Средство для гемостатической обработки раны
Группа изобретений относится к медицине и касается средства для гемостатической обработки раны, которое содержит неколлоидный пористый материал и более чем один фибриногенсвязывающий пептид, иммобилизованный на указанном неколлоидном пористом материале, причем каждый фибриногенсвязывающий пептид содержит: аминокислотную последовательность Gly-Pro-Arg-Xaa (SEQ ID NO: 1) в аминоконцевой части указанного пептида, в которой Хаа представляет собой любую аминокислоту, кроме валина; или аминокислотную последовательность Gly-His-Arg-Xaa (SEQ ID NO: 2) в аминоконцевой части указанного пептида, в которой Хаа представляет собой любую аминокислоту, кроме пролина. Группа изобретений также касается набора для формирования средства для гемостатической обработки раны; способа остановки кровотечения, который включает в себя наложение указанного средства; способа изготовления указанного средства для гемостатической обработки раны. Группа изобретений обеспечивает синергический эффект в отношении остановки кровотечения. 6 н. и 25 з.п. ф-лы, 6 пр., 5 ил.
Настоящее изобретение относится к средствам для гемостатической обработки ран, наборам и агентам для получения средств для гемостатической обработки ран, способам изготовления указанных средств, а также использованию указанных средств для остановки кровотечения, особенно сильного кровотечения, которое может произойти в хирургической практике.
В настоящее время доступен ряд некоторых гемостатиков местного применения для использования во время хирургических операций. Гемостатические губки, такие как Gelfoam, сделаны из свиного желатина. Gelfoam способна поглотить кровь более чем в сорок раз больше своего веса и расшириться приблизительно до двухсот процентов от своего первоначального объема. Поверхность губки вызывает активацию тромбоцитов посредством контактного воздействия на путь активации системы свертывания крови. Альтернативный продукт на основе желатина Floseal содержит желатиновые гранулы, которые сшиты таким образом, что они не набухают до почти той же степени, как Gelfoam.
Листовая окисленная целлюлоза, такая как Surgicel, представляет собой производное альфа-целлюлозы, и действует таким же образом, как и Gelfoam за счет контактного пути активации системы свертывания крови. При пропитывании кровью листы быстро набухают и превращаются в гелеобразную массу. Для микрофибриллярного коллагена, такого как Avitene, используется коллаген, который получен из кожи крупного рогатого скота. Он поставляется в виде тонкодисперсного порошка или листов. Он плотно связывается с поверхностью крови и вызывает минимальное набухание. Он не только вызывает контактную активацию, но и непосредственно активирует тромбоциты.
Местные гемостатики часто используются в сочетании с тромбином, который образует фибрин из фибриногена и способствует активации тромбоцитов, тем самым ускоряя свертывание крови. Обычно используется очищенный бычий или человеческий тромбин, или же рекомбинантный человеческий тромбин. Тем не менее, бычий тромбин является контаминированным с бычьим антигеном, в частности бычьим фактором V. Антитела, образованные против этого антигена, перекрестно реагируют с человеческим фактором V и приводят к опасному для жизни кровотечению, а, в некоторых случаях, к анафилаксии и смерти. В попытке свести к минимуму эти риски из объединенной плазмы доноров был выделен человеческий тромбин, но существует потенциальная возможность передачи переносимых кровью патогенных микроорганизмов, особенно вирусов. В последнее время был разработан рекомбинантный человеческий тромбин и одобрен для использования Управлением по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных средств США. Он обладает тем преимуществом, что является минимально антигенным и не несет на себе риск передачи вируса. Тем не менее, это осуществляется с использованием генетически модифицированной линии клеток яичника китайского хомячка, и таким образом является относительно дорогим в производстве.
Препараты очищенного бычьего и рекомбинантного человеческого тромбина хранятся при комнатной температуре в виде порошка, который должен быть перед использованием разведен физиологическим раствором для приготовления рабочего раствора. Утвержденный Управлением по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных средств США очищенный человеческий тромбин упакован в виде раствора, но может быть сохранен при комнатной температуре только в течение 24 часов; долгосрочное хранение требует замораживания (Lew and Weaver, Biologics: Targets & Therapy 2008:2(4) 593-599).
Еще один недостаток использования тромбина заключается в том, что ферменту требуется время для того, чтобы преобразовать фибриноген в фибрин, при этом происходит незначительная задержка перед тем, как процесс свертывания крови будет ускорен.
По этой причине существует необходимость создания гемостатиков для местного применения, которые обладают способностью остановить кровотечение быстро и эффективно, и при этом преодолеть один или более из вышеуказанных недостатков при использовании тромбина.
В соответствии с настоящим изобретением предлагается средство для гемостатической обработки раны, которое содержит неколлоидный пористый материал и некоторое количество фибриноген-связывающих пептидов, иммобилизованных на неколлоидном пористом материале, где каждый фибриноген-связывающий пептид содержит: аминокислотную последовательность Gly-Pro-Arg-Xaa (SEQ ID NO: 1) в аминоконцевой части пептида, в которой Хаа обозначает любую аминокислоту кроме валина, предпочтительно пролин, саркозин или лейцин; или аминокислотную последовательность Gly-His-Arg-Xaa (SEQ ID NO: 2) в аминоконцевой части пептида, в которой Хаа обозначает любую аминокислоту кроме пролина.
Фибриноген содержит два крайних домена (D-домены), каждый из которых связан с фибриноген-связывающим пептидом. Когда фибриноген, например, в плазме или крови взаимодействует с пептидами, образуется сополимер, содержащий фибриноген-связывающие пептиды и фибриноген, который имеет характеристики фибринового сгустка. Наличие фибриноген-связывающих пептидов в средстве для гемостатической обработки раны согласно настоящему изобретению, таким образом, ускоряет гемостаз.
Неожиданно было обнаружено, что средства для гемостатической обработки раны согласно настоящему изобретению обладают значительно лучшими гемостатическими свойствами, чем обычный желатиновый тампон, который пропитан тромбином.
Средства для гемостатической обработки раны согласно настоящему изобретению не зависят от действия экзогенного тромбина. Фибриноген-связывающие пептиды являются синтетическими и поэтому минимально антигенными, не несут риск передачи вируса, в процессе изготовления являются более дешевыми, чем рекомбинантные белки, которые экспрессируются в линиях клеток млекопитающих, и сохраняются длительное время в растворе при комнатной температуре.
Средства для гемостатической обработки раны согласно настоящему изобретению не требуют ферментативной активности для того, чтобы ускорить гемостаз, и поэтому ускоряют гемостаза немедленно при контакте с фибриногеном.
Термин "неколлоидный пористый материал" используется в настоящем документе для обозначения любого неколлоидного пористого материала, который может быть локально нанесен как покрытие, в качестве обработки или для защиты раны. Примеры такого материала содержат листы, тампоны, губки, пены, пленки, марлю, сетку, гранулы и шарики. Неколлоидный пористый материал содержит материал, который пригоден для местного нанесения на рану, но не подходит для введения в организм. В частности, гранулы или шарики являются слишком большими для того, чтобы пройти через легочно-капиллярное русло. По меньшей мере, большинство гранул или шариков имеют максимальный размер, который является большим, чем 6 мкм. Неколлоидный пористый материал может содержать любое подходящее химическое вещество. Примеры содержат желатин, хлопок, вискозу, полиэфир, коллаген, альгинат и окисленную целлюлозу. Предпочтительным является желатин.
Тромбин отщепляет пептиды (с высвобождением фибринопептидов А и В) от концов аминокислот α и β цепей фибриногена, в результате чего становятся доступным последовательности NH2-GPRV- (SEQ ID NO: 3) и NH2-GHRP- (SEQ ID NO: 4) соответственно. Фибриноген-связывающие пептиды в средстве для гемостатической обработки раны согласно настоящему изобретению, по этой причине, различаются по последовательности от последовательностей находящихся под действием тромбина на фибриноген. Предпочтительно, по меньшей мере, некоторые (более предпочтительно, все) фибриноген-связывающие пептиды содержат последовательность NH2-GPRP- (SEQ ID NO: 5) в аминоконцевой части.
Предпочтительно, фибриноген-связывающий пептиды представляет собой каждый пептид длиной 4-60, предпочтительно 4-30, более предпочтительно 4-10 остатков амитнокислот.
Аминоконцевая часть каждого фибриноген-связывающего пептида способна связываться с «отверстиями» в молекуле фибриногена (Weisel, Fibrinogen and Fibrin, Advances in Protein Chemistry, 2005, Vol. 70, pp. 247-299). Таким образом, любая последовательность фибриноген-связывающих пептидов, которая является карбоксиконцевой до четырех аминокислотных остатков в аминоконцевой части каждого пептида, не является критической, пока эта последовательность не ингибирует связывание аминоконцевой части пептида с фибриногеном.
В некоторых предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения каждый фибриноген-связывающий пептид является по меньшей мере 5 аминокислотных остатков в длину для того, чтобы обеспечить достаточную длину пептида для того, чтобы взаимодействовать с высокой аффинностью с его областью связывания с фибриногеном. Таким образом, является особенно предпочтительным, чтобы каждый фибриноген-связывающий пептид имел длину 5-60, 5-30, или 5-10 аминокислотных остатков. Предпочтительно, чтобы пятый аминокислотный остаток аминоконцевой части каждого из таких фибриноген-связывающих пептидов являлся глициновым остатком. В других вариантах осуществления изобретения каждый фибриноген-связывающий пептид имеет длину по меньшей мере 6, 7, 8, 9, 10 или 11 аминокислотных остатков. Является предпочтительным, чтобы каждый фибриноген-связывающий пептид являлся не более чем 60 аминокислотных остатков в длину, более предпочтительно не более чем 30 аминокислотных остатков в длину.
Предпочтительно, каждый фибриноген-связывающий пептид представляет собой синтетический пептид.
Предпочтительно, фибриноген-связывающие пептиды связываются с фибриногеном с константой диссоциации лежащей в интервале от 10-9 до 10-6 М, например, приблизительно 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 200, 250, 300, 350, 400 или более нМ. Константа диссоциации равная приблизительно 100 нМ является предпочтительной.
Фибриноген-связывающие пептиды каждый имеют одну и ту же последовательность, предпочтительно каждый из которых содержит последовательность SEQ ID NO: 1 в аминоконцевой части. Альтернативно, фибриноген-связывающий пептиды содержат пептиды разной последовательности при условии, что каждый пептид содержит последовательность SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2 в его аминоконцевой части.
Некоторое количество фибриноген-связывающих пептидов являются ковалентно или нековалентно иммобилизованными на неколлоидном пористом материале.
В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения, некоторое количество носителей являются нековалентно иммобилизованными на неколлоидном пористом материале, и некоторое количество фибриноген-связывающих пептидов являются иммобилизованными, предпочтительно ковалентно иммобилизованными, в каждом носителе.
Когда фибриноген, например, в плазме или крови взаимодействует с фибриноген-связывающими пептидами, иммобилизованными на носителях, происходит связывание фибриногена с пептидами. Поскольку каждая молекула фибриногена связывает два пептида, молекулы фибриногена становятся нековалентно сшитыми с помощью носителей, и образуется сополимер, содержащий носители и фибриноген, который имеет характеристики фибринового сгустка.
Носителями могут быть растворимые или нерастворимые носители, но не тромбоциты. Носители должны быть пригодны для местного применения при кровотечении в области раны. Носители могут содержать растворимый или нерастворимый полимер, например белок, полисахарид или синтетический биосовместимый полимер, такой как полиэтиленгликоль, или комбинацию любого из них. Альбумин является предпочтительным белковым носителем.
Нерастворимый носитель может представлять собой микрочастицу (в том числе твердого вещества, полую или пористую микрочастицу, предпочтительно, по существу, сферическую микрочастицу). Микрочастица может быть выполнена из любого подходящего вещества, например сшитого белка. Подходящий белок представляет собой альбумин (полученный из сыворотки или рекомбинантный, человеческий или нечеловеческий в последовательности). Микрочастицы, пригодные для использования в качестве нерастворимых носителей в настоящем изобретении, сформированы путем сушки распылением сывороточного альбумина человека (HSA) с использованием хорошо известной технологии сушки распылением, например, как в WO 92/18164. Альтернативы для использования микрочастиц в качестве носителей содержат липосомы, синтетические полимерные частицы (такие как полимолочная кислота, полигликолевая кислота и поли (молочная/гликолевая) кислоты), или фрагменты клеточной мембраны.
По меньшей мере, большинство носителей предпочтительно имеют максимальный размер, который является меньшим, чем 6 мкм.
В теории нет верхнего предела количества фибриноген-связывающих пептидов на молекулу носителя. Оптимальное количество может зависеть от многих факторов, таких как природа носителя, и от количества реакционноспособных групп на каждом носителе для прикрепления фибриноген-связывающих пептидов. Тем не менее, предпочтительно, чтобы на молекулу носителя в среднем приходилось до 100 фибриноген-связывающих пептидов. Предпочтительно, чтобы на молекулу носителя в среднем приходилось по меньшей мере три, предпочтительно, по меньшей мере, пять фибриноген-связывающих пептидов. Предпочтительный диапазон на молекулу носителя составляет 10-20 фибриноген-связывающих пептидов.
Предпочтительно, фибриноген-связывающие пептиды являются ковалентно иммобилизованными на носителе.
Носители содержат реакционноспособные группы, которые позволяют прикрепление фибриноген-связывающих пептидов. Например, носители содержат на их поверхности тиольные компоненты или компоненты аминов. Если носители являются белковоподобными, тиоловые или аминные группы представлены боковыми цепями аминокислот, например, цистеина или лизина. Альтернативно, к носителю добавляются реакционноспособные группы. Это является особенно преимущественным, если носитель выполнен из белка, такого как HSA. Например, носитель использует такой тиолированный реагент, как 2-иминотиолан (2-IT), который обладает способностью взаимодействовать на носителе с первичными аминогруппами. Альтернативно, цистамин соединяется с карбоксильными группами на носителе в присутствии 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида гидрохлорида (EDC) и N-гидроксисукцинимида (NHS) с последующим восстановительным расщеплением введенной дисульфидной связи.
В предпочтительных вариантах осуществления изобретения фибриноген-связывающие пептиды, ковалентно иммобилизованы на носителе через спейсер. Предпочтительный спейсер представляет собой непептидный спейсер, например, содержащий гидрофильный полимер, такой как полиэтиленгликоль (PEG). В предпочтительном варианте осуществления изобретения некоторое количество пептидных конъюгатов, каждый из которых содержит фибриноген-связывающий пептид, связанный с тиоловой реактивной группой (например, с малеимидной группой) с помощью PEG спейсера, взаимодействуют с тиолированным носителем (например, полученным с использованием 2-IT или цистамина, как описано выше).
Носители являются нековалентно иммобилизованными на неколлоидном пористом материале посредством взаимодействия с материалом в водном растворе или суспензии носителей в течение достаточно долгого времени для того, чтобы произошла иммобилизация носителей на материале. В предпочтительном способе, указнный материал пропитывают носителями.
В других вариантах осуществления изобретения каждый фибриноген-связывающий пептид ковалентно иммобилизован непосредственно на неколлоидном пористом материале необязательно при помощи спейсера. Предпочтительный спейсер представляет собой непептидный спейсер, который предпочтительно содержит гидрофильный полимер, такой как PEG.
В таких вариантах осуществления изобретения, неколлоидный пористый материал предпочтительно содержит гранулы или шарики. В особенно предпочтительном варианте осуществления изобретения гранулы или шарики состоят из полимерного вещества, например белка, такого как желатин.
Неколлоидный материал содержит реакционноспособные группы, которые позволяют прикрепление фибриноген-связывающих пептидов. Например, указанный материал содержит на своей поверхности тиольные компоненты или компоненты аминов. Если указанный материал является белковоподобным, тиоловые или аминные компоненты представлены боковыми цепями аминокислот, например, цистеина или лизина. Альтернативно, к материалу добавляются реакционноспособные группы. Это является особенно преимущественным, если указанный материал выполнен из белка, такого как желатин. Например, указанный материал использует такой тиолированный реагент, как 2-иминотиолан (2-IT), который обладает способностью взаимодействовать на указанном материале с первичными аминогруппами. Альтернативно, цистамин соединяется с карбоксильными группами на указанном материале в присутствии 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида гидрохлорида (EDC) и N-гидроксисукцинимида (NHS) с последующим восстановительным расщеплением введенной дисульфидной связи.
В предпочтительных вариантах осуществления изобретения фибриноген-связывающие пептиды, ковалентно иммобилизованы на неколлоидном материале при помощи спейсера. Предпочтительный спейсер представляет собой непептидный спейсер, например, содержащий гидрофильный полимер, такой как полиэтиленгликоль (PEG). В предпочтительном варианте осуществления изобретения некоторое количество пептидных конъюгатов, каждый из которых содержит фибриноген-связывающий пептид, связанный с тиоловой реактивной группой (например, с малеимидной группой) с помощью PEG спейсера, взаимодействуют с тиолированным указанным материалом (например, полученным с использованием 2-IT или цистамина, как описано выше).
Средство для гемостатической обработки ран согласно настоящему изобретению представлено в сухом виде, предпочтительно в лиофилизированной форме. Пример 5, который описан ниже, показывает, что средство для гемостатической обработки ран согласно настоящему изобретению сохраняет способность сополимеризировать фибриноген при повторном увлажнении после лиофилизации.
Предпочтительно средство для обработки ран является стерильным. Средство для гемостатической обработки ран согласно настоящему изобретению выполнено как стерильное средство для обработки раны, которое является готовым для введения в рану.
В соответствии с настоящим изобретением дополнительно представлено средство для гемостатической обработки раны в комплекте с инструкциями по наложению средства для обработки на рану.
В соответствии с настоящим изобретением также предлагается набор для формирования средства для гемостатической обработки раны, который содержит неколлоидный пористый материал и, отдельно, гемостатический агент, содержащий некоторое количество носителей и некоторое количество фибриноген-связывающих пептидов, иммобилизованных на каждом носителе, где каждый фибриноген-связывающий пептид содержит: аминокислотную последовательность Gly-Pro-Arg-Xaa (SEQ ID NO: 1) в аминоконцевой части пептида, в которой Хаа обозначает любую аминокислоту кроме валина, предпочтительно пролин, саркозин или лейцин; или аминокислотную последовательность Gly-His-Arg-Xaa (SEQ ID NO: 2) в аминоконцевой части пептида, в которой Хаа обозначает любую аминокислоту кроме пролина.
Набор дополнительно содержит инструкции по нанесению указанного агента на неколлоидный пористый материал перед наложением указанного материала на рану и/или инструкции по наложению средства для гемостатической обработки раны на рану.
В соответствии с настоящим изобретением также предлагается гемостатический агент, который содержит некоторое количество носителей и некоторое количество фибриноген-связывающих пептидов, иммобилизованных на каждом носителе, где каждый фибриноген-связывающий пептид содержит: аминокислотную последовательность Gly-Pro-Arg-Xaa (SEQ ID NO: 1) в аминоконцевой части пептида, в которой Хаа обозначает любую аминокислоту кроме валина, предпочтительно пролин, саркозин или лейцин; или аминокислотную последовательность Gly-His-Arg-Xaa (SEQ ID NO: 2) в аминоконцевой части пептида, в которой Хаа обозначает любую аминокислоту кроме пролина, и при этом указанный агент упакован совместно с инструкциями по нанесению указанного агента на неколлоидный пористый материал перед наложением указанного материала на рану.
Преимущественно, гемостатическый агент может находиться в виде раствора, в виде суспензии или в сухом виде, например, в лиофилизированной форме. Пример 3, который описан ниже, показывает, что гемостатический агент согласно настоящему изобретению сохраняет способность сополимеризировать фибриноген после экстрагирования в раствор из лиофилизированного средства для гемостатической обработки раны согласно настоящему изобретению. Пример 6 показывает, что гемостатический агент согласно настоящему изобретению является стабильным в растворе в течение по меньшей мере шести месяцев при температуре 37°C. Таким образом, при желании, гемостатический агент согласно настоящему изобретению можно хранить в растворе, благодаря этому устраняется необходимость в восстановлении в растворенное состояние перед использованием.
Настоящее изобретение дополнительно представляет способ остановки кровотечения, особенно сильного кровотечения, который включает в себя наложение средства для гемостатической обработки раны на рану согласно настоящему изобретению.
Термин "сильное кровотечение" используется в настоящем документе для того, чтобы обозначить кровотечение, которое требует вмешательства (хирургического или эндоскопического) или декомпрессию замкнутого пространства для того, чтобы остановить или контролировать эпизод, в результате которого произошло кровотечение и нарушение гемодинамики (требующее гемотрансфузии, восстановления объема потерянной жидкости, инотропной поддержки или хирургического вмешательства), или кровотечение, которое не может быть остановлено с помощью общепринятых вмешательств, таких как пальцевое прижатие, прижигание или наложение швов.
В соответствии с настоящим изобретением также предлагается способ изготовления средства для гемостатической обработки раны, которое содержит некоторое количество фибриноген-связывающих пептидов, иммобилизованных на неколлоидном пористом материале, где каждый фибриноген-связывающий пептид содержит: аминокислотную последовательность Gly-Pro-Arg-Xaa (SEQ ID NO: 1) в аминоконцевой части пептида, в которой Хаа обозначает любую аминокислоту кроме валина, предпочтительно пролин, саркозин или лейцин; или аминокислотную последовательность Gly-His-Arg-Xaa (SEQ ID NO: 2) в аминоконцевой части пептида, в которой Хаа обозначает любую аминокислоту кроме пролина.
Некоторое количество фибриноген-связывающих пептидов являются ковалентно или нековалентно иммобилизованными на неколлоидном пористом материале.
Предпочтительно, некоторое количество фибриноген-связывающих пептидов являются иммобилизованными на неколлоидном пористом материале при помощи некоторого количества носителей иммобилизованных на неколлоидном пористом материале, при этом некоторое количество фибриноген-связывающих пептидов являются иммобилизованными на каждом носителе.
Определенные способы дополнительно включают в себя некоторое количество фибриноген-связывающих пептидов, которые иммобилизованы на каждом носителе.
Предпочтительно, некоторое количество носителей являются нековалентно иммобилизованными на неколлоидном пористом материале, и некоторое количество фибриноген-связывающих пептидов являются иммобилизованными, предпочтительно ковалентно, на каждом носителе.
Подходящие способы ковалентной иммобилизации фибриноген-связывающих пептидов с носителями, необязательно через спейсер (предпочтительно непептидный спейсер, например, содержащий гидрофильный полимер, такой как PEG), описаны выше.
Подходящие способы нековалентной иммобилизации носителей на неколлоидном пористом материале описаны выше.
Подходящие способы ковалентной иммобилизации каждого фибриноген-связывающего пептида непосредственно на неколлоидном пористом материале, необязательно через спейсер (предпочтительно непептидный спейсер, например, содержащий гидрофильный полимер, такой как PEG), описаны выше.
В соответствии с настоящим изобретением также предлагается способ изготовления средства для гемостатической обработки раны, который включает в себя нанесение гемостатического агента на неколлоидный пористый материал, при этом указанный гемостатический агент содержит некоторое количество носителей и некоторое количество фибриноген-связывающих пептидов, иммобилизованных на каждом носителе, где каждый фибриноген-связывающий пептид содержит: аминокислотную последовательность Gly-Pro-Arg-Xaa (SEQ ID NO: 1) в аминоконцевой части пептида, в которой Хаа обозначает любую аминокислоту кроме валина, предпочтительно пролин, саркозин или лейцин; или аминокислотную последовательность Gly-His-Arg-Xaa (SEQ ID NO: 2) в аминоконцевой части пептида, в которой Хаа обозначает любую аминокислоту кроме пролина.
Гемостатический агент нековалентно вводится в неколлоидный пористый материал, например, посредством взаимодействия водного раствора или суспензии гемостатического агента с указанным материалом в течение достаточно долгого времени для того, чтобы произошла иммобилизация гемостатического агента на материале. В предпочтительном способе, материал пропитывают гемостатическим агентом.
Особенно предпочтительные средства для гемостатической обработки раны согласно настоящему изобретению содержат некоторое количество растворимых носителей (предпочтительно растворимых белковых носителей, таких как носитель альбумин) в которых некоторое количество фибриноген-связывающих пептидов (каждый пептид предпочтительно содержащий аминокислотную последовательность Gly-Pro-Arg-Pro-Gly- (SEQ ID NO: 6) в аминоконцевой части) ковалентно иммобилизованы посредством непептидного спейсера (подходящего гидрофильного полимера, такого как полиэтиленгликоль) на каждом носителе. Носители являются нековалентно иммобилизованными на неколлоидном пористом материале (предпочтительно, содержащем желатин, такой как желатиновый тампон, или содержащем целлюлозное химическое волокно или сложный полиэфир). Примеры таких средств для гемостатической обработки раны описаны ниже в примерах 2, 3 и 4.
Дополнительно, особенно предпочтительные средства для гемостатической обработки раны согласно настоящему изобретению содержат некоторое количество фибриноген-связывающих пептидов (каждый пептид предпочтительно содержащий аминокислотную последовательность Gly-Pro-Arg-Pro-Gly- в аминоконцевой части пептида), ковалентно иммобилизованых посредством непептидного спейсера (подходящего гидрофильного полимера, такого как полиэтиленгликоль) непосредственно на неколлоидном пористом материале (предпочтительно содержащем желатин в виде желатиновых гранул). Примеры таких средств для гемостатической обработки раны описаны ниже в примере 5.
Варианты осуществления настоящего изобретения теперь будут описаны ниже, в качестве только примера со ссылкой на прилагаемые чертежи, на которых:
Фигура 1 иллюстрирует структуру предпочтительного примера фибриноген-связывающего пептида, который ковалентно иммобилизован на носителе (в соответствии с предпочтительными вариантами осуществления изобретения ковалентно иммобилизованы на носителе некоторое количество таких фибриноген-связывающих пептидов - а на Фигуре иллюстрирован только один фибриноген-связывающий пептид, иммобилизованный на носителе);
Фигура 2а иллюстрирует схему для присвоения оценки тяжести кровотечения в соответствии с Adams и соавт., J Thromb Thrombolysis, 2009, 28(1):1-5;
Фигура 2b иллюстрирует график, который показывает результаты оценки гемостатической активности средства для гемостатической обработки раны в соответствии с предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения;
Фигура 3 иллюстрирует результаты сравнения свертывающей активности носителей с иммобилизованными фибриноген-связывающими пептидами, которые выделены из лиофилизированных и нелиофилизированных средств для гемостатической обработки раны согласно настоящему изобретению;
Фигура 4 иллюстрирует результаты оценки гемостатической активности средства для гемостатической обработки раны в соответствии с дополнительным предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения; и
Фигура 5 иллюстрирует результаты испытаний стабильности фибриноген-связывающих пептидов, иммобилизованных на носителе HSA, которые хранились в растворе при 37°C в течение 6 месяцев.
Обозначение "образование сгустка" и "свертывающая активность" по отношению к средствам для гемостатической обработки раны и гемостатическим агентам согласно настоящему изобретению обозначает образование сополимера, содержащего фибриноген-связывающие пептиды средства, или агентов и фибриногена, которые имеют характеристики сгустка фибрина.
Пример 1
Конъюгация фибриноген-связывающего пептида с носителем альбумином
Этот пример описывает конъюгацию фибриноген-связывающего пептида с последовательностью GPRPG, связанной с малеимидной группой (Mal), при помощи связующего звена полиэтиленгликоля (PEG) с носителем альбумином. Полученный в результате продукт назван "PeproStat".
Сывороточный альбумин человека разбавляют до 50 мг/мл в рабочем буферном растворе (50 ммоль фосфата натрия, 150 ммоль хлорида натрия, 100 ммоль этилендиаминтетрауксусной кислоты [EDTA], рН 8,0±0,2) и тиолируют добавлением шестидесятикратного молярного избытка 2-иминотиолан гидрохлорида. После инкубации в течение одного часа при комнатной температуре тиолированный альбумин отделен от непрореагировавшего 2-иминотиолан гидрохлорида путем диафильтрации тангенциальным потоком с использованием 20 ммоль фосфата натрия, 150 ммоль хлорида натрия, 1 ммоль EDTA, рН 7,2±0,2 (буферная фильтрация).
Конъюгация пептида выполняется путем растворения пептида (GPRPG-PEG12-малеимидного) при концентрации 50 мг/мл в буферной фильтрации и добавления к тиолированному альбумину в соотношении 0,95 мг пептида на 1 мг альбумина. После инкубации в течение одного часа при комнатной температуре избыток пептид удаляется при помощи диализа против 60-кратного избытка ТРИС-буферизированного физиологического раствора (TBS, 20 ммоль ТРИС, 150 ммоль хлорида натрия, рН 7,2±0,2) с использованием диализной мембраны с отсечением по молекулярной массе 10-14 кД, по меньшей мере 16 часов при 4°C с одной сменой буфера. Восстановленный PeproStat разбавляют до 5 мг/мл в TBS, стерильно фильтруют через фильтр 0,2 мкм, разливают и хранят при 4°C.
Содержание белка в конечном продукте оценивается путем измерения оптической плотности при длине волны 280 нм, где Е (280, 1%)=5,3.
Активность конечного продукта исследуется с помощью коагулометра Sigma Amelung KC4. Вкратце, 30 мкл тестового образца при концентрации 0,5 мг/мл добавляют к 100 мкл очищенного человеческого фибриногена при концентрации 3 мг/мл, затем KC4 регистрирует образование сгустка крови менее чем за 6 секунд.
Молекулярная масса конечного продукта оценивается при помощи SDS-PAGE-электрофореза восстановленных образцов с использованием 4-15% трис-глициновых сборных гелей окрашенных Кумасси по сравнению с профилем зоны неокрашенного маркера белка.
Характеристика препарата
Пример 2
Исследование гемостатической активности PeproStat в предварительно пропитанном желатиновом тампоне
Гемостатическая активность PeproStat была определена с использованием гепаринизированной модели кролика. Тем не менее, перед использованием этой модели, важно было определить, что препарат у кролика является активным, в частности, что фибриноген-связывающая последовательность PeproStat (GPRP-) связывается с фибриногеном кролика. Это было сделано путем конъюгирования пептида GPRPG с микрочастицами альбумина, которые затем инкубировали с FITC-меченым фибриногеном кролика. Флуоресцентный фибриноген, связанный с частицами был измерен с помощью проточного цитометра. При помощи этого способа было показано, что связывание PeproStat с кроличьим фибриногеном была сравнимо со связыванием с человеческим фибриногеном. Это подтверждает опубликованные данные, которые показывают, что относящиеся к исследуемой теме кроличьи и человеческие фибриноген-связывающие последовательности, подверженные воздействию при отщеплении тромбином фибринопептида А от фибриногена, являются одинаковыми.
Фибриноген-связывающая последовательность (GPRP) в PeproStat представляет собой производную от последовательности GPR, которая подвергается воздействию, когда фибринопептид А отщепляется от фибриногена под действием тромбина. Четвертая аминокислота в последовательности (пролин) дает более высокую аффинность с фибриногеном, чем естественная отщепленная последовательность человеческого фибриногена, которая имеет остаток валина в этом положении (Laudano and Doolittle Biochemistry 1980, 19: 1013-1019). Laudano и Doolittle доказали, что в то время как все соединения используют концевую последовательность GPR, существует изменение в четвертом положении аминокислоты, которое, как известно, влияет на аффинность с фибриногеном. Данные последовательности показывают, что кроличий фибриноген также имеет остаток валина в положении четыре и, по этой причине, кроличий и человеческий фибриноген, можно ожидать, имеют сравнимую аффинность с GPRP, как и было обнаружено.
Была использована модель абразивного повреждения печени кролика для оценки сравнительной гемостатического действия PeproStat, тромбина или физиологического раствора, которыми были пропитаны желатиновые тампоны. У кроликов, которым вводили гепарин в дозе 1000 ME/кг определяли гемостатическую активность.
Желатиновый тампон был обрезан до размера 2,0×3,0 см с использованием лезвия скальпеля. При каждой обработке образец тампона погружали в 1,5 мл аликвоты испытуемого раствора (PeproStat, тромбина или физиологического раствора). Затем он был извлечен и зажат между пальцами в перчатке для того, чтобы изгнать пузырьки воздуха, а затем возвращен в раствор до тех пор, пока не потребуется.
Поверхностное кругообразное повреждение (диаметром 10,3 мм, глубиной 2-3 мм) было создано путем обработки абразивным инструментом поверхности доли печени с помощью ручной дрели Dremel (модель 395, тип 5, USA; 10000-35000 оборотов в минуту) абразивным камнем с плоской поверхностью (Dremel, номер по каталогу 85602, USA). Выходящая из раны кровь была собрана в течение 15 секунд при помощи предварительно взвешенного сухого тампона. Вес собранной крови был использован в качестве измерения степени тяжести кровотечения. После удаления тампона был применен предварительно пропитанный тестовый тампон, а также была использована влажная марля для легкого придавливания обработанной раны в течение 30 секунд.
Были выполнены последовательно семь повреждений на каждой печени, а испытуемые тампоны рандомизированы по семи органам и тканям. Каждым испытуемым тампоном было выполнено 34 теста.
После удаления влажной марли с оставлением испытуемого тампона на своем месте рана была оценена для гемостаза на 1, 3, 6, 9, и 12 минуте, где одна минута обозначает время от того момента, когда испытуемый тампон был наложен на рану. Показатели кровотечения в баллах 0, 1, 2, 3, 4 и 5 были определены хирургом в соответствии со схемой, иллюстрированной на Фигуре 3а.
Результаты
0 баллов (т.е. отсутствие кровотечения) расценивались как успешный гемостаз в каждой временной точке. Процентное содержание 34 обработок (n=34 кроликов) считавшихся успешными, рассчитывали для каждой временной точки. Результаты иллюстрированы на Фигуре 3b.
Результаты показывают, что PeproStat в концентрации 5 мг/мл в пропитанном желатиновом тампоне является значительно лучшим гемостатическим агентом, чем физиологический раствор или тромбин (в концентрации 125 ед/мл) в пропитанном желатиновом тампоне.
Пример 3
Лиофилизированный PeproStat в желатиновом тампоне
Для определения поглощающей способности тампона 40 см2 желатинового тампона замачивали в 10 мл деионизированной воды. После максимального поглощения при помощи сжимания и повторного замачивания тампона для устранения всего воздуха остались 2 мл воды. Вследствие этого было подсчитано, что поглощающая способность 40 тампона площадью 40 см2 составляет 8 мл.
PeproStat в концентрации 10 мг/мл обессоливали с помощью устройства, которое представляет собой фильтрующую центрифугу Amicon Ultra, и разбавляли до концентрации 2,5 мг/мл. Желатиновый тампон площадью 40 см2 замачивали в 8 мл PeproStat при концентрации 2,5 мг/мл, и тампон затем сжимали пальцами в перчатках для того, чтобы удалить пузырьки воздуха. Тампоны оставляли в растворе и осторожно покачивали в течение 1 часа при комнатной температуре для того, чтобы гарантировать, что весь раствор подвергся адсорбции.
Тампон затем подвергали лиофилизированию с использованием настольного лиофилизатора.
Полки камеры для лиофилизации были приведены к начальной температуре -36°C, при этом тампоны были размещены на предварительно замороженных полках и подвержены этапам термальной обработки, доводящих температуру до -20°C в течение 270 минут.
Первичная сушка была выполнена в течение 800 минут при уменьшении вакуума от 800 мм. рт.ст. с сопутствующим увеличением температуры до 20°C.
Лиофилизированный тампон хранили в эксикаторе.
Успех лиофилизации был проанализирован путем сравнения свертывающей активности PeproStat, извлеченного из тампона после лиофилизации, со свертывающей активностью PeproStat, который не был лиофилизирован.
Было обнаружено, что тампон площадью 40 см2, содержащий 40 мг PeproStat весил после лиофилизации в общей сложности 440 мг.
Из тампона вырезали 25 мг и поместили в лодочку для взвешивания. Сухой PeproStat экстрагировали из тампона посредством тщательного замачивания тампона в 1 мл 10 ммоль фосфата натрия, 150 ммоль буферного раствора хлорида натрия, рН 7,2±0,2, и последующего отжимания полученного в результате раствора из тампона. Процедуру экстракции проводили в четырех отдельных случаях. Содержание белка извлеченного в раствор PeproStat было измерено с использованием 5 мкм С8 симметричности пиков обращенно-фазовой хроматографии HPLC по калибровочной кривой, построенной по разведениям стандартного PeproStat.
Анализ экстрагированного белка показал, что из тампона было извлечено 90-95% белка.
Свертывающую активность образца измеряли с использованием коагулометра Sigma Amelung KC-4, который измеряет время, необходимое для образования сгустка крови. Анализ свертывающей активности извлеченного из адсорбента PeproStat сравнивали с нелиофилизированным PeproStat.
Результаты
Результаты иллюстрированы на Фигуре 4.
Не было обнаружено никакого существенного различия между свертывающей активностью контрольного нелиофилизированного PeproStat и PeproStat из лиофилизированного тампона при испытании в коагулометре KC-4 при концентрации 0,5 мг/мл.
Пример 4
Гемостатическая активность PeproStat в пропитанном вискозно/полиэфирном пористом средстве
Гемостатическая активность 0,5 мл PeproStat при концентрации 5 мг/мл в пропитанной полиэфир/вискозной смеси была измерена с использованием метода определения импеданса крови следующим образом:
Двойной слой полиэфир/вискозной марли был растянут над универсальным контейнером с внутренним диаметром 2,5 см и была отмечена площадь марли, покрывающей открытую цилиндрическую область. Марля была удалена из цилиндрической области и 0,5 мл PeproStat при концентрации 5 мг/мл наносили на отмеченную окружность; 0,5 мл воды наносили на второе средство, отмеченное таким же образом, в качестве контроля.
Универсальные контейнеры были взвешены и пропитанные марли были растянуты над горловиной цилиндрической части. Затем последовательно наносили на пропитанную марлю 4×0,5 мл цитратной цельной крови, а прохождение крови через марлю измеряли по весу крови в цилиндрической части.
Результаты
Средний вес крови, прошедшей через марлю, содержащую PeproStat был 0,009 г±0,016 г (n=3) по сравнению с 0,695 г±0,721 г, прошедшей через контрольную марлю (n=3), как иллюстрировано в репрезентативном изображении, показанном на Фигуре 5.
Пример 5
Гемостатические свойства желатиновых носителей с иммобилизованными фибриноген-связывающими пептидами
Этот пример описывает приготовление двух различных предпочтительных средств для гемостатической обработки раны согласно настоящему изобретению и их гемостатические свойства. Оба средства содержали некоторое количество желатиновых носителей с некоторым количеством фибриноген-связывающих пептидов, ковалентно иммобилизованных на каждом носителе посредством такого связывающего агента, как полиэтиленгликоль. В этом примере желатиновые носители (или гранулы) представляют неколлоидный пористый материал.
Для приготовления первого средства был использован 2-иминотиолан с целью ковалентного присоединения некоторого количества конъюгатов фибриноген-связывающий пептид-PEG-связывающий агент к желатиновому носителю. Для приготовления второго средства фрагменты цистамина были конъюгированы с карбоксильными группами желатина в присутствии 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида гидрохлорида (EDC) и N-гидроксисукцинимида (NHS) с последующим восстановительным расщеплением введенной дисульфидной связи для того, чтобы образовать свободный тиол для прикрепления фибриноген-связывающего пептида.
Приготовление желатиновых гранул конъюгированных с GPRPG-PEG-12-Mal с использованием 2-иминотиолана
Желатиновые гранулы были тиолированы с использованием 2-иминотиолана, который модифицирует аминные остатки. Способ был использован в соответствии с Kommareddy S, Amiji М, 2005, Bioconjugate Chem 16: 1423-1432.
1 г желатиновых гранул взвешивали и гидратировали в 40 мл буферного раствора, содержащем 50 ммоль фосфата натрия, 0,15 моль NaCl, 0,1 моль EDTA, рН 8,0±0,2 путем смешивания на вальцовом смесителе в течение 10 минут при комнатной температуре. В гидратированный желатин добавляли 102 г 2-иминотиолана и перемешивали в вальцовом смесителе в течение 1 часа. Гранулы затем центрифугировали при 500 об/мин центрифугой RCF 28 в течение 2 минут, затем надосадочная жидкость была удалена, а объем замещен 20 ммоль фосфата натрия, 0,15 моль NaCl, 0,1 моль ЭДТА, рН 7,2±0,2. Это повторяли четыре раза для того, чтобы удалить 2-иминотиолан.
С целью определения количества -SH групп, введенных в желатин, был проведен анализ Эллмана. Реагент Эллмана - 5,5'-дитиобис-(2-нитробензойная кислота) - взаимодействует с сульфгидрилами при слегка щелочных условиях для того, чтобы высвободить высоко хромогенное соединение 5-тио-2-нитробензойную кислоту (TNB) Ellman GL. (1959) Arch Bichem. Biophys. 82 70-77.
После количественной оценки SH-групп 2,5 мл GPRPG-PEG-12-Mal в концентрации 50 мг/мл было добавлено к гранулам и перемешивали в вальцовом смесителе в течение 1 часа. Затем гранулы промывали четыре раза дистиллированной водой для того, чтобы удалить избыток пептида. Суспензия гранул была помещена в пластиковый контейнер и высушена путем инкубации при 37°C в течение 15 часов.
Приготовление желатиновых гранул конъюгированных с GPRPG-PEG-12-Mal с использованием химического соединения EDC/цистамин
2,2 г желатиновых гранул были взвешены и гидратированы в 80 мл 50 ммоль буферного раствора MES, рН 6,0, в течение 15 минут на вальцовом смесителе. 625 мг цистамина, 350 мг 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида гидрохлорида (EDC) и 130 мг N-гидроксисукцинимида (NHS) были взвешены и добавлены к гидратированным гранулам. Реакционную смесь выдерживали в течение 2 часов в вальцовом смесителе при температуре окружающей среды, а затем разлили в два мерных цилиндра емкостью 50 мл. Затем гранулы были промыты и центрифугированы при 500 оборотов/мин с 4×40 мл объемами MES буферного раствора. 200 мкл одномолярного трис(2-карбоскиэтил)фосфина (ТСЕР) исходного раствора добавляли в каждую пробирку и оставляли на 10 минут в вальцовом смесителе при комнатной температуре. Повторяли промывание с 4 объемами MES с последующим проведением анализа Эллмана для того, чтобы определить свободные -SH.
7,2 мл GPRPG-PEG-12-Mal в концентрации 50 мг/мл смешивали с 10,45 мл N-этил-малеимида, а затем 8,8 мл смеси было добавлено в каждую пробирку. Реакционную смесь выдерживали в течение 1 часа в вальцовом смесителе при температуре окружающей среды.
Реакционные смеси промывали и центрифугировали при 800 об/мин с 4 объемами воды Milli-Q для того, чтобы удалить избыток пептида и N-этил-малеимида. Гранулы затем вылили в пластиковую коробку, покрытую Nescofilm, затем Nescofilm пробили и поместили в настольный лиофилизатор для сушки следующим образом:
Процесс сушки для конъюгированных гранул
Полки камеры для лиофилизации были приведены к начальной температуре -36°C, при этом желатиновые гранулы были размещены на предварительно замороженных полках и подвержены этапам термальной обработки, доводящих температуру до -20°C в течение 270 минут. Первичная сушка была выполнена в течение 800 минут при уменьшении вакуума от 800 мм. рт.ст. с сопутствующим увеличением температуры до 20°C. Лиофилизированные гранулы хранили в эксикаторе до тестирования.
Тестирование гранул сухого желатина на распадаемость тампона
100 мг сухих конъюгированных гранул желатина были помещены в шприц объемом 3 мл, а затем 0,5 мл трис-буферного физиологического раствора (TBS) (0,02 моль Трис, 0,15 моль NaCl, рН 7,2±0,2) были добавлены с помощью наконечника шприца для образования взвеси гранул. 0,5 мл тромбина в концентрации 500 ед/мл или 0,5 мл TBS были добавлены к 100 мг холостой пробы реагента (неконъюгированным гранулам желатина). При использовании наконечника шприца TBS был добавлен из другого шприца объемом 3 мл в каждый состав для образования взвеси. Каждую суспензию затем перемешивали при прохождении ее между шприцами приблизительно 40 раз.
Желатиновая суспензия была добавлена к третьему шприцу объемом 3 мл, а поршень шприца использовался для формирования тампона. Затем было введено в тампон 0,2 мл плазмы и выдержано в течение 3 минут. Затем нижняя часть шприца была отрезана, а тампон вытолкнут в 50 мл колбу, содержащую 0,9% физиологический раствор. Содержимое колбы затем перемешивали в вихревом смесителе в течение 10 минут. Тампон был затем оценен через 10 минут следующим образом:
0 = тампон распался полностью; 2 = присутствуют маленькие комочки (2-5 мм по размеру); 5 = присутствуют крупные куски (5-8 мм); 8 = большей частью тампон остался интактным, признаки эрозии; 10 = тампон полностью интактный.
Результаты
Результаты показывают, что механическая прочность тампона, образованного с помощью конъюгированных желатиновых гранул согласно настоящему изобретению является эквивалентной неконъюгированным гранулам, смешанным с тромбином.
Пример 6
Стабильность в растворе фибриноген-связывающих пептидов, иммобилизованных на носителе
Пример описывает результаты испытаний стабильности фибриноген-связывающих пептидов, иммобилизованных на носителе в растворе при 37°C.
PeproStat (содержащий фибриноген-связывающие пептиды, каждый в последовательности GPRPG, иммобилизованные на носителе HSA) хранился в растворе при 37°C в течение 6 месяцев. В нулевой момент времени, а также в различные моменты времени в течение периода хранения хранимые образцы раствора анализировали на способность образовывать сополимер с фибриногеном следующим образом:
Фибриноген разводили в 10 ммоль HEPES, 0,15 моль NaCl, рН 7,3+/10,2 до концентрации 6 мг/мл. 25 мкл PeproStat в концентрации 5 мг/мл было добавлено к 400 мкл разведенного фибриногена, а время, необходимое для формирования визуального сгустка крови, содержащего сополимер PeproStat и фибриноген, было запротоколировано.
Результаты иллюстрированы на Фигуре 5 и демонстрируют, что PeproStat является стабильным в растворе при 37°C в течение по меньшей мере 6 месяцев.
1. Средство для гемостатической обработки раны, которое содержит неколлоидный пористый материал и более чем один фибриногенсвязывающий пептид, иммобилизованный на указанном неколлоидном пористом материале, причем каждый фибриногенсвязывающий пептид содержит:
аминокислотную последовательность Gly-Pro-Arg-Xaa (SEQ ID NO: 1) в аминоконцевой части указанного пептида, в которой Хаа представляет собой любую аминокислоту, кроме валина; или
аминокислотную последовательность Gly-His-Arg-Xaa (SEQ ID NO: 2) в аминоконцевой части указанного пептида, в которой Хаа представляет собой любую аминокислоту, кроме пролина, и
при этом указанный неколлоидный пористый материал содержит лист, тампон, губку, пену, пленку, марлю, сетку, гранулы или шарики, при этом в случае если указанный неколлоидный пористый материал содержит гранулы или шарики, по меньшей мере большая часть указанных гранул или шариков имеют максимальный размер, составляющий более 6 мкм.
2. Средство по п. 1, отличающееся тем, что каждый фибриногенсвязывающий пептид содержит аминокислотную последовательность Gly-Pro-Arg-Xaa (SEQ ID NO: 1) в аминоконцевой части указанного пептида, в которой Хаа представляет собой пролин, саркозин или лейцин.
3. Средство по п. 1, отличающееся тем, что более чем один фибриногенсвязывающий пептид является нековалентно иммобилизованным на указанном неколлоидном пористом материале.
4. Средство по п. 1, отличающееся тем, что более чем один носитель является иммобилизованным на указанном неколлоидном пористом материале, а более чем один фибриногенсвязывающий пептид является иммобилизованным на каждом носителе.
5. Средство по п. 4, отличающееся тем, что более чем один фибриногенсвязывающий пептид является ковалентно иммобилизованным на каждом носителе.
6. Средство по п. 5, отличающееся тем, что каждый фибриногенсвязывающий пептид является ковалентно иммобилизованным на носителе при помощи непептидного спейсера.
7. Средство по п. 6, отличающееся тем, что указанный непептидный спейсер содержит гидрофильный полимер.
8. Средство по п. 7, отличающееся тем, что указанный гидрофильный полимер содержит полиэтиленгликоль.
9. Средство по п. 4, отличающееся тем, что указанные носители представляют собой растворимые носители.
10. Средство по п. 1, отличающееся тем, что более чем один фибриногенсвязывающий пептид является ковалентно иммобилизованным на указанном неколлоидном пористом материале.
11. Средство по п. 10, отличающееся тем, что каждый фибриногенсвязывающий пептид является ковалентно иммобилизованным на указанном неколлоидном пористом материале при помощи непептидного спейсера.
12. Средство по п. 11, отличающееся тем, что указанный непептидный спейсер содержит гидрофильный полимер.
13. Средство по п. 12, отличающееся тем, что указанный гидрофильный полимер содержит полиэтиленгликоль.
14. Средство по любому из пп. 1-13, отличающееся тем, что указанный неколлоидный пористый материал содержит желатин, хлопок, целлюлозное химическое волокно, сложный полиэфир, коллаген, альгинат или окисленную целлюлозу.
15. Средство по любому из пп. 1-13, которое находится в сухой форме.
16. Средство по любому из пп. 1-13, которое находится в лиофилизированной форме.
17. Средство по любому из пп. 1-13, отличающееся тем, что каждый из фибриногенсвязывающих пептидов имеет длину от 4 до 60 аминокислотных остатков.
18. Средство по любому из пп. 1-13, которое представлено в комплекте с инструкциями по наложению указанного средства на рану.
19. Средство по любому из пп. 1-13 для остановки кровотечения.
20. Набор для формирования средства для гемостатической обработки раны, который содержит неколлоидный пористый материал и, отдельно, гемостатический агент, содержащий более чем один носитель и более чем один фибриногенсвязывающий пептид, иммобилизованный на каждом носителе, при этом каждый фибриногенсвязывающий пептид содержит: аминокислотную последовательность Gly-Pro-Arg-Xaa (SEQ ID NO: 1) в аминоконцевой части указанного пептида, в которой Хаа представляет собой любую аминокислоту, кроме валина; или аминокислотную последовательность Gly-His-Arg-Xaa (SEQ ID NO: 2) в аминоконцевой части пептида, в которой Хаа представляет собой любую аминокислоту, кроме пролина, и при этом указанный неколлоидный пористый материал содержит лист, тампон, губку, пену, пленку, марлю, сетку, гранулы или шарики, при этом в случае если указанный неколлоидный пористый материал содержит гранулы или шарики, по меньшей мере большая часть указанных гранул или шариков имеют максимальный размер, составляющий более 6 мкм.
21. Набор по п. 20, отличающийся тем, что каждый фибриногенсвязывающий пептид содержит аминокислотную последовательность Gly-Pro-Arg-Xaa (SEQ ID NO: 1) в аминоконцевой части пептида, в которой Хаа представляет собой пролин, саркозин или лейцин.
22. Набор по п. 20, который дополнительно содержит инструкции по нанесению указанного агента на указанный неколлоидный пористый материал перед наложением указанного материала на рану.
23. Набор по п. 20 или 22, который дополнительно содержит инструкции по наложению указанного средства для гемостатической обработки раны на рану.
24. Набор для формирования средства для гемостатической обработки раны, содержащий гемостатический агент, содержащий более чем один носитель и более чем один фибриногенсвязывающий пептид, иммобилизованный на каждом носителе, и неколлоидный пористый материал, при этом каждый фибриногенсвязывающий пептид содержит:
аминокислотную последовательность Gly-Pro-Arg-Xaa (SEQ ID NO: 1) в аминоконцевой части пептида, в которой Хаа представляет собой любую аминокислоту, кроме валина; или
аминокислотную последовательность Gly-His-Arg-Xaa (SEQ ID NO: 2) в аминоконцевой части пептида, в которой Хаа представляет собой любую аминокислоту, кроме пролина;
инструкции по нанесению указанного агента на неколлоидный пористый материал перед наложением материала на рану, которые упакованы совместно с указанным агентом,
причем указанный неколлоидный пористый материал содержит лист, тампон, губку, пену, пленку, марлю, сетку, гранулы или шарики, при этом в случае если указанный неколлоидный пористый материал содержит гранулы или шарики, по меньшей мере большая часть указанных гранул или шариков имеют максимальный размер, составляющий более 6 мкм.
25. Набор по п. 24, отличающийся тем, что каждый фибриногенсвязывающий пептид содержит аминокислотную последовательность Gly-Pro-Arg-Xaa (SEQ ID NO: 1) в аминоконцевой части пептида, в которой Хаа представляет собой пролин, саркозин или лейцин.
26. Способ остановки кровотечения, который включает в себя наложение средства для гемостатической обработки раны по любому из пп. 1-17 на рану.
27. Способ изготовления средства для гемостатической обработки раны, который включает в себя иммобилизацию более чем одного фибриногенсвязывающего пептида на неколлоидном пористом материале, при этом каждый фибриногенсвязывающий пептид содержит:
аминокислотную последовательность Gly-Pro-Arg-Xaa (SEQ ID NO: 1) в аминоконцевой части пептида, в которой Хаа представляет собой любую аминокислоту, кроме валина; или
аминокислотную последовательность Gly-His-Arg-Xaa (SEQ ID NO: 2) в аминоконцевой части пептида, в которой Хаа представляет собой любую аминокислоту, кроме пролина, и
при этом указанный неколлоидный пористый материал содержит лист, тампон, губку, пену, пленку, марлю, сетку, гранулы или шарики, при этом в случае если указанный неколлоидный пористый материал содержит гранулы или шарики, по меньшей мере большая часть указанных гранул или шариков имеют максимальный размер, составляющий более 6 мкм.
28. Способ по п. 27, отличающийся тем, что каждый фибриногенсвязывающий пептид содержит аминокислотную последовательность Gly-Pro-Arg-Xaa (SEQ ID NO: 1) в аминоконцевой части пептида, в которой Хаа представляет собой пролин, саркозин или лейцин.
29. Способ по п. 27, отличающийся тем, что более чем один фибриногенсвязывающий пептид является иммобилизованным на неколлоидном пористом материале при помощи иммобилизации более чем одного носителя на неколлоидном пористом материале, при этом более чем один фибриногенсвязывающий пептид является иммобилизованным на каждом носителе.
30. Способ изготовления средства для гемостатической обработки раны, который включает в себя нанесение гемостатического агента на неколлоидный пористый материал, при этом указанный гемостатический агент содержит более чем один носитель и более чем один фибриногенсвязывающий пептид, иммобилизованный на каждом носителе, где каждый фибриногенсвязывающий пептид содержит: аминокислотную последовательность Gly-Pro-Arg-Xaa (SEQ ID NO: 1) в аминоконцевой части пептида, в которой Хаа представляет собой любую аминокислоту, кроме валина; или аминокислотную последовательность Gly-His-Arg-Xaa (SEQ ID NO: 2) в аминоконцевой части пептида, в которой Хаа представляет собой любую аминокислоту, кроме пролина, и
при этом указанный неколлоидный пористый материал содержит лист, тампон, губку, пену, пленку, марлю, сетку, гранулы или шарики, при этом в случае если указанный неколлоидный пористый материал содержит гранулы или шарики, по меньшей мере большая часть указанных гранул или шариков имеют максимальный размер, составляющий более 6 мкм.
31. Способ по п. 30, отличающийся тем, что каждый фибриногенсвязывающий пептид содержит аминокислотную последовательность Gly-Pro-Arg-Xaa (SEQ ID NO: 1) в аминоконцевой части пептида, в которой Хаа представляет собой пролин, саркозин или лейцин.
