Антитела против клаудина 18.2 для диагностики рака

Изобретение относится к иммунологии. Предложено антитело и его антигенсвязывающий фрагмент против эпитопа, расположенного в С-концевой части клаудина 18.2 (CLDN18.2). Кроме того, описаны гибридомы, продуцирующие антитело по изобретению, конъюгат, содержащий антитело, и диагностический набор. Также рассмотрены способы, основанные на использовании указанного антитела, для выявления или определения количества CLDN18.2 в образце, определения экспрессии CLDN18.2, диагностирования, выявления или наблюдения за течением рака и определения того, подлежит ли раковое заболевание противораковой терапии. Изобретение может найти дальнейшее применение в терапии и диагностике рака. 9 н. и 16 з.п. ф-лы, 3 ил., 9 табл., 9 пр.

 

Клаудины (CLDN) - это интегральные мембранные белки, являющиеся компонентом плотных межклеточных контактов в эпителии и эндотелии. Предполагается, что в молекуле клаудина четыре трансмембранных сегмента, две внеклеточные петли, а N- и С-концы находятся в цитоплазме. Трансмембранные белки семейства клаудинов играют ключевую роль в поддержании плотных контактов между эпителиальными или эндотелиальными клетками и, возможно, участвуют в поддержании цитоскелета и в клеточных сигнальных механизмах.

Клаудин 18 (CLDN18) представляет собой интегральный трансмембранный белок (тетраспанин), в молекуле которого имеются четыре трансмембранные гидрофобные области и две внеклеточных петли, из которых первая петля в полипептидной цепи находится между первой и второй гидрофобными областями, а вторая петля - между третьей и четвертой гидрофобными областями). Клаудин 18 существует в двух различных сплайс-вариантах, которые описаны у мыши и человека (Niimi, Mol. Cell. Biol. 21:7380-90, 2001). Эти сплайс-варианты [вариант 1 (CLDN18.1) - регистрационный номер в Genbank NP_057453, NM_016369, вариант 2 (CLDN18.2): NM 001002026, NP_001002026) имеют молекулярную массу примерно 27,9/27,72 кДа. Белки CLDN18.1 и CLDN18.2 различаются в N-концевой части, включающей первую трансмембранную (ТМ) область и петлю 1, а первичная структура С-концевой части у них одинакова (см. фиг. 1).

Белок CLDN18.1 экспрессируется только в клетках нормальной легочной ткани, а CLDN18.2 - только в клетках желудка, причем в здоровом желудке экспрессия CLDN18.2 ограничена дифференцированными короткоживущими клетками эпителия желудка. Установлено,, что экспрессия CLDN18.2 имеет место в различных опухолевых тканях. Например, CLDN18.2 экспрессируется в карциноме поджелудочной железы, карциноме пищевода, карциноме желудка, карциноме бронхов, карциноме молочной железы и в опухолях уха-горла-носа. CLDN18.2 является ценной мишенью для предотвращения и/или лечения первичных опухолей, например при раке желудка, раке пищевода, раке поджелудочной железы, раке легких (в частности, при немелкоклеточном раке легких), раке яичника, раке прямой кишки, раке печени, раке головы и шеи, при раке желчного пузыря и их метастазах, в частности при метастазирующем раке желудка (например, при опухолях Крукенберга), при перитонеальных метастазах и метастазах лимфатических узлов.

То, что экспрессия CLDN18.2 различна в нормальных и в раковых клетках и притом ограничена обновляющейся популяцией дифференцированных клеток желудка, которые могут быть восполнены за счет стволовых клеток желудка, не несущих мишени, а также мембранная локализация этого белка и его отсутствие в большинстве токсикологически значимых нормальных тканях делают CLDN18.2 привлекательной мишенью для иммунотерапии рака, и использование терапевтических средств на основе антител, нацеленных на CLDN18.2, сулит высокую терапевтическую эффективность при лечении рака.

Клиническому применению антител, нацеленных на CLDN18.2, препятствует высокая гомологичность человеческих CLDN18.1 и CLDN18.2. Удается получить специфичные к CLDN18.2 антитела, нацеленные на N-концевой внеклеточный домен CLDN18.2, в последовательности которого имеются отличия от CLDN18. Попытки получить антитела, нацеленные на N-концевую часть CLDN18.2 и обладающие свойствами, нужными для клинического применения в диагностических целях, например для выявления экспрессии CLDN18.2 в клетках срезов опухолевой ткани, не имели успеха.

К своему удивлению авторы данного изобретения обнаружили, что антитела против определенного эпитопа, расположенного в С-концевой части CLDN18.2, удовлетворяют критериям диагностической применимости антител, в частности для выявления и идентификации клеток, в которых экспрессируется CLDN18.2. Как ни странно, эти антитела, хотя и направлены против последовательности, которая одинакова в CLDN18.1 и в CLDN18.2, не связываются с нераковыми клетками легких.

Антитела по данному изобретению можно использовать, например, при диагностировании рака и/или при установлении экспрессии CLDN18.2 в раковых клетках. Предпочтительно использование антител по данному изобретению касается раковых заболеваний или раковых клеток, которым свойственна экспрессия CLDN18.2 на клеточной поверхности. Мишенью терапии, нацеленной на CLDN18.2, например терапии с использованием антител против CLDN18.2, являются раковые клетки, в которых экспрессируется CLDN18.2. В одном из воплощений данного изобретения в раковых клетках имеет место экспрессия или аномальная экспрессия CLDN18.2, тогда как в нормальных клетках CLDN18.2 не экспрессируется или экспрессируется очень мало. Клетки, в которых экспрессируется CLDN18.2, предпочтительно выбирают из группы, состоящей из туморогенных раковых клеток желудка, пищевода, поджелудочной железы, легких, яичника, прямой кишки, печени, головы и шеи, желчного пузыря.

Раскрытие изобретения

Данное изобретение относится к антителу или к антиген-связывающему фрагменту, которые:

(i) связываются с пептидом, имеющим аминокислотную последовательность TEDEVQSYPSKHDYV (SEQ ID NO: 5) или EVQSYPSKHDYV (SEQ ID NO: 6) и/или

(ii) связываются с клаудином 18.2 (CLDN18.2), причем указанное антитело или его антиген-связывающий фрагмент, связываются с CLDN18.2 путем связывания с по меньшей мере одним эпитопом в молекуле CLDN18.2, имеющим аминокислотную последовательность TEDEVQSYPSKHDYV (SEQ ID NO: 5) или EVQSYPSKHDYV (SEQ ID NO: 6).

В одном из воплощений данного изобретения указанный CLDN18.2 является CLDN18.2, связанным с клеточной мембраной. В одном из воплощений данного изобретения указанный CLDN18.2 присутствует на раковых клетках, причем указанные раковые клетки являются предпочтительно раковыми клетками, в которых экспрессируется CLDN18.2. В одном из воплощений данного изобретения указанные раковые клетки выбирают из группы, состоящей из клеток желудка, пищевода, поджелудочной железы, легких, яичника, прямой кишки, печени, головы и шеи, желчного пузыря. В одном из воплощений данного изобретения антитело или его антиген-связывающий фрагмент по данному изобретению не связывается с нераковыми клетками, за исключением эпителиальных клеток желудка. В одном из воплощений данного изобретения антитело или его антиген-связывающий фрагмент по данному изобретению не связывается с нераковыми клетками легких. В одном из воплощений данного изобретения антитело по данному изобретению является химерным, человеческим или гуманизированным. В одном из воплощений данного изобретения антитело по данному изобретению является моноклональным антителом.

В этом и других своих аспектах данное изобретение относится к антителу, содержащему:

(I) тяжелую цепь антитела, включающую

(i) последовательность тяжелой цепи антитела, соответствующую SEQ ID NO: 7 или ее варианту,

(ii) по меньшей мере одну, предпочтительно две, более предпочтительно - все три последовательности CDR аминокислотной последовательности тяжелой цепи молекулы антитела, соответствующей SEQ ID NO: 7 или ее варианту, или

(iii) последовательность CDR3, соответствующую SEQ ID NO: 10 или ее варианту, и предпочтительно также содержащему последовательность CDR1, соответствующую SEQ ID NO: 8 или ее варианту, и/или последовательность CDR2, соответствующую SEQ ID NO: 9 или ее варианту,

и/или

(II) легкую цепь антитела, включающую:

(i) последовательность легкой цепи антитела, соответствующую SEQ ID NO: 11 или ее варианту,

(ii) по меньшей мере одну, предпочтительно две, более предпочтительно - все три последовательности CDR аминокислотной последовательности легкой цепи молекулы антитела, соответствующей SEQ ID NO: 11 или ее варианту, или

(iii) последовательность CDR3, соответствующую SEQ ID NO: 14 или ее варианту, и предпочтительно также содержащему последовательность CDR1, соответствующую SEQ ID NO: 12 или ее варианту, и/или последовательность CDR2, соответствующую SEQ ID NO: 13 или ее варианту.

В указанных выше и в других своих аспектах данное изобретение относится также к антителу, содержащему:

(I) тяжелую цепь антитела, включающую

(i) последовательность тяжелой цепи антитела, соответствующую SEQ ID NO: 15 или ее варианту,

(ii) по меньшей мере одну, предпочтительно две, более предпочтительно - все три последовательности CDR аминокислотной последовательности тяжелой цепи молекулы антитела, соответствующей SEQ ID NO: 15 или ее варианту, или

(iii) последовательность CDR3, соответствующую SEQ ID NO: 18 или ее варианту, и предпочтительно также содержащему последовательность CDR1, соответствующую SEQ ID NO: 16 или ее варианту, и/или последовательность CDR2, соответствующую SEQ ID NO: 17 или ее варианту,

и/или

(II) легкую цепь антитела, включающую:

(i) последовательность легкой цепи антитела, соответствующую SEQ ID NO: 19 или ее варианту,

(ii) по меньшей мере одну, предпочтительно две, более предпочтительно - все три последовательности CDR аминокислотной последовательности легкой цепи молекулы антитела, соответствующей SEQ ID NO: 19 или ее варианту, или

(iii) последовательность CDR3, соответствующую SEQ ID NO: 22 или ее варианту, и предпочтительно также содержащему последовательность CDR1, соответствующую SEQ ID NO: 20 или ее варианту, и/или последовательность CDR2, соответствующую SEQ ID NO: 21 или ее варианту.

В предпочтительных воплощениях данного изобретения антитело по данному изобретению содержит тяжелую цепь, включающую константную область тяжелой γ1-цепи, предпочтительно константную область тяжелой γ1-цепи человеческого антитела, и/или антитело по данному изобретению содержит легкую цепь, включающую константную область легкой κ-цепи.

В указанных выше и в других своих аспектах данное изобретение относится к антителу, продуцируемому гибридомой (или получаемому из нее), депонированной в Немецком банке микроорганизмов и клеточных культур (DSMZ, Inhoffenstr. 7В, 38124 Брауншвейг, Германия) и имеющей одно из следующих обозначений и регистрационных номеров:

1. muAB 43-14А, регистрационный номер DSM АСС3144, депонировано 6 октября, 2011; или

2. muAB 35-22А регистрационный номер DSM АСС3143, депонировано 6 октября, 2011.

Антитела по данному изобретению в настоящем документе обозначаются по обозначению антитела и/или по обозначению продуцирующего его клона, например muAB 43-14А.

Также по данному изобретению предпочтительны антитела, обладающие специфичностью антител, продуцируемых упомянутыми выше гибридомами (или получаемыми из них) и, в частности, антитела, содержащие участок или сайт связывания антигена, в частности вариабельную область, идентичную или в высокой степени гомологичную таковой антител, продуцируемых упомянутыми выше гибридомами (или получаемых из них). Предполагается, что предпочтительные по данному изобретению антитела имеют области CDR, идентичные или в высокой степени гомологичные областям CDR антител, продуцируемых упомянутыми выше гибридомами (или получаемых из них). Выражение «в высокой степени гомологичные» подразумевает, что в каждой области CDR может быть от 1 до 5 замен, предпочтительно от 1 до 4, например 1-3 или 1-2. Особенно предпочтительны по данному изобретению химеризованные или гуманизированные формы антител, продуцируемых упомянутыми выше гибридомами (или получаемых из них).

Таким образом, антитело по данному изобретению выбирают из группы, состоящей из (i) антитела, продуцируемого клоном, депонированным под регистрационным номером DSM АСС3144 (muAB 43-14А) или DSM АСС3143 (muAB 35-22А), или получаемым из них; (ii) антитела, являющегося химеризованной или гуманизированной формой антитела по пункту (i); (iii) антитела, обладающего специфичностью антитела по пункту (i), и (iv) антитела, содержащего участок или сайт связывания антигена антитела по пункту (i). Участок или сайт связывания антигена антитела по пункту (i) может представлять собой вариабельную область антитела по пункту (i). В объем данного изобретения входят также антиген-связывающие фрагменты антител, описанных в настоящем документе.

Антитела по данному изобретению предпочтительно способны связываться с клаудином 18.2 в его нативном виде, то есть в природном или не денатурированном виде, или же в денатурированном виде.

В одном из воплощений данного изобретения антитела по данному изобретению получают способом, включающим этап иммунизации животных пептидом, содержащим аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5 или SEQ ID NO: 6, а предпочтительно состоящим из нее, или иммунологически эквивалентным пептидом, или нуклеиновой кислотой, или клетками-хозяевами, в которых экспрессируется указанный пептид. Предпочтительно указанный пептид содержит не более 110, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, или 20 расположенных подряд аминокислотных остатков CLDN18.2.

В одном из воплощений данного изобретения антитела по данному изобретению получают способом, включающим этап иммунизации животных пептидом, содержащим аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24 или SEQ ID NO: 25, а предпочтительно состоящим из нее, или иммунологически эквивалентным пептидом, или нуклеиновой кислотой, или клетками-хозяевами, в которых экспрессируется указанный пептид. Предпочтительно указанный пептид содержит не более 110, 100, 90, 80 или 75 расположенных подряд аминокислотных остатков CLDN18.2.

Антитела или антиген-связывающие фрагменты, по данному изобретению могут быть соединены, то есть ковалентно или не ковалентно связаны, с другими молекулами, например с метками, по которым их можно выявить.

Данное изобретение относится также к клетками, например гибридомам, продуцирующим описанные в настоящем документе антитела.

Предпочтительными по данному изобретению гибридомами являются клетки, депонированные в Немецком банке микроорганизмов и клеточных культур (DSMZ, Inhoffenstr. 7 В, 38124 Брауншвейг, Германия) и имеющие одно из следующих обозначений и регистрационных номеров:

1. muAB 43-14А, регистрационный номер DSM АСС3144, депонирован 6 октября, 2011; или

2. muAB 35-22А регистрационный номер DSM АСС3143, депонирован 6 октября, 2011.

Данное изобретение относится также к пептидам, содержащим аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5 или SEQ ID NO: 6, а предпочтительно состоящим из нее, или к иммунологически эквивалентным пептидам. Предпочтительно указанный пептид содержит не более ПО, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, или 20 расположенных подряд аминокислотных остатков CLDN18.2.

Данное изобретение относится также к пептидам, содержащим аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24 или SEQ ID NO: 25, а предпочтительно состоящим из нее, или к иммунологически эквивалентным пептидам, или нуклеиновым кислотам, или клеткам-хозяевам, в которых экспрессируется указанный пептид. Предпочтительно указанный пептид содержит не более ПО, 100, 90, 80 или 75 расположенных подряд аминокислотных остатков CLDN18.2.

Данное изобретение относится также к нуклеиновым кислотам, содержащим гены или нуклеотидные последовательности, кодирующие антитела или их части, например какие-либо из цепей молекулы антитела, или антиген-связывающие фрагменты, или пептиды, описанные в настоящем документе. Предпочтительно нуклеиновая кислота по данному изобретению функционально соединена с элементами, регулирующими экспрессию в эукариотических или прокариотических клетках. Регуляторные элементы, обеспечивающие экспрессию генов в эукариотических или прокариотических клетках хорошо известны в данной области техники.

Нуклеиновая кислота по данному изобретению может входить в состав вектора, например плазмиды, космиды, вируса, бактериофага или иного вектора, обычно используемого в генетической инженерии. Этот вектор может также содержать маркерные гены, позволяющие осуществлять его отбор в подходящих клетках-хозяевах и в подходящих условиях. Также этот вектор может содержать элементы, регулирующие экспрессию, которые обеспечивают должную экспрессию кодирующих последовательностей в подходящих организмах-хозяевах. Такие регуляторные элементы известны специалистам в данной области техники; они включают промоторы, сплайсирующиеся кассеты и кодоны инициации трансляции.

Методы конструирования молекул нуклеиновых кислот и содержащих их векторов, методы введения векторов в соответственно выбранные клетки-хозяева и методы инициирования и обеспечения экспрессии этих молекул хорошо известны в данной области техники.

В другом своем аспекте данное изобретение относится к клеткам-хозяевам, содержащим нуклеиновые кислоты или векторы, описанные в настоящем документе.

В другом своем аспекте данное изобретение относится к выявлению CLDN18.2 или клеток, в которых экспрессируется CLDN18.2, или определения количества CLDN18.2 или клеток, в которых экспрессируется CLDN18.2, с использованием антител или антиген-связывающего фрагмента, по данному изобретению. CLDN18.2 или клетки, в которых экспрессируется CLDN18.2, определяют путем выявления или определения количества комплекса, образуемого CLDN18.2 и антителом или антиген-связывающим фрагментом по данному изобретению. Образование такого комплекса указывает на присутствие CLDN18.2 или клеток, в которых экспрессируется CLDN18.2. Подобное выявление или определение количества может осуществляться различными путями, включая иммунодетекцию с использованием антител или антиген-связывающих фрагментов по данному изобретению (но не ограничиваясь ею). Методы использования антител для выявления пептидов или белков хорошо известны; к ним относятся твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA), анализ конкурентного связывания и проч. В принципе в таких методах используются антитела или фрагменты антител, специфично связывающиеся с мишенью - пептидом или белком, непосредственно или опосредованно связанным с меткой, обеспечивающей выявление, например с индикаторным ферментом, радиоактивным веществом, флуорофором или парамагнитными частицами. Способы по данному изобретению позволяют качественно и/или количественно определить, например измерить в абсолютных или относительных единицах, уровни CLDN18.2 или клеток, в которых экспрессируется CLDN18.2.

В одном из своих аспектов данное изобретение относится к способу выявления CLDN18.2 или определения количества CLDN18.2 в образце, включающему этапы:

(i) контактирования образца с антителом или антиген-связываюпщм фрагментом по данному изобретению или с конъюгатом по данному изобретению и

(ii) выявления образования комплекса или определения количества комплекса, образуемого CLDN18.2 и таким антителом, антиген-связьтающим фрагментом, или конъюгатом.

В одном из воплощений данного изобретения упомянутый образец является клеточным, то есть это образец, содержащий клетки, например раковые клетки. В этом воплощении комплекс образуют предпочтительно антитело, антиген-связывающий фрагмент или конъюгат, с одной стороны, и CLDN18.2, экспрессирующийся в клетках указанного образца, с другой стороны.

В одном из своих аспектов данное изобретение относится к способу определения экспрессии CLDN18.2, включающему этапы:

(i) контактирования клеточного образца с антителом или антиген-связьтающим фрагментом, по данному изобретению или с конъюгатом по данному изобретению и

(ii) выявления образования комплекса, образуемого CLDN18.2, экспрессирующимся в клетках указанного образца, и антителом, антиген-связывающим фрагментом, или конъюгатом.

В одном из воплощений данного изобретения клетки образца являются раковыми. Предпочтительно образуется комплекс из CLDN18.2, экспрессирующегося в клетках указанного образца, и антитела, антиген-связывающего фрагмента, или конъюгата по данному изобретению.

В других своих аспектах данное изобретение относится к способам диагностирования или классифицирования заболеваний с помощью CLDN18.2 в качестве мишени и антитела или антиген-связывающего фрагмента по данному изобретению. Эти способы обеспечивают избирательное выявление клеток, в которых экспрессируется CLDN18.2, тем самым позволяя отличить эти клетки от нормальных клеток, в которых не экспрессируется CLDN18.2, или аномальных клеток, в которых не экспрессируется CLDN18.2. Заболевания, характеризующиеся тем, что в обусловливающих его клетках экспрессируется CLDN18.2, подлежат лечению, при котором CLDN18.2 служит мишенью, например лечение терапевтическими антителами против CLDN18.2. Предпочтительными для такой диагностики или лечения являются те заболевания, при которых имеет место экспрессия или аномальная экспрессия CLDN18.2, в частности раковые заболевания, например описанные в настоящем документе.

В одном из своих аспектов данное изобретение относится к способам диагностирования, выявления или наблюдения за течением, то есть определения регрессии, прогрессирования, динамики и/или начала, ракового заболевания, включающим выявление CLDN18.2 или клеток, в которых экспрессируется CLDN18.2, и/или определение количества CLDN18.2 или клеток, в которых экспрессируется CLDN18.2, в биологическом образце, взятом у больного, при помощи антитела или антиген-связывающего фрагмента по данному изобретению. Такие способы можно применять для того, чтобы определить, имеется ли у пациента раковое заболевание или повышен ли для него риск развития ракового заболевания, или, например, эффективно ли схема лечения.

Таким образом, в одном из своих аспектов данное изобретение относится к способу диагностирования, выявления или наблюдения рака, включающему этапы:

(i) контактирования биологического образца с антителом или антиген-связывающим фрагментом, по данному изобретению или с конъюгатом по данному изобретению и

(ii) выявления образования и/или определения количества комплекса, образуемого CLDN18.2 и антителом, антиген-связьшающим фрагментом, или конъюгатом по данному изобретению:

В одном из воплощений данного изобретения биологический образец является клеточным образцом, то есть образцом, включающим клетки, например раковые клетки. В этом воплощении данного изобретения предпочтительно образуется комплекс из CLDN18, экспрессирующегося в клетках указанного образца, и антителом, антиген-связывающим фрагментом, или конъюгатом по данному изобретению.

Способы наблюдения за течением болезни по данному изобретению предпочтительно включают выявление и/или определение количества CLDN18.2 или клеток, в которых экспрессируется CLDN18.2, в первом образце в первый момент времени и в другом образце во второй момент времени, причем регрессия, прогрессирование, динамика и/или начало опухолевого заболевания можно определить путем сравнения этих двух образцов.

В типичном случае уровень CLDN18.2 или клеток, в которых экспрессируется CLDN18.2, в биологическом образце сопоставляют с некоторым уровнем, выбранпым для сравнения, причем отклонение от этого уровня является указанием на наличие или стадию ракового заболевания у данного пациента. Уровнем, взятым для сравнения, может быть уровень, определенный в контрольном образце (например, взятом из нормальной ткани или у здорового индивида, в частности у индивида, не страдающего раковым заболеванием), или средний уровень по данным для здоровых индивидов. Под отклонением от уровня, взятого для сравнения, понимается любое значительное изменение, например увеличение на по меньшей мере 10%, 20% или 30%, предпочтительно по меньшей мере на 40% или 50%, или даже больше.

Предпочтительно присутствие CLDN18.2 или клеток, в которых экспрессируется CLDN18.2, и/или увеличение количества CLDN18.2 или клеток, в которых экспрессируется CLDN18.2, по сравнению с уровнем, взятым для сравнения, например по сравнению с индивидом, не страдающим раковым заболеванием, указывает на наличие или риск (то есть возможность развития) ракового заболевания у данного пациента.

Уменьшение количества CLDN18.2 или клеток, в которых экспрессируется CLDN18.2, по сравнению с биологическим образцом, взятым у данного пациента ранее, может указывать на регрессию, положительную динамику, например на успешность лечения, или на уменьшение риска возникновения ракового заболевания у данного пациента.

Увеличение количества CLDN18.2 или клеток, в которых экспрессируется CLDN18.2, по сравнению с биологическим образцом, взятым у данного пациента ранее, может указывать на прогрессирование: отрицательную динамику, например на неэффективность лечения, рецидив или метастазирование, на начало или на риск возникновения ракового заболевания у данного пациента.

В одном из своих аспектов данное изобретение относится к способу, позволяющему определять, подлежит ли раковое заболевание лечению методом с использованием CLDN18.2 в качестве мишени, включающему этапы:

(i) контактирования образца, содержащего раковые клетки, с антителом или антиген-связывающим фрагментом, по данному изобретению или с конъюгатом по данному изобретению и

(ii) выявления образования комплекса из CLDN18.2 и антитела, антиген-связывающего фрагмента, или конъюгата по данному изобретению.

Предпочтительно образуется комплекс из CLDN18.2, экспрессирующегося в раковых клетках указанного образца, и антитела, антиген-связывающего фрагмента, или конъюгата по данному изобретению.

Такие способы можно применять для того, чтобы определить, подходит ли для данного пациента лечение, нацеленное на клетки, в которых экспрессируется CLDN18.2, например использование антител, обладающих одной или более иммуноэффекторными функциями, например являющихся специфичными к CLDN18.2 антителами, вызывающими цитотоксический эффект, например антителами, меченными цитотоксическим агентом (токсином или радиоактивным изотопом), или приводящими в действие механизмы гибели клеток, например зависимой от комплемента цитотоксичности (CDC) или зависимой от антител клеточно-опосредованной цитоксичности (ADCC). Лечению, нацеленному на CLDN18.2, подлежат заболевания, характеризующиеся тем, что в обусловливающих заболевание клетках экспрессируется CLDN18.2, например раковые заболевания, в частности описанные в настоящем документе.

В одном из воплощений данного изобретения в упомянутых выше аспектах образец, клеточный образец или биологический образец - это образец, взятый у индивида с раковым заболеванием, с подозрением на наличие или вероятность развития ракового заболевания. В одном из воплощений данного изобретения образец, клеточный образец или биологический образец берут из ткани или органа, в клетках которого в отсутствие ракового поражения этой ткани или органа нет существенной экспрессии CLDN18.2. Предпочтительно указанная ткань не является тканью желудка. Предпочтительно указанная ткань является тканью легкого, пищевода, поджелудочной или молочной железы, причем уже мог быть поставлен диагноз ракового поражения данной ткани или органа, например в результате осмотра или цитологического исследования этой ткани или органа. В этом воплощении данного изобретения указанием на то, что данному индивиду подходит лечение, нацеленное на клетки, в которых экспрессируется CLDN18.2, служит присутствие CLDN18.2 или клеток, в которых экспрессируется CLDN18.2, и/или увеличение количества CLDN18.2 или клеток, в которых экспрессируется CLDN18.2, по сравнению с уровнем, взятым для сравнения, например по сравнению с индивидом, не имеющим опухолевых заболеваний.

В одном из аспектов данного изобретения предлагаются композиции, например диагностического назначения, или наборы, включающие описанные в настоящем документе антитела или фрагменты, связывающие антиген, или сочетание антител и/или антиген-связывающего фрагмента. Такие диагностические композиции или наборы для анализа полезны при осуществлении способов по данному изобретению, например способов для диагностирования, выявления или наблюдения. Эти наборы при необходимости могут содержать выявляемую метку, например индикаторный фермент, радиоактивную метку, флуорофор или парамагнитные частицы. В набор может входить инструкция, содержащая практически полезную информацию, например сведения о том, как использовать реагенты для осуществления способа, описанного в настоящем документе.

Другие признаки и преимущества данного изобретения явствуют из приведенных ниже раздела «Подробное описания изобретения» и формулы изобретения.

Подробное описание изобретения

Хотя ниже данное изобретение описывается подробно, следует учесть, что оно не ограничивается конкретными методиками, протоколами и реагентами, описанными в настоящем документе, поскольку они могут варьировать. Следует также принять во внимание, что используемая в настоящем документе терминология служит лишь задаче описания конкретных воплощений данного изобретения и не должна ограничивать объем данного изобретения, который ограничивается только прилагаемой формулой изобретения. Если не говорено иного, то все технические и научные термины в настоящем документе употребляются в тех же значениях, в которых они понимаются рядовым специалистом в данной области техники.

Ниже описываются элементы данного изобретения. Эти элементы упоминаются в связи с конкретными воплощениями данного изобретения, однако следует учесть, что их можно комбинировать любым образом и в любом числе для создания дополнительных воплощений. Различным образом описанные примеры и предпочтительные воплощения не следует истолковывать как ограничивающие объем изобретения только конкретно описанными воплощениями. Настоящее описание следует понимать как подтверждающее и охватывающее воплощения данного изобретения, в которых сочетается подробное описание с любым числом описанных и/или предпочтительных элементов. Также любые перестановки и комбинации всех описанных элементов в настоящей заявке следует считать раскрытыми в настоящем описании, если только из контекста не следует иного.

Предпочтительно употребляемые в настоящем документе термины имеют значения, определяемые «Многоязычным словарем биотехнологических терминов» - "А multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)", H.G.W. Leuenberger, B. Nagel, and H. Kolbl, Eds., Helvetica Chimica Acta, CH-4010, Базель, Швейцария (1995).

Практическое осуществление данного изобретения включает, если не указано иного, применение общепринятых химических, биохимических, цитологических, иммунологических методов и технологии рекомбинантных ДНК, освещенных в литературе по данной области техники (см., например, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, J. Sambrook et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor 1989).

В настоящем описании и в прилагаемой формуле изобретения, если и контекста не следует иного, глагол «содержать» и его производные такие как «содержащий» «содержит» означают, что указанный компонент, число или этап или группа компонентов, чисел или этапов включаются, но при этом не исключаются какие-либо другие компоненты, числа или этапы или группы компонентов, чисел иди этапов, хотя в некоторых воплощениях данного изобретения такие другие компоненты, числа или этапы или группы компонентов, чисел иди этапов могут исключаться, то есть существенно включение указанного компонента, числа иди этапа или группы компонентов, чисел или этапов. В контексте описания данного изобретения (и особенно в контексте формулы изобретения) слова указанные в единственном числе подразумевают как единственное, так и множественное число, если только не указано или с очевидностью не следует из конкретного контекста иное значение). Приведенные в настоящем документе диапазоны значений той или иной величины служат лишь для краткости обозначения всего набора отдельных значений в пределах указанного диапазона. Каждое из этих отдельных значений включается в данное описание, как если бы оно было указано буквально (если не оговорено иного). Все описанные в настоящем документе способы можно осуществлять в любом удобном порядке, если иное не указано или не следует с очевидностью из конкретного контекста. Использование в настоящем документе примеров или выражений типа «например», «такие как» и т.п. имеет лишь иллюстративную цель и не носит ограничительного характера в отношении объема данного изобретения, если только не заявлено иного. Никакие выражения в настоящем документе не следует понимать как указывающие на не заявленные элементы, существенные для практического осуществления данного изобретения.

В настоящем описании цитируется ряд документов. Каждый из них (включая все патенты, патентные заявки, научные публикации, инструкции и описания производителей и проч.) как выше, так и ниже по тексту полностью включается в настоящий документ путем отсылки. Ничто в настоящем документе не дает оснований для допущения, что данное изобретение не вправе включать задним числом такие описания в силу более раннего создания настоящего изобретения.

Термин «рекомбинантный» в контексте данного изобретения означает «полученный/созданный путем генетической инженерии». В контексте данного изобретения " рекомбинантный объект, например рекомбинантные клетки, предпочтительно не существует в природе.

Выражения «существует/встречается в природе» или «природный» в настоящем документе относится к тому факту, что данный объект можно найти в естественных условиях в. природе. Например, пептиды или нуклеиновые кислоты, которые присутствуют в организме (включая вирусы), могут быть выделены из природного источника и не были намеренно модифицированы людьми в лабораторных условиях, являются природными/встречающимися в природе.

Термин «антиген» относится к агентам, содержащим эпитоп, против которого возникает и/или направляется иммунный ответ. В контексте данного изобретения антиген - это предпочтительно вещество, которое, при необходимости после некоторых превращений, вызывает иммунологическую реакцию, предпочтительно направленную против этого антигена. Термин «антиген» включает, в частности, белки, пептиды, полисахариды, нуклеиновые кислоты, в том числе РНК и ДНК, и нуклеотиды.

Термин «эпитоп» относится к антигенной детерминанте в молекуле, то есть к той ее части, которая распознается иммунной системой, например, распознается антителами. Например, эпитопами являются дискретные организованные в трех измерениях сайты в молекуле антигена, распознаваемые иммунной системой. Эпитоп обычно состоит из химически активных группировок, располагающихся на поверхности молекулы, например аминокислотных остатков или боковых цепей Сахаров; эпитоп, как правило, обладает специфическими особенностями пространственной структуры, а также специфическими электрическими свойствами (зарядом). Различают конформационные и неконформационные эпитопы: первые, в отличие от вторых, исчезают в присутствии денатурирующих агентов. Эпитоп белка, например клаудина, предпочтительно представляет собой непрерывный или составной участок полипептидной цепи длиной предпочтительно от 5 до 100, предпочтительно от 5 до 50, более предпочтительно от 8 до 30, наиболее предпочтительно от 10 до 25 аминокислотных остатков; например, эпитоп может быть длиной предпочтительно 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23,24 или 25 аминокислотных остатков.

Термин «составной/дискретный/не непрерывный эпитоп» в настоящем документе означает конформационный эпитоп белкового антигена, образованный по меньшей мере двумя не. соседними участками первичной структуры (аминокислотной последовательности) данного белка.

В одном из предпочтительных воплощений данного изобретения антиген является ассоциированным с опухолью, например это CLDN18.2, то есть компонент раковых клеток, происходящий из цитоплазмы, клеточной поверхности или ядра, в частности это может быть антиген, образующийся предпочтительно в большом количестве внутри или на поверхности раковой клетки.

В контексте данного изобретения термин «антиген, ассоциированный с опухолью» или «опухолевый антиген» относится к белкам, которые в норме экспрессируются специфически - только в ограниченном числе тканей и/или органов или на определенной стадии развития, например антиген, ассоциированный с опухолью, в норме экспрессируется в ткани желудка, предпочтительно в слизистой желудка, в репродуктивных органах, например в яичках, в трофобластной ткани (например, в плаценте) или в клетках зародышевой линии, и экспрессируется или аномально экспрессируется в одной или более опухолях или раковых тканях. В этом контексте выражение «только в ограниченном числе» предпочтительно означает «не более чем в трех», более предпочтительно «пе более чем в двух». В контексте данного изобретения антигены, ассоциированные с опухолями, включают, например, дифференцировочные антигены, предпочтительно дифференцировочные антигены, специфичные в отношении типа клетки, то есть белки, которые в норме экспрессируются только в клетках определенного типа; раковые/тестикулярные антигены, то есть белки, которые в норме экспрессируются в яичках и иногда в плаценте; и антигены, специфичные для клеток зародышевой линии. В контексте данного изобретения антиген, ассоциированные с опухолями, предпочтительно связаны с поверхностью раковых клеток и предпочтительно не экспрессируются или редко экспрессируются в нормальных тканях. Предпочтительно раковые клетки идентифицируются по антигенам, ассоциированным с опухолями, или по аномальной экспрессии антигенов, ассоциированных с опухолями. В контексте данного изобретения ассоциированный с опухолями антиген, который у данного индивида, например у больного раком, экспрессируется в раковых клетках, является собственным белком организма данного индивида. В предпочтительных воплощениях данного изобретения антигены, ассоциированные с опухолями, в норме экспрессируются только в органах или тканях, которые не являются абсолютно необходимыми, то есть в тех органах или тканях, поражение которых иммунной системой не ведет к смерти индивида, или в тех органах или тканях, или структурах организма, которые не доступны или лишь незначительно доступны для иммунной системы. Предпочтительно аминокислотные последовательности антигена, ассоциированного с опухолью, который экспрессируется в нормальных тканях, и антигена, ассоциированного с опухолью, который экспрессируется в раковой ткани, идентичны.

Примерами дифференцировочных антигенов, которые удовлетворяют критериям антигена, ассоциированного с опухолью, как мишени противоопухолевой иммунотерапии, в частности противоопухолевой вакцинации, являются белки клеточной поверхности из семейства клаудинов, например CLDN18.2. Клаудины - это семейство белков, являющихся наиболее важными компонентами плотных контактов, создающих параклеточный барьер, регулирующий поток веществ в межклеточном пространстве эпителия. Клаудины представляют собой трансмембранные белки, полипептидная цепь которых четыре раза пересекает мембрану, причем N- и С-концы ее располагаются в цитоплазме.

Название «клаудин 18» или "CLDN18" предпочтительно относится к человеческому белку CLDN18, включая любые его сплайс-варианты, например CLDN18.1 и CLDN18.2. CLDN18.1 и CLDN18.2 различаются в N-концевой области, содержащей первый трансмембранный домен и первую петлю, а первичная структура (аминокислотная последовательность) С-концевой части у этих двух белков одинакова.

Обозначение "CLDN18.1" предпочтительно относится к человеческому белку CLDN18.1, в частности к белку, содержащему аминокислотную последовательность, соответствующую последовательности SEQ ID NO: 1 (см. перечень последовательностей) или варианту указанной аминокислотной последовательности.

Обозначение "CLDN18.2" предпочтительно относится к человеческому белку CLDN18.2 в частности к белку, содержащему аминокислотную последовательность, соответствующую последовательности SEQ ID NO: 2 (см. перечень последовательностей) или варианту указанной аминокислотной последовательности.

Термин «вариант» по данному изобретению относится, в частности, к мутантным формам, сплайс-вариантам, конформационным вариантам, изоформам, аллельным вариантам, видовым вариантам и видовым гомологам, в частности существующим в природе. Термин «аллельный вариант» относится к изменениям нормальной нуклеотидной последовательности гена, значение которых зачастую неясно. Определение полной нуклеотидной последовательности гена нередко выявляет его многочисленные аллельные варианты. Термин «видовый гомолог» означает нуклеотидную или аминокислотную последовательность, имеющуюся у вида живых организмов, отличного от вида - источника данной нуклеотидной или аминокислотной последовательности.

Обозначения "CLDN", "CLDN18", "CLDN18.1" и "CLDN18.2" охватывают любые варианты, возникающие в результате посттрансляционной модификации, и конформационные варианты.

В норме CLDN18.2 экспрессируется только в дифференцированных эпителиальных клетках слизистой желудка. CLDN18.2 экспрессируется в раковых опухолях различного происхождения, и благодаря избирательности экспрессии (в тканях, подверженных токсическому действию терапевтического агента, экспрессия отсутствует) и локализации в плазматической мембране этот белок представляет особенно подходящую мишень для опосредованной антителами противораковой иммунотерапии. Например, экспрессия CLDN18.2 обнаружена в карциноме поджелудочной железы, карциноме пищевода, карциноме желудка, карциноме бронхов, карциноме молочной железы и опухолях ENT. CLDN18.2 является ценной мишенью для предотвращения и/или лечения первичных опухолей при раке желудка, пищевода, поджелудочной железы, легких (в том числе при немелкоклеточном раке легких), яичника, толстой кишки, печени, при раковых опухолях головы и шеи, раковых поражениях мочевого пузыря и их метастазах, в частности при метастазах рака желудка, например опухолях Крукенберга, перитонеальных метастазах и метастазах в лимфатических узлах. Клетки, в которых экспрессируется CLDN18.2, являются предпочтительно раковыми, выбираемыми, в частности, из группы, состоящей из туморогенных клеток желудка, пищевода, поджелудочной железы, легких, яичника, толстой кишки, печени, головы и шеи, мочевого пузыря.

По данному изобретению клетки, в которых экспрессируется CLDN18.2 предпочтительно отличаются тем, что CLDN18.2 связан с мембраной и локализован на поверхности клетки, то есть CLDN18.2 ассоциирован с клеточной поверхностью. Также по данному изобретению клеточный CLDN18.2 является предпочтительно связанным с поверхностной мембраной клетки. Клетки, в которых экспрессируется CLDN18.2 или клетки, отличающиеся связью CLDN18.2 с клеточной поверхностью, являются предпочтительно раковыми, предпочтительно клетками, обусловливающими раковые заболевания, описанные в настоящем документе.

Выражение «ассоциированный/связанный с клеточной поверхностью» означает, что антиген, ассоциированный с опухолью, например CLDN18.2, локализован на плазматической мембране клетки и связан с ней, причем по меньшей мере часть молекулы антигена, ассоциированного с опухолью, располагается с наружной стороны данной клетки (во внеклеточном пространстве) и доступна снаружи, например для антител, находящихся вне клетки. В этом смысле предпочтительно, чтобы внеклеточная часть антигена состояла из по меньшей мере четырех, предпочтительно по меньшей мере из 8, предпочтительно по меньшей мере из 12, более предпочтительно по меньшей мере из 20 аминокислотных остатков. Связь антигена с клеточной поверхностью может быть непосредственной или же опосредованной. Например, эта связь может осуществляться за счет одного или более трансмембранных доменов, или посредством одного или более липидных якорных структур, или путем взаимодействия с другим белком, липидом, сахаридом или иной структурой, присутствующей во внешнем слое плазматической мембраны клетки. Например, ассоциированный с опухолью антиген, связанный с клеточной поверхностью, может быть трансмембранным белком, часть которого расположена вне клетки, или белком, связанным с клеточной поверхностью в результате взаимодействия с другим белком, являющимся трансмембранным.

Термин «клеточная поверхность» или «поверхность клетки» употребляется в настоящем документе соответственно его общепринятому в данной области техники значению и включает внешнюю сторону клетки, доступную для связывания с белками и другими веществами.

По данному изобретению экспрессия CLDN18.2 в клетках и связь с клеточной поверхностью являются несущественными, если уровни экспрессии и этой связи превышают таковые в нераковых тканях, отличных от ткани желудка, не более чем вдвое, предпочтительно в полтора раза, и предпочтительно не превышают уровни экспрессии и связи с клеточной поверхностью в указанных нераковых тканях. Предпочтительно экспрессия CLDN18.2 в клетках и связь с клеточной поверхностью являются несущественными, если уровни экспрессии и этой связи ниже предела детекции и/или если указанные уровни слишком низкие, чтобы происходило связывание добавленных к клеткам антител, специфичных в отношении CLDN18.2.

По данному изобретению экспрессия CLDN18.2 в клетках и связь с клеточной поверхностью имеют место, если уровни экспрессии и этой связи превышают таковые в нераковых тканях, отличных от ткани желудка, предпочтительно более чем вдвое, предпочтительно в 10,100, 1000 или 10000 раз. Предпочтительно экспрессия CLDN18.2 в клетках и связь с клеточной поверхностью имеют место, если уровни экспрессии и этой связи выше предела детекции и/или если указанные уровни достаточно высокие, чтобы происходило связывание добавленных к клеткам антител, специфичных в отношении CLDN18.2.

Термин «антитело» относится к гликопротеинам, содержащим по меньшей мере две тяжелых (Н) цепи и две легких (L), соединенных дисульфидными связями, и включает любое вещество, содержащее участок, связывающий антиген. Термин «антитело» включает моноклональные антитела и фрагменты или производные антител, в том числе (не ограничиваясь перечисленным здесь) человеческие антитела, гуманизированные антитела, химеризованные антитела, одноцепочечные антитела, например scFv, и фрагменты, связывающие антиген, например Fab и Fab', а также все рекомбинантные формы антител, например антитела, экспрессирующиеся у прокариот, негликозилированные антитела и любые связывающие антиген фрагменты и производные антител, описанные в настоящем документе. Каждая тяжелая цепь состоит из вариабельной области (сокращенно обозначается VH) и константной области. Каждая легкая цепь состоит из вариабельной области (сокращенно обозначается VL) и константной области. Области VH and VL можно далее подразделить на гипервариабельные участки, называемые участками определяющими комплементарность (CDR), которые чередуются с более консервативными участками, называемыми каркасными (FR). В каждой из областей VH и VL имеются три участка CDR и четыре участка FR, которые располагаются, считая в направлении от N-конца к С-концу цепи, в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Вариабельные области тяжелых и легких цепей содержат связывающий домен, который взаимодействует с антигеном. -Константные области могут участвовать в связывании молекул иммуноглобулинов с тканями или с какими-либо факторами, включая различные клетки иммунной системы (например, эффекторные клетки) и первый компонент системы комплемента (Clq).

Антитела, описанные в настоящем документе, могут быть человеческими антителами.. Термин «человеческие антитела» здесь подразумевает антитела, вариабельные и константные области которых происходят из последовательностей иммуноглобулинов человеческих клеток зародышевой линии. Человеческие антитела по данному изобретению могут содержать аминокислотные остатки, которых нет в последовательностях иммуноглобулинов человеческих клеток зародышевой линии (например, в результате мутаций, вызванных путем случайного или сайт-специфического мутагенеза in vitro или путем соматических мутаций in vivo).

Термин «гуманизированные антитела» относится к иммуноглобулинам, в которых сайт связывания антигена происходит в основном из антител видов, отличных от человека, а в остальной своей части данное антитело имеет структуру и/или последовательность человеческого иммуноглобулин. Сайт связывания антигена может содержать либо вариабельные домены целиком, слитые с константными доменами, либо только участки, определяющие комплементарность (CDR), пересаженные на соответствующие каркасные участки вариабельных доменов. Сайты связывания антигена могут быть дикого типа или же модифицированными путем одной или более замен аминокислотных остатков, например модифицированные так, чтобы больше походить на человеческие иммуноглобулины. В некоторых формах гуманизированных антител сохраняются все д последовательности CDR (например, гуманизированнное мышиное антитело, содержащее все шесть CDR мышиного антитела). Другие формы гуманизированных антител содержат один или более CDR, измененных соответственно исходному антителу.

Термин «химерное антитело» относится к антителам, в молекулах которых одна часть аминокислотной последовательности каждой из тяжелых и легких цепей гомологична соответствующим последовательностям в антителах, происходящих из определенного вида живых организмов или принадлежащих к определенному классу, а остальная часть этой цепи гомологична соответствующим последовательностям в антителах другого вида или класса. Обычно вариабельные области как в легких, так и в тяжелых цепях молекулы антитела имитируют вариабельные области антител, происходящих из одного вида млекопитающих, а константные участки гомологичны последовательностям антител, происходящих из другого вида. Одним из очевидных преимуществ таких химеризованных форм является то удобство, что вариабельную область можно «взять» из известных на сегодняшний день источников, используя легко доступные В-клетки или гибридомы из организмов, отличных от человека, и скомбинировать ее с константными областями, «взятыми» из, например, препаратов человеческих клеток. Вариабельную область сравнительно легко получить, и на ее специфичность не влияет источник, а константная область, будучи человеческой, вызовет иммунный ответ у человека, которому ввели такие антитела, с меньшей вероятностью, чем константная область из иного источника (не человеческого происхождения). Впрочем, приведенное определение не ограничивается этим конкретным примером.

Термин «антиген связывающий участок» молекулы антитела (или просто «связывающий участок») или «антиген-связьшающий фрагмент» антитела (или просто «связывающий фрагмент») относится к одному или более фрагментам молекулы антитела, которым присуща способность специфично связываться с антигеном. Показано, что такая функция антитела, как связывание антигена, может осуществляться не всей молекулой антитела, а определенными его частями. Примеры связывающих фрагментов молекулы антитела, охватываемые термином «антиген связывающий участок», включают: (i) Fab-фрагменты - моновалентные фрагменты, состоящие из доменов VL, VH, CL и СН; (ii) Р(ab')2-фрагменты - бивалентные фрагменты, состоящие из двух фрагментов Fa, соединенных дисульфидным мостиком в шарнирном участке; (Ш) Fd-фрагменты, состоящие из доменов VH и СН; (iv) Fv-фрагменты, состоящие из доменов VL и VH одной руки молекулы антитела; (v) dAb-фрагменты (Ward et al., (1989) Nature 341: 544-546), которые состоят из домена VH; (vi) изолированные участки, определяющие комплементарность (CDR) и (vii) комбинации из двух или более изолированных CDR, которые при необходимости могут быть соединены синтетическим линкером. Также, хотя два домена фрагмента Fv - VL и VH - кодируются разными генами, они могут быть соединены (с использованием методов рекомбинантной ДНК) синтетическим линкером, благодаря которому они образуют единую полипептидную цепь, в которой пара участков VL и VH формирует моновалентную молекул; такие формы известны под названием одноцепочечных Fv-фрагментов (scFv); см., например, Bird et al. (1988) Science 242: 423-426; and Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883). Такие одноцепочечные антитела тоже охватываются термином «антиген-связывающий фрагмент» антитела. Другой пример - слитые иммуноглобулиновые белки, включающий (i) полипептид, составляющий связывающий домен и слитый с полипептидом, составляющим шарнирный участок молекулы иммуноглобулина, (ii) константную область тяжелой цепи СН2, слитую с шарнирным участком, и (iii) константную область тяжелой цепи СН3, слитую с константной областью СН2. Полипептид, составляющий связывающий домен, может быть вариабельной областью тяжелой либо легкой цепи. Такие слитые иммуноглобулиновые белки, содержащие связывающий домен, также описаны в заявках на патент США №№2003/0118592 и 2003/0133939. Эти фрагменты антител получают стандартными методами, известными специалистам в данной области техники, и проверяют их свойства, которые предполагается использовать, таким же образом, как в случае интактных антител.

Антитела, описанные в настоящем документе, могут быть моноклональными антителами. Термин «моноклональные антитела» здесь относится к препаратам антител одного молекулярного состава. У моноклональных антител одинаковая специфичность и сродство связывания. В одном из воплощений данного изобретения моноклональные антитела продуцируются гибридомами, полученные от слияния В-клеток какого-либо животного (не человека), например мыши, и бессмертных клеток.

Антитела, описанные в настоящем документе, могут быть рекомбинантными антителами. Термин «рекомбинантные антитела» здесь охватывает все антитела, которые получены, экспрессируются, созданы или выделены в рекомбинантном виде, например (а) антитела, выделенные у животного (например, мыши), являющегося трансгенным или трансхромосомным по генам иммуноглобулинов, или из гибридом, полученных с использованием такого животного, (b) антитела, выделенные из клеток-хозяев, трансформированных для экспрессии этих антител, например из трансфектом, (с) антитела, выделенные из комбинаторной библиотеки антител, и (d) антитела, полученные, экспрессируемые, созданные или выделенные любыми другими путями с использованием сплайсинга, нуклеотидных последовательностей генов иммуноглобулинов с другими последовательностями ДНК.

Термин «трансфектома» в настоящем документе охватывает рекомбинантные эукариотические клетки-хозяева, в которых экспрессируются антитела, например клетки СНО, NS/0, НЕК293, НЕК293Т, растительные клетки или клетки грибов, включая дрожжевые клетки.

Термин «гетерологичные антитела» в настоящем документе определяется по отношению к трансгенному организму, продуцирующему такие антитела. Этот термин относится к антителам, аминокислотная последовательность которых или кодирующая ее нуклеотидная последовательность соответствует таковой, имеющейся у организма, не являющегося данным трансгенным организмом, и видовое происхождение которых иное, нежели данного трансгенного организма.

Термин «гетерогибридные антитела» в настоящем документе относится к антителам, в которых легкие и тяжелые цепи происходят из разных организмов. Например, гетерогибридным является антитело, в котором человеческие тяжелые цепи и мышиные легкие цепи.

Данное изобретение включает все описанные в настоящем документе антитела и производные антител, которые для целей данного изобретения охватываются термином «антитело». Термин «производные антитела» относится к любым модифицированным формам данного антитела, например к его конъюгатам с другим агентом или антителом, или фрагментом антитела.

Антитела, описанные в настоящем документе, являются предпочтительно изолированными (выделенными). Определение «изолированное/выделенное» подразумевает, что данный антительный препарат не содержит других антител иной антигенной специфичностью. Также изолированные антитела в основном не содержат другого клеточного материал и/или химических веществ.

По данному изобретению антитело способно связываться с определенной мишенью, если оно обладает значительным сродством к этой мишени и связывание с ней происходит в условиях стандартного аналитического метода. Величина сродства или сродства связывания часто измеряется константой равновесия реакции диссоциации (K_D). Предпочтительно термин «значительное сродство» относится к связыванию с определенной мишенью, характеризующемуся константой диссоциации (K_D) 10^-5 M или менее, 10^-6 M или менее, 10^-7 M или менее, 10^-8 M или менее, 10^-9 M или менее, 10^-10 M или менее, 10^-11 M или менее, 10^-12 M или менее.

Антитело не способно (по существу) связываться с мишенью, если оно не обладает значительным сродством к этой мишени и в значительной степени с ним не связывается, в частности не связывается так, чтобы это можно было выявить стандартными аналитическими методами. Предпочтительно связывание антитела с определенной мишенью не выявляемо, если оно присутствует в концентрации до 2, предпочтительно 10, более предпочтительно 20, в частности 50 или 100 мкг/мл или более. Предпочтительно антитело не имеет значительного сродства к мишени, если его связывание с этой мишенью характеризуется константой диссоциации (K_D), по меньшей мере в 10 раз, 100 раз, 10³ раз, 10⁴ раз, 10⁵ раз или 10⁶ раз большей, чем Ко, характеризующая связывание данного антитела с определенной мишенью, с которой оно способно связываться. Например, если Ко связывания антитела с мишенью, с которой оно способно связываться, составляет 10^-7 М, то K_D связывания данного антитела с мишенью, к которой оно не имеет значительного сродства, составит по меньшей мере 10^-6 Μ, 10^-5 Μ, 10^-4 M, 10^-3 М, 10^-2 M или 10^-1 М.

Антитело специфично к определенной мишени, если оно способно связываться с этой мишенью, но не способно связываться с другими мишенями, то есть не имеет значительного сродства к другим мишеням и не связывается существенно с другими мишенями в стандартных аналитических методах. По данному изобретению антитело специфично к клаудину 18.2 (CLDN18.2), если оно способно связываться с этим белком, но не способно (по существу) связываться с другими мишенями, в частности с белками, отличными от клаудинов, предпочтительно отличными от клаудинов 18, в частности от CLDN18.2. Предпочтительно антитело специфично к CLDN18.2, если сродство к другим таким мишеням и связывание с ними существенно не превышает сродство и связывание в случае не родственных клаудинам белков, например бычьего сывороточного альбумина (BSA), казеина, человеческого сывороточного альбумина (HSA) или трансмембранных белков, отличных от клаудинов, например молекул МНС или рецептора трансферрина, или любых других известных полипептидов. Предпочтительно антитело специфично к определенной мишени, если его связывание с ней характеризуется K_D, которая по меньшей мере в 10 раз, 100 раз, 10³ раз, 10⁴ раз, 10⁵ раз или 10⁶ раз меньше, чем K_D связывания с мишенью, к которой данное антитело не специфично. Например, если связывание данного антитела с мишенью, к которой оно специфично, характеризуется K_D 10^-7 М, то K_D связывания данного антитела с мишенью, к которой оно не специфично, составит по меньшей мере 10^-6 М, 10^-5 М, 10^-4 М, 10^-3 М, 10^-2 М или 10^-1 М.

Связывание антитела с мишенью можно определить экспериментально, применяя любой подходящий метод; см., например, Berzofsky et al., "Antibody-Antigen Interactions" In Fundamental Immunology, Paul, W.E., Ed., Raven Press New York, Ν Y (1984), Kuby, Janis Immunology, W. H. Freeman and Company New York, Ν Y (1992), и методы, описанные в настоящем документе. Сродство нетрудно определить с помощью общепринятых методик, например путем равновесного диализа; при помощи системы BIAcore 2000, следуя инструкциям производителя; путем радиоиммунологического анализа с использованием радиоактивно меченного антигена-мишени; или любым другим способом из числа известных специалистам в данной области техники. Данные по сродству можно анализировать, например, методом, описанным в работе Scatchard et al., Ann Ν.Y. Acad. ScL, 51:660 (1949). Результат измерения сродства для взаимодействия конкретных антигена и антитела может варьировать в зависимости от условий, например концентрации солей и рН. Поэтому измерять сродство или другие параметры связывания антигена, например K_D и IC₅₀, предпочтительно с использованием стандартизованных растворов антитела и антигена, а также буферных растворов.

В настоящем документе термин «изотип» относится к классу антител (например, IgM или IgGl), кодируемых генами константной области тяжелых цепей. Антитела по данному изобретению включают поликлональные или моноклональные антитела IgG2a (например, IgG2a, κ, λ), IgG2b (например, IgG2b, κ, λ), IgG3 (например, IgG3, κ, λ) и IgM. Нот другие изотипы антител тоже входят в объем данного изобретения, в том числе IgG1, IgAl, IgA2, секреторные IgA, IgD и IgE.

В настоящем документе термин «переключение изотипов» относится к явлению, состоящему в том, что класс/изотип антител изменяется с одного на другой класс иммуноглобулинов (Ig).

Термин «перестроенный» в настоящем документе относится к конфигурации локуса тяжелых или легких цепей иммуноглобулинов, когда сегмент V располагается в непосредственном соседстве с сегментом D-J или J в конформации, кодирующей в основном целиком домен VH или VL соответственно. Перестроенный генный локус иммуноглобулинов (антител) можно идентифицировать путем сравнения с ДНК зародышевой линии; в перестроенном локусе имеется по меньшей мере один рекомбинантньш гомологичный элемент гептамер/нонамер.

Термины «не перестроенный» или «конфигурация зародышевой линии» применительно к сегменту V в настоящем относятся к такой конфигурации, когда сегмент V не претерпевал рекомбинацию, в результате которой он оказывался бы в непосредственном соседстве с сегментом D или J.

По данному изобретению антитела могут иметь различное видовое происхождение, в том числе быть (не ограничиваясь перечисленным здесь) мышиными, крысиными, кроличьими, морской свинки и человеческими. Антитела также включают гибридные молекулы, в которых константная область одного видового происхождения, предпочтительно человеческая, скомбинирована с сайтом связывания антигена другого вида живых организмов. Также антитела включают гуманизированные антитела, в которых сайт связывания антигена не человеческого происхождения скомбинирован с человеческими константной и каркасной областями.

Антитела можно производить различными способами, включая обычный метод получения моноклональных антител, например стандартную методику гибридизации соматических клеток (см. Kohler and Milstein, Nature 256: 495 (1975). Метод гибридизации соматических клеток предпочтителен, но, в принципе, можно применять и другие способы получения моноклональных антител, например путем вирусной или онкогенной трансформации В-лимфоцитов или методом фагового дисплея с использованием библиотек генов антител.

Предпочтительной животной системой для получения гибридом, секретирующих моноклональные антитела, является мышиная. Получение гибридом с использованием мышей хорошо разработано. Протоколы иммунизации и методики выделения спленоцитов для слияния известны в данной области техники. Также известны клетки, подходящие для слияния (например, мышиные миеломные клетки) и методики слияния.

К числу предпочтительных животных систем для получения гибридом, секретирующих моноклональные антитела, принадлежат крысиная и кроличья системы (например, описанные в работе Spieker-Polet et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:9348 (1995); см. также Rossi et al., Am. J. Clin. Pathol. 124:295 (2005)).

В другом предпочтительном воплощении данного изобретения, человеческие моноклональные антитела против клаудина 18.2 получают с помощью трансгенных или трансхромосомных мышей, несущих элементы иммунной системы человека. В числе таких трансгенных и трансхромосомных мышей - линии HuMAb и КМ, соответственно; в настоящем документе они вместе называются трансгенными мышами. Используя таких трансгенных мышей, можно получить человеческие антитела, как подробно описано для CD20 в публикации WO 2004035607.

Другой подход к созданию моноклональных антител - непосредственное выделение генов, кодирующих антитела, из лимфоцитов, продуцирующих антитела определенной специфичности; см., например, работу Babcock et al., 1996. A novel strategy for generating monoclonal antibodies from single, isolated lymphocytes producing antibodies of defined specificities. Подробно о создании рекомбинантных антител см. также Welschof and Kraus, Recombinant antibodes for cancer therapy ISBN-0-89603-918-8 и Benny K.C. Lo Antibody Engineering ISBN 1-58829-092-1.

Чтобы получить антитела к клаудину 18.2, мышей можно иммунизировать конъюгатами носителя с пептидами, происходящими из аминокислотной последовательности CLDN18.2, обогащенным препаратом рекомбинантно экспрессирующегося антигена CLDN18.2 или его фрагментов и/или клетками, в которых экспрессируется CLDN18.2 или его фрагменты, как описано в настоящем документе, или же мышей можно иммунизировать ДНК, кодирующей весь целиком человеческий CLDN18.2 или его фрагменты. В случае, если иммунизация очищенным или обогащенным препаратом антигена CLDN18.2 не приводит к образованию у мышей антител, для стимуляции иммунного ответа их можно также иммунизировать клетками, в которых экспрессируется CLDN18.2, например какой-либо клеточной линии.

Иммунный ответ можно отслеживать в ходе и после иммунизации по образцам плазмы и сыворотки крови, взятым из хвостовой вены или из ретроорбитального венозного сплетения. Для слияния клеток берут клетки мышей, у которых достаточно высокий титр иммуноглобулинов против CLDN18.2. Таким животным за 3-5 суток до умерщвления и извлечения селезенки для усиления иммунного ответа вводят внутривенно или внутрибрюшинно клетки, в которых экспрессируется CLDN18.2, что повышает выход гибридом, секретирующих специфичные антитела.

Для создания гибридом, продуцирующих моноклональные антитела против CLDN18.2, клетки лимфатических узлов, селезенки или костного мозга, взятые у иммунизированных мышей, сливают с бессмертными клетками подходящей линии, например линии мышиных миеломных клеток. Полученные гибридомы проверяют на продуцирование антител, специфичных к данному антигену. Лунки проверяют на наличие гибридом, секретирующих нужные антитела, путем твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA). Антитела, обладающие специфичностью к CLDN18.2, идентифицируют путем сортировки клеток по флуоресцентным меткам (FACS) и прямой иммунофлуоресценции, используя клетки, в которых экспрессируется CLDN18.2. Гибридомы, секретирующие нужные антитела собирают, вновь проверяют, и те, для которых подтвердилось продуцирование моноклональных антител, специфичных к CLDN18.2, субклонируют, применяя метод предельных разведений. Стабильные субклоны культивируют in vitro, так что нужные антитела попадают в культуральную среду, откуда их можно выделить и охарактеризовать.

Антитела по настоящему изобретению также могут быть получены в трансфицированных клетках-хозяевах, путем применения сочетания технологии рекомбинантной ДНК и методов трансфекции генов, хорошо известных в данной области техники (Morrison, S. (1985) Science 229: 1202).

Например, в одном из воплощений данного изобретения, нужный ген (гены), например гены антител, могут быть вставлены в экспрессионный вектор, например плазмиду эукариотической клетки, как это делается, например, в экспрессионной системе гена глутамйнсинтетазы (GS), описанном в публикациях WO 87/04462 и WO 89/01036, а также в Европейском патенте №338 841, или в других экспрессионных системах, известных в данной области техники. Очищенные плазмиды с клонированными генами антител можно ввести в эукариотические клетки-хозяева, например в клетки СНО, NS/0, НЕК293Т или НЕК293, или же в другие эукариотические клетки, например в клетки растительного происхождения или в клетки грибов, включая дрожжи. Для введения указанных генов может применяться метод из числа описанных в данной области техники, например электропорация, трансфекция с липофектином или липофектамином, или какой-либо другой. После введения генов антител в клетки-хозяева, последние проверяют на наличие антител и отбирают клетки, в которых экспрессируются введенные гены. Эти клетки представляют собой трансфектомы, в которых можно повысить уровень экспрессии, чтобы культивировать в нужном количестве для получения антител. Из культурального супернатанта и/или клеток выделяют рекомбинантные антитела и очищают их.

Экспрессию клонированных генов антител можно осуществлять и в других экспрессионных системах, в том числе в прокариотических клетках, например таких микроорганизмов, как Е. coli. Также указанные антитела могут продуцироваться трансгенными животными, например в составе молока у овец и кроликов или в составе яиц у кур, или же трансгенными растениями; СМИ., например, Verma, R., et al. (1998) J. Immunol. Meth. 216: 165-181; Pollock, et al. (1999) J. Immunol. Meth. 231: 147-157; and Fischer, R., et al. (1999) Biol. Chem. 380: 825-839.

Химерные антитела - это такие антитела, в которых различные части молекулы имеют разное видовое происхождение, например вариабельная область является мышиной, а константная - человеческой. Химеризация антител достигается путем соединения вариабельных областей тяжелых и легких цепей мышиных антител с константными областями тяжелых и легки цепей человеческих антител (как, например, описано в работе Kraus et al., in Methods in Molecular Biology series, Recombinant antibodies for cancer therapy ISBN-0-89603-918-8). В одном из предпочтительных воплощений данного изобретения химерные антитела получают, соединяя константную область легкой к-цепи человека с вариабельной областью легкой цепи мышиного антитела. В другом предпочтительном воплощении данного изобретения химерные антитела получают, соединяя константную область легкой κ-цепи человека с вариабельной областью легкой цепи мышиного антитела. Для создания химерных антител предпочтительны константные области тяжелых цепей IgGl, IgG3 и IgG4. Также для создания химерных антител предпочтительны константные области тяжелых цепей IgG2, IgA, IgD и IgM.

Взаимодействие антител с антигенами-мишенями происходит преимущественно при участии аминокислотных остатков, расположенных в шести участках, определяющих комплементарность (CDR), тяжелой и легкой цепей. Поэтому разные антитела больше различаются до аминокислотной последовательности в участках CDR, нежели в других частях молекулы. Поскольку последовательности участков CDR определяют в основном взаимодействие антиген-антитело, возможно осуществить экспрессию антител, имитирующих свойства определенных природных антител путем создания экспрессионного вектора, включающего нуклеотидные последовательности, кодирующие участки CDR из этих природных антител, вставленные в нуклеотидные последовательности, кодирующие каркасные участки из других антител с другими свойствами (см., например, Riechmann, L. et al. (1998) Nature 332: 323-327; Jones, P. et al. (1986) Nature 321: 522-525; and Queen, С.et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 86: 10029-10033). Нуклеотидные последовательности, кодирующие каркасные участки антител, можно получить из общедоступных баз данных ДНК, включающих последовательности генов антител зародышевой линии. Эти последовательности зародышевой линии отличаются от последовательностей генов зрелых антител, потому что в них нет полностью собранных вариабельных областей, которые образуются путем соединения V (D) J в процессе созревания В-клеток. Последовательности генов зародышевой линии также отличаются от последовательностей высокоаффинных антител вторичного репертуара в отдельных положениях, равномерно распределенных по вариабельной области. Например, в N-концевой части первой каркасной области и в С-концевой части четвертой каркасной области соматические мутации относительно редки. Кроме того, многие соматические мутации не влияют существенно на связывающие свойства антитела. Поэтому, чтобы создать интактное рекомбинантное антитело, обладающее такими же связывающими свойствами, что и исходное антитело, нет необходимости получать всю целиком нуклеотидную последовательность конкретного антитела (см. публикацию WO 99/45962). Для этой цели обычно достаточно частичных последовательностей тяжелой и легкой цепей, покрывающих участки CDR. Частичная последовательность используется для того, чтобы определить, какие вариабельные и соединяющие сегменты генов зародышевой линии дают вклад в вариабельные гены рекомбинантного антитела. Затем последовательность зародышевой линии используется для заполнения недостающих участков вариабельных областей. В процессе созревания белка лидерные последовательности тяжелых и легких цепей отщепляются и не имеют значения для свойств окончательного антитела. Чтобы добавить недостающие последовательности, соединяют клонированные последовательности кДНК с синтетическими олигонуклеотидами путем лигирования или ПЦР-амшшфикации. Или же можно синтезировать полную вариабельную область как набор коротких перекрьшающихся олигонуклеотидов и, соединив путем ПЦР-амплификации, клонировать полностью синтетическую вариабельную область. Этот способ имеет определенные преимущества, в числе которых исключение или включение определенных сайтов рестрикции или оптимизация определенных кодонов.

Чтобы составить набор перекрывающихся олигонуклеотидов для создания синтетических V-последовательностей, кодирующих те же аминокислоты, что и природные последовательности, можно использовать транскрипты нуклеотидных последовательностей, кодирующих тяжелые и легкие цепи, из гибридом. Синтетические последовательности тяжелых и κ-цепей могут отличаться от природных последовательностей в трех отношениях: цепочки повторяющихся нуклеотидов прерываются, что облегчает синтез олигонуклеотидов и ПЦР-амплификацию; оптимальные сайты инициации трансляции включаются по Козак (Kozak, 1991, J. Biol. Chem. 266: 19867-19870); сайты рестрикции HindIII располагаются в сторону 3'-конца от сайтов инициации трансляции.

Для вариабельных областей как легких, так и тяжелых цепей оптимизированные кодирующие и соответствующие некодирующие нуклеотидные последовательности разбиваются на 30-50 нуклеотидов примерно в середине соответствующего некодирующего олигонуклеотида. Таким образом, для каждой цепи олигонуклеотиды можно собрать в перекрывающиеся двухцепочечные наборы, покрывающие сегменты из 150-400 нуклеотидов. Эти пулы затем используют как матрицы для получения продуктов ПЦР-амплификации из 150-400 нуклеотидов. Как правило, один набор олиголнуклеотидов для вариабельной области разбивается на два пула, которые амплифицируют по отдельности, что дает два перекрьшающихся ПЦР-продукта. Эти перекрывающиеся продукты объединяют путем ПЦР-амплификации, так что получается полная вариабельная область. Может быть также желательно включить в ПЦР-амплификацию перекрьшающийся фрагмент константной области, чтобы получить фрагменты, которые легко клонировать в экспрессионных векторных конструкциях.

Реконструированные нуклеотидные последовательности, кодирующие вариабельные области химеризованных или гуманизированных тяжелых и легких цепей, затем соединяют с клонированными промотором, лидерной последовательностью, сайтом инициации трансляции, последовательностью, кодирующей константную область, 3"-нетранслируемой областью, сайтом полиаденилирования и сайтом терминации транскрипции, получая конструкцию экспрессионного вектора. Конструкции для экспрессии тяжелой и легкой цепей можно объединить в единый вектор, трансфецировать совместно или последовательно или же трансфецировать по отдельности в клетки-хозяева, которые затем сливают, получая клетки, в которых экспрессируются и те, и другие цепи. Применительно к конструированию экспрессионных векторов для человеческого Gig описаны плазмиды. Плазмины можно сконструировать таким образом, чтобы ПЦР-амплифицированные последовательности кДНК V-генов тяжелых цепей и легких κ-цепей можно было использовать для реконструирования полных минигенов тяжелых и легких цепей. Эти плазмиды можно использовать для экспрессии полностью человеческих или химерных антител IgGl-κ или IgG4-κ. Сходные плазмиды можно сконструировать для экспрессии других изотипов тяжелых цепей или для экспрессии антител, содержащих легкие λ-цепи.

В другом аспекте данного изобретения структурные свойства описанных в настоящем документе антител против клаудина 18.2 используются для создания структурно близких гуманизированных антител против клаудина 18.2, которые сохраняют по меньшей мере одно функциональное свойство антител по данному изобретению, например способность связываться с CLDN18.2. А именно, один или более участков CDR моноклональных мышиных антител рекомбинантным путем соединяют с известными каркасными областями и CDR человеческих антител, получая дополнительные рекомбинантные гуманизированные антитела против CLDN18.2.

Способность антител связываться с клаудином 18.2 можно определить с помощью стандартных аналитических методов, например твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), вестерн-блоттинга, иммунофлуоресценции и проточной цитометрии. Метод ELISA применяют для того, чтобы продемонстрировать присутствие антител в сыворотке иммунизированных мышей или связывание моноклональных антител с клаудином 18.2 или его пептидами. Пептиды или белок, которые использовали для иммунизации, можно использовать для определения специфичности супернатантов от гибридом или титров сыворотки.

Для того, чтобы продемонстрировать присутствие антител в сыворотке иммунизированных мышей или связывание моноклональных антител с живыми клетками, можно применять метод проточной цитометрии. Клетки линий, в которых от природы или после трансфекции экспрессируется антиген, или отрицательный контроль - клетки, в которых этот антиген не экспрессируется (растущие в стандартных условиях культивирования) смешивают с моноклональными антителами (в различных концентрациях) из супернатанта от гибридом или с физиологическим раствором, забуференным фосфатом (PBS), содержащим 1% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS), и инкубируют при температуре 4°С в течение 30 минут. После промывания осуществляют связывание антител против IgG, меченных аллофикоцианином (АРС) или флуоресцентным красителем Alexa647, с моноклональными антителами, связанными с антигеном, в тех же условиях, в которых проходило взаимодействие с первичными антителами. Образцы анализируют методом проточной цитометрии с помощью цитофлуориметра FACS, используя данные по прямому и боковому светорассеянию для регистрации единичных живых клеток. Для того, чтобы при измерении отличить моноклональные антитела, специфичные к данному антигену, от неспецифичных связывающихся агентов, можно применять метод совместной трансфекции. Клетки, транзиторно трансфицированные плазмидами, кодирующими антиген и флуоресцентный маркер, окрашивают, как описано выше. Трансфицированные клетки и клетки, «окрашенные» антителами, выявляются в разных каналах флуоресценции. Поскольку в большинстве трансфицированных клеток экспрессируются оба трансгена, моноклональные антитела, специфичные к данному антигену, связываются преимущественно с клетками, в которых экспрессируется флуоресцентный маркер, тогда как не специфичные к этому антигену антитела связываются в сравнимом соотношении с не трансфицированными клетками. В дополнение к проточной цитометрии или вместо нее можно применять флуоресцентную микроскопию. Клетки окрашивают точно так же, как описано выше, и исследуют с помощью флуоресцентного микроскопа.

Для того, чтобы продемонстрировать присутствие антител против клаудина 18.2 в сыворотке иммунизированных мышей или связывание моноклональных антител с живыми клетками, в которых экспрессируется клаудин 18.2, можно применять метод иммунофлуоресцентаой микроскопии. Например, клетки линий, в которых спонтанно или после трансфекции экспрессируется CLDN18.2 и отрицательный контроль - клетки, в которых нет экспрессии CLDN18.2 - выращивают в слайд-камерах в стандартных условиях культивирования в среде DMEM/F12, в которую добавлены FCS (10%), L-глутамин (2 мМ), пенициллин (100 МЕ/мл) и стрептомицин (100 мкг/мл). Затем клетки фиксируют метанолом или параформальдегидом либо оставляют необработанными. Клетки инкубируют с моноклональными антителами против CLDN18.2 в течение 30 минут при температуре 25°С. После промывания на клетки воздействуют вторичными антителами - антимышиными IgG, меченными Alexa555 (Molecular Probes), в тех же условиях, после чего исследуют с помощью флуоресцентного микроскопа.

Для выявления суммарного уровня CLDN18.2 в клетках их фиксируют метанолом или параформальдегидом и обрабатывают детергентом Triton Х-100. В живых клетках и в клетках, фиксированных параформальдегидом. но с не нарушенной проницаемостью, можно наблюдать локализацию CLDN18.2 на клеточной поверхности. Для выявления связи CLDN18.2 с плотными контактами применяют совместное окрашивание с маркером плотных контактов, например ZO-1. Также можно исследовать эффекты связывания антител и локализацию CLDN18.2 в клеточной мембране.

IgG против CLDN18.2 проверяют на взаимодействие с антигеном CLDN18.2 путем вестерн-блоттинга. Вкратце, делают следующее: получают экстракты клеток, в которых экспрессируется CLDN18.2, и соответствующие отрицательные контроли и проводят с ними гель-электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS). После электрофореза разделившиеся антигены переносят на нитроцеллюлозные мембраны, блокируют и воздействуют проверяемыми моноклональными антителами. Связывание IgG выявляют при помощи антимышиных IgG с пероксидазой и субстрата для электрохемилюминесцентной (ECL) детекции.

Мышиные IgG против CLDN18.2 далее проверяют на взаимодействие с антигеном CLDN18.2 путем иммуногистохимического анализа способами, известными специалистам в данной области техники, например, используя криосрезы тканевых образцов, фиксированных параформальдегидом или ацетоном, или парафиновые срезы образцов, фиксированных параформальдегидом, нормальных и раковых тканей, взятых у больных в ходе хирургических вмешательств, или у мышей с опухолевыми ксенотрансплантатами, которым вводили клетки линий, в которых спонтанно или после трансфекции экспрессируется CLDN18.2. Для иммунологического окрашивания антитела, взаимодействующие с CLDN18.2, инкубируют с козьими антимышиными или антикроличьими антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена, по инструкциям производителя.

Одним из предпочтительных по данному изобретению подходов к аналитическому исследованию CLDN18.2 является иммуногистохимический (IHC). Этот подход предполагает выявления антигенов (например, белков) в клетках тканевых срезов, например в клетках тканей, упоминаемых в настоящем документе. Иммуногистохимическое окрашивание широко используется для диагностирования аномальных клеток, например присутствующих в раковых опухолях. Визуализации взаимодействия антитела с антигеном можно достичь несколькими путями. Чаще всего применяется конъюгирование антител с ферментом, например с пероксидазой, который катализирует «цветную» реакцию. Или же к антителам присоединяют флуорофор, например флуоресцеин или родамин.

Процесс: изготовления образца имеет решающее значение для сохранения морфологии клеток, строения ткани и антигенности эпитопов мишени. Необходимо должным образом взять ткань, фиксировать ее и сделать срезы. Для фиксации обычно используют параформальдегид. В зависимости от целей эксперимента и толщины образца делают либо тонкие (около 4-40 мкм) срезы нужной ткани, либо - если ткань не очень плотная и достаточно проницаемая - образец используют целиком. Срезы обычно получают с помощью микротома и заключают их в желаемую среду на предметных стеклах.

Чтобы обеспечить доступность эпитопов для связывания с антителами, могут потребоваться дополнительные манипуляции с образцом, в том числе депарафинизация и демаскировка антигена. В иммуногистохимических исследованиях для уменьшения поверхностного натяжения обычно используют детергенты, например Triton Х-100; это позволяет достигать лучшего и более равномерного покрывания образца при меньшем количестве реагента.

При прямом иммуногистохимическом окрашивании используется одно меченое антитело, которое непосредственно связывается с антигеном, который нужно выявить окрашиванием. При чаще применяемом непрямом иммуногистохимическом окрашивании используются два антитела: первое антитело против искомого антигена, а второе, меченое - против первого антитела.

Для уменьшения фонового окрашивания образцы инкубируют с буферным раствором, блокирующим реакционноспособные сайты, с которыми могли бы связываться первичные или вторичные антитела. Первичные антитела направлены против искомого антигена и они обычно немеченые (не конъюгированные), а вторичные антитела направлены против иммуноглобулинов того вида животных, которому принадлежат первичные антитела. Вторичное антитело обычно конъюгировано с промежуточным связующим веществом, например биотином, которое затем присоединяет репортерное вещество; или же вторичное антитело непосредственно связано с репортерным веществом. В качестве блокирующих растворов чаще всего используются нормальная сыворотка, нежирное сухое молоко, бычий сывороточный альбумин или желатин, а также имеющиеся в продаже готовые блокирующие растворы.

В качестве репортерных веществ используются различные соединения в зависимости от метода детекции; наиболее популярны методы хромогенной или флуоресцентной детекции, опосредованной ферментами и флуорофорами, соответственно. В случае хромогенного репортера фермент-метка взаимодействует с субстратом так, что образуется интенсивно окрашенный продукт, который можно наблюдать с помощью обычного светового микроскопа. Субстратов для ферментов множество, но чаще всего в качестве метки для выявления белков используются щелочная фосфатаза (АР) и пероксидаза хрена (HRP). Для любого из этих ферментов доступен ряд хромогенных, флуорогенных и хемилюминесцентных субстратов, включая 3,3'-диаминобензидин (DAB) или 5-бром-4-хлор-3-индолилфосфат/нитросиний тетразолий хлорид (BCIP/NBT). Флуоресцентные репортеры, используемые в иммуногистохимических исследованиях, - это небольшие органические соединения. При хромогенной и флуоресцентной детекции денситометрический анализ сигнала позволяет получить количественные и полуколичественные данные, по которым можно сопоставить уровень сигнала от репортерного вещества с уровнем экспрессии белка или с его локализацией.

Нередко после иммуногистохимического окрашивания антигена-мишени применяют второе окрашивание для получения контраста, помогающего выделить первое. Многие из -этих красителей проявляют специфичность в отношении отдельных компартментов клетки или антигенов, а другие окрашивают всю клетку. Практически для любого эксперимента найдется подходящий набор из широкого спектра доступных хромогенных и флуоресцентных красителей. Часто используются гематоксилин, красители группы Хехст (Hoechst) и 4,6-диамидино-2-фенилиндол дигидрохлорид (DAPI).

Картирование эпитопов, распознаваемых антителами, можно проводить, как подробно описано в работах Glenn Ε. Morris "Epitope Mapping Protocols (Methods in Molecular Biology) ISBN-089603-375-9 и Olwyn M.R. Westwood, Frank C. Hay "Epitope Mapping: A Practical Approach" Practical Approach Series, 248.

Термин «эффекторные иммунные функции» в контексте данного изобретения включает любые функции, опосредуемые компонентами иммунной системы и имеющие своим результатом подавление опухолевого роста и/или подавление развития опухолей, в том числе подавление диссемииации и метастазирования опухоли. Предпочтительно результатом эффекторных иммунных функций является гибель раковых клеток. Предпочтительно эффекторные иммунные функции в контексте данного изобретения опосредуются антителами. Такие функции включают цитотоксичность, зависимую от комплемента (CDC); зависимую от антител клеточно-опосредованную цитотоксичность (ADCC); зависимый от антител клеточно-опосредованньш фагоцитоз (ADCP); индукцию апоптоза в клетках, несущих антиген, ассоциированный с опухолью, например путем связывания антитела с антигеном клеточной поверхности; подавление опосредованной CD40L передачи сигнала, например путем связывания антитела с CD40-рецептором или лигандом CD40 (CD40L); и/или подавление пролиферации клеток, несущих антиген, ассоциированный с опухолью, предпочтительно ADCC и/или CDC. Таким образом, антитела которые способны опосредовать одну или более эффекторных иммунных функций предпочтительно способны опосредовать гибель клеток, вызывая лизис посредством CDC-, лизис посредством ADCC, апоптоз, гомотипическую адгезию и/или фагоцитоз, предпочтительно вызывая лизис, опосредованный CDC и/или ADCC. Антитела могут также действовать, просто связываясь с антигенами, ассоциированными с опухолями, на поверхности раковых клеток. Например, антитела могут блокировать функцию антигена, ассоциированного с опухолью, или вызывать апоптоз просто путем связывания с антигеном, ассоциированным с опухолью, на поверхности раковых клеток.

Цитотоксичность, зависимая от антител и опосредованная клетками (ADCC), характеризует способность эффекторных клеток, в частности лимфоцитов, вызывать гибель клеток и предпочтительно предполагает, что клетка-мишень «помечена» антителом. ADCC предпочтительно имеет место, когда антитела связываются с антигенами на раковых клетках и домен Fe антитела занимает рецепторы Fe (FcR) на поверхности эффекторных клеток. Идентифицированы несколько семейств рецепторов Fe; определенным группам клеток свойственна экспрессия определенных рецепторов Fe. ADCC можно рассматривать как механизм, непосредственно вызывающий немедленное разрушение опухоли (в той или иной степени), что также ведет к представлению антигена и индукции Т-клеточного ответа, направленного против опухоли. Предпочтительно in vivo индукция ADCC приводит к Т-клеточному ответу, направленному против опухоли, и дальнейшим антительным реакциям организма-хозяина.

Другой путь уничтожения клеток, направляемый антителами, - это цитотоксичность, зависимая от комплемента (CDC). Для активации комплемента наиболее эффективный изотип антител IgM. Также весьма эффективны IgG1 и IgG3, которые направляют CDC по классическому пути активации комплемента. Предпочтительно в этом каскаде образование комплексов антиген-антитело приводит к демаскировке множества сайтов связывания C1q поблизости от доменов С_Н2 задействованных молекул антител, например IgG (C1q - это один из трех субкомпонентов компонента C1 комплемента). Предпочтительно эти демаскированные сайты связывания Clq делают до того низкоаффинное взаимодействие Clq-IgG высокоаффинным, что приводит в действие каскад событий, в которых участвует ряд других белков комплемента и ведет к протеолитическому высвобождению хемотаксических/активирующих агентов эффекторных клеток С3а и С5а. Предпочтительно каскад комплемента заканчивается образованием комплекса, атакующего мембрану, и возникновению пор в клеточной мембране, облегчающих свободный переход воды и растворимых веществ в клетку и из нее, и ведет к апоптозу.

Термин «эффекторные клетки иммунной системы» в контексте данного изобретения относится клеткам, которые осуществляют эффекторные функции в процессе иммунологической реакции организма. Например, такие клетки выделяют цитокины и/или хемокины, убивают микробов, выделяют антитела, распознают и при необходимости уничтожают раковые клетки. Эффекторные клетки иммунной системы включают, например, Т-лимфоциты (цитотоксические, хелперные, инфильтрирующие опухоль), В-лимфоциты, NK-клетки («естественные киллеры»), нейтрофилы, макрофаги и дендритные клетки.

Нуклеиновые кислоты по данному изобретению - это предпочтительно дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) или рибонуклеиновая кислота (РНК), более предпочтительно РНК, наиболее предпочтительно РНК, транскрибированная in vitro. Нуклеиновые кислоты по данному изобретению включают геномную ДНК, комплементарную ДНК (кДНК), матричную РНК (мРНК), полученные путем рекомбинации или химического синтеза. Нуклеиновая кислота по данному изобретению может быть в двухцепочечной либо одноцепочечной форме, линейной или ковалентно замкнутой в кольцо. Нуклеиновая кислота по данному изобретению может использоваться для введения в клетки, то есть трансфекции; это, например, РНК, полученная путем транскрипции ДНК-матрицы in vitro. Эта РНК до использования может быть модифицирована путем стабилизации последовательности, кэширования или полиаденилирования.

Нуклеиновые кислоты, описанные в настоящем документе, могут быть включены в состав векторов. Термин «вектор» в настоящем документе включает любые векторы, известные специалистам в данной области техники, в том числе плазмиды, космиды, фаги (например, фаг λ), вирусы (например, аденовирусные или бакуловирусные векторы) или искусственные хромосомы, например бактериальные искусственные хромосомы (ВАС), дрожжевые искусственные хромосомы (YAC) или искусственные хромосомы Р1 (РАС). Указанные векторы включают как экспрессионные, так и клонирующие векторы. Экспрессионные векторы включают плазмиды, а также вирусные векторы; они обычно содержат нужную кодирующую нуклеотадную последовательность и последовательности ДНК, необходимые для экспрессии функционально связанной кодирующей последовательности в определенном организме-хозяине (например, в бактериях, дрожжах, растениях, насекомых или млекопитающих) или в экспрессионной системе in vitro. Клонирующие векторы обычно используются для конструирования и амплификации определенных нужных фрагментов ДНК и в них может не быть функциональных нуклеотидных последовательностей, необходимых для экспрессии этих фрагментов ДНК.

В качестве. вектора для экспрессии антител можно использовать вектор такого типа, что цепи антитела представлены в разных векторах, либо такого типа, что цепи антитела представлены в одном и том же векторе.

Термин «РНК» в настоящем документе означает вещество, содержащее по меньшей мере один рибонуклеотидньш остаток. Рибонуклеотид - это нуклеотид, в котором имеется гидроксильная группа в положении 2' остатка β-D-рибофуранозы. Этот термин включает РНК двухцепочечную, одноцепочечную, изолированную (например, частично очищенную, практически чистую), синтетическую, полученную в рекомбинантно виде, а также измененную РНК, происходящую от природной РНК путем добавления, делеции, замены и/или изменения одного или более нуклеотидов. Такие изменения могут включать добавление компонентов, отличных от нуклеотидов (например, присоединение к концам цепи РНК или на ее протяжении одного или более рибонуклеотидов. В числе нуклеотидов РНК также могут быть нестандартные нуклеотиды, например не встречающиеся в природе или синтезированные химическим путем, или дезоксинуклеотиды. Эти измененные РНК можно считать аналогами или аналогами природных РНК.

По данному изобретению термин «РНК» включает матричную РНК (мРНК) (и предпочтительно относится к ней) и относится к транскрипту, который можно получить, используя в качестве матрицы ДНК и которые кодирует пептид или белок. Матричная РНК обычно содержит 5'-нетранслируемую область, область, кодирующую белок, или пептид, и 3'- нетранслируемую область. Как в клетках, так и in vitro мРНК существует лишь ограниченное время.

В контексте данного изобретения термин «транскрипция» относится к процессу синтеза молекулы РЖ по ДНК-матрице (перекодирование генетической информации из ДНК в РНК).

Нуклеиновые кислоты по данному изобретению, описанные в настоящем документе, предпочтительно изолированные (выделенные). Термин «изолированная/выделенная нуклеиновая кислота» здесь означает, что эта нуклеиновая кислота была (i) амплифицирована in vitro, например путем полимеразной цепной реакции (ПНР), (ii) получена в рекомбинантном виде и клонирована, (iii) очищена, например путем расщепления- и гель-электрофоретического фракционирования, или (iv) синтезирована, например химическим путем. Изолированная/выделенная нуклеиновая кислота доступна для использования по технологии рекомбинантной ДНК.

По данному изобретению нуклеиновая кислота может быть взята в отдельности или же в сочетании с другими нуклеиновыми кислотами, которые могут быть гомологичными: или гетерологичными. В предпочтительных воплощениях данного изобретения нуклеиновая кислота функционально связана с нуклеотидными и последовательностями, регулирующими экспрессию, которые могут быть гомологичным или гетерологичными по отношению к указанной нуклеиновой кислоте. Термин «гомологичные» здесь означает, что данная нуклеиновая кислота функционально связана с ними и от природы, а термин «гетерологичные» - что в природе она с ними не связана.

Нуклеиновая кислота и нуклеотидные последовательности, регулирующие экспрессию, являются функционально связанными друг с другом, если они соединены ковалентно таким образом, что экспрессия или транскрипция указанной нуклеиновой кислоты контролируется указанными регуляторными последовательностями или находится под их влиянием. Если нуклеиновая кислота должна транслироваться с образованием функционального белка, то при наличии регулирующих экспрессию последовательностей, функционально связанных с кодирующей нуклеотидной последовательностью, индукция указанных регуляторных последовательностей приводит к транскрипции указанной нуклеиновой кислоты без сдвига рамки считывания кодирующей последовательности или указанная кодирующая последовательность транслируется с образованием желаемого белка или пептида.

Термин «последовательность, регулирующая экспрессию» или «элемент, регулирующий экспрессию» по данному изобретению включает промоторы, сайты связывания рибосомы, энхансеры и другие регуляторные элементы, которые обеспечивают транскрипцию гена или трансляцию мРНК. В конкретных воплощениях данного изобретения можно регулировать последовательности, регулирующие экспрессию. Детальная структура последовательностей, регулирующих экспрессию, может варьировать в зависимости от видовой принадлежности или типа клетки, но, как правило, в них имеется 5'-нетранскрибируемая последовательность, а также 5'- и 3'-нетранслируемые последовательности, которые участвуют в инициации соответственно транскрипции и трансляции, например ТАТА-бокс, кэп, последовательность СААТ и проч. Говоря конкретнее, 5'-нетранскрибируемые последовательности, регулирующие экспрессию, содержат промоторную область, которая включает промоторную последовательность для управления транскрипцией функционально связанной с ней нуклеиновой кислоты. Последовательности, регулирующие экспрессию, могут также содержать энхансерные последовательности или активаторные последовательности, расположенные ближе к 5'-концу.

Термин «промотор» или «промоторная область» по данному изобретению относится к нуклеотидной последовательности, расположенной ближе к 5'-концу, чем та нуклеотидная последовательность, которая должна экспрессироваться, и регулирует экспрессию, обеспечивая сайт узнавания и связывания для РНК-полимеразы. Промоторная область может включать сайты узнавания и связывания для других факторов, участвующих в регуляции транскрипции гена. Промотор может регулировать транскрипцию прокариотического или эукариотического гена. Кроме того, промотор может быть индуцибельным - это значит, что он инициирует транскрипцию в ответ на некий индуцирующий агент; или же промотор конститутивньш - это значит, что транскрипция не зависит от какого-либо индуцирующего агента. Ген, находящийся под контролем индуцибельного промотора, в отсутствие индуцирующего агента не экспрессируется или экспрессируется лишь незначительно. В присутствии индуцирующего агента ген «включается» или уровень транскрипции повышается. Как правило, это опосредуется связыванием определенного фактора транскрипции.

Предпочтительные по данному изобретению промоторы включают промоторы для полимераз фагов SP6, Т3 и Т7, промотор гена U6-PHK человека, промотор цитомегаловируса (CMV) и искусственные гибридные промоторы, в которых часть или части указанных (например, CMV) слиты с частью или частями промоторов генов других клеточных белков, например человеческой глицеральдегтад-3-фосфатдегидрогеназы (GAPDH), включая или не включая дополнительные интроны.

Термин «экспрессия» в настоящем документе употребляется в его наиболее широком значении и подразумевает образование РНК или РНК и белка или пептида. Что касается РНК, то термины «экспрессия» и «трансляция» относятся в особенности к образованию пептидов или белков. Экспрессия может быть временной или постоянной. По данному изобретению экспрессия включает также измененную или аномальную экспрессию.

Определения «измененная» или «аномальная» применительно к экспрессии по данному изобретению означают, что уровень экспрессии изменился, предпочтительно увеличился относительно уровня, взятого для сравнения, например имеющего место у индивида, не страдающего заболеванием, при котором изменена или аномальна экспрессия определенного белка, например антигена, ассоциированного с опухолью. Под повышением уровня экспрессии понимается его увеличение по меньшей мере на 10%, в частности на по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 50% или по меньшей мере на 100% или более. В одном из воплощений данного изобретения экспрессия наблюдается только в пораженной ткани, а в здоровых тканях она подавлена.

Термин «специфичная экспрессия» («тканеспецифичная/органоспецифичная») означает, что белок экспрессируется практически только в определенных тканях или органах. Например, специфичная экспрессия антигена, ассоциированного с опухолью, в слизистой желудка подразумевает, что указанный белок экспрессируется преимущественно в клетках слизистой желудка и не экспрессируется или лишь незначительно экспрессируется в других тканях или органах. Таким образом, экспрессия белка, который экспрессируется исключительно в клетках слизистой желудка, а в любой другой ткани он экспрессируется гораздо меньше, является специфичной для слизистой желудка. В некоторых воплощениях данного изобретения антиген, ассоциированный с опухолью, также может специфично экспрессироваться в нормальных условиях более чем в одной ткани или органе, например в двух-трех тканях или органах, но предпочтительно не более чем в трех различных тканях или органах. В таком случае говорят о специфичности экспрессии данного антигена, ассоциированного с опухолью, в этих органах или тканях.

Термин «трансляция» по данному изобретению относится к процессу, происходящему в рибосомах клетки и состоящему в том, что матричная РНК направляет сборку аминокислотной последовательности с образованием белка или пептида.

Термин «кодирующая нуклеотидная последовательность/кодирующая нуклеиновая кислота» по данному изобретению означает, что данная последовательность/данная молекула нуклеиновой кислоты в подходящих условиях, предпочтительно внутри клетки, может экспрессироваться, то есть образуется кодируемый ею белок или пептид.

Термин «пептид» включает олигопептиды и полипептиды и относится к веществам, содержащим 2 или более, предпочтительно 3 или более, предпочтительно 4 или более, предпочтительно 6 или более, предпочтительно 8 или более, предпочтительно 9 или более, предпочтительно 10 или более, предпочтительно 13 или более, предпочтительно 16 или более, предпочтительно 21 или более, предпочтительно до 8, 10, 20, 30, 40 или 50, в частности до 100 аминокислот, соединенных ковалентно пептидными связями. Термин «белок» относится к большим пептидам, предпочтительно к пептидам, содержащим.более 100 аминокислотных остатков, но в принципе термины «пептид» и «белок» являются синонимами и употребляются в настоящем документе взаимозаменяемо.

Предпочтительно белки и пептиды по данному изобретению являются изолированными/выделенными. Определение «изолированный/выделенный» применительно к белку или пептиду по данному изобретению означает, что данный белок или пептид отделен от его естественного окружения. Изолированный/выделенный белок или пептид может быть практически очищенным. Определение «очищенный» применительно к белку или пептиду подразумевает, что препарате данного белка или пептида практически нет других веществ, в окружении которых он находится in vivo.

Приводимые в настоящем документе указания касательно определенных аминокислотных последовательностей, например тех, которые приведены в перечне последовательностей, следует считать относящимися также к модификациям этих последовательностей, то есть к вариантам, которые функционально им эквивалентны, например модифицированная аминокислотная последовательность обладает такими же или сходными свойствами, что и данная последовательность. Одно из важных свойств -связывание антитела с его мишенью. Предпочтительно при замене данной аминокислотной последовательности в молекуле антитела модифицированной последовательностью связывание указанного антитела с его мишенью сохраняется.

Для специалистов в данной области техники немаловажно, что, в частности, последовательности CDR, гипервариабельные и вариабельные области могут быть модифицированы без потери способности связываться с мишенью. Например, последовательности CDR должны быть идентичны или высоко гомологичны последовательностям CDR, приведенным в настоящем документе.

Термин «высокая степень гомологии/ высоко гомологичные последовательности» означает, что возможны от 1 до 5 замен аминокислот, предпочтительно от 1 до 4, например 1-3-или 1-2 замены.

Термин «вариант» по данному изобретению также включает мутантные формы. Варианты, являющиеся результатом различного сплайсинга, конформационные варианты, изоформы, аллельные варианты, видовые варианты и межвидовые гомологи, в частности существующие в природе. Аллельные варианты - это результат изменений в нормальной нуклеотидной последовательности гена, значение которых часто остается неясным. Нередко при определении полной нуклеотидной последовательности того или иного гена идентифицируют многочисленные аллельные варианты данного гена. Межвидовые гомологи - это нуклеотидные или аминокислотные последовательности иного, нежели данная последовательность, видового происхождения.

Для целей данного изобретения варианты аминокислотной последовательности включают варианты, возникшие в результате вставки, прибавления, делеции и/или замены аминокислот.Варианты, являющиеся результатом делеции аминокислотных остатков на N- и/или С-конце полипептидной цепи, называются также соответственно N- или С-укороченными вариантами.

В вариантах, являющихся результатом вставки, в определенное место данной аминокислотной последовательности добавлены один, два или более аминокислотных остатков; возможна также вставка в случайные места последовательности (в этом случае требуется соответствующий анализ продукта).

Варианты, являющиеся результатом прибавления, включают последовательности, в которых к N- или С-концу данной аминокислотной последовательности присоединено один или более аминокислотных остатков, например 1, 2, 3, 5, 10, 20, 30, 50 или более.

В вариантах, являющихся результатом делеции, в данной аминокислотной последовательности отсутствуют 1, 2, 3, 5, 10, 20, 30, 50 или более аминокислотных остатков. Делеция может иметь место в любом положении на протяжении полипептидной цепи.

В вариантах, являющихся результатом замены, в данной аминокислотной последовательности на месте по меньшей мере одного аминокислотного остатка находится другой. Такая модификация предпочтительна в тех положениях аминокислотной последовательности, которые не консервативны, то есть не принадлежат областям, одинаковым в гомологичных белках; и/или аминокислотные остатки заменяются на сходные по свойствам. Предпочтительно замены аминокислот в вариантах белка являются консервативными, то есть на месте замененного аминокислотного остатка стоит аминокислотный остаток с такими же электрическими свойствами (несущий заряд или нет). Консервативные аминокислотные замены включают замены в пределах групп аминокислот с близкими по свойствам боковыми цепями. Существующие в природе аминокислоты можно разделить на четыре группы: кислые (аспарагиновая и глутаминовая кислоты), основные (лизин, аргинин, гистидин), неполярные (аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенил аланин, метионин, триптофан) и незаряженные полярные (глицин, аспарагин, глутамин, цистеин, серии, треонин, тирозин). Иногда фенилаланин, триптофан и тирозин объединяют в группу ароматических аминокислот.

Предпочтительно степень сходства, предпочтительно идентичности между данной аминокислотной последовательностью и последовательностью, являющейся ее вариантом, составляет по меньшей мере около 60%, 65%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, или 99%. Степень сходства или идентичности дается предпочтительно для области аминокислотной последовательности, на долю которой приходится по меньшей мере около 10%, по меньшей мере около 20%, по меньшей мере около 30%, по меньшей мере около 40%, по меньшей мере около 50%, по меньшей мере около 60%, по меньшей мере около 70%, по меньшей мере около 80%, по меньшей мере около 90% или около 100% всей длины аминокислотной последовательности, с которой проводится сравнение. Например, если последовательность, с которой проводится сравнение, состоит из 200 аминокислотных остатков,, то степень сходства или идентичности дается предпочтительно для по меньшей мере около 20, по меньшей мере около 40, по меньшей мере около 60, по меньшей мере около 80, по меньшей мере около 100, по меньшей мере около 120, по меньшей мере около 140, по меньшей мере около 160, по меньшей мере около 180 или около 200 аминокислотных остатков, предпочтительно расположенных подряд. В предпочтительны воплощениях данного изобретения степень сходства или идентичности дается для всей длины аминокислотной последовательности, с которой проводиться сравнение. Выравнивание последовательностей для определения их сходства, предпочтительно идентичности, возможно при помощи известных в данной области техники способов и средств, предпочтительно с использованием наилучшего выравнивания, например с использованием Align, стандартных настроек программы Needle из пакета EMBOSS (матрица весов аминокислотных замен BLOSUM62; штраф за открытие делеции - 10,0; штраф за продолжение делеции - 0,5).

Сходство последовательностей показывается долей (в процентах) одинаковых аминокислотных остатков или консервативных замен в сравниваемых аминокислотных последовательностях. Идентичность последовательностей показывается долей (в процентах) аминокислотных остатков, одинаковых в сравниваемых последовательностях.

Термин «процент идентичности» обозначает долю (в процентах) аминокислотных остатков, одинаковых в двух сравниваемых последовательностях, полученную после наилучшего выравнивания; эта величина чисто статистическая, и различия между двумя сравниваемыми последовательностями распределяются случайным образом по всей длине последовательности. Сравнение двух аминокислотных последовательностей обычно проводится путем их сопоставления после оптимального выравнивания, причем указанное сравнение осуществляется по сегментам или с помощью «окна», чтобы идентифицировать и сравнить локальные области сходства. Оптимальное выравнивание последовательностей для их сравнения можно делать не только вручную, но с помощью алгоритмов локальной гомологии Смита-Ватермана (Smith and Waterman, 1981, Ads App.Math. 2, 482), Нидлмана-Вунша (Neddleman and Wunch, 1970, J. Mol. Biol. 48,443), с помощью сходного метода анализа Пирсона и Липмана (Pearson and Lipman, 1988, Proc. Natl Acad. Sci. USA 85, 2444) или с помощью компьютерных программ, в которых используются эти алгоритмы (GAP, BESTFIT, FASTA, BLAST Ρ, BLAST Ν и TFASTA в пакете Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Мадисон, шт. Висконсин, США).

Процент идентичности рассчитывают путем определения числа идентичных положений в двух сравниваемых последовательностях, которое делят на число сравненных положений и умножают результат на 100, что дает процентное выражение идентичности этих двух последовательностей.

Гомологичные аминокислотные последовательности по данному изобретению идентичны по меньшей мере на 40%, в частности по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90% и предпочтительно по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98 или по меньшей мере на 99% аминокислотных остатков.

Варианты аминокислотных последовательностей, описанные в настоящем документе, специалисту в данной области техники нетрудно получить с помощью, например, методов рекомбинантной ДНК. Действия с последовательностями ДНК с целью получения белков и пептидов, в которых имеются замены, добавления, вставки или делеции, подробно описаны, например, в работе Sambrook et al. (1989). Также варианты пептидов и белков, описанные в настоящем документе, можно сравнительно легко получить с помощью известных методов пептидного синтеза, например путем твердофазного синтеза или сходных методов.

Данное изобретение включает производные пептидов и белков, описанных в настоящем документе, охватываемые терминами «белок» и «пептид». По данному изобретению производные белков и пептидов - это модифицированные формы этих белков и пептидов. Такие модификации включают любые химические модификации, в том числе единичные или множественные замены, делеции и/или прибавления любых веществ, связывающихся с белками или пептидами, например углеводов, липидов и/или белков или пептидов. В одном из воплощений данного изобретения производные белков или пептидов включают модифицированные их аналоги, образовавшиеся в результате гликозилирования, ацетилирования, фосфорилирования, амидирования, пальмитоилирования, миристоилирования, изопренилирования, липидирования, алкилирования, дериватизации, введения заппттых/блокирующих групп, протеолитическсто расщепления или связывания с антителами или иными клеточными лигандами. Термин «производное» также охватывает все функциональные химические эквиваленты указанных белков и пептидов. Предпочтительно модифицированный пептид обладает повышенной стабильностью и/или увеличенной иммуногенностью.

По данному изобретению варианты, производные, модифицированные формы, фрагменты, части или участки аминокислотной последовательности, пептида или белка обладают функциональными свойствами аминокислотной последовательности, пептида или белка, соответственно, из которой они происходят, то есть функционально эквивалентны. В одном из воплощений данного изобретения варианты, производные, модифицированные формы, фрагменты, части или участки аминокислотной последовательности, пептида или белка иммунологически эквивалентны аминокислотной последовательности, пептиду или белку, соответственно, из которой они происходят. В одном из воплощений данного изобретения функциональное свойство является иммунологическим свойством.

Определение «происходящий» по данному изобретению означает, что данный объект, в частности конкретная последовательность, присутствует в другом объекте, в частности в организме или молекуле, из которого первый объект происходит. В случае аминокислотных последовательностей, в особенности областей последовательностей, «происходящая», в частности, означает, что аминокислотная последовательность, о которой идет речь, происходит из аминокислотной последовательности, в которой она присутствует.

Термин «клетка» или «клетка-хозяин» предпочтительно относится к интактным клеткам, то есть к клетка с ненарушенной мембраной, не выделяющая свои нормальные внутриклеточные компоненты, например ферменты, органеллы или генетический материал. Интактная клетка предпочтительно является жизнеспособной, то есть это живая клетка, способная осуществлять свои нормальные метаболические функции. По данному изобретению термин «клетка» включает прокариотические клетки (например, Escherichia coif) или эукариотические клетки (например, дендритные клетки, В-клетки, клетки СНО, клетки COS, клетки К562, клетки НЕК293, клетки HELA, дрожжевые клетки и клетки насекомых). Особенно предпочтительны клетки млекопитающих, например клетки приматов, в том числе человека, мышей, хомяков, свиней и коз. Указанные клетки могут происходить из тканей многих различных типов и включают первичные клетки и клеточные линии. Термин «клетка» включает не раковые клетки, а также раковые клетки, например клетки описанных в настоящем документе раковых опухолей.

В клетке, содержащей какую-либо нуклеиновую кислоту, предпочтительно экспрессируется пептид или белок, кодируемый этой нуклеиновой кислотой.

Термин «клетка-мишень» означает клетку, являющуюся мишенью иммунного ответа, например антител. Клетки-мишени включают любые нежелательные клетки, например раковые клетки, описанные в настоящем документе. В предпочтительных воплощениях данного изобретения клетка-мишень - это клетка, в которой экспрессируется клаудин 18.2. Клетки, в которых экспрессируется клаудин 18.2, являются, как правило, раковыми.

Термин «трансгенное животное» относится к животным, геном которых включает один или более трансгенов, предпочтительно трансгенов тяжелых и/или легких цепей антител, или трансхромосом (интегрированных либо не интегрированных в природную геномную ДНК данного животного) и у которых предпочтительно эти трансгены могут экспрессироваться. Например, у трансгенной мыши может иметься человеческий трансген легкой цепи и либо человеческий трансген тяжелой цепи, либо трансхромосома с этим геном, так что у этой мыши в результате иммунизации антигеном клаудина 18.2 и/или клетками, в которых экспрессируется клаудин 18.2, могут образовываться человеческие антитела против этого белка. Человеческий трансген тяжелой цепи может быть интегрирован в хромосомную ДНК мыши, как в случае трансгенных мышей, например мышей HuMAb - НСо7 или НСо12, или человеческий трансген тяжелой цепи может существовать вне клеточных хромосом, как в случае трансхромосомных мышей (например, КМ), описанных в публикации WO 02/43478. Такие трансгенные и трансхромосомные мыши обладают способностью к образованию множества изотипов человеческих моноклональных антител против CLDN18.2 (например, IgG, IgA и/или IgE) благодаря рекомбинации V-D-J и переключению изотипов.

Выражение «иммунологически эквивалентно» означает, что иммунологически эквивалентная молекулярная структура, например иммунологически эквивалентная аминокислотная последовательность проявляет такие же или практически такие же иммунологические свойства и/или вызывает такие же или практически такие же иммунологические эффекты, например по типу иммунологического эффекта (индукция гуморального иммунного ответа, интенсивность и/или продолжительность вызванного иммунного ответа или специфичность этого иммунного ответа). В контексте данного изобретения выражение «иммунологически эквивалентно» употребляется предпочтительно в отношении иммунологических эффектов или свойств пептида или варианта пептида, использовавшегося для иммунизации, либо антитела. Конкретным иммунологическим свойством является способность связывать антитела и при необходимости генерировать иммунный ответ, предпочтительно путем стимуляции образования антител. Например, аминокислотная последовательность иммунологически эквивалентна другой аминокислотной последовательности, взятой для сравнения, если указанная аминокислотная последовательность, будучи предъявлена иммунной системе индивида, вызывает иммунный ответ, предпочтительно образование антител, специфично взаимодействующих с аминокислотной последовательностью, взятой для сравнения, например с последовательностью, формирующей часть клаудина 18.2.

Данным изобретением предлагаются способы выявления присутствия антигена CLDN18.2 в образце или измерения количества антигена CLDN18.2, включающие контактирование образца и при необходимости контрольного образца с антителами по данному изобретению, которые связываются с CLDN18.2, в условиях, делающих возможным образование комплекса указанных антител с CLDN18.2. Затем выявляется образование комплекса, причем разница в образовании этого комплекса между анализируемым образцом и контрольным указывает на присутствие антигена CLDN18.2 в анализируемом образце.

Указанные выше способы полезны, в частности, для диагностирования заболеваний, к которым имеет отношение клаудин 18.2, например раковых заболеваний. Предпочтительно если количество CLDN18.2 в образце, взятом у обследуемого индивида (в частности, человека), превышает таковое в контрольном образце, то это является указанием на наличие у данного индивида заболевания, связанного с клаудином 18.2.

При использовании в указанных выше способах антитела, описанные в настоящем документе, могут быть снабжены меткой, роль которой состоит в том, чтобы (i) обеспечить детектируемый сигнал; (ii) взаимодействовать со второй меткой, чтобы изменить детектируемый сигнал, даваемый первой или второй меткой, например путем флуоресцентного резонансного переноса энергии (FRET); (iii) повлиять на подвижность, например на электрофоретическую подвижность, изменяя заряд, гидрофобность, форму или иные физические параметры, или (iv) обеспечить структуру-«ловушку», осуществляющую образование комплекса по сродству, антиген-антитело или ионного. В качестве меток подходят структуры, которые выявляются с помощью связывающихся с ними агентов: флуоресцентные метки, люминесцентные метки, хромофоры, радиоактивные изотопы, изотопные метки, предпочтительно стабильные изотопные метки, изобарные метки, ферменты, частицы, в частности частицы металлов, магнитные частицы, полимерные частицы, небольшие органические соединения, например биотин, лиганды рецепторов или связывающие агенты, например белки клеточной адгезии или лектины, метки-последовательности, содержащие нуклеиновые кислоты и/или аминокислотные остатки. Метки включают (данное перечисление не имеет ограничительного характера) сульфат бария, йоцетамовую кислоту, йопаноевую кислоту, иподат кальция, диатризоат натрия, меглумина диатризоат, тиропаноат натрия и агенты для лучевой диагностики, включая источники позитронов, например фтор-18 и углерод-11, источники гамма-излучения, например иод-123, технеций-99 т, йод-131 и индий-111, нуклиды для ядерного магнитного резонанса, например фтор и гадолиний.

По данному изобретению выражение «для сравнения» или «контрольный», например «образец, взятый для сравнения/контрольный образец» или «организм, взятый для сравнения» употребляются тогда, когда нужно сопоставить и сравнить результаты, полученные способами по данному изобретению для анализируемого образца или организма. Как правило, организм для сравнения - это здоровый/нормальный организм, в частности организм, не страдающий от какого-либо заболевания, например ракового. Величина для сравнения или уровень для сравнения могут быть определены по объекту для сравнения эмпирически путем их измерения в достаточно большом числе объектов для сравнения. Предпочтительно величину для сравнения определяют путем измерения по меньшей мере 2, предпочтительно по меньшей мере 3, предпочтительно по меньшей мере 5, предпочтительно по меньшей мере 8, предпочтительно по меньшей мере 12, предпочтительно по меньшей мере 20, предпочтительно по меньшей мере 30, предпочтительно по меньшей мере 50 или предпочтительно по меньшей мере 100 объектов для сравнения.

Слова «уменьшать» или «ингибировать» в настоящем документе относятся к способности вызывать общее снижение уровня предпочтительно на 5% или более, 10% или более, 20% или более, более предпочтительно на 50% или более, наиболее предпочтительно на 75% или более. Ингибирование (или сходные по значению выражения) включает полное или практически полное ингибирование, то есть уменьшение до нуля или практически до нуля.

Выражения «повышать/усиливать/увеличивать» предпочтительно относятся к повышению/усилению/увеличению» на около по меньшей мере 10%, предпочтительно по меньшей мере 20%, предпочтительно по меньшей мере 30%, более предпочтительно по меньшей мере 40%, более предпочтительно по меньшей мере 50%, еще более предпочтительно по меньшей мере 80%, наиболее предпочтительно по меньшей мере 100%.

Описанные в настоящем документе агенты, композиции и способы можно использовать для диагностирования заболевания у индивида. Заболевания, подлежащие такому диагностированию, включают все заболевания, при которых экспрессируется CLDN18.2. Особенно предпочтительными из них являются раковые заболевания, например те раковые заболевания, которые описаны в настоящем документе.

Термин «заболевание/болезнь» по данному изобретению относится к любому патологическому состоянию, включая раковые заболевания, в частности те формы раковых заболеваний, которые описаны в настоящем документе.

Определение «нормальный», например «нормальная ткань» или «нормальные условия», относится к здоровым тканым или к условиям в организме здорового индивида, то есть к не патологическим условиям, причем «здоровый» предпочтительно означает «не раковый/не больной раком».

Выражение «заболевание с участием клеток, в которых экспрессируется CLDN18.2», по данному изобретению означает, что экспрессия CLDN18.2 в клетках пораженной ткани или органа предпочтительно усилена по сравнению со здоровой тканью или органом. Увеличением считается превышение по меньшей мере на 10%, в частности по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 100%, по меньшей мере на 200%, по меньшей мере на 500%, по меньшей мере на 1000%, по меньшей мере на 10 000% или даже больше. В одном из воплощений данного изобретения экспрессия имеет место только в пораженной ткани, а в нормальной ткани она подавлена. По данному изобретению заболевания с участием клеток, в которых экспрессируется CLDN18.2, или ассоциированные с такими клетками включают раковые заболевания, в частности раковые заболевания, описанные в настоящем документе.

По данному изобретению термин «опухоль» или «опухолевое заболевание» относится к объемному образованию или поражению, обусловленному аномальным размножением клеток (называемых неопластическими или опухолевыми). Термин «опухолевая клетка» обозначает аномальную клетку, быстро размножающуюся бесконтрольно, причем этот клеточный рост продолжается и после прекращения действия вызвавшего -его фактора. Опухоли частично или полностью лишены структурной организации и функционально не координируются с нормальной тканью, образуя обычно отличную от нее клеточную массу, и это образование может быть доброкачественным, предзлокачественным или злокачественным.

Доброкачественная опухоль - это такая опухоль, у которой нет всех трех злокачественных свойств, присущих раку. А именно, рост доброкачественной опухоли не имеет неограниченного агрессивного характера, не является инвазивным по отношению к окружающей ткани и не распространяется за ее пределы в другие ткани (опухоль не метастазирует). Примерами часто встречающихся доброкачественных опухолей являются пузырный занос и фиброиды матки.

Определение «доброкачественный» подразумевает умеренное не прогрессирующее заболевание; многие доброкачественные опухоли безвредны. Однако некоторые неопластические образования, характеризуемые как доброкачественные по причине отсутствия инвазивных свойств, присущих раку, могут, тем не менее, негативно влиять на здоровье. Примеры таких образований включают опухоли, которые сдавливают жизненно важные органы, например сосуды, или так называемые функциональные опухоли эндокринных тканей, которые могут продуцировать в излишних количествах некоторые гормоны (примеры таких опухолей - аденома щитовидной железы, аденома коры надпочечников, аденома гипофиза).

Доброкачественная опухоль часто бывает окружена капсулой из соединительной ткани, которая лишает опухоль способности «вести себя» злокачественно. Иногда некоторые изначально доброкачественные опухоли со временем дают начало злокачественному раковому росту; это происходит вследствие дальнейших генетических изменений в какой-то субпопуляции неопластических клеток. Яркий пример такого явления - трубчатая аденома толстой кишки, представляющая собой часто встречающуюся форму полипа; эта опухоль нередко становится предшественником рака толстой кишки. Клетки тубулярной аденомы, как и большинства опухолей, часто перерождающихся в рак, имею определенные аномалии созревания и внешнего вида, в совокупности называемые дисплазией. Эти аномалии не наблюдаются в доброкачественных опухолях, лишь в редких случаях превращающихся в раковые (или никогда не превращающиеся в раковые), но встречаются в других предраковых измененных тканях, не образующих отдельной массы, например в предраковых поражениях - шейки матки. Некоторые специалисты предпочитают называть диспластические опухоли предзлокачественными, оставляя определение «доброкачественные» для опухолей, которые никогда не дают начало раку или только в редких случаях.

Неоплазма - это аномальная масса ткани, возникшая в результате неоплазии. Неоплазией («новый рост» по-гречески) называется аномальная пролиферация клеток: клеточный рост интенсивнее нормального и не координируется с ростом окружающей ткани, причем интенсивность роста повышена даже после прекращения действия стимулировавшего его фактора. В результате неоплазии образуется узел или опухоль. Неоплазмы бывают доброкачественные, предзлокачественные и злокачественные.

Выражение «рост опухоли/опухолевый рост» по данному изобретению относится к тенденции увеличения размеров опухоли и/или тенденции к пролиферации опухолевых клеток.

Рак (злокачественная неоплазма) - это группа заболеваний, при которых наблюдается неконтролируемый клеточный рост (некоторые клетки делятся за пределами нормы), инвазия (прорастание в соседние ткани и их разрушение) и иногда метастазы (распространение через кровь или лимфу в другие места организма). Эти три злокачественных свойства отличают раковые опухоли от доброкачественных, рост и развитие которых ограничено само по себе и не сопровождается инвазией или метастазированием. При большинстве раковых заболеваний образуется опухоль, но при некоторых, например при лейкозах, опухоли нет. По данному изобретению термины «рак» и «опухоль» или «раковое заболевание» и «опухолевое заболевание» употребляются в настоящем документе в основном взаимозаменяемо применительно к заболеваниям, при которых имеет место неконтролируемый клеточный рост и могут быть инвазия и/или метастазы.

Предпочтительно раковое заболевание по данному изобретению отличается присутствием клеток, в которых экспрессируется клаудин 18.2. Клети, в которых экспрессируется клаудин 18.2, являются предпочтительно раковыми клетками, предпочтительно описанных в настоящем документе опухолей и раковых поражений. Предпочтительно эти клетки не являются клетками желудка.

Раковые заболевания классифицируют по типу клеток, образующих опухоль, и по ткани/органу, где образовалась первичная опухоль. Это, соответственно, гистологическая характеристика и локализация.

Термин «рак» по данному изобретению включает лейкозы, семиномы, меланомы, тератомы, лимфомы, нейробластомы, глиомы, ректальный рак, рак эндометрия, рак почки, рак надпочечника, рак щитовидной железы, рак крови, рак кожи, рак головного мозга, рак шейки матки, рак кишечника, рак печени, рак толстой кишки, рак желудка, рак головы и шеи, рак желудочно-кишечного тракта, рак лимфатических узлов, рак пищевода, колоректальный рак, рак поджелудочной железы, рак уха/горла/носа, рак молочной железы, рак предстательной железы, рак матки, рак яичника, рак легкого и их метастазы. Примеры перечисленных выше раковых поражений являются карциномы легкого, карциномы молочной железы, карциномы предстательной железы, почечноклеточные карциномы, карциномы шейки матки или метастазы перечисленного выше или опухоли, описанные выше. Термин «рак» по данному изобретению включает также метастазы.

Основными типами рака легкого являются мелкоклеточная карцинома легкого (SCLC) и немелкоклеточная карцинома легкого (NSCLC). Существуют три основных подтипа немелкоклеточных карцином легкого: плоскоклеточная карцинома легкого, аденокарцинома и крупноклеточная карцинома легкого. На долю аденокарцином приходится приблизительно 10% случаев рака легкого. Это раковое поражение обычно имеет место в периферической области легкого - в отличие от мелкоклеточного и плоскоклеточного рака легкого, локализованных обычно ближе к центру органа.

По данному изобретению карцинома - это злокачественная опухоль, происходящая из эпителиальных клеток. Карциномы представляют наиболее часто встречающиеся раковые заболевания, в том числе молочной железы, предстательной железы, легких и толстой кишки.

Термин «метастаз» обозначает распространение раковых клеток из места первоначального расположения в другие части тела. Образование метастазов - очень сложный процесс, зависящий от отделения злокачественных клеток от первичной опухоли, инвазии во внеклеточный матрикс, проникновения через базальную мембрану на границе эндотелия в просвет сосудов и в полость тела, затем транспортировки с кровью и инфильтрации в органы-мишени. Наконец, рост новой опухоли, то есть вторичной (метастатической) опухоли, в новом месте зависит от ангиогенеза. Метастазы опухолей нередко образуются даже после того, как удалена первичная опухоль, потому что опухолевые клетки или компоненты могут остаться и обрести метастатический потенциал. В одном из воплощений данного изобретения термин «метастаз» относится к отдаленным метастазам, находящимся относительно далеко от первичной опухоли и регионарных лимфатических узлов.

Клетки вторичной, или метастатической опухоли подобны клеткам первичной опухоли. Это значит, что, например, если рак яичника метастазирует в печень, то вторичная опухоль образована аномальными клетками яичника, а не печени, Такая опухоль в печени называется метастазом рака яичника, но не раком печени.

Рецидив или активизация рака случается, когда индивид подвергается вновь условиям, спровоцировавшим заболевание в прошлом. Например, если больной, страдавший раковым заболеванием, успешно лечился, но затем оно у него развилось опять, то это заново возникшее заболевание рассматривается как рецидив или активизация заболевания. Однако по данному изобретению рецидив или активизация ракового заболевания может произойти не в том месте, где оно проявлялось первоначально. Так, например, если больная, страдавшая от опухоли яичника и с успехом прошедшая лечение, то рецидив или активизация заболевания могут выражаться возникновением опухоли яичника же либо образованием опухоли в другом месте. К рецидивам или активации заболевания относятся также ситуации, когда опухоль возникает в месте, отличном от локализации первичной опухоли, либо в той же локализации. Предпочтительно первоначальная опухоль, по поводу которой больной получал лечение, является первичной, а опухоль, возникшая в месте, отличном от локализации первично опухоли, -вторичной, или метастатической.

Под лечением понимается введение индивиду веществ или композиций с целью предотвратить или ликвидировать заболевание, включая уменьшение размеров опухоли или числа опухолей в организме данного индивида; остановку или замедление прогрессирования заболевания у данного индивида; подавление или замедление развития нового заболевания у данного индивида; сокращение частоты или уменьшение степени тяжести симптомов и/или обострений/рецидивов заболевания у больного или индивида, ранее страдавшего от этого заболевания; и/или продление жизни, то есть увеличение ее продолжительности у данного индивида.

В частности под лечением заболевания понимается излечение, сокращение продолжительности, облегчение, предотвращение, замедление или подавление прогрессирования или ухудшения, предотвращение или отсрочка возникновения заболевания или его симптомов.

Выражение «риск заболевания» означает, что для данного индивида установлена повышенная против нормальной вероятность развития заболевания, в частности рака, по сравнению с популяцией в целом. Также если у индивида имеется или недавно было заболевание, в частности рак, то для него существует повышенный риск развития этого заболевания,. поскольку оно может продолжать развиваться. Также для индивидов, больных или болевших раком повышен риск возникновения метастазов рака.

Термин «иммунотерапия» относится к лечению, включающему специфичные иммунологические реакции. В контексте данного изобретения выражения типа «защищать», «предотвращать», «профилактический», «превентивный» или «защитный/протективный» относятся к предотвращению или лечению (или к тому и другому вместе) возникновения и/или распространения заболевания у индивида и, в частности, к снижению вероятности или к задержке развития заболевания у данного индивида. Например, человек, для которого есть риск возникновения опухоли из числа упомянутых выше, является кандидатом на получение иммунотерапии для предотвращения опухоли. Иммунотерапия может осуществляться путем применения любого из множества разнообразных методов с использованием агентов, ликвидирующих клетки, в которых экспрессируется определенный антиген, в организме пациента.

В некоторых воплощениях данного изобретения иммунотерапия может быть активной, то есть лечение базируется на том, чтобы in vivo стимулировать эндогенную иммунную систему организма-хозяина к реакции против пораженных клеток путем введения агентов, модифицирующих иммунный ответ (например, иммунореактивных пептидов и нуклеиновых кислот).

В других воплощениях данного изобретения иммунотерапия может быть пассивной, то есть лечение включает доставку агентов с установленной противоопухолевой иммунореактивностью (например, антител), которые могут непосредственно или опосредованно оказывать противоопухолевое действие и для которых не обязательно участие интактяой иммунной системы организма-хозяина.

Термин «in vivo» относится к тому, что происходит в организме индивида.

Слова «индивид», «особь», «пациент», «больной» или «организм» в настоящем документе употребляются взаимозаменяемо и относятся к позвоночным животным, предпочтительно млекопитающим. Например, в контексте данного изобретения млекопитающие - это люди и другие приматы, домашние животные (например, собаки, кошки, овцы, крупный рогатый скот, козы, свиньи, лошади и проч.), лабораторные животные (например, мыши, крысы, кролики, морские свинки и проч.), а также животные, содержащиеся в неволе, например обитатели зоопарков. Термин «животное» в настоящем документе включает и человека. Термин «индивид» может также включать больного/пациента, то есть животное, предпочтительно человека, страдающего заболеванием, предпочтительно заболеванием из числа описанных в настоящем документе.

В контексте данного изобретения образец - это любой образец, который можно использовать по данному изобретению, в частности биологический образец, например образец ткани, включая жидкости тела, и/или клеточный образец, и который можно получить обычными способами, например путем биопсии, в том числе пункционной/штанцевой, путем забора крови, бронхиального аспирата, мокроты, мочи, кала и проч. По данному изобретению термин «образец» также включает образцы, прошедшие ту или иную обработку, например фракции или изоляты биологических образцов, например выделенные нуклеиновые кислоты и пептиды/белки. Предпочтительно образец содержит клетки или ткань подлежащего исследованию органа, например для диагностирования рака. Например, если нужно диагностировать рак легкого, образец может содержать клетки или ткань, полученные из легкого.

По данному изобретению образец может быть телесным образцом, взятым у индивида, имеющего или предположительно имеющего опухоль или раковые клетки. Телесный образец может быть образцом любой ткани, например крови, образцом ткани первичной опухоли или метастаза, или любым другим образцом, содержащим опухоль или опухолевые клетки.

Ниже данное изобретение описывается подробно с помощью чертежей и примеров, которые используются только с иллюстративной целью и не имеют ограничительного характера. Благодаря описанию и примерам специалистам в данной области техники доступны и другие варианты осуществления изобретения, которые также включаются в его объем.

Чертежи

Фиг. 1. Выравнивание аминокислотных последовательностей клаудинов 18 человека и мыши

Выравнивание аминокислотных последовательностей показывает высокую степень гомологии между человеческим и мышиным клаудинами 18.2 и человеческими клаудинами 18.1 и 18.2.

Фиг. 2. Рекомбипантный белок, включающий С-концевую часть CLDN18.2 (аминокислотные остатки с 191 по 261), который использовали для иммунизации мышей.

Фиг. 3. Анализ аминокислотных последовательностей антител 43-14А и 35-22А.

Примеры

Методики и способы, использовавшиеся по настоящему изобретению, описаны в настоящем документе или осуществлялись известным в данной области техники образом, как описано, например, в работе Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. Bee методы, включающие использование готовых наборов и реагентов, осуществлялись согласно информации, предоставленной их производителем, если только специально не оговорено иного.

Пример 1. Получение моноклональных антител

Задача этой части исследования состояла в получении мышиных моноклональных антител, специфичных в отношении CLDN18 и способных выявлять опухолевые клетки, в которых экспрессируется CLDN18.2, в фиксированных формалином и залитых парафином (FFPE) тканях карцином желудка, пищевода, поджелудочной железы и легких.

Чтобы добиться образования высокоспецифичных высокоаффинных диагностических антител против CLDN18.2, нужно было начать иммунизацию с широкого спектра различных иммуногенов и адъювантов. В ходе этой работы около 100 мышей (линий С57В1/6 и Balb/c) иммунизировали по различным протоколам для достижения иммунного ответа против α-CLDN18.

Чтобы стимулировать мышиную иммунную систему и преодолеть иммунную толерантность авторы изобретения использовали вирусоподобные частицы (VLP), конъюгаты с пептидами и рекомбинантаые белки, соответствующие различным частям человеческого CLDN18.2, которые экспрессировались как рекомбинантаые слитые белки с различными экспрессионными «партнерами» (метками).

Из 13 различных вариантов иммунизации наилучшие результаты получились в результате обработки мышей рекомбинантаым белком, включающим С-концевую часть CLDN18 и гистидиновую метку (HIS-TAG) (см. фиг. 2; иммунизация #20) в сочетании с различными адъювантами (см. таблицу 1, внизу, слияние 35).

Один из кандидатов (35-22А) был получен после иммунизации в 4 этапа (30 суток). Другой кандидат (43-14А) был получен после иммунизации в 7 этапов (79 суток); см. таблицу 1 (внизу, слияние 43).

За двое суток до спленэктомии, мышам делали бустер-инъекцию для активации В-клеток.

В день слияния у мышей выделяли спленоциты и сливали их с мышиными миеломными клетками линии Ag8.653. Для слияния мышиных клеток с миеломными применяли стандартный протокол, приведенный в работе Kohler and Milstein 1975. Проводили отбор путем непрямого антитлобулинового теста (HAT) HAT и супернатанты проверяли путем твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) на наличие антител, распознающих антиген, использовавшийся для иммунизации.

Гибридомы, соответствующие тем супернатантам, которые дали положительную реакцию при ELISA, субклонировали для получения моноклональных гибридом и супернатанты от субклонированных гибридомных клеток проверяли путем ELISA. Гибридомные клетки клонов, давших положительную реакцию, размножали и проводили дальнейшее исследование супернатантов.

Пример 2. Проверка супернатантов моноклональных гибридом методом вестерн-блоттинга

Чтобы установить, способны ли антитела в супернатантах, давших положительную реакцию при проверке методом ELISA, связываться с рекомбинантаым клаудином 18 или с белковыми лизатами стабильно трансфицированных клеток НЕК293, в которых экспрессируется клаудин 18, проводили анализ методом вестерн-блоттинга. Антитела, которые оказались способны специфично связываться с клаудином 18, получали в большем количестве. Клетки подвергали криоконсервации и проводили очистку антител путем быстрой жидкостной хроматографии белков (FPLC) с сорбентом MABselect. Антитела, отобранные после анализа методом вестерн-блотпшга, очищали и иммуногистохимическим путем определяли их способность связывать антиген в образцах тканей, фиксированных формалином и залитых парафином (FFPE).

Пример 3. Гистологический анализ - первый уровень антител, давших положительный результат при вестерн-блоттинге

Целью этого эксперимента - проверить специфичность и чувствительность антител против CLDN18. Для этого использовали FFPE-образцы нормальной ткани желудка, в которых экспрессировался CLDN18.

В первом опыте антитела, проверенные методом вестерн-блоттинга и очищенные, брали в концентрации 0,5 мкг/мл и определяли связывание, используя FFPE-срезы желудка человека. Антитела, проявлявшие достаточное связывание и не дававшие высокого фона, далее разводили до концентрации 0,2 и 0,1 мкг/мл и для определения их чувствительности и специфичности брали различные нормальные ткани желудка. На более поздних стадиях разработки антитела сразу после получения брали в концентрации 0,2 мкг/мл, поскольку наилучшие антитела уже проявили себя достаточно хорошо при концентрации 0,2 мкг/мл, что служило ориентиром. Для дальнейшего титрования и определения специфичности отбирали антитела, с которыми получался наиболее сильный сигнал в эпителии слизистой желудка человека и не было фона в соседних слоях слизистой. Выделялись два антитела - 35-22А и 43-14А; см. таблицы 2 и 3 ниже.

Антитела, с которыми получался достаточно интенсивный сигнал в нормальной ткани желудка, далее проверяли на раковых тканях. Соответствующие гибридомные клетки адаптировали к бессывороточной среде. С антителами murnAb 43-14А сигнал получался несколько сильнее, чем с mumAb 35-22А; см. таблицу 4 ниже.

Пример 4. Углубленный гистологический анализ и характеристика антител

Антитела, полученные без сыворотки, использовали для окрашивания микрообразцов раковой ткани желудка (ТМА). Анализировали количество случаев окрашивания, интенсивность сигнала и количество опухолевых клеток, давших положительную реакцию.

С антителами 35-22А и 43-14А окрашивание было весьма интенсивным. Между этими двумя антителами не наблюдалось существенных различий в распределении окрашивания и лишь слабые различия в его интенсивности.

Пример 5. Анализ специфичности антител применительно к нормальным тканям

Отобранные антитела испытывали на различных нормальных тканях с целью проверить их высокую специфичность к мишени (CLDN18); см. таблицы 5А и 5В ниже.

В предыдущих экспериментах не обнаруживалось существенной разницы в распределении и интенсивности окрашивания при использовании антител 35-22А и 43-14А. Поэтому эти антитела далее использовали в экспериментах по окрашиванию тканей с более клинически-ориентрированым протоколом. Чтобы имитировать процедуры окрашивания, применяемые обычно в патологоанатомических лабораториях, был предложен «однодневный» протокол эксперимента, в котором был короткий (1 час) этап инкубации первичных антител.

Во всех проанализированных случаях с антителами mumAb 43-14А получались отличные результаты и с mumAb 35-22А лишь немного хуже; см. таблицу 6 ниже.

Пример 6. Углубленный анализ применительно к эпителию дыхательных путей

Дополнительно антитела mumAb 43-14А с целью проверить их специфичность испытывали на различных тканях дыхательных путей, в особенности на тканях-мишенях легких и бронхов. Сообщалось об экспрессии CLDN18.1 в этих тканях. Чтобы определить, имеется ли перекрестная реактивность диагностических антител по данному изобретению и изоформой CLDN18.1, экспрессирующейся в легких/бронхах, проверяли все доступные ткани легких/бронхов. Ни в одном из этих случаев сигнал не определялся; см. таблицу 7 ниже. Изоформа CLDN18, экспрессирующаяся в изученных тканях дыхательных путей, не распознавалась антителами 43-14А.

Пример 7. Картирование эпитопов mumAb 43-14А и mumAb 35-22А

С целью идентифицировать эпитопы CLDN18.2, связывающиеся с антителами, был проведен анализ пептидов методом ELISA. Для каждого из очищенных антител анализировали перекрывающиеся пептиды, охватывающие С-концевую часть аминокислотной последовательности CLDN18.2. Антитела 35-22А и 43-14А специфично связывались с пептидом TEDEVQSYPSKHDYV. Последовательность EVQSYPSKHDYV была определена как иммунореактивная.

Пример 8. Анализ аминокислотной последовательности mumAb 43-14А и mumAb 35-22А

Результаты анализа аминокислотных последовательностей антител 43-14А и 35-22А представлены на фиг. 3.

Пример 9. Окрашивание различных раковых тканей

Для иммуногистохимического анализа использовали фиксированные 4%-ным забуференным формалином и залитые парафином образцы на предметных стеклах. Заливку парафином делали согласно стандартным протоколам.

Препараты образцов депарафинизировали и проводили демаскировку антигенов путем кипячения в растворе лимонной кислоты (10 мМ), содержавшем 0,05% Tween-20 (рН 6,0) при температуре 120°С в течение 10 минут, после чего блокировали 2%-ным раствором Н₂О₂ и инкубировали в течение ночи при температуре 4°С с диагностическими мышиными моноклональными антителами против CLNDN18.2 43-14А или 35-22А в концентрации 0,2-0,5 мкг/мл. Связывание антител визуализировали с помощью вторичных антител, меченных перкосидазой хрена, используя полимерную технологию с системой Powervision (антимышиные козьи HRP-антитела Power Vision; Immunologic, Дуивен, Нидерланды) и раствор хромогенного субстрата (VectorRed; Vector Labs, Берлингем, США). Затем проводили контрастное окрашивание срезов гематоксилином Майера (Carl Roth GmbH, Карлсруэ, Германия), результаты которого подвергали экспертной оценке.

Гистологическая оценка

Все образцы анализировали, рассматривая относительную долю окрашивающихся опухолевых клеток относительно всех видимых опухолевых клеток в данном срезе. Интенсивность окрашивания оценивали как отрицательную (-), слабо положительную (1+), умеренно положительную (2+) или сильно положительную (3+). Положительным сочли только окрашивание мембран. Контролем (положительным) в каждом случае служила нормальная ткань желудка человека. Поскольку при интраэпителиальной неоплазии поджелудочной железы (PanIN) часто имеет место интенсивное окрашивание пораженной ткани, эти области брали как внутренний стандарт интенсивности окрашивания для сильно положительной реакции (3+).

С обоими испытывавшимися антителами получалось сильное окрашивание клеточных мембран в раковой ткани поджелудочной железы, пищевода и желудка (таблица 8), а также с антителами 43-14А в раковой ткани легких (таблица 9). Число «положительных» опухолевых клеток варьировало у разных индивидов и в разных случаях опухолей. Подавляющее большинство образцов было «положительными» (2+) - (3+).

1. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые

(i) связываются с пептидом, имеющим аминокислотную последовательность TEDEVQSYPSKHDYV (SEQ ID NO: 5) или EVQSYPSKHDYV (SEQ ID NO: 6) и/или

(ii) связываются с клаудином 18.2 (CLDN18.2), причем указанное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, связываются с CLDN18.2 путем связывания по меньшей мере одного эпитопа в молекуле CLDN18.2, аминокислотная последовательность которого TEDEVQSYPSKHDYV (SEQ ID NO: 5) или EVQSYPSKHDYV (SEQ ID NO: 6),

где указанное антитело включает:

(A)

тяжелую цепь антитела, содержащую:

CDR1 с последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 8,

CDR2 с последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 9, и

CDR3 с последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 10,

и

легкую цепь антитела, содержащую:

CDR1 с последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 12,

CDR2 с последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 13, и

CDR3 с последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 14,

или

(B)

тяжелую цепь антитела, содержащую:

CDR1 с последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 16,

CDR2 с последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 17, и

CDR3 с последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 18,

и

легкую цепь антитела, содержащую:

CDR1 с последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 20,

CDR2 с последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 21, и

CDR3 с последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 22.

2. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 1, в котором указанный CLDN18.2 является связанным с клеточной мембраной CLDN18.2.

3. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 1, в котором указанный CLDN18.2 присутствует на раковых клетках.

4. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 3, в котором указанные раковые клетки являются раковыми клетками, в которых экспрессируется CLDN18.2.

5. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 3, в котором указанные раковые клетки выбирают из группы, состоящей из раковых клеток желудка, пищевода, поджелудочной железы, легких, яичников, толстой кишки, печени, головы-шеи и желчного пузыря.

6. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 1, которые не связываются с нераковыми клетками, за исключением эпителиальных клеток желудка в иммуногистохимическом анализе при концентрации антитела от 0,2 мкг/мл до 0,5 мкг/мл.

7. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 1, которые не связываются с нераковыми клетками легких в иммуногистохимическом анализе при концентрации антитела от 0,2 мкг/мл до 0,5 мкг/мл.

8. Антитело по п. 1, которое является химерным, человеческим или гуманизированным.

9. Антитело по п. 1, которое является моноклональным.

10. Конъюгат, содержащий антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-9, присоединенный к по меньшей мере одной выявляемой метке, где

указанный конъюгат:

(a) связывается с пептидом, имеющим аминокислотную последовательность TEDEVQSYPSKHDYV (SEQ ID NO: 5) или EVQSYPSKHDYV (SEQ ID NO: 6), и/или

(b) связывается с клаудином 18.2 (CLDN18.2), где указанное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связываются с CLDN18.2 путем связывания по меньшей мере одного эпитопа CLDN18.2, имеющего аминокислотную последовательность TEDEVQSYPSKHDYV (SEQ ID NO: 5) или EVQSYPSKHDYV (SEQ ID NO: 6).

11. Гибридома, депонированная под регистрационным номером DSM ACC3144 (muAB 43-14A), где указанная гибридома способна продуцировать антитело по любому из пп. 1-9.

12. Гибридома, депонированная под регистрационным номером DSM ACC3143 (muAB 35-22A), где указанная гибридома способна продуцировать антитело по любому из пп. 1-9.

13. Способ выявления CLDN18.2 или определения количества CLDN18.2 в образце, включающий этапы:

(i) контактирование образца с антителом или антигенсвязывающим фрагментом по любому из пп. 1-9 или с конъюгатом по п. 10 и

(ii) выявление образования комплекса из антитела, антигенсвязывающего фрагмента или конъюгата и CLDN18.2 или определение количества этого комплекса.

14. Способ определения экспрессии CLDN18.2 клетками, включающий этапы:

(i) контактирование клеточного образца с антителом или с антигенсвязывающим фрагментом по любому из пп. 1-9 или с конъюгатом по п. 10 и

(ii) выявление образования комплекса из антитела, антигенсвязывающего фрагмента или конъюгата и CLDN18.2, экспрессирующегося в клетках указанного образца.

15. Способ диагностирования, выявления или наблюдения за течением рака, включающий этапы:

(i) контактирование биологического образца с антителом или с антигенсвязывающим фрагментом по любому из пп. 1-9 или с конъюгатом по п. 10 и

(ii) выявление образования комплекса из антитела, антигенсвязывающего фрагмента или конъюгата и CLDN18.2 и/или определение количества этого комплекса,

где указанный рак характеризуется раковыми клетками, экспрессирующими CLDN18.2.

16. Способ определения, подлежит ли раковое заболевание противораковой терапии, использующей CLDN18.2 как мишень, который включает этапы:

(i) контактирование образца, содержащего раковые клетки, с антителом или с антигенсвязывающим фрагментом по любому из пп. 1-9 или с конъюгатом по п. 10 и

(ii) выявление образования комплекса из антитела, антигенсвязывающего фрагмента или конъюгата и CLDN18.2,

где указанный рак характеризуется раковыми клетками, экспрессирующими CLDN18.2.

17. Диагностический набор для диагностики заболевания, включающего клетки, экспрессирующие CLDN18.2, включающий антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-9 или конъюгат по п. 10.

18. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-9, где указанный CLDN18.2 содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2 перечня последовательностей, или вариант указанной аминокислотной последовательности.

19. Конъюгат по п. 10, где указанный CLDN18.2 содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2 перечня последовательностей, или вариант указанной аминокислотной последовательности.

20. Гибридома по п. 11 или 12, где указанный CLDN18.2 содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2 перечня последовательностей, или вариант указанной аминокислотной последовательности.

21. Способ по п. 13, где указанный CLDN18.2 содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2 перечня последовательностей, или вариант указанной аминокислотной последовательности.

22. Способ по п. 14, где указанный CLDN18.2 содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2 перечня последовательностей, или вариант указанной аминокислотной последовательности.

23. Способ по п. 15, где указанный CLDN18.2 содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2 перечня последовательностей, или вариант указанной аминокислотной последовательности.

24. Способ по п. 16, где указанный CLDN18.2 содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2 перечня последовательностей, или вариант указанной аминокислотной последовательности.

25. Диагностический набор по п. 17, где указанный CLDN18.2 содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2 перечня последовательностей, или вариант указанной аминокислотной последовательности.