела, которые специфически связываются с мембрано-проксимальной внешней областью (MPER) gp41 ВИЧ-1.

Изобретение относится к области ветеринарии. Клинически здоровым телятам 20-30-дневного возраста применяют внутрь ксимедон гидрохлорид в смеси с 3,5% спиртовой настойкой почек сосны обыкновенной (Gemmue Pini), травы и соцветий эхинацеи пурпурной (Ehinacea purpurea L.), корневищ и корней девясила высокого (Inula Neleium L.), взятых в соотношении 2:1:1, из расчета 2,0 г ксимедона гидрохлорида на 100,0 мл 3,5% спиртовой настойки почек сосны обыкновенной (Gemmue Pini), травы и соцветий эхинацеи пурпурной (Ehinacea purpurea L.), корневищ и корней девясила высокого (Inula Neleium L.) в дозе 1,5-2,0 мл/кг живой массы первый раз за 18-24 часа до и двукратно после иммунизации.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к моноклональному антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, которые специфически связывают белок gB цитомегаловируса (CMV).

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии, а именно к получению диагностических препаратов. При осуществлении предлагаемого способа получения сыворотки для диагностики алеутской болезни норок (АБН) получают высокоочищенный вирусный антиген путем гомогенизации органов инфицированных АБН норок с последующим трехкратным замораживанием/размораживанием гомогената, дезинтеграции клеточного гомогената трехкратной ультразвуковой обработкой, осаждением неразрушенных клеток двукратным низкоскоростным центрифугированием, последующим осаждением иммунных комплексов, уплотнением осадка низкоскоростным центрифугированием, экстрагированием иммунных комплексов (ИК) минимальными количествами ТНЭ буфера путем трехкратной экстракции на холоду в течение 1-2 часов с последующим низкоскоростным центрифугированием, осаждением ИК высокоскоростным центрифугированием из объединенных экстрактов при 30000 об/мин в течение 2,5 часов, извлечением ИК из осадка минимальными количествами ТНЭ буфера путем трехкратного экстрагирования на холоду в течение 1-2 часов с последующим низкоскоростным центрифугированием, диссоциацией иммунных комплексов в кислой среде в течение 1 часа на холоду, отделением вируса АБН-Ф от антител высокоскоростным ультрацентрифугированием, растворением осадка в минимальном количестве карбонатного буфера, отделением ферритина от вирусных частиц на колонке с сефарозой 6B в системе карбонатного буфера.

Представлена группа изобретений, касающаяся эпитопа, специфичного для вируса гепатита В (ВГВ), полинуклеотида, кодирующего эпитоп, экспрессионного рекомбинантного векора, рекомбинантного микроорганизма, вируса или клетки млекопитающих, способа получения эпитопа и способа получения антитела, специфично связывающегося с эпитопом.

Настоящее изобретение относится к фармацевтической промышленности. Предложены способ получения вирусного антигена из оболочечного вируса и применение этого способа в производстве вакцинного препарата, содержащего указанный вирусный антиген.

Группа изобретений относится к медицине, а именно к иммунологии, и может быть использована для получения фармацевтического набора для пассивной иммунизации против бешенства. Фармацевтический набор, помещенный в приемлемую упаковку, включает: 1) фармацевтическую композицию, содержащую вируснейтрализующие антирабические однодоменные антитела в эффективном количестве и фармацевтически приемлемый буферный раствор до 1 мл, при этом вируснейтрализующие антирабические однодоменные антитела имеют аминокислотную последовательность SEQ ID NO.1; причем эффективной дозой вируснейтрализующих антирабических однодоменных антител является доза - не менее 150 ME активности, в лиофилизированном виде; 2) фармацевтическую композицию, содержащую рекомбинантные псевдоаденовирусные частицы, несущие ген вируснейтрализующих антирабических однодоменных антител в эффективном количестве, фармацевтически приемлемый буферный раствор до 1 мл; при этом рекомбинантные псевдоаденовирусные частицы, несущие ген вируснейтрализующих антирабических однодоменных антител, имеют нуклеотидную последовательность генетической вставки SEQ ID NO.3, и эффективная доза рекомбинантных псевдоаденовирусных частиц, несущих ген вируснейтрализующих антирабических однодоменных антител, составляет не менее 5×108 БОЕ в 1 мл фармацевтически приемлемого растворителя; 3) инструкцию для введения этого фармацевтического набора. Группа изобретений относится также к применению фармацевтического набора для пассивной иммунизации против бешенства. Использование данной группы изобретений позволяет проводить экстренную профилактику бешенства путем пассивной иммунизации с использованием полученных фармацевтических композиций, действие которых начинается с 6 часов введения в организм и продолжается до 7 дней. 2 н.п. ф-лы, 12 пр., 4 табл., 6 ил.

Наверх