Улучшенные способы применения рекомбинантных секретоглобинов человека
Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к терапевтическим композициям секретоглобинов человека, и может быть использовано в медицине для предупреждения осложнений острых и хронических состояний дыхательной системы. Предложен способ получения композиции, включающий получение белка слияния на основе рекомбинантного белка SCGB3A2 человека, слитого с убиквитин-подобным белком (UBL), и воздействие на полученный белок слияния UBL-протеазой, которая распознает UBL и отщепляет его от SCGB3A2 с высвобождением интактного белка SCGB3A2. Полученная указанным способом композиция содержит в эффективном количестве рекомбинантный белок секретоглобина SCGB3A2 человека. Изобретение обеспечивает эффективное ингибирование секреторного фермента PLA2, что может быть использовано для облегчения тяжелых состояний при заболеваниях дыхательной системы. 2 н. и 2 з.п. ф-лы, 6 ил., 3 табл., 8 пр.
ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям, способам получения, аналитическим способам и способам применения секретоглобинов, в том числе SCGB1A1 (СС10), SCGB3A1 и SCGB3A2. Были выявлены новые физиологические роли и терапевтические применения этих секретоглобинов. Конкретно, настоящее изобретение относится к новым способам применения rhCC10, rhSCGB3A2 и rhSCGB3A1 для предупреждения или отсрочки госпитализации вследствие тяжелых обострений заболевания дыхательной системы на протяжении до 10 месяцев после курса лечения. Настоящее изобретение также относится к новым способам получения и фармацевтическим композициям на основе rhSCGB3A2, которые являются стабильными и имеют противовоспалительные свойства. Более конкретно, настоящее изобретение дополнительно обеспечивает способ предупреждения тяжелых обострений заболевания дыхательной системы с помощью введения rhCC10. Настоящее изобретение дополнительно обеспечивает способ лечения бронхоэктаза и предупреждения обострений бронхоэктаза с помощью введения rhSCGB3A2. Еще более конкретно, настоящее изобретение представляет способ регрессии изменения структуры воздухоносных путей при хронических заболеваниях легких и предупреждения изменения структуры воздухоносных путей при острых повреждениях легких с помощью введения rhCC10, rhSCGB3A2 или rhSCGB3A1. Еще более конкретно, эти секретоглобины модифицируют изменение структуры воздухоносных путей косвенным путем с помощью восстановления нормального количества клеток Клара и ассоциированных с ними структур, которые называются нейроэпителиальными тельцами (также известные под названием NEB) или кластерами нейроэндокринных клеток (также известные под названием NEC), которые выявляют благодаря их иммунореактивности в отношении антител против CGRP1, в эпителии воздухоносных путей. Затем клетки Клара и другие CGRP1+ клетки секретируют эти секретоглобины и другие компоненты нормальной среды слизистой оболочки, которые способствуют гомеостазу и нормальному функционированию слизистой оболочки дыхательных путей и эпителия, которые в этом случае являются более устойчивыми к вдыхаемым неблагоприятным факторам без возникновения тяжелых обострений.
ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Природный 10 кДа белок клеток Клара человека (СС10), также известный как утероглобин, 16 кДа белок клеток Клара (СС16), секреторный белок клеток Клара (CCSP), бластокинин, белок-1 мочи и секретоглобин 1А1 (SCGB1A1) являются представителями семейства родственных белков, называемых секретоглобины, которые, как считается, существуют у всех позвоночных животных. Существуют два дополнительных секретоглобина, которые также экспрессируются при очень высоких уровнях в дыхательных путях, называемые SCGB3A1 и SCGB3A2 (Porter, 2002). Эти три белка; SCGB1A1, SCGB3A1 и SCGB3A2, в данном документе называются ''секретоглобинами дыхательной системы''. В таблице 1 показаны идентификаторы в Genebank и аминокислотные последовательности для каждого секретоглобина дыхательной системы.
Основным источником секретоглобинов дыхательной системы у млекопитающих является эпителий легких и трахеи, а именно бронхиолярные эпителиальные клетки воздухоносных путей, отличные от реснитчатых (прежде всего клетки Клара), и при этом они являются очень распространенными белками, которые продуцируются в локальной среде, во внеклеточной жидкости легких взрослых. Они также секретируются в назальном эпителии. Таким образом, секретоглобины дыхательной системы характеризуются высоким уровнем экспрессии как в верхних, так и в нижних дыхательных путях; причем верхние дыхательные пути включают носовые ходы и пазухи, а нижние дыхательные пути включают трахею, бронхи и альвеолы легких. Значительное количество секретоглобинов дыхательной системы также присутствует в сыворотке крови и моче, причем в большинстве случаев их получают из пульмональных источников. SCGB3A1 также экспрессируется в желудке, сердце, тонком кишечнике, матке и молочных железах, а SCGB3A2 характеризуется низким уровнем экспрессии в щитовидной железе (Porter, 2002). СС10 также продуцируется тканями репродуктивных органов (матка, семенные пузырьки), экзокринными железами (предстательная железа, молочная железа, поджелудочная железа), эндокринными железами (щитовидная железа, гипофиз, надпочечные железы и яичники), а также тимусом и селезенкой (Mukherjee, 1999; Mukherjee, 2007). Основная форма СС10 человека in vivo, которую можно выделить, представляет собой гомодимер, состоящий из двух идентичных мономеров из 70 аминокислот, причем значение изоэлектрической точки составляет 4,8. Его молекулярная масса составляет 15,8 кДа, хотя он мигрирует при анализе с помощью SDS-PAGE с получением наблюдаемой молекулярной массы приблизительно 10 кДа. Мономеры расположены в антипараллельной конфигурации, причем N-конец одного является смежным с С-концом другого, а в полностью окисленной форме димера мономеры соединены двумя дисульфидными связями (Mukherjee, 1999). Однако, in vivo молекулярная форма (мономер, димер или другой комплекс) SCGB3A2 в образцах, полученных от человека, еще не была описана. Все три секретоглобина дыхательной системы можно получить с помощью синтетических способов (Nicolas, 2005) или способов с использованием рекомбинантных ДНК (Mantile, 1993), хотя до настоящего времени не было сообщений с описанием успешного синтеза SCGB3A1 и SCGB3A2 человека и биохимической характеристикой этих белков in vitro.
СС10 представляет собой белок с противовоспалительным и иммуномодулирующим действием, который был описан в связи с разными взаимодействиями с другими белками, рецепторами и типами клеток (обзор в Mukherjee, 2007, Mukherjee, 1999 и Pilon, 2000). Более низкие уровни белка или мРНК СС10 были выявлены в образцах разных тканей и жидкостей при ряде клинических состояний, которые характеризуются некоторой степенью воспаления, в том числе астме (Lensmar, 2000; Shijubo, 1999; Van Vyve, 1995), пневмонии (Nomori, 1995), облитерирующем бронхите (Nord, 2002), саркоидозе (Shijubo, 2000), и у пациентов, которые страдают хроническим ринитом с рецидивирующим синуситом и назальным полипозом (Liu, 2004). При этих состояниях на эпителиальные клетки легких, основной источник эндогенных СС10 в организме, часто осуществляется неблагоприятное влияние, они истощаются или даже разрушаются (Shijubo, 1999).
Мыши, нокаутные (KO) по СС10, имели важное значение для определения роли СС10 в гомеостазе легких, размножении и определенных типах заболеваний почек. Существуют две линии мышей СС10 KO, для каждой из которых использовали разные конструкции для генного нокаута и разные исходные линии мышей. Одна нокаутная линия характеризуется несколькими выраженными фенотипическими характеристиками, в том числе, системным воспалением, слабой способностью к размножению (малый размер приплода), и летальным фенотипом почек, похожим на IgA-нефропатию у человека (Zhang, 1997; Zheng, 1999). Другая нокаутная линия не характеризуется этими выраженными фенотипическими характеристиками и является более жизнеспособной, что дает возможность проведения большего количества экспериментов (Stripp, 1997). Обе линии мышей СС10 KO характеризуются намного большей чувствительностью и существенно усиленными воспалительными реакциями на факторы, неблагоприятно влияющие на легкие, в моделях астмы, фиброза легких и канцерогенеза, бактериальных и вирусных инфекций и влияния кислорода и озона (Plopper, 2006; Lee, 2006; Yang, 2004; Wang, 2003; Harrod, 2002; Chen, 2001; Wang, 2001; Hayashida, 2000; Harrod, 1998). Восстановление функции CC10 y этих нокаутных мышей с применением рекомбинантного СС10 человека (rhCC10), как было продемонстрировано, ослабляет чрезмерные воспалительные реакции в легких в моделях с провокационной пробой на протяжении короткого периода времени с конечной точкой до 7 дней (Chen, 2001; Wang, 2003). Что в наибольшей степени касается настоящего изобретения, обе линии имеют фенотип эпителия воздухоносных путей, который характеризуется значительно сниженным количеством клеток Клара и ассоциированных структур, называемых нейроэпителиальными тельцами (NEB; Castro, 2000) или кластерами нейроэндокринных клеток (NEC; Hong, 2001; Reynolds, 2000), как выявлено с помощью положительного окрашивания на белок 1, связанный с геном кальцитонина (CGRP1). Это снижение количества клеток Клара и ассоциированных структур в 2-10 раз в воздухоносных путях возникает при отсутствии какого-либо типа повреждения у этих мышей KO.
Недоношенные дети, у которых возникает респираторный дистресс-синдром (RDS), имеют недостаточное количество нативного СС10. В клиническом исследовании одну дозу rhCC10 вводили в день рождения и опосредствовали сильные краткосрочные противовоспалительные эффекты на протяжении 3-7 дней в легких. Анализы фармакокинетики продемонстрировали, что избыток СС10 выводился на протяжении 48 часов после введения одной дозы. Несмотря на противовоспалительные эффекты, rhCC10 не предупреждает развитие бронхолегочной дисплазии у новорожденных (BPD) (Levine, 2005), как было определено с помощью клинических параметров, в том числе 1) затемнения на рентгенограмме грудной клетки через 28 дней после рождения или 2) использования дополнительного кислорода при гестационном возрасте 36 недель (РМА). rhCC10 не уменьшает период госпитализации или количество дней с применением аппарата искусственной вентиляции легких, несмотря на значительное снижение показателей воспаления легких, наблюдаемых с использованием жидкости, аспирированной из трахеи (TAF). Не наблюдали различия между группами с использованием плацебо, лечением низкими дозами и высокими дозами с конечной точкой 12 месяцев, как изложено в Levine et al. (2005).
У недоношенных детей с BPD наблюдается склонность к возникновению частых и тяжелых обострений заболевания дыхательной системы и при этом частота их повторной госпитализации в первые 1-2 года жизни является высокой. Тяжелые обострения заболевания дыхательной системы характеризуются одышкой, затрудненным дыханием, заложенностью носа и груди, чрезмерным образованием слизи и иногда респираторным дистрессом. Тяжелые обострения заболевания дыхательной системы наблюдаются, когда на пациентов осуществляется влияние факторов окружающего среды и инфекций при вдыхании пыли, дыма, аллергенов, загрязнителей, химических веществ, бактерий, грибов и вирусов.
Много категорий пациентов с хроническими заболеваниями дыхательных путей, желудочно-кишечного тракта, урогенитального тракта склонны к тяжелым обострениям под влиянием провоцирующего фактора окружающей среды. Аналогично, пациенты с заболеваниями иммунной системы, в том числе аутоиммунными и аллергическими заболеваниями, также склонны к тяжелым обострениям под влиянием провоцирующего фактора окружающей среды. Тяжелые или острые обострения считаются частыми, если они встречаются у пациента более чем 3 раза на год. Даже пациенты, у которых нет хронического заболевания, но которые подвергаются острому повреждению легких (ALI), после повреждения склонны к частым и тяжелым острым респираторным эпизодам, напоминающим тяжелые обострения заболевания дыхательной системы. Раздражители из окружающей среды, которые провоцируют обострения, включают, без ограничения, пыль, твердые частички, дым, аллергены, загрязнители, химические вещества, загрязняющие вещества, бактерии, грибы и вирусы, которые могут вдыхаться, попадать в пищеварительную систему, заглатываться, поглощаться через кожу или другим путем вступать в местный контакт с влажной слизистой оболочкой I поверхности организма пациента.
ОБЪЕКТЫ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Исходя из изложенного выше, предоставляется неисключительный перечень целей, достигаемых с помощью настоящего изобретения.
Основным объектом настоящего изобретения является введение секретоглобина для предупреждения госпитализации вследствие тяжелого обострения основного или хронического заболевания на протяжении до 10 месяцев после введения секретоглобина.
Еще одним объектом настоящего изобретения является введение секретоглобина дыхательной системы для предупреждения госпитализации вследствие тяжелого обострения основного или хронического заболевания дыхательной системы на протяжении до 10 месяцев после введения секретоглобина.
Еще одним объектом настоящего изобретения является введение rhCC10 для предупреждения госпитализации вследствие тяжелого обострения основного или хронического заболевания дыхательной системы на протяжении до 10 месяцев после введения секретоглобина.
Еще одним объектом настоящего изобретения является введение rhSCGB3A2 для предупреждения госпитализации вследствие тяжелого обострения основного или хронического заболевания дыхательной системы на протяжении до 10 месяцев после введения секретоглобина.
Еще одним объектом настоящего изобретения является введение rhSCGB3A1 для предупреждения госпитализации вследствие тяжелого обострения основного или хронического заболевания дыхательной системы на протяжении до 10 месяцев после введения секретоглобина.
Еще одним объектом настоящего изобретения является введение секретоглобина для предупреждения госпитализации вследствие тяжелого обострения основного или хронического заболевания на протяжении по меньшей мере одного месяца после введения секретоглобина.
Еще одним объектом настоящего изобретения является введение секретоглобина дыхательной системы для предупреждения госпитализации вследствие тяжелого обострения основного или хронического заболевания дыхательной системы на протяжении по меньшей мере одного месяца после введения секретоглобина.
Еще одним объектом настоящего изобретения является введение rhCC10 для предупреждения госпитализации вследствие тяжелого обострения основного или хронического заболевания дыхательной системы на протяжении по меньшей мере одного месяца после введения секретоглобина.
Еще одним объектом настоящего изобретения является введение rhSCGB3A2 для предупреждения госпитализации вследствие тяжелого обострения основного или хронического заболевания дыхательной системы на протяжении по меньшей мере одного месяца после введения секретоглобина.
Еще одним объектом настоящего изобретения является введение rhSCGB3A1 для предупреждения госпитализации вследствие тяжелого обострения основного или хронического заболевания дыхательной системы на протяжении по меньшей мере месяца после введения секретоглобина.
Еще одним объектом настоящего изобретения является введение секретоглобина для увеличения промежутка времени от одного тяжелого обострения до следующего у пациентов, у которых, как правило, возникают повторные обострения хронических заболеваний.
Еще одним объектом настоящего изобретения является увеличение промежутка времени от одного тяжелого обострения до следующего на протяжении до 10 месяцев после терапии с помощью дозы или курса секретоглобина дыхательной системы у пациентов, у которых возникают повторные обострения хронических заболеваний.
Еще одним объектом настоящего изобретения является введение секретоглобина дыхательной системы для увеличения промежутка времени от одного тяжелого обострения до следующего у пациентов, у которых возникают повторные обострения хронических заболеваний дыхательной системы.
Еще одним объектом настоящего изобретения является введение секретоглобина дыхательной системы для предупреждения тяжелого острого респираторного эпизода, напоминающего обострение, у пациента, который подвергался острому повреждению легких, но у которого хроническое заболевание дыхательной системы не было диагностировано до повреждения.
Еще одним объектом настоящего изобретения является введение секретоглобина дыхательной системы для предупреждения тяжелого обострения после воздействия вдыхаемого раздражителя, способного провоцировать обострение, у восприимчивого пациента с хроническим заболеванием дыхательной системы.
Еще одним объектом настоящего изобретения является введение секретоглобина для увеличения промежутка времени от одного тяжелого обострения аутоиммунного заболевания до следующего у пациентов, у которых возникают повторные обострения хронических аутоиммунных заболеваний.
Еще одним объектом настоящего изобретения является введение секретоглобина дыхательной системы для увеличения промежутка времени от одного тяжелого обострения до следующего у пациентов, у которых возникают частые обострения хронических заболеваний дыхательной системы.
Еще одним объектом настоящего изобретения является введение секретоглобина дыхательной системы для увеличения промежутка времени от одного тяжелого обострения аутоиммунного заболевания до следующего у пациентов, у которых возникают частые обострения хронических аутоиммунных заболеваний.
Еще одним объектом настоящего изобретения является введение секретоглобина во время или после предыдущего обострения для предупреждения следующего обострения.
Еще одним объектом настоящего изобретения является введение секретоглобина с помощью внутривенной инъекции, интратрахеального вливания, ингаляции, интраназального вливания, пероральным путем, сублингвальным путем или с помощью крема, геля или суппозитория для анального или вагинального применения.
Дополнительным объектом настоящего изобретения является введение секретоглобина дыхательной системы для увеличения количества секреторных эпителиальных клеток, отличных от реснитчатых, и, таким образом, восстановления тканей слизистой оболочки.
Еще одним объектом настоящего изобретения является введение секретоглобина дыхательной системы для увеличения количества секреторных эпителиальных клеток, отличных от реснитчатых, в дыхательных путях, в том числе верхних и нижних дыхательных путях, и, таким образом, восстановления тканей слизистой оболочки и воздухоносных путей дыхательной системы.
Еще одним объектом настоящего изобретения является введение секретоглобина дыхательной системы для увеличения количества клеток Клара в дыхательных путях и, таким образом, восстановления тканей слизистой оболочки и воздухоносных путей дыхательной системы.
Еще одним объектом настоящего изобретения является введение секретоглобина дыхательной системы для увеличения количества NEB и NEC в дыхательных путях и, таким образом, восстановления тканей слизистой оболочки и воздухоносных путей дыхательной системы.
Еще одним объектом настоящего изобретения является введение секретоглобина дыхательной системы для увеличения количества одного или нескольких нативных секретоглобинов дыхательной системы, циркулирующих в крови.
Еще одним объектом настоящего изобретения является введение секретоглобина дыхательной системы для увеличения количества одного или нескольких нативных секретоглобинов дыхательной системы, обнаруженных в жидкости слизистой оболочки, которая выстилает воздухоносные пути дыхательной системы (ALF), носовых ходов, трахеи или легких, и/или в мокроте или индуцированной мокроте.
Еще одним объектом настоящего изобретения является введение секретоглобина дыхательной системы для увеличения количества клеток, секретирующих секретоглобин, в дыхательных путях и, таким образом, восстановления тканей слизистой оболочки и воздухоносных путей дыхательной системы.
Еще одним объектом настоящего изобретения является введение секретоглобина дыхательной системы для увеличения количества клеток, секретирующих СС10, в дыхательных путях и, таким образом, восстановления тканей слизистой оболочки и воздухоносных путей дыхательной системы.
Еще одним объектом настоящего изобретения является введение секретоглобина дыхательной системы для увеличения количества клеток, секретирующих SCGB3A2, в дыхательных путях и, таким образом, восстановления тканей слизистой оболочки и воздухоносных путей дыхательной системы.
Еще одним объектом настоящего изобретения является введение секретоглобина дыхательной системы для увеличения количества клеток, секретирующих SCGB3A1, в дыхательных путях и, таким образом, восстановления тканей слизистой оболочки и воздухоносных путей дыхательной системы.
Еще одним объектом настоящего изобретения является введение секретоглобина дыхательной системы для увеличения количества эпителиальных клеток, секретирующих СС10, в женском урогенитальном тракте и, таким образом, восстановления тканей слизистой оболочки влагалища.
Еще одним объектом настоящего изобретения является введение секретоглобина дыхательной системы для увеличения количества эпителиальных клеток, секретирующих СС10, в желудочно-кишечном тракте, в том числе, во рту, горле, пищеводе, желудке, поджелудочной железе, желчных протоках, верхнем и нижнем отделе кишечника и толстой кишке, и, таким образом, восстановления тканей слизистой оболочки желудочно-кишечного тракта.
Еще одним объектом настоящего изобретения является обеспечение фармацевтической композиции на основе SCGB3A2 человека с N-концом ATA, отличным от нативного.
Еще одним объектом настоящего изобретения является обеспечение фармацевтической композиции на основе SCGB3A2 человека с изоэлектрической точкой, равной 6,7.
Еще одним объектом настоящего изобретения является обеспечение фармацевтической композиции на основе SCGB3A2 человека с изоэлектрической точкой, равной 6,3.
Еще одним объектом настоящего изобретения является обеспечение фармацевтической композиции на основе SCGB3A2 человека с комбинацией изоформ с изоэлектрическими точками, равными 6,3 и 6,7.
Еще одним объектом настоящего изобретения является обеспечение фармацевтической композиции на основе рекомбинантного SCGB3A2 человека, синтезированного в виде слияния с другим белком.
Еще одним объектом настоящего изобретения является обеспечение фармацевтической композиции на основе рекомбинантного SCGB3A2 человека, синтезированного в виде слияния с убиквитин-подобным белком.
Еще одним объектом настоящего изобретения является введение секретоглобина дыхательной системы человека для отсрочки или предупреждения обострения бронхоэктаза у пациента, у которого был диагностирован бронхоэктаз.
Еще одним объектом настоящего изобретения является введение секретоглобина дыхательной системы человека для отсрочки или предупреждения обострения фиброза легких у пациента, у которого был диагностирован определенный тип фиброза легких.
Еще одним объектом настоящего изобретения является введение секретоглобина дыхательной системы человека для отсрочки или предупреждения обострения муковисцидоза у пациента, у которого был диагностирован определенный тип муковисцидоза.
Еще одним объектом настоящего изобретения является введение секретоглобина дыхательной системы человека для отсрочки или предупреждения обострения COPD у пациента, у которого было диагностировано COPD.
Еще одним объектом настоящего изобретения является введение секретоглобина дыхательной системы человека для отсрочки или предупреждения обострения хронического бронхита у пациента, у которого был диагностирован хронический бронхит.
Еще одним объектом настоящего изобретения является введение секретоглобина дыхательной системы человека для отсрочки или предупреждения обострения эмфиземы у пациента, у которого была диагностирована эмфизема.
Еще одним объектом настоящего изобретения является введение секретоглобина дыхательной системы человека для отсрочки или предупреждения обострения астмы у пациента, у которого была диагностирована астма.
Еще одним объектом настоящего изобретения является введение секретоглобина дыхательной системы человека для отсрочки или предупреждения обострения BPD у пациента, у которого была диагностирована BPD.
Еще одним объектом настоящего изобретения является введение секретоглобина дыхательной системы человека для отсрочки или предупреждения обострения синдрома аспирации мекония (MAS) у пациента, у которого был диагностирован MAS.
Еще одним объектом настоящего изобретения является введение СС10 человека для отсрочки или предупреждения обострения бронхоэктаза у пациента, у которого был диагностирован бронхоэктаз.
Еще одним объектом настоящего изобретения является введение СС10 человека для отсрочки или предупреждения обострения фиброза легких у пациента, у которого был диагностирован определенный тип фиброза легких. Еще одним объектом настоящего изобретения является введение СС10 человека для отсрочки или предупреждения обострения муковисцидоза у пациента, у которого был диагностирован определенный тип муковисцидоза.
Еще одним объектом настоящего изобретения является введение СС10 человека для отсрочки или предупреждения обострения COPD у пациента, у которого было диагностировано COPD.
Еще одним объектом настоящего изобретения является введение СС10 человека для отсрочки или предупреждения обострения хронического бронхита у пациента, у которого был диагностирован хронический бронхит.
Еще одним объектом настоящего изобретения является введение СС10 человека для отсрочки или предупреждения обострения эмфиземы у пациента, у которого была диагностирована эмфизема.
Еще одним объектом настоящего изобретения является введение СС10 человека для отсрочки или предупреждения обострения астмы у пациента, у которого была диагностирована астма.
Еще одним объектом настоящего изобретения является введение СС10 человека для отсрочки или предупреждения обострения BPD у пациента, у которого была диагностирована BPD.
Еще одним объектом настоящего изобретения является введение СС10 человека для отсрочки или предупреждения обострения синдрома аспирации мекония (MAS) у пациента, у которого был диагностирован MAS.
Еще одним объектом настоящего изобретения является введение SCGB3A2 человека для отсрочки или предупреждения обострения бронхоэктаза у пациента, у которого был диагностирован бронхоэктаз.
Еще одним объектом настоящего изобретения является введение SCGB3A2 человека для отсрочки или предупреждения обострения фиброза легких у пациента, у которого был диагностирован определенный тип фиброза легких. Еще одним объектом настоящего изобретения является введение SCGB3A2 человека для отсрочки или предупреждения обострения муковисцидоза у пациента, у которого был диагностирован определенный тип муковисцидоза.
Еще одним объектом настоящего изобретения является введение SCGB3A2 человека для отсрочки или предупреждения обострения COPD у пациента, у которого было диагностировано COPD.
Еще одним объектом настоящего изобретения является введение SCGB3A2 человека для отсрочки или предупреждения обострения хронического бронхита у пациента, у которого был диагностирован хронический бронхит.
Еще одним объектом настоящего изобретения является введение SCGB3A2 человека для отсрочки или предупреждения обострения эмфиземы у пациента, у которого была диагностирована эмфизема.
Еще одним объектом настоящего изобретения является введение SCGB3A2 человека для отсрочки или предупреждения обострения астмы у пациента, у которого была диагностирована астма.
Еще одним объектом настоящего изобретения является введение SCGB3A2 человека для отсрочки или предупреждения обострения BPD у пациента, у которого была диагностирована BPD.
Еще одним объектом настоящего изобретения является введение SCGB3A2 человека для отсрочки или предупреждения обострения синдрома аспирации мекония (MAS) у пациента, у которого был диагностирован MAS.
Еще одним объектом настоящего изобретения является введение SCGB3A1 человека для отсрочки или предупреждения обострения бронхоэктаза у пациента, у которого был диагностирован бронхоэктаз.
Еще одним объектом настоящего изобретения является введение SCGB3A1 человека для отсрочки или предупреждения обострения фиброза легких у пациента, у которого был диагностирован определенный тип фиброза легких.
Еще одним объектом настоящего изобретения является введение SCGB3A1 человека для отсрочки или предупреждения обострения муковисцидоза у пациента, у которого был диагностирован определенный тип муковисцидоза.
Еще одним объектом настоящего изобретения является введение SCGB3A1 человека для отсрочки или предупреждения обострения COPD у пациента, у которого было диагностировано COPD.
Еще одним объектом настоящего изобретения является введение SCGB3A1 человека для отсрочки или предупреждения обострения хронического бронхита у пациента, у которого был диагностирован хронический бронхит.
Еще одним объектом настоящего изобретения является введение SCGB3A1 человека для отсрочки или предупреждения обострения эмфиземы у пациента, у которого была диагностирована эмфизема.
Еще одним объектом настоящего изобретения является введение SCGB3A1 человека для отсрочки или предупреждения обострения астмы у пациента, у которого была диагностирована астма.
Еще одним объектом настоящего изобретения является введение SCGB3A1 человека для отсрочки или предупреждения обострения BPD у пациента, у которого была диагностирована BPD.
Еще одним объектом настоящего изобретения является введение SCGB3A1 человека для отсрочки или предупреждения обострения синдрома аспирации мекония (MAS) у пациента, у которого был диагностирован MAS.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Секретоглобины, которые экспрессируются в дыхательных путях, обеспечивают развитие клеток Клара и других эпителиальных клеток дыхательной системы и резидентных структур иммунной системы в функциональном эпителии дыхательной системы. Существуют три секретоглобина, которые характеризуются высоким уровнем экспрессии в дыхательных путях человека, в том числе SCGB1A1 (также известный под названием СС10, утероглобин, CCSP, СС16 и т.п.), SCGB3A2 (также известный под названием UGRP1, HIN-2) и SCGB3A1 (также известный под названием UGRP2, HIN-1).
Настоящее изобретение в целом относится к применению секретоглобинов дыхательной системы для отсрочки и предупреждения тяжелых обострений хронических заболеваний, вызванных влиянием факторов окружающей среды, в частности, заболеваний дыхательной системы. На уровне ткани секретоглобины дыхательной системы опосредуют увеличение количества клеток, секретирующих секретоглобин, и ассоциированных структур в тканях дыхательной системы, которые можно измерять опосредованно по увеличению количества продуктов секреции секретоглобина в жидкостях организма. Например, введение rhCC10 опосредует увеличение количества клеток Клара, NEB и NEC с восстановлением эпителия воздухоносных путей дыхательной системы. На сегодняшний день эта гипотеза является единственной, которая согласуется с фенотипом эпителия воздухоносных путей у мышей СС10 KO и объясняет данные касательно недоношенных детей, связанные с очень сильной продолжительной защитой от тяжелых обострений заболевания дыхательной системы, но отсутствием предупреждения BPD новорожденных, что представляет собой тип фиброза легких.
Хотя rhCC10 не предотвращал развития BPD новорожденных, он обеспечивал продолжительную защиту от тяжелых обострений заболевания дыхательной системы, при которых требуется повторная госпитализация, при этом эту защиту наблюдали в 6 месяцев РМА, что является моментом времени, при котором возраст ребенка составил бы 6 месяцев после 40 недель беременности. Поскольку в исследование включали детей в 24-28 недель РМА, эта конечная точка представляет собой до 10 месяцев после одной дозы rhCC10.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
Фиг. 1. Аминокислотные последовательности SCGB3A2 человека, выравнивание аминокислотных последовательностей SCGB3A2 человека со сравнением предполагаемого и фактического N-концов
Фиг. 2. SDS-PAGE очищенного rhSCGB3A2, SDS-PAGE очищенного rhSCGB3A2. Образцы, каждый из которых содержал 5 микрограмм, с 1 мМ DTT и без 1 мМ DTT, смешивали с буфером для образца, содержащим SDS, кипятили 5 минут и загружали на гель с 10-20% трицина. Осуществляли электрофорез и окрашивали Coomassie R250. Гель обесцвечивали и получали изображение с помощью цифровой фотокамеры.
Фиг. 3. Изоэлектрическое фокусирование очищенного rhSCGB3A2, изоэлектрическое фокусирование очищенного rhSCGB3A2 в сравнении с rhCC10 и UBL и Den-1. Образцы, каждый из которых содержал 5 микрограмм, загружали на гель Novex IEF. Осуществляли электрофорез и окрашивали Coomassie R250. Гель обесцвечивали и получали изображение с помощью цифровой фотокамеры. Стрелки указывают на основную и менее распространенную изоформу rhSCGB3A2 с N-концом ATA.
Фиг. 4. In vitro ингибирование sPLAr1 В с применением панели A rhSCGB3A2: субстрат UNIBIPY; без PLA2; без rhSCGB3A2. Панель В: субстрат UNIBIPY с PLA2; без rhSCGB3A2. Панель С: субстрат UNIBIPY с PLA2, а также с rhSCGB3A2. Пик №1 представляет собой субстрат на основе фосфолипида UNIBIPY, пик №2 представляет собой продукт после расщепления с использованием sPLA2.
Фиг. 5. Вестерн-блоттинг SCGB3A2 из TAF человека. Вестерн-блоттинг жидкости, аспирированной из трахеи, полученной от детей, в сравнении с очищенным rhSCGB3A2 с использованием поликлонального антитела кролика против rhSCGB3A2. Образцы, каждый из которых содержал 20 микролитров TAF, загружали на гель Novex с 10-20% трицина; причем rhSCGB3A2 представлен на дорожке 1 (5 нанограмм) и дорожке 8 (1 нанограмм). Гель обесцвечивали и получали изображение с помощью цифровой фотокамеры.
Фиг. 6. Стандартная кривая для конкурентного ELISA SCGB3A2 человека Конкурентный ELISA разрабатывали с помощью стандартных способов, используют для конкуренции с неконъюгированной мишенью в образце для связывания с доступными сайтами в лунке. Антителом кролика против rhSCGB3A2 покрывали 96-луночные планшеты Maxisorb (200 нг/лунка), далее лунки блокировали 5% сахарозы, 2,5% BSA в PBS, далее планшеты высушивали и хранили при 4°С Получали конъюгат пероксидазы хрена (HRP) и rhSCGB3A2 (набор Pierce - EZ-link Maleimide Activated HRP kit, №в каталоге 31494) и использовали в анализе с разведением 1:130000. Калибраторы (1-500 нг) получали с использованием rhSCGB3A2
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ
Три отдельных факта объединяли для создания данного изобретения; в том числе 1) продолжительная защита от тяжелых обострений заболевания дыхательной системы и повторной госпитализации с помощью одной дозы rhCC10, наблюдаемая у недоношенных детей, 2) фенотип эпителия воздухоносных путей у мышей СС10 KO и 3) свойства ''фактора роста'' у SCGB3A2 (Guha, 2012; Kurotani, 2008; Kurotani, 2008а; Inoue, 2008; Niimi, 2001). Несмотря на исследования на протяжении многих лет, нет единого взгляда на роль СС10 в эпителии дыхательной системы, кроме того, что он опосредует противовоспалительные эффекты. Недавняя неудача клинического исследования на модели аллергического ринита с провокационной пробой с помощью введения аллергена в полость носа продемонстрировала, что даже его противовоспалительные эффекты in vivo не являются одинаковыми против всех типов воспалительных заболеваний (Widegren, 2009). Также, несмотря на полное отсутствие СС10, клетки Клара все еще были выявлены в дыхательных путях обеих линий мышей СС10 KO. Хотя СС10 и SCGB3A2 являются подобными по структуре, и, таким образом, как полагают, имеют некоторые одинаковые функции, не сообщалось о стимуляции роста или развития эпителиальных клеток воздухоносных путей с помощью СС10, к тому же rhCC10, фактически, как хорошо известно, подавляет рост опухолевых клеток эпителиального происхождения (Kundu, 1996; Leyton, 1994), в том числе линии эпителиальных клеток воздухоносных путей А549 (Szabo, 1998).
Все же, авторы считают, что rhCC10, который вводили недоношенным детям в день рождения, стимулировал развитие клеток, секретирующих СС10, которые, в свою очередь, продуцировали нативные СС10, которые стимулировали развитие большего количества клеток, секретирующих СС10, и так далее. Конечным результатом был более нормальный и жизнеспособный эпителий дыхательной системы у детей, которых лечили с помощью rhCC10, которые были более выносливыми к неблагоприятным факторам окружающей среды (пыль, дым, аллергены, инфекция RSV, инфекция вирусом гриппа и т.п.) в сравнении с детьми, которых лечили с использованием плацебо. Одна доза rhCC10 в день рождения придавала 100% защиту от повторной госпитализации вследствие тяжелого обострения заболевания дыхательной системы по сравнению с 50% показателем повторной госпитализации, наблюдавшимся у детей, которых лечили с использованием плацебо.
Также авторы считают, что применение СС10 для стимуляции развития клеток, секретирующих СС10, в эпителии дыхательной системы также будет давать результат у взрослых с хроническими заболеваниями дыхательной системы, при которых изменение структуры дыхательных путей приводило в результате к потере клеток Клара. Курс лечения с использованием rhCC10 может не вылечить заболевание, но, как считают авторы, будет в определенной степени восстанавливать клетки Клара и ассоциированные структуры, приводя в результате к более нормальному эпителию, который в этом случае является более выносливым к дальнейшим неблагоприятным факторам окружающей среды. Клиническим результатом курса лечения с помощью rhCC10 в этом случае будет увеличение промежутка времени до следующего тяжелого обострения.
Также, авторы считают, что фенотип эпителия воздухоносных путей с недостаточным количеством клеток Клара у мышей СС10 KO позволяет предположить, что СС10 представляет собой аутокринный и паракринный фактор, необходимый для развития клеток Клара, ассоциированных структур, и других нормальных популяций клеток эпителия воздухоносных путей. Авторы считают, что СС10 представляет собой аутокринный и паракринный фактор, необходимый для развития и поддержания клеток, секретирующих СС10, за пределами дыхательных путей, в том числе в желудочно-кишечном тракте и урогенитальном тракте. Существует много соображений, что поскольку секретоглобины характеризуются структурным сходством, они также характеризуются подобной функцией, однако, как было продемонстрировано раньше, никакие два секретоглобина ни в одном случае не характеризовались одинаковой биологической активностью, ни in vitro, ни in vivo. В данном документе авторы сообщают, что rhSCGB3A2 и СС10 характеризуются способностью ингибировать фосфолипазу А2 из поджелудочной железы свиней in vitro. Это первое сообщение о том, что какой-либо другой секретоглобин, кроме СС10, действительно ингибирует какую-нибудь фосфолипазу А2 или характеризуется каким-либо типом противовоспалительной активности. Исходя из этих результатов, авторы приходят к выводу, что другие секретоглобины, в том числе секретоглобины дыхательной системы, которые характеризуются структурным сходством с rhCC10, могут стимулировать развитие и поддержание клеток, которые секретируют их, с достижением продолжительного клинического результата, например, увеличения промежутка времени до следующего обострения, уменьшения тяжести следующего обострения и предупреждения тяжелых обострений после острого повреждения.
ПРИМЕРЫ
Пример 1. Продолжительная защита с помощью rhCC10 у недоношенных детей с RDS
Безопасность, фармакокинетические свойства и противовоспалительные свойства rhCC10 оценивали в рандомизированном, плацебо-контролируемом, двойном слепом, многоцентровом исследовании при участии 22 недоношенных детей с респираторным дистресс-синдромом (RDS) со средним значением массы при рождении 932 г и среднем значении гестационного возраста 26,9 недели, которые получали одну интратрахеальную (IT) дозу плацебо (n=7), 1,5 мг/кг (n=8) или 5,0 мг/кг (n=7) rhCC10 после лечения с помощью сурфактанта (Levine, 2005). Дети, которых лечили с помощью rhCC10, демонстрировали значимое уменьшение общего количества клеток в TAF (Р<0,001), количества нейтрофилов (Р<0,001), и значений концентрации общего белка (Р<0,01), и снижение IL-6 (Р<0,07) на протяжении первых 3 дней жизни. rhCC10 был безопасным и характеризовался хорошей переносимостью.
Следует отметить, что, несмотря на небольшое количество участников, исследование при дальнейшем наблюдении 17 детей в 6 месяцев с поправкой на гестационный возраст (CGA) показало, что 0 из 11, которые получали rhCC10, были повторно госпитализированы, что обусловлено причинами, связанными с дыхательной системой, в сравнении с 3 из 6, которые получали плацебо, как показано в таблице 2 (Р<0,05, точный критерий Фишера, двусторонний).
Этот результат является даже более значительным, если принять во внимание, что 6 месяцев CGA, в этом случае, означает период времени, который соответствует 6 месяцам после того, как ребенок прожил бы 40 недель беременности, и при этом некоторые дети в исследовании при рождении имели гестационный возраст 24 недели (РМА), таким образом, момент времени дальнейшего наблюдения 6 месяцев CGA наступил только через 10 месяцев после введения одной дозы rhCC10 в день рождения. С точки зрения статистики, результаты продемонстрировали по меньшей мере 57% частоту повторной госпитализации в группе плацебо по сравнению по меньшей мере с 27% в группе rhCC10. Наблюдали очень мощный продолжительный эффект, и при этом эти данные проиллюстрировали значимый и беспрецедентный продолжительный результат введения rhCC10.
Выявление такого существенного продолжительного результата является даже более значительным, после того, как анализы фармакокинетики продемонстрировали, что избыток СС10 выводился на протяжении 48 часов после введения, причем время полужизни в сыворотке крови составляло 9-11 часов (Levine, 2005). Значительное количество rhCC10 наблюдали в жидкости, аспирированной из трахеи, на протяжении приблизительно 2 дней, и он достигал концентрации в сыворотке крови к моменту времени 6 часов, но потом отфильтровывался почками и выделялся с мочой к моменту времени 12 часов. rhCC10 следовал естественному физиологическому пути распределения из легких в кровь, а далее в мочу, и продемонстрировал продолжительные результаты, несмотря на быстрое выведение.
Пример 2. Клонирование и экспрессия rhSCGB3A2
На фиг. 2 показана аминокислотная последовательность rhSCGB3A2, которая была получена для этих исследований. Использовали последовательность с идентификатором в Genebank AAQ89338. В результате способа получения рекомбинантного продукта с использованием системы слияния на основе убиквитин-подобного белка (UBL) и высвобождения продукта в виде rhSCGB3A2 из UBL с помощью UBL-протеазы, N-конец отличается от N-концов, предполагаемых для нативного белка с использованием консенсусных сайтов расщепления одного пептида для секретированных белков млекопитающих. Также он отличается от N-концов фактических пептидов, выделенных из образцов биологической жидкости человека. Изложенное является первым описанием синтеза SCGB3A2 человека без гистидиновой метки для очистки, и при этом эффекты N-конца на стабильность и активность белка могли быть непредусмотренными. Аминокислотная последовательность rhSCGB3A2 была показана в таблице 1 и имела предполагаемую молекулярную массу 8147,82 дальтона и предполагаемую изоэлектрическую точку, равную 6,1.
Синтетическая кодирующая последовательность ДНК для rhSCGB3A2 была создана с помощью jcat (www.jcat.de) с оптимизацией согласно частоте использования кодонов для экспрессии в бактериях Е.coli штамма K12. После получения последовательности ДНК добавляли сайты рестрикции на концах для обеспечения направленного клонирования гена в бактериальный вектор экспрессии, рТХВ1, который уже содержал UBL. SCGB3A2 клонировали в виде продолжения UBL по С-концу. Сайт AfIII располагали на 5'-конце, и сайт BamHI располагали на 3'-конце для направленного клонирования.
Новый ген для rhSCGB3A2 синтезировали с использованием перекрывающихся олигонуклеотидов с помощью ПЦР. Последовательность ДНК для гена rhSCGB3A2 была следующей:
Плазмидой рТХВ1, содержащей слияние UBL-rhSCGB3A2, трансформировали Е.coli штамма HMS174/DE3, которые содержали профаг DE3, кодирующий РНК-полимеразу Т7, которая обеспечивает индуцибельную экспрессию белка слияния. Проводили скрининг колоний относительно экспрессии белка слияния, и при этом присутствие гена rhSCGB3A2 повторно подтверждали с помощью секвенирования ДНК в случае высокого уровня экспрессии.
Четыре литра культуры для ферментации, которая содержала среду Superbroth с ампициллином, инокулировали 120 мл культуры, полученной на протяжении ночи, клона с наивысшим уровнем экспрессии и выращивали при 37°С. В культуре индуцировали сверхэкспрессию белка слияния UBL-rhSCGB3A2 при значении OD600, что равнялось 8,75, с использованием 0,3 мМ IPTG, далее давали возможность расти на протяжении еще 2 часов. Клеточную массу собирали с помощью центрифугирования, и при этом выход влажной клеточной массы составлял 67 грамм. Клеточную массу далее использовали для очистки rhSCGb3A2.
Пример 3. Очистка rhSCGB3A2
Клеточную массу ресуспендировали в 20 мМ NaH2PO4, 0,5М NaCl, рН 7,2, далее клетки разрушали с помощью замораживания-оттаивания с получением неочищенного лизата. Неочищенный лизат очищали от примесей с помощью центрифугирования при 19800×g на протяжении 20 минут при 4°С. ДНК, эндотоксины и другие загрязняющие вещества бактериального происхождения осаждали из супернатанта очищенного от примесей лизата с использованием полиэтиленимина (PEI) при концентрации 0,025% и второго центрифугирования при 19800×g на протяжении 10 минут при 4°С. Супернатант с PEI далее фильтровали через 0,22 микронный фильтр и к фильтрату добавляли 10 мМ имидазола. Как UBL, так и UBL-протеаза, содержали гистидиновую метку, таким образом, что они связывались с иммобилизованными ионами металлов в колонке для аффинной хроматографии. Фильтрат, который содержал белок слияния UBL-rhSCGB3A2, далее пропускали через колонку IMAC (Chelating Sepharose Fast Flow с ионами никеля), предварительно уравновешенную с помощью 20 мМ NaH2PO4, 0,5 M NaCl, 10 мМ имидазола, рН 7,2, причем колонку промывали тем же буфером, далее белок слияния UBL-rhSCGB3A2 элюировали 20 мМ NaH2PO4, 100 мМ NaCl, 300 мМ имидазола, рН 7,2. Элюат из IMAC далее концентрировали и заменяли буфер с помощью фильтрации тангенциальным потоком с использованием 5 кДа фильтра NMWCO в 15 мМ Tris, 15 мм BisTris, 40 мМ NaCl, рН 7,0. UBL-rhSCGB3A2 дополнительно очищали с помощью колонки Macro Prep High Q (Biorad), в которой связывались загрязняющие вещества, a UBL-rhSCGB3A2 проходил через нее. rhSCGB3A2 далее отделяли от UBL путем расщепления с помощью UBL-протеазы Den-1 (молярное соотношение 1:100) в 5 мМ DTT, причем рН доводили до 6,5 с помощью HCl, при 37°С на протяжении 2 часов. rhSCGB3A2 далее очищали из смеси продуктов расщепления с помощью катионообменной хроматографии (GE Sepharose SP High Performance). Колонку SP уравновешивали с помощью 15 мМ Tris, 15 мМ BisTris, 40 мм NaCl, рН 6,5, загружали смесь продуктов расщепления, и при этом загрязняющие вещества связывались с колонкой, в то время как rhSCGB3A2 проходил через нее. Далее осуществляли интенсивный диализ того, что прошло через SP, против 0,9% NaCl с использованием 3,5 кДа мембраны MWCO из регенерированной целлюлозы. Образец концентрировали с использованием центрифуг-концентраторов (3,5 кДа MWCO), далее фильтровали через 0,22 микронный фильтр. Фильтрат представлял собой очищенный rhSCGB3A2. На фиг. 2 показан анализ окончательно очищенного белка с помощью SDS-PAGE. Он был чистым на >97%, как определено с помощью денситометрии при SDS-PAGE, и содержал приблизительно 95% димера и 5% мономера. Как и в случае rhCC10, сложно полностью восстановить димер с получением мономера с использованием восстановителя.
Пример 4. Изоэлектрическая точка для rhSCGB3A2
Изоэлектрическая точка (pI) белка представляет собой меру общего поверхностного заряда этого белка. Значение pI измеряют с использованием стандартных способов изоэлектрического фокусирования (IEF). Приблизительно 5 микрограмм rhSCGB3A2, rhCC10, UBL и Den-1 загружали на гель IEF (Novex) для определения pi rhSCGB3A2, как показано на фиг. 3. Если белок мигрирует в виде одной полосы при SDS-PAGE, а в геле IEF наблюдают несколько полос, то, вероятно, что присутствуют альтернативные изоформы белка. В отличие от rhCC10, который характеризуется одной полосой при pi 4,8, rhSCGB3A2 характеризуется двумя полосами при pi 6,7 и 6,3. Предположительное значение pI для последовательности rhSCGB3A2 согласно данному изобретению равняется 6,1 (www.expasy.edu; инструмент для белка ''Рассчитать MW/pI''), при этом абсолютное большинство молекул белка мигрирует в положение, соответствующее значению pi 6,7. Даже меньшая полоса при 6,3 не соответствует предположительному значению pI 6,1. То, что существуют две полосы rhSCGB3A2 при IEF, означает, что или присутствуют альтернативно свернутые изоформы, или они отображают мономеры и димеры, как наглядно представлено с помощью SDS-PAGE в невосстанавливающих условиях.
С помощью этих значений pI также продемонстрировано, что этот препарат представляет собой неизвестную и непредвиденную изоформу rhSCGB3A2, которая является уникальной. Уникальный паттерн свертывания рекомбинантного белка часто определяют с помощью способа синтеза, в этом случае, выбора N-конца, экспрессии белка в виде С-концевого слияния с убиквитин-подобным белком, очищения белка слияния с помощью IMAC, отщепления SCGB3A2 от UBL и отделения SCGB3A2 от UBL и UBL-протеазы. Таким образом, уникальность этого препарата может быть обусловлена способом синтеза, N-концом, отличным от нативного, или комбинацией этих или других неизвестных факторов.
Пример 5. Ингибирование PLA2 с помощью rhSCGB3A2
Биологическую активность rhSCGB3A2 оценивали с помощью количественного анализа HPLC с детектором флуоресценции, при помощи которого оценивали ингибирование секреторного фермента PLA2 (sPLA2) из поджелудочной железы свиней, причем анализ был разработан для оценки эффективности разных партий rhCC10. Ингибирование ферментов PLA2 считают основным противовоспалительным механизмом действия СС10. Существует много соображений, что другие секретоглобины также могут ингибировать ферменты PLA2, вследствие их структурного сходства с СС10. rhSCGB3A2 (5,5 микрограмма) смешивали с 100 нанограммами свиного sPLA2 1 В (0,1 микрограмма) и инкубировали при 37°С. Реакцию начинали с добавления флуоресцентного аналога фосфолипида деканоил-1-(O-(11-(4,4-дифтор-5,7-диметил-4-бора-3а,4а-диаза-s-индацен-3-пропионил)амино)ундецил)-sn-глицеро-3-фосфохолина (также известного под названием UNIBIPY; 47,6 нанограмма). Через 15 минут реакцию прекращали с помощью добавления 2-пропанола/н-гексана. Продукт расщепления отделяли от субстрата с помощью колонки для HPLC на силикагеле Waters Spherisorb. Продукт разделения проходил через детектор флуоресценции G1321A.
Результаты анализа показаны на фиг. 4. На панели А показан субстрат UNIBIPY без sPLA2 или rhSCGB3A2; на панели В показан субстрат UNIBIPY с sPLA2, и на панели С показан субстрат UNIBIPY с sPLA2, а также с rhSCGB3A2. sPLA2 расщепляет субстрат (пик №1), что приводит к образованию продукта (пик №2). В присутствии rhSCGB3A2 наблюдается значимое уменьшение пика продукта. Каждую реакцию проводили дважды. В анализе rhSCGB3A2 продемонстрировали 83% ингибирование активности sPLA2-1B, что можно сравнить с белком rhCC10 (данные не показаны).
Процентное ингибирование рассчитывали следующим образом:
% ингибирование = {1-(средняя площадь для продукта расщепления с rhSCGB3A2/(средняя площадь для продукта расщепления без rhSCGB3A2)}×100
Пришли к выводу, что rhSCGB3A2 ингибирует sPLA2 из поджелудочной железы свиней и уровень активности можно сравнить с rhCC10.
Пример 6. Сравнение rhSCGB3A2 с нативным SCGB3A2 в биологических жидкостях человека
Очищенный rhSCGB3A2 использовали для иммунизации двух новозеландских белых кроликов с использованием стандартного протокола иммунизации. Белок был конъюгирован с KLH, его смешивали с адъювантом Фрейнда и вводили животным путем инъекции. У обоих животных наблюдали выраженный уровень иммунного ответа с очень высокими титрами. IgG очищали из каждого набора образцов сыворотки крови животных с использованием набора Pierce Protein A IgG Purification Kit и очищенные IgG диализировали в PBS, рН 7,2, отбирали аликвоты и сохраняли при -80°С.
Антитела качественно определяли с помощью вестерн-блоттинга с использованием жидкости, аспирированной из трахеи (TAF), полученной от недоношенных детей. Образцы, которые содержали 20 микролитров TAF, от 6 детей анализировали с помощью SDS-PAGE в невосстанавливающих условиях и сравнивали с rhSCGB3A2 (5 нанограмм). Осуществляли электроблоттинг из геля на мембрану PVDF, блокировали 4% обезжиренным молоком, далее с блотом инкубировали наивысший титр IgG кролика против rhSCGB3A2 (разведение 1:5000), а затем конъюгат антитела козы против IgG кролика с HRP (разведение 1:20000). Блот проявляли с использованием усиленной хемилюминисценции (41PBA-ECL - 100 мМ Tris/HCl, рН 8,8, 1,25 мМ люминола, 5,3 мМ перекиси водорода и 2 мМ 41РВА). Полосы, которые соответствуют иммунной реакции, появились в 5 из 6 образцов TAF. Два образца (дорожка 3 и дорожка 6) содержали полосы, которые мигрировали, такого же размера, что и гомодимер rhSCGB3A2, что указывало на то, что препарат rhSCGB3A2 был похож на нативный SCGB3A2 человека у некоторых пациентов. Гетерологичная экспрессия рекомбинантных белков, а именно гидрофобных белков, для применения в исследованиях на животных или при участии людей часто приводила к неправильно свернутым, неактивным, иммуногенным белкам или препаратам, которые нельзя использовать по другой причине. Учитывая то, что фактический N-конец нативного SCGB3A2 неизвестен и значение pI для SCGB3A2 отличается от предположительного, наблюдение того, что по меньшей мере некоторые образцы, полученные от человека, содержали подобные белки, подтвердило синтетический подход, предложенный авторами, и препарат rhSCGB3A2. Все 5 образцов, в которых происходила реакция, содержали молекулы с высокой молекулярной массой порядка 200 кДа, и при этом все содержали несколько отдельных полос, которые имели размер в диапазоне 8-13 кДа, причем некоторые из них могут соответствовать мономерам, димерам и альтернативным изоформам. Два образца (дорожки 3 и 7) также содержали пятна, которые соответствуют иммунной реакции, менее 3,5 кДа, которые, вероятно, отображают продукты распада SCGB3A2. Впервые нативный SCGB3A2 был визуализирован с помощью вестерн-блоттинга. Антитело против rhSCGB3A2, которое использовали для вестерн-блоттинга, далее использовали для разработки ELISA в отношении SCGB3A2 человека.
Пример 7. Разработка ELISA в отношении rhSCGB3A2
Конкурентный ELISA разрабатывали с помощью стандартных способов. В формате конкурентного анализа лунки микротитровального планшета покрывают антителом, с помощью которого захватывают мишень, далее молекулу мишени, конъюгированную с ферментом (меченую мишень), используют для конкуренции с неконъюгированной мишенью в образце для связывания с доступными сайтами в лунке. С увеличением концентрации мишени в образце уменьшается количество меченой мишени, которая связывается с лунками. Антителом кролика против rhSCGB3A2 покрывали 96-луночные планшеты Maxisorb (200 нг/лунка), далее лунки блокировали 5% сахарозы, 2,5% BSA в PBS, далее планшеты высушивали и хранили при 4°С. Получали конъюгат пероксидазы хрена (HRP) и rhSCGB3A2 (набор Pierce - EZ-link Maleimide Activated HRP kit, № в каталоге 31494) и использовали в анализе с разведением 1:130000. Калибраторы (1-500 нг) получали с использованием rhSCGB3A2, и получали стандартную кривую, как показано на фиг. 6. Далее количественно определяли нативный SCGB3A2 в образцах TAF, полученных от человека, как показано в таблице 3.
SCGB3A2 также измеряли в образцах сыворотки крови от 3 взрослых людей; причем получали значения 0,29 и 32 нг/мл. SCGB3A2 нельзя было выявить в неконцентрированной моче человека или в моче, концентрированной в 10 раз. Граница определения анализа равнялась 5 нг/мл.
Пример 8
а) Способ применения rhCC10 для предупреждения госпитализации вследствие тяжелого обострения заболевания дыхательной системы у пациента с острым повреждением легких на протяжении периода до десяти месяцев после введения.
b) Способ применения rhCC10 для предупреждения тяжелого обострения заболевания дыхательной системы у пациента, у которого возникают частые обострения, на протяжении по меньшей мере одного месяца после введения.
c) Способ применения rhCC10 для предупреждения госпитализации вследствие тяжелых обострений заболевания дыхательной системы у пациента с хроническим состоянием дыхательной системы на протяжении периода по меньшей мере один месяц после введения.
d) Способ по любому из примеров а-с, где хроническое состояние дыхательной системы представляет собой COPD.
e) Способ по любому из примеров а-с, где хроническое состояние дыхательной системы представляет собой астму.
f) Способ применения rhSCGB3A2 для предупреждения госпитализации вследствие тяжелого обострения заболевания дыхательной системы у пациента с острым повреждением легких на протяжении периода до десяти месяцев после введения.
g) Способ применения rhSCGB3A2 для предупреждения тяжелого обострения заболевания дыхательной системы у пациента, у которого возникают частые обострения, на протяжении по меньшей мере двух месяцев после введения.
h) Способ применения rhSCGB3A2 для предупреждения госпитализации вследствие тяжелых обострений заболевания дыхательной системы у пациента с хроническим состоянием дыхательной системы на протяжении периода по меньшей мере один месяц после введения.
i) Способ применения rhSCGB3A2 для предупреждения госпитализации вследствие тяжелых обострений заболевания дыхательной системы у пациента с хроническим состоянием дыхательной системы на протяжении периода по меньшей мере 2 месяца после введения.
j) Способ по любому из примеров g-i, где хроническое состояние дыхательной системы представляет собой фиброз легких.
k) Способ по любому из примеров g-i, где хроническое состояние дыхательной системы представляет собой бронхоэктаз. SCGB3A2:
l) Композиция, которая содержит рекомбинантный белок SCGB3A2 человека с N-концом ATA, содержащий SEQ ID 1.
m) Способ синтеза рекомбинантного SCGB3A2 человека с применением белка слияния на основе UBL и UBL-протеазы, которая распознает партнера слияния и отщепляет партнера слияния от SCGB3A2 с высвобождением интактного белка SCGB3A2 согласно SEQ ID 1.
n) Фармацевтическая композиция на основе rhSCGB3A2, который ингибирует ферменты PLA2.
о) Фармацевтическая композиция на основе rhSCGB3A2, который мигрирует в геле для изоэлектрического фокусирования так, что его положение соответствует изоэлектрической точке в диапазоне 6,3-6,7.
р) Фармацевтическая композиция на основе rhSCGB3A2, который содержит гомодимер.
q) Фармацевтическая композиция на основе rhSCGB3A2, который содержит гомодимер со значением pI, равным 6,7, который ингибирует ферменты PLA2.
В то время как настоящее изобретение было описано в связи с тем, что в данное время считается наиболее практическими и преобладающими вариантами осуществления, следует понимать, что настоящее изобретение не должно ограничиваться раскрытыми вариантами осуществления, но, наоборот, предусматривает охват разных модификаций и эквивалентных структур, которые находятся в пределах сущности и объема прилагаемой формулы изобретения.
Сокращения и определения
СС10: 10 кДа белок клеток Клара;
CCSP: секреторный белок клеток Клара;
СС16: 16 кДа белок клеток Клара;
SCGB1A1: белок, который кодируется геном SCGB1A1,
причем он также называется CC10, CCSP, CC16, утероглобин;
SCGB3A1: белок, который кодируется геном SCGB3A1,
причем он также называется HIN-1 и UGRP2;
SCGB3A2:белок, который кодируется геном SCGB3A2,
причем он также называется HIN-2 и UGRP1;
HIN-1: белок 1 high-in-normal;
HIN-2: белок 2 high-in normal;
UGRP1: белок 1, связанный с геном утероглобина;
UGRP2: белок 2, связанный с геном утероглобина;
Секретоглобин: белок из семейства структурно родственных белков, которые характеризуются четырьмя мономерами в виде спиральных пучков, соединенными дисульфидными связями.
Секретоглобины дыхательной системы: секретоглобины, которые характеризуются высоким уровнем экспрессии и распространены в дыхательных путях, в том числе SCGB1A1, SCGB3A1 и SCGB3A2.
1. Композиция для ингибирования секреторного фермента PLA2, содержащая в эффективном количестве рекомбинантный белок секретоглобина SCGB3A2 человека с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:3.
2. Композиция по п. 1, в которой белок мигрирует в геле для изоэлектрического фокусирования так, что его положение соответствует изоэлектрической точке в диапазоне 6,3-6,7.
3. Композиция по п. 1, в которой белок дополнительно содержит гомодимер со значением pI равным 6,7.
4. Способ получения композиции для ингибирования секреторного фермента PLA2, включающий получение белка слияния на основе рекомбинантного белка SCGB3A2 человека с SEQ ID NO:3, слитого с убиквитин-подобным белком (UBL), и воздействие на полученный белок слияния UBL-протеазой, которая распознает UBL и отщепляет его от SCGB3A2 с высвобождением интактного белка SCGB3A2 и с получением, таким образом, композиции по п. 1.
