Способ непрерывной многостадийной очистки антител

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ трехстадийной хроматографической мелкомасштабной и крупномасштабной очистки белков, в частности моноклональных антител, с применением только четырех буферных растворов, приготовленных из исходного раствора. 16 з.п. ф-лы, 9 пр., 12 ил.

 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Изобретение относится к способу трехстадийной мелко и крупномасштабной хроматографической очистки белков, в особенности моноклональных антител, с применением четырех буферных растворов.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Очистка антитела может быть одним из наиболее дорогостоящих аспектов биотехнологического производства. Моноклональные антитела (мАт) обычно очищают при помощи трехстадийного хроматографического процесса с использованием трех смол и определенной буферной системы в каждой стадии. Этот стандартный способ очистки включает стадию захвата, после которой следует стадия ионного обмена и заключительная стадия окончательной очистки, и обычно занимает 3-5 рабочих дней (включая фазы хранения и фазы открывания). В таких стандартных процессах эти три стадии выполняют в последовательности операций различных блоков, которые невозможно проводить в непрерывном режиме, поскольку между каждой стадией необходимо производить регулирование pH, молярной концентрации и концентрации белка. Такой стандартный процесс очистки схематически изображен на Фигуре 5. Таким образом, стандартные способы очистки обычно требуют применения множества различных буферов, а также множества единиц хранения между каждой прекращенной стадией. Такие стандартные способы очистки, таким образом, подвержены контаминации, техническим отказам и ошибкам, связанным с человеческим фактором. Кроме того, так как между каждой стадией требуется остановка для концентрирования элюата, регулирование pH и электропроводности и сохранение элюата до следующей стадии, и поскольку каждая стадия не может начинаться до завершения предыдущей, такие стандартные процессы очистки являются особенно длительными и дорогостоящими, как это можно видеть на Фигуре 7.

При увеличении титров клеточных культур и использовании в производстве клеточных культур большего объема последующая переработка и выделение продукта рассматривается в промышленности в качестве лимитирующего фактора. Это, в особенности, относится к производству моноклональных антител, где основное внимание смещено от объема партии к производственной мощности при последующей переработке. Кроме того, в доклинических и клинических исследованиях ранней фазы требуется большее количество антител, которые могут быть получены более быстро. Таким образом, в промышленности существует потребность в способе очистки антител, который можно вести в непрерывном режиме, а также в уменьшении времени, затрачиваемого на получение партий, в снижении риска контаминации, технических отказов и ошибок, связанных с человеческим фактором, и требований к масштабированию способа.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Авторы изобретения нашли новый способ очистки антител, включающий ограниченное количество стадий, выполняемых в непрерывном режиме, с использованием уменьшенного количества смол и буферов, и при этом позволяющий получать высокие выходы очищенных антител с превосходной степенью чистоты. Очищенные белки, таким образом, подходят для медицинского применения. Таким образом, способ может применяться при очистке белков для клинических испытаний и/или для выпуска на рынок фармацевтической композиции, включающей белок. Кроме того, данный способ не требует какой-либо межстадийной регулировки и, таким образом, может быть выполнен в закрытой системе, от сбора очищаемых белков до получения конечного продукта.

Коротко, данный способ включает только три хроматографических стадии, выполняемых в непрерывном режиме: одна стадия аффинной хроматографии, одна стадия хроматографии на мультимодальных смолах или катионообменной хроматографии и одна стадия анионообменной хроматографии (AEX). Эти три хроматографических стадии могут быть выполнены в любом порядке. Кроме того, было обнаружено, что все буферы, используемые в ходе этих трех стадий хроматографии, могут быть приготовлены из одного и того же исходного раствора. Указанные буферы предпочтительно включают бис-трис, например, в комбинации с NaCl, уксусной кислотой, водой и, необязательно, NH₄Cl. Поскольку нет никакой потребности в замене буфера, способ является легковыполнимым и очень подходящим для автоматизации и/или для выполнения в непрерывном режиме. Более конкретно, во всем процессе можно использовать только 4 буфера, что гарантирует совместимость между всеми стадиями и обеспечивает производство полного цикла и экономию при контроле качества, а также снижает потребности в хранении.

Способ согласно изобретению также позволяет уменьшить или исключить фазы открывания (то есть стадии, в которых систему очистки открывают для выполнения операций вручную, например, при подготовке хроматографической колонки для нового буфера, разбавлении образца или регулировании pH), что позволяет снизить риск контаминации и дает возможность работать при более низких требованиях к контролю среды. Кроме того, так как в каждой хроматографической стадии способа согласно изобретению могут использоваться смолы многократного применения или неожиданно могут многократно использоваться одноразовые мембранные адсорберы, последовательность из трех хроматографических стадий можно повторять до получения нужного количества без манипуляций, выполняемых человеком. В частности, все хроматографические стадии способа согласно изобретению могут быть выполнены с использованием смол, которые могут повторно использоваться по меньшей мере 100 раз, или с использованием мембранных адсорберов, которые могут повторно использоваться по меньшей мере 50 раз. Авторы изобретения действительно продемонстрировали, что можно было использовать один и тот же одноразовый мембранный адсорбер на протяжении по меньшей мере 50 циклов без потери стабильности. Продолжительность производственного цикла, таким образом, уменьшается, требования к масштабированию процесса минимизируются, и при этом можно снизить затраты на производственные операции и хранение, так как можно уменьшить объемы смол и буферов, и одноразовые мембранные адсорберы не требуется хранить после обработки партии. Поэтому способ изобретения обеспечивает быстрое рентабельное получение партий и уменьшает продолжительность занятости систем очистки, как это можно видеть на Фигурах 10 и 12, по сравнению с Фигурами 9 и 11. Таким образом, он подходит для масштабирования и очистки рекомбинантных белков от лабораторного до промышленного масштаба.

Определенная методика была разработана и применена для четырех различных антител. В этой методике неочищенный белковый элюент, полученный в конце первой хроматографической стадии, непосредственно переносили на вторую хроматографическую матрицу, в частности на вторую хроматографическую колонку или мембранный адсорбер, то есть без проведения какой-либо обработки, такой как регулирование pH, замена или разбавление буфера, и белковый элюат, полученный в конце второй хроматографической стадии, также непосредственно переносят на третью хроматографическую матрицу, в частности на третью хроматографическую колонку или мембранный адсорбер, то есть без проведения какой-либо обработки, такой как регулирование pH, замена или разбавление буфера. Данный способ схематически изображен на Фигуре 6. Кроме того, в данной методике содержащий белок раствор наносят на первую хроматографическую матрицу, в частности на первую хроматографическую колонку или мембранный адсорбер, в последовательных циклах (см. Пример 6), причем последовательные циклы начинают непосредственно после элюции предыдущей партии в первой хроматографической стадии, как можно видеть на Фигуре 8. Данная методика имеет преимущество, состоящее в том, что она является чрезвычайно быстрой (приблизительно 2 часа на последовательность), дает повышенный выход (больше 90%), более высокую чистоту и позволяет уменьшить используемые объемы буферов и смол в случае использования колонок, и уменьшить использование буферов и мощностей хранения в случае использования мембранных адсорберов. Кроме того, этот процесс обладает преимуществом чрезвычайной гибкости, поскольку размер используемых колонок и/или количество циклов можно легко адаптировать к количеству очищаемых белков. Кроме того, он может быть полностью автоматизированным, работать в непрерывном режиме, и при этом он не включает фазы открывания. Кроме того, он был успешно применен для четырех различных антител без необходимости оптимизации.

Таким образом, изобретение предоставляет способ очистки белка из раствора, включающий первую хроматографическую стадию, включающую пропускание уравновешивающего буфера через первую хроматографическую матрицу, в особенности через первую хроматографическую колонку или мембранный адсорбер, пропускание раствора через первую хроматографическую матрицу, в особенности через первую хроматографическую колонку или мембранный адсорбер, пропускание уравновешивающего буфера через первую хроматографическую матрицу, в особенности через первую хроматографическую колонку или мембранный адсорбер, пропускание промывочного буфера через первую хроматографическую матрицу, в особенности через первую хроматографическую колонку или мембранный адсорбер, пропускание уравновешивающего буфера через первую хроматографическую матрицу, в особенности через первую хроматографическую колонку или мембранный адсорбер, и элюирование неочищенного белкового элюента с первой хроматографической матрицы, в особенности с первой хроматографической колонки или мембранного адсорбера, при использовании первого элюирующего буфера; вторую хроматографическую стадию, включающую пропускание уравновешивающего буфера через вторую хроматографическую матрицу, в особенности через вторую хроматографическую колонку или мембранный адсорбер, пропускание неочищенного белкового элюента через вторую хроматографическую матрицу, в особенности через вторую хроматографическую колонку или мембранный адсорбер, необязательно пропускание уравновешивающего буфера через вторую хроматографическую матрицу, в особенности через вторую хроматографическую колонку или мембранный адсорбер, и элюирование белкового элюата со второй хроматографической матрицы, в особенности со второй хроматографической колонки или мембранного адсорбера, при использовании второго элюирующего буфера; и третью хроматографическую стадию, включающую пропускание уравновешивающего буфера через третью хроматографическую матрицу, в особенности через третью хроматографическую колонку или мембранный адсорбер, пропускание белкового элюата через третью хроматографическую матрицу, в особенности через третью хроматографическую колонку или мембранный адсорбер, в режиме непрерывного потока, необязательно пропускание промывочного буфера через третью хроматографическую матрицу, в особенности через третью хроматографическую колонку или мембранный адсорбер, и выделение очищенного белка из элюата с третьей хроматографической матрицы, в особенности третьей хроматографической колонки или мембранного адсорбера.

Изобретение также предоставляет способ очистки белка из раствора, включающий первую хроматографическую стадию, включающую пропускание уравновешивающего буфера через первую хроматографическую матрицу, в особенности через первую хроматографическую колонку или мембранный адсорбер, пропускание части раствора через первую хроматографическую матрицу, в особенности через первую хроматографическую колонку или мембранный адсорбер, пропускание уравновешивающего буфера через первую хроматографическую матрицу, в особенности через первую хроматографическую колонку или мембранный адсорбер, пропускание промывочного буфера через первую хроматографическую матрицу, в особенности через первую хроматографическую колонку или мембранный адсорбер, пропускание уравновешивающего буфера через первую хроматографическую матрицу, в особенности через первую хроматографическую колонку или мембранный адсорбер, элюирование неочищенного белкового элюента с первой хроматографической матрицы, в особенности с первой хроматографической колонки или мембранного адсорбера, при использовании первого элюирующего буфера, и необязательно пропускание буфера для очистки через первую хроматографическую матрицу, в особенности через первую хроматографическую колонку или мембранный адсорбер; вторую хроматографическую стадию, включающую пропускание уравновешивающего буфера через вторую хроматографическую матрицу, в особенности через вторую хроматографическую колонку или мембранный адсорбер, пропускание неочищенного белкового элюента через вторую хроматографическую матрицу, в особенности через вторую хроматографическую колонку или мембранный адсорбер, необязательно пропускание уравновешивающего буфера через вторую хроматографическую матрицу, в особенности через вторую хроматографическую колонку или мембранный адсорбер, элюирование белкового элюата со второй хроматографической матрицы, в особенности со второй хроматографической колонки или мембранного адсорбера, при использовании второго элюирующего буфера, и необязательно пропускание буфера для очистки через вторую хроматографическую матрицу, в особенности через вторую хроматографическую колонку или мембранный адсорбер; третью хроматографическую стадию, включающую пропускание уравновешивающего буфера через третью хроматографическую матрицу, в особенности через третью хроматографическую колонку или мембранный адсорбер, пропускание белкового элюата через третью хроматографическую матрицу, в особенности через третью хроматографическую колонку или мембранный адсорбер, в режиме пропускания непрерывного потока, необязательно пропускание промывочного буфера через третью хроматографическую матрицу, в особенности через третью хроматографическую колонку или мембранный адсорбер, выделение очищенного белка из элюата с третьей хроматографической матрицы, в особенности третьей хроматографической колонки или мембранного адсорбера, и необязательно пропускание буфера для очистки через третью хроматографическую матрицу, в особенности через третью хроматографическую колонку или мембранный адсорбер; последовательный повтор первой, второй и третьей хроматографических стадий с использованием другой части раствора до полного использования всего раствора, и сбор очищенных белков, выделенных в конце каждой третьей хроматографической стадии.

В одном варианте осуществления изобретения каждый из буферов содержит бис-трис. В другом варианте осуществления каждый буфер содержит бис-трис, уксусную кислоту, NaCl, воду и необязательно NH₄Cl. Использование бис-трис буферов в способе изобретения особенно важно, поскольку это позволяет избежать регулирования pH между тремя хроматографическими стадиями и, таким образом, проводить способ в закрытой системе от первой до последней стадии.

В одном варианте осуществления одна из хроматографических матриц является матрицей с белком A. В одном варианте осуществления одна из хроматографических матриц является мультимодальной смолой или катионообменной хроматографической матрицей. В одном варианте осуществления одна из хроматографических матриц является анионообменной хроматографической матрицей.

В конкретном варианте осуществления способ изобретения включает белок A, хроматографическую матрицу, мультимодальную смолу или катионообменную хроматографическую матрицу и анионообменную хроматографическую матрицу, где указанные матрицы используют в любом порядке в трех хроматографических стадиях.

В одном варианте осуществления изобретения первая хроматографическая матрица является матрицей с белком A, вторая хроматографическая матрица является мультимодальной смолой или катионообменной хроматографической матрицей, и третья хроматографическая матрица является анионообменной хроматографической матрицей.

В одном варианте осуществления изобретения каждая хроматографическая матрица является хроматографической колонкой. В конкретном варианте данного варианта осуществления первая хроматографическая матрица является колонкой с белком A, вторая хроматографическая матрица является хроматографической колонкой с мультимодальной смолой, и третья хроматографическая матрица является анионообменной хроматографической колонкой.

В другом варианте осуществления изобретения каждая хроматографическая матрица является хроматографическим мембранным адсорбером. В конкретном варианте данного варианта осуществления первая хроматографическая матрица является мембранным адсорбером с белком A, вторая хроматографическая матрица является катионообменным мембранным адсорбером, и третья хроматографическая матрица является анионообменным мембранным адсорбером.

В одном варианте осуществления изобретения очищаемый белок является антителом. В другом варианте осуществления антитело является моноклональным антителом.

В одном варианте осуществления изобретения способ дополнительно включает стадию нанофильтрации после стадии (c) и/или стадию ультрафильтрации и диафильтрации после стадии нанофильтрации. В другом варианте осуществления изобретения способ дополнительно включает стадию инактивации при низком pH после стадии (c), после стадии нанофильтрации и/или после стадии ультрафильтрации и диафильтрации. В одном варианте осуществления изобретения способ включает, перед стадией (a), стадию клеточной культуры в жидкой питательной среде, предпочтительно в биореакторе, с получением жидкой питательной среды, содержащей белок. Культивируемые клетки могут быть клетками млекопитающих, бактерий или дрожжей.

Изобретение, таким образом, также предоставляет интегрированный способ получения очищенного белка из жидкой питательной среды.

В некоторых вариантах осуществления изобретения первый элюирующий буфер включает 20 мМ бис-трис и 20 мМ NaCl, доведенные до pH 3,7 уксусной кислотой; второй элюирующий буфер включает 20 мМ бис-трис, 45 мМ NaCl и 25 мМ NH₄Cl, доведенные до pH 7,25 уксусной кислотой, или включает 20 мМ бис-трис, 80 мМ NaCl и 25 мМ NH₄Cl, доведенные до pH 6,2 уксусной кислотой; уравновешивающий буфер включает 20 мМ бис-трис и 20 мМ NaCl, доведенные до pH 7,4 уксусной кислотой; и промывочный буфер включает 20 мМ бис-трис и 1 М NaCl, доведенные до pH 7,4 уксусной кислотой. В других вариантах осуществления изобретения буфер для очистки включает 0,1н гидроксид натрия.

В изобретении предложен набор, включающий мультимодальную смолу или катионообменную хроматографическую матрицу, матрицу с белком A и/или анионообменную хроматографическую матрицу; и по меньшей мере один буфер, включающий или состоящий из бис-трис, уксусной кислоты, NaCl, воды и необязательно NH₄Cl. В некоторых вариантах осуществления набор применяется для очистки белка из раствора с применением способа согласно изобретению.

В одном варианте осуществления набор включает хроматографическую колонку с мультимодальной смолой, колонку с белком A и/или анионообменную хроматографическую колонку; и по меньшей мере один буфер, включающий или состоящий из бис-трис, уксусной кислоты, NaCl, воды и необязательно NH₄Cl.

В другом варианте осуществления набор включает катионообменный мембранный адсорбер, мембранный адсорбер с белком A и/или анионообменный мембранный адсорбер; и по меньшей мере один буфер, включающий или состоящий из бис-трис, уксусной кислоты, NaCl, воды и необязательно NH₄Cl.

В изобретении также предложен набор, включающий мультимодальную смолу или катионообменную хроматографическую матрицу, матрицу с белком A и/или анионообменную хроматографическую матрицу; и инструкции по приготовлению по меньшей мере одного буфера, включающего или состоящего из бис-трис, уксусной кислоты, NaCl, воды и необязательно NH₄Cl. В некоторых вариантах осуществления набор применяется для очистки белка из раствора с применением способа согласно изобретению.

В одном варианте осуществления набор включает хроматографическую колонку с мультимодальной смолой, колонку с белком A и/или анионообменную хроматографическую колонку; и инструкции по приготовлению по меньшей мере одного буфера, включающего или состоящего из бис-трис, уксусной кислоты, NaCl, воды и необязательно NH₄Cl.

В другом варианте осуществления набор включает катионообменный мембранный адсорбер, мембранный адсорбер с белком A и/или анионообменный мембранный адсорбер; и инструкции по приготовлению по меньшей мере одного буфера, включающего или состоящего из бис-трис, уксусной кислоты, NaCl, воды и необязательно NH₄Cl.

В изобретении также предложен способ приготовления уравновешивающего буфера, включающий создание 100 л раствора с конечной концентрацией 20 мМ бис-трис и 20 мМ NaCl; доведение pH раствора до 7,4 уксусной кислотой; и сбор 25 л раствора. В изобретении также предложен способ приготовления промывочного буфера, включающий сбор 25 л из 75 л раствора, оставшихся после приготовления уравновешивающего буфера, и добавление дополнительного количества 1 М NaCl к этим 25 л раствора. В изобретении также предложен способ приготовления элюирующего буфера, включающий сбор 25 л из 50 л раствора, оставшегося после приготовления уравновешивающего буфера, и доведение pH этих 25 л раствора до 3,7 уксусной кислотой. В изобретении также предложен способ приготовления элюирующего буфера, включающий добавление дополнительного количества 45 мМ NaCl и дополнительного количества 25 мМ NH₄Cl к 25 л раствора, оставшегося после приготовления уравновешивающего буфера, и доведение pH этих 25 л до 7,25 уксусной кислотой. Буферы, приготовленные способами, раскрытыми в настоящей заявке, могут применяться для очистки белка из раствора с применением способа согласно изобретению.

Также в настоящей заявке предложены выделенные белки, фармацевтические средства и фармацевтические композиции, полученные любым из способов, описанных в настоящей заявке.

Эти и другие признаки и преимущества раскрытого способа очистки будут более ясны из последующего подробного описания, рассматриваемого вместе с прилагаемой формулой изобретения. Следует отметить, что объем формулы изобретения определяется ее содержанием, а не определенным обсуждением признаков и преимуществ, изложенных в описании.

В рамках изобретения термины "включающий", "имеющий" и "содержащий" следует рассматривать как открытые термины (то есть означающие "включающий, но не ограниченный"), если не отмечено иное. Дополнительно, термин "включающий" охватывает "состоящий" (например, композиция, "включающая" X, может состоять исключительно из X или может включать что-либо дополнительное, например X+Y).

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР

Следующее подробное описание вариантов осуществления раскрытого способа очистки может быть лучше всего понято при прочтении в сочетании со следующими чертежами.

На Фигуре 1 показано схема методики, используемой для приготовления буферов для способа очистки, раскрытого в Примерах 2-7.

На Фигуре 2 показаны графики, на которых представлены области максимальной эффективности второго элюирующего буфера для трех концентраций NH₄Cl.

На Фигуре 3 показаны графики, на которых представлен анализ тенденции изменения ВММ, выход, БКХ и ДНК в каждом из 15 циклов Примера 5.

На Фигуре 4 показаны графики, на которых представлен анализ тенденции изменения ВММ, НММ, БКХ и ДНК в каждом из 50 циклов Примера 8.

На Фигуре 5 показана схема различных стадий стандартного способа очистки белков. СВ: суммарный выход; EqB#1: первый уравновешивающий буфер; WB#1: первый промывочный буфер, ElB#1: первый элюирующий буфер; EqB#2: второй уравновешивающий буфер; WB#2: второй промывочный буфер, ElB#2: второй элюирующий буфер; EqB#3: третий уравновешивающий буфер; WB#3: третий промывочный буфер; хром1: первая хроматографическая стадия; хром2: вторая хроматографическая стадия; хром3: третья хроматографическая стадия; регул. pH: регулирование pH; регул. конц.: регулирование концентрации; регул. электропр.: регулирование удельной электропроводности; проб.: отбор пробы; хран.: хранение; фильт.: фильтрация; нанофильт.: нанофильтрация; ФТП: фильтрация в тангенциальном потоке.

На Фигуре 6 показана схема различных стадий способа согласно изобретению. СВ: суммарный выход; EqB#1: первый уравновешивающий буфер; WB#1: первый промывочный буфер, ElB#1: первый элюирующий буфер; ElB#2: второй элюирующий буфер; хром1: первая хроматографическая стадия; хром2: вторая хроматографическая стадия; хром3: третья хроматографическая стадия; проб.: отбор пробы; хран.: хранение; наноф.: нанофильтрация; ФТП: фильтрация в тангенциальном потоке.

На Фигуре 7 показана схема различных стадий стандартного способа очистки белков, включающего несколько циклов. Освет.: осветление; EqB#1: первый уравновешивающий буфер; WB#1: первый промывочный буфер, ElB#1: первый элюирующий буфер; EqB#2: второй уравновешивающий буфер; WB#2: второй промывочный буфер, ElB#2: второй элюирующий буфер; EqB#3: третий уравновешивающий буфер; WB#3: третий промывочный буфер; хром1: первая хроматографическая стадия; хром2: вторая хроматографическая стадия; хром3: третья хроматографическая стадия; Наноф.: нанофильтрация; УФ/ДФ: ультрафильтрация/диафильтрация.

На Фигуре 8 показана схема различных стадий способа согласно изобретению, включающего несколько циклов. Освет.: осветление; EqB#1: первый уравновешивающий буфер; WB#1: первый промывочный буфер, ElB#1: первый элюирующий буфер; ElB#2: второй элюирующий буфер; хром1: первая хроматографическая стадия; хром2: вторая хроматографическая стадия; хром3: третья хроматографическая стадия; Наноф.: нанофильтрация; УФ/ДФ: ультрафильтрация/диафильтрация.

На Фигуре 9 показана схема временного графика различных стадий стандартного способа очистки белков, включающего несколько циклов. В первой строке таблицы показано время в часах. Освет.: осветление; хром1: первая хроматографическая стадия; хром2: вторая хроматографическая стадия; хром3: третья хроматографическая стадия; Инакт. при низком pH: инактивация при низком pH; Наноф.: нанофильтрация; УФ/ДФ: ультрафильтрация/диафильтрация. Круг обозначает время завершения процесса.

На Фигуре 10 показана схема временного графика различных стадий способа согласно изобретению, включающего несколько циклов. Освет.: осветление; хром1: первая хроматографическая стадия; хром2: вторая хроматографическая стадия; хром3: третья хроматографическая стадия; Наноф.: нанофильтрация; УФ/ДФ: ультрафильтрация/диафильтрация. Круг обозначает время завершения процесса.

На Фигуре 11 показана схема временного графика различных стадий стандартного способа очистки белков, включающего несколько циклов. В первой строке таблицы показано время в часах. Освет.: осветление; хром1: первая хроматографическая стадия; хром2: вторая хроматографическая стадия; хром3: третья хроматографическая стадия; Инакт. при низком pH: инактивация при низком pH; Наноф.: нанофильтрация; УФ/ДФ: ультрафильтрация/диафильтрация. Указан расчетный уровень производительности процесса.

На Фигуре 12 показана схема временного графика различных стадий способа согласно изобретению, включающего несколько циклов. Освет.: осветление; хр1: первая хроматографическая стадия; хр2: вторая хроматографическая стадия; хр3: третья хроматографическая стадия; Наноф.: нанофильтрация; УФ/ДФ: ультрафильтрация/диафильтрация. Указан расчетный уровень производительности процесса.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ АСПЕКТОВ И ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ

Исходя из доступности смол смешанного типа (также называемых мультимодальными смолами) и хроматографических мембранных адсорберов, авторы изобретения разработали новый способ очистки, в котором используются только три хроматографических стадии. Другими словами, способ включает только три стадии, включающие пропускание через хроматографическую матрицу.

Изобретение относится к способу очистки белка из раствора, включающему или состоящему из:

(a) первой хроматографической стадии, включающей:

- пропускание указанного раствора через первую хроматографическую матрицу;

- элюирование неочищенного белкового элюента с первой хроматографической матрицы при использовании первого элюирующего буфера;

(b) второй хроматографической стадии, включающей:

- пропускание неочищенного белкового элюента, полученного в конце стадии (a), через вторую хроматографическую матрицу;

- элюирование белкового элюата со второй хроматографической матрицы при использовании второго элюирующего буфера; и

(c) третьей хроматографической стадии, включающей:

- пропускание белкового элюата, полученного в конце стадии (b), через третью хроматографическую матрицу в режиме пропускания непрерывного потока;

- выделение очищенного белка из элюата с третьей хроматографической матрицы;

где каждый из буферов включает бис-трис.

Более конкретно, каждая из двух первых хроматографических стадий выше может включать или состоять из:

- пропускания уравновешивающего буфера через хроматографическую матрицу;

- пропускания раствора или неочищенного белкового элюента через хроматографическую матрицу (как указано выше);

- пропускание уравновешивающего буфера через хроматографическую матрицу;

- необязательно, пропускание промывочного буфера через хроматографическую матрицу;

- необязательно, пропускание уравновешивающего буфера через хроматографическую матрицу;

- элюирование неочищенного белкового элюента или белкового элюата с хроматографической матрицы при использовании элюирующего буфера (как указано выше),

где каждый из буферов включает бис-трис.

Изобретение также относится к способу очистки белка из раствора, включающему или состоящему из:

(a) первой хроматографической стадии, включающей:

- пропускание части указанного раствора через первую хроматографическую матрицу;

- элюирование неочищенного белкового элюента с первой хроматографической матрицы при использовании первого элюирующего буфера, и

- необязательно, пропускание буфера для очистки через первую хроматографическую матрицу;

(b) второй хроматографической стадии, включающей:

- пропускание неочищенного белкового элюента, полученного в конце стадии (a), через вторую хроматографическую матрицу,

- элюирование белкового элюата со второй хроматографической матрицы при использовании второго элюирующего буфера, и

- необязательно, пропускание буфера для очистки через вторую хроматографическую матрицу;

(c) третьей хроматографической стадии, включающей:

- пропускание белкового элюата, полученного в конце стадии (b), через третью хроматографическую матрицу в режиме пропускания непрерывного потока,

- выделение очищенного белка из элюата с третьей хроматографической матрицы, и

- необязательно, пропускание буфера для очистки через третью хроматографическую матрицу;

последовательный повтор стадий (a), (b) и (c) с использованием другой части раствора до полного использования всего раствора, и

сбор очищенных белков, выделенных в конце каждой стадии (c);

где каждый уравновешивающий, промывочный и элюирующий буфер включает бис-трис.

В рамках изобретения выражение "хроматографическая матрица" относится к любому типу состоящих из частиц сорбционных сред, смол или другой твердой фазы, такой как мембрана, которые, в процессе очистки, действуют как абсорбент, обеспечивая отделение очищаемой молекулы от других молекул, присутствующих в смеси. Матрица, в частности матрицы, состоящих из смол, могут находиться в форме колонок или в форме мембранных адсорберов.

В рамках изобретения "мембранный адсорбер" относится к плоскому листу из акрилового полимера, несущего ионные группы и включающего присоединенные функциональные группы, такие как аффинные группы и ионообменные группы. Одним из различий между смолой и мембраной является распределение потока: под действием диффузии в случае смолы и под действием конвекции в мембранах.

В одном варианте осуществления способа согласно изобретению первая, вторая и третья хроматографические матрицы являются хроматографическими колонками. В другом варианте осуществления способа согласно изобретению первая, вторая и третья хроматографические матрицы являются хроматографическими мембранными адсорберами.

Таким образом, в одном варианте осуществления изобретение относится к способу очистки белка из раствора, включающему или состоящему из:

(a) первой хроматографической стадии, включающей:

- пропускание указанного раствора через первую хроматографическую колонку;

- элюирование неочищенного белкового элюента с первой хроматографической колонки при использовании первого элюирующего буфера;

(b) второй хроматографической стадии, включающей:

- пропускание неочищенного белкового элюента, полученного в конце стадии (a), через вторую хроматографическую колонку;

- элюирование белкового элюата со второй хроматографической колонки при использовании второго элюирующего буфера; и

(c) третьей хроматографической стадии, включающей:

- пропускание белкового элюата, полученного в конце стадии (b), через третью хроматографическую колонку в режиме пропускания непрерывного потока;

- выделение очищенного белка из элюата с третьей хроматографической колонки;

где каждый из буферов включает бис-трис.

Более конкретно, каждая из двух первых хроматографических стадий выше может включать или состоять из:

- пропускания уравновешивающего буфера через хроматографическую колонку;

- пропускания раствора или неочищенного белкового элюента через хроматографическую колонку (как указано выше);

- пропускания уравновешивающего буфера через хроматографическую колонку;

- необязательно, пропускания промывочного буфера через хроматографическую колонку;

- необязательно, пропускания уравновешивающего буфера через хроматографическую колонку;

- элюирования неочищенного белкового элюента или белкового элюата с хроматографической колонки при использовании элюирующего буфера (как указано выше),

где каждый из буферов включает бис-трис.

Изобретение также относится к способу очистки белка из раствора, включающему или состоящему из:

(a) первой хроматографической стадии, включающей:

- пропускание части указанного раствора через первую хроматографическую колонку;

- элюирование неочищенного белкового элюента с первой хроматографической колонки при использовании первого элюирующего буфера, и

- необязательно, пропускание буфера для очистки через первую хроматографическую колонку;

(b) второй хроматографической стадии, включающей:

- пропускание неочищенного белкового элюента, полученного в конце стадии (a), через вторую хроматографическую колонку,

- элюирование белкового элюата со второй хроматографической колонки при использовании второго элюирующего буфера, и

- необязательно, пропускание буфера для очистки через вторую хроматографическую колонку;

(c) третьей хроматографической стадии, включающей:

- пропускание белкового элюата, полученного в конце стадии (b), через третью хроматографическую колонку в режиме пропускания непрерывного потока,

- выделение очищенного белка из элюата с третьей хроматографической колонки, и

- необязательно, пропускание буфера для очистки через третью хроматографическую колонку;

последовательный повтор стадий (a), (b) и (c) с использованием другой части раствора до полного использования всего раствора, и

сбор очищенных белков, выделенных в конце каждой стадии (c);

где каждый уравновешивающий, промывочный и элюирующий буфер включает бис-трис.

В другом варианте осуществления изобретение относится к способу очистки белка из раствора, включающему или состоящему из:

(a) первой хроматографической стадии, включающей:

- пропускание указанного раствора через первый хроматографический мембранный адсорбер;

- элюирование неочищенного белкового элюента с первого хроматографического мембранного адсорбера при использовании первого элюирующего буфера;

(b) второй хроматографической стадии, включающей:

- пропускание неочищенного белкового элюента, полученного в конце стадии (a), через второй хроматографический мембранный адсорбер;

- элюирование белкового элюата со второго хроматографического мембранного адсорбера при использовании второго элюирующего буфера; и

(c) третьей хроматографической стадии, включающей:

- пропускание белкового элюата, полученного в конце стадии (b), через третий хроматографический мембранный адсорбер в режиме пропускания непрерывного потока;

- выделение очищенного белка из элюата с третьего хроматографического мембранного адсорбера;

где каждый из буферов включает бис-трис.

Более конкретно, каждая из двух первых хроматографических стадий выше может включать или состоять из:

- пропускания уравновешивающего буфера через хроматографический мембранный адсорбер;

- пропускания раствора или неочищенного белкового элюента через хроматографический мембранный адсорбер (как указано выше);

- пропускания уравновешивающего буфера через хроматографический мембранный адсорбер;

- необязательно, пропускания промывочного буфера через хроматографический мембранный адсорбер;

- необязательно, пропускания уравновешивающего буфера через хроматографический мембранный адсорбер;

- элюирования неочищенного белкового элюента или белкового элюата с хроматографического мембранного адсорбера при использовании элюирующего буфера (как указано выше),

где каждый из буферов включает бис-трис.

Изобретение также относится к способу очистки белка из раствора, включающему или состоящему из:

(a) первой хроматографической стадии, включающей:

- пропускание части указанного раствора через первый хроматографический мембранный адсорбер;

- элюирование неочищенного белкового элюента с первого хроматографического мембранного адсорбера при использовании первого элюирующего буфера, и

- необязательно, пропускание буфера для очистки через первый хроматографический мембранный адсорбер;

(b) второй хроматографической стадии, включающей:

- пропускание неочищенного белкового элюента, полученного в конце стадии (a), через второй хроматографический мембранный адсорбер,

- элюирование белкового элюата со второго хроматографического мембранного адсорбера при использовании второго элюирующего буфера, и

- необязательно, пропускание буфера для очистки через второй хроматографический мембранный адсорбер;

(c) третьей хроматографической стадии, включающей:

- пропускание белкового элюата, полученного в конце стадии (b), через третий хроматографический мембранный адсорбер в режиме пропускания непрерывного потока,

- выделение очищенного белка из элюата с третьего хроматографического мембранного адсорбера, и

- необязательно, пропускание буфера для очистки через третий хроматографический мембранный адсорбер;

последовательный повтор стадий (a), (b) и (c) с использованием другой части раствора до полного использования всего раствора, и

сбор очищенных белков, выделенных в конце каждой стадии (c);

где каждый уравновешивающий, промывочный и элюирующий буфер включает бис-трис.

Как указано выше, вышеуказанный способ согласно изобретению включает только три хроматографических стадии. Даже несмотря на то, что способ согласно изобретению включает только три стадии хроматографии, это позволяет получать очищенные белки, которые подходят для применения в фармацевтических целях и, в особенности, для введения людям.

В дополнение к отсутствию выполняемых вручную операций в процессе очистки (и в результате уменьшению общего времени, требуемого для выполнения процесса очистки), раскрытый способ позволяет уменьшить количество буферов и смол, используемых для очистки. Кроме того, основные буферы включают те же компоненты (то есть бис-трис, NaCl, уксусную кислоту, воду и необязательно NH₄Cl), что существенно облегчает приготовление буфера. Раскрытый способ очистки также упрощает очистку мАт, улучшает общий выход и уменьшает использование исходных материалов, мощностей хранения, стоимость товаров и время процесса, в дополнение к возможности очистки множества мАт.

В отличие от обычных способов очистки белков, как указано выше, в способе, раскрытом в настоящей заявке, используется четыре или пять буферов: уравновешивающий буфер, промывочный буфер, два элюирующих буфера и необязательно буфер очистки. Четыре основных буфера, используемые в раскрытом способе, приготовлены с тем же составом соединений, из исходного раствора, что в значительной степени облегчает приготовление буфера.

При использовании в настоящем описании, "буферы согласно изобретению" относятся к буферам, включающим бис-трис. Бис-трис является соединением, известным специалистам в данной области техники, имеющим название согласно IUPAC 2-[бис(2-оксиэтил)амино]-2-(гидроксиметил)пропан-1,3-диол и номер CAS 6976-37-0. Такие буферы согласно изобретению могут соответствовать уравновешивающему буферу, промывочному буферу и/или элюирующему буферу.

Более конкретно, такие буферы согласно изобретению могут включать или состоять из одних и тех же химических веществ в различных концентрациях (одним из которых является бис-трис). В определенном варианте осуществления буферы включают или состоят из бис-триса, уксусной кислоты и воды. В более конкретном варианте осуществления буферы включают или состоят из бис-триса, уксусной кислоты, NaCl, воды и необязательно NH₄Cl. В других условиях такие буферы включают или состоят из бис-триса, уксусной кислоты, NaCl, воды и необязательно NH₄Cl в различных концентрациях.

Элюирующий буфер может, например, включать или состоять из 15-25 мМ (например, 20 мМ) бис-триса и 15-25 мМ (например, 20 мм) NaCl, доведенных до pH 3-4 (например, 3,7) уксусной кислотой. Такой элюирующий буфер является особенно подходящим для использования с аффинной хроматографической матрицей, в особенности с аффинной хроматографической колонкой или мембранным адсорбером, таким как матрица с белком A, в особенности колонка с белком A или мембранный адсорбер с белком A.

Элюирующий буфер может также включать или состоять из 15-25 мМ (например, 20 мМ) бис-триса, 40-50 мМ (например, 45 мМ) NaCl и 20-30 мМ (например, 25 мМ) NH₄Cl, доведенных до pH 7-8 (например, 7,25) уксусной кислотой. Такой элюирующий буфер особенно подходит для использования с хроматографической матрицей мультимодальной смолы, в особенности с хроматографической колонкой с мультимодальной смолой, такой как, например, Capto MMC.

Элюирующий буфер может также включать или состоять из 15-25 мМ (например, 20 мМ) бис-триса, 50-150 мМ (например, 80 мМ) NaCl и 20-30 мМ (например, 25 мМ) NH₄Cl, доведенных до pH 6-7 (например, 6,2) уксусной кислотой. Такой элюирующий буфер особенно подходит для использования с катионообменной хроматографической матрицей, в особенности с катионообменным мембранным адсорбером.

Уравновешивающий буфер может включать или состоять из 15-25 мМ (например, 20 мМ) бис-триса и 15-25 мМ (например, 20 мМ) NaCl, доведенных до pH 7-8 (например, 7,4) уксусной кислотой.

Промывочный буфер может включать или состоять из 15-25 мМ (например, 20 мМ) бис-триса и 0,9-1,1 М (например, 1 M) NaCl, доведенных до pH 7-8 (например, 7,4) уксусной кислотой.

Более конкретно, один уравновешивающий буфер для применения в раскрытом способе содержит 20 мМ бис-триса и 20 мМ NaCl, доведенных до pH 7,4 2 мМ уксусной кислотой. Один промывочный буфер для применения в раскрытом способе содержит 20 мМ бис-триса и 1 М NaCl, доведенных до pH 7,4 2 мМ уксусной кислотой. Первый элюирующий буфер для применения в раскрытом способе содержит 20 мМ бис-триса и 20 мМ NaCl, доведенных до pH 3,7 275 мМ уксусной кислотой. Второй элюирующий буфер для применения в раскрытом способе содержит 20 мМ бис-триса, 45 мМ NaCl и 25 мМ NH₄Cl, доведенных до pH 7,25 5 мМ уксусной кислотой, в особенности для применения с хроматографической колонкой с мультимодальной смолой, или содержит 20 мМ бис-триса, 80 мМ NaCl и 25 мМ NH₄Cl, доведенных до pH 6,2 5 мМ уксусной кислотой, в особенности для применения с катионообменным мембранным адсорбером.

Преимущества вышеуказанных буферных составов включают возможность продукта мАт проходить через три хроматографических матрицы, в особенности три хроматографических колонки или три хроматографических мембранных адсорбера, используемых в раскрытом способе с большей совместимостью, что позволяет снизить до минимума нежелательные взаимодействия, ограничивает снижение pH и электропроводности и вызывает увеличение выхода в сравнении с традиционными способами очистки. В дополнение к применению уменьшенного количества буферов, другим аспектом раскрытого способа является применение бис-трис буфера. Применение такого буфера позволяет избежать регулирования pH между тремя хроматографическими стадиями и, таким образом, позволяет осуществлять способ в закрытой системе от сбора до последней стадии очистки.

Буфер для очистки, необязательно используемый в изобретении, может включать или состоять из 0,05-0,15 Н (например, 0,1 Н) NaOH. Такой буфер для очистки является особенно подходящим для использования с аффинной хроматографической матрицей, в особенности с аффинной хроматографической колонкой, такой как колонка с белком A, или с аффинным хроматографическим мембранным адсорбером, таким как мембранный адсорбер Sartobind с белком A, с мультимодальной смолой или катионообменной хроматографической матрицей, в особенности с хроматографической колонкой с мультимодальной смолой, такой как Capto MMC, или с катионообменным хроматографическим мембранным адсорбером, таким как мембранный адсорбер Sartobind S, и/или с анионообменной хроматографической матрицей, в особенности с анионообменной хроматографической колонкой, такой как BioPro Q75, или с анионообменным хроматографическим мембранным адсорбером, таким как мембранный адсорбер Sartobind Q.

Термины "полипептид" или "белок", при использовании в настоящем описании, относятся к:

1) молекулам, имеющим последовательность нативных белков, которые являются: a) белками, продуцированными природными и, в особенности, нерекомбинантными клетками, или b) генно-инженерно сконструированными или рекомбинантными клетками, или

2) молекулам, отличающимся от последовательности нативных белков делециями, дополнениями и/или заменами одной или более аминокислот и/или по меньшей мере одной посттрансляционной модификацией (например, гликосилация).

Молекулы, указанные в параграфе 1) выше, могут быть названы нативными белками.

Молекулы, указанные в параграфе 2) выше, являются неприродными белками.

В некоторых аспектах очищаемый белок является антителом.

Термин "антитело", при использовании в настоящем описании, относится к интактному антителу или его связывающему фрагменту, который конкурирует с интактным антителом за специфичное связывание. Связывающие фрагменты включают, без ограничения перечисленным, F(ab), F(ab'), F(ab')₂, Fv и одноцепочечные антитела. Термин "тяжелая цепь" включает любой полипептид иммуноглобулина, имеющий достаточную последовательность вариабельной области, чтобы придавать специфичность в отношении антигена.

Термин "тяжелая цепь", при использовании в настоящем описании, охватывает полноразмерную тяжелую цепь и ее фрагменты. Полноразмерная тяжелая цепь включает домен вариабельной области, VH, и три домена константной области, CH1, CH2 и CH3. Домен VH расположен на N-конце полипептида, а домен CH3 - на C-конце.

Термин "легкая цепь", при использовании в настоящем описании, охватывает полноразмерную легкую цепь и ее фрагменты. Полноразмерная легкая цепь включает домен вариабельной области, VL, и домен константной области, CL. Как и тяжелая цепь, домен вариабельной области легкой цепи расположен на N-конце полипептида. Термин "легкая цепь", при использовании в настоящем описании, включает любой полипептид иммуноглобулина, имеющий достаточную последовательность вариабельной области, чтобы придавать специфичность в отношении антигена.

Структурные единицы природного антитела обычно включают тетрамер. Каждый такой тетрамер обычно состоит из двух идентичных пар полипептидных цепей, каждая пара содержит одну полноразмерную легкую цепь (обычно имеющую молекулярную массу приблизительно 25 кДа) и одну полноразмерную тяжелую цепь (обычно имеющую молекулярную массу приблизительно 50-70 кДа). N-концевая часть каждой легкой и тяжелой цепи обычно включает вариабельную область, содержащую приблизительно 100-110 или больше аминокислот, которая обычно отвечает за распознавание антигена. C-концевая часть каждой цепи обычно определяет константную область, отвечающую за эффекторную функцию. Легкие цепи человека обычно делят на каппа и лямбда легкие цепи. Тяжелые цепи обычно относятся к мю, дельта, гамма, альфа или эпсилон и определяют изотип антитела как IgM, IgD, IgG, IgA и IgE, соответственно. IgG имеет несколько подклассов, включающих, без ограничения, IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4. IgM имеет подклассы, включающие, без ограничения, IgM1 и IgM2. IgA аналогично подразделяется на подклассы, включающие, без ограничения, IgA1 и IgA2. Внутри полноразмерных легких и тяжелых цепей, как правило, вариабельные и константные области соединены "J" областью из приблизительно 12 или больше аминокислот, при этом тяжелая цепь также включает "D" область еще из приблизительно 10 аминокислот.

Вариабельные области каждой пары легкой/тяжелой цепей обычно формируют антигенсвязывающий участок. Вариабельные области обычно демонстрируют одинаковую общую структуру относительно консервативных каркасных областей (FR), соединенных тремя гипервариабельными областями, также называемыми определяющими комплементарность областями или CDR. Области CDR из двух цепей каждой пары обычно выровнены каркасными областями, что могут обеспечивать связывание с определенным эпитопом. В направлении от N-конца до C-конца вариабельные области легкой и тяжелой цепей обычно включают домены FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 и FR4. Отнесение аминокислот к каждому домену обычно производится в соответствии с определениями, приведенными в Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242. Биспецифичное или бифункциональное антитело обычно является искусственным гибридным антителом, содержащим две пары разных тяжелых цепей/легких цепей и два разных связывающих участка.

F(ab) фрагмент состоит из одной легкой цепи и CH1 и вариабельных областей одной тяжелой цепи. Тяжелая цепь молекулы F(ab) не может образовывать дисульфидный мостик с другой молекулой тяжелой цепи. F(ab') фрагмент содержит одну легкую цепь и одну тяжелую цепь, которая содержит больший участок константной области между доменами CH1 и CH2, при этом между двумя тяжелыми цепями может образовываться межцепочечный дисульфидный мостик с формированием молекулы F(ab')₂. Область Fv включает вариабельные области из обеих тяжелых и легких цепей, но не содержит константных областей. Одноцепочечные антитела представляют собой молекулы Fv, в которых вариабельные области тяжелых и легких цепей связаны гибким линкером с формированием одной полипептидной цепи, которая образует антигенсвязывающую область. Бивалентное антитело, не являющееся "мультиспецифичным" или "мультифункциональным" антителом, в некоторых вариантах осуществления, как понимают, включает связывающие участки, обладающие идентичной антигенной специфичностью.

Моноклональные антитела (мАт), которые могут быть очищены раскрытым способом, могут быть получены множеством методик, включая обычную технологию получения моноклональных антител, например, стандартную методику гибридизации соматических клеток, известную в уровне техники. Хотя методики гибридизации соматических клеток предпочтительны, в принципе для получения моноклональных антител могут использоваться другие методики, например, вирусная или онкогенная трансформация B-лимфоцитов. Моноклональное антитело может, например, соответствовать мышиному, химерному, гуманизированному или полностью человеческому антителу.

В определенном варианте осуществления антитело, очищенное способом согласно изобретению, является моноклональным антителом, выбранным из группы, состоящей из антитела, которое специфично связывается с протофибриллярной формой человеческого β-амилоидного белка (например, гуманизированное антитело), антитела, которое специфично связывается с поверхностным бактериальным полисахаридом поли-N-ацетилглюкозамином (PNAG) (например, полностью человеческое антитело), антитела, которое специфично связывается с раково-эмбриональным антигеном связанной молекулой клеточной адгезии 5 (CEACAM5), и антитела, которое специфично связывается с трансмембранным гликопротеином CD38 (например, гуманизированное антитело).

Неограничивающие примеры антител, которые могут быть очищены с применением способа согласно изобретению, также включают: панитумумаб, омализумаб, абаговомаб, абциксимаб, актоксумаб, адалимумаб, адекатумумаб, афелимомаб, афутузумаб, алацизумаб, алемтузумаб, алирокумаб, алтумомаб, аматуксимаб, анатумомаб, аполизумаб, атинумаб, тоцилизумаб, базилизимаб, бектумомаб, белимумаб, бевацизумаб, бициромаб, канакинумаб, цeтуксимаб, даклизумаб, денсумаб, экулизумаб, эдреколомаб, эфализумаб, эфунгумаб, эртумаксомаб, этарацизумаб, этанерцепт, голимумаб, инфликсимаб, натализумаб, паливизумаб, панитумумаб, пертузумаб, ранибизумаб, ритуксимаб, тоцилизумаб, трастузумаб, дупилумаб, сарилумаб или фрезолимумаб.

В некоторых аспектах очищаемый белок является ферментом.

Неограничивающие примеры ферментов, которые могут быть очищены с применением способа согласно изобретению, включает кислую α-глюкозидазу, α-L-идуронидазу, идуронатсульфатазу, гепаран-N-сульфатазу, галактоза-6-сульфатазу, кислую β-галактозидазу, β-глюкуронидазу, N-ацетилглюкозамин-1-фосфотрансферазу, α-N-ацетилгалактозаминидазу (α-галактозидазу B), кислую липазу, лизосомальную кислую церамидазу, кислую сфингомиелиназу, β-глюкозидазу, галактозилцерамидазу, α-галактозидазу A, кислую β-галактозидазу, β-галактозидазу, нейраминидазу, гексозаминидазу A или гексозаминидазу B.

Другие неограничивающие примеры белков, которые могут быть очищены с применением способа согласно изобретению, включают человеческий эритропоэтин, фактор некроза опухоли (например, ФНО-α, ФНО-β или TNF-K), интерферон-альфа или интерферон-бета.

Раствор, содержащий очищаемый белок, может быть средой культивирования, предпочтительно осветленной средой культивирования. Раствор, содержащий очищаемый белок, является, например, средой культивирования, полученной в перфузионном биореакторе или биореакторе периодического действия.

Примеры перфузионных биореакторов или биореакторов периодического действия раскрыты в предварительной заявке на патент США 61/775,060 (полностью включенной в настоящую заявку посредством отсылки).

Термин "осветленная среда культивирования" означает жидкую среду культивирования, полученную из культуры клеток млекопитающих, бактерий или дрожжей, которая по существу освобождена (например, освобождена по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98% или на 99%) от клеток млекопитающих, бактерий или дрожжей.

Фраза "выделение белка", при использовании в настоящем описании, относится к сбору белка после применения раскрытого способа очистки. Раскрытый способ очистки может быть осуществлен с использованием множества стандартных методик хроматографии белков, таких как, без ограничения перечисленными, аффинная хроматография, ионообменная хроматография, хроматография гидрофобных взаимодействий, гель-фильтрационная хроматография и хроматография на мультимодальных смолах.

В некоторых вариантах осуществления раскрытого способа первая хроматографическая матрица является матрицей с белком A. В конкретных вариантах осуществления раскрытого способа первая хроматографическая матрица является колонкой с белком A. В других конкретных вариантах осуществления раскрытого способа первая хроматографическая матрица является мембранным адсорбером с белком A. Матрица с белком A, в особенности колонка с белком A или мембранный адсорбер с белком A, работает с использованием сродства между лигандом на смоле и белком, что обеспечивает высокоэффективное удаление примесей. Другое преимущество использования матрицы с белком A, в частности колонки с белком A или мембранного адсорбера с белком A, в раскрытом способе состоит в том, что мАт обладают универсальным сродством к белку A. В одном варианте осуществления раскрытого способа колонка с белком A является смолой MabSelect Sure (GE Healthcare). В другом варианте осуществления раскрытого способа колонка с белком A является Absolute High Cap (Novasep). В одном варианте осуществления раскрытого способа мембранный адсорбер с белком A является мембранным адсорбером Sartobind с белком A (Sartorius).

В дополнительных вариантах осуществления раскрытого способа вторая хроматографическая матрица является мультимодальной смолой (смолой смешанного типа) или катионообменной хроматографической матрицей. В конкретных вариантах осуществления раскрытого способа вторая хроматографическая матрица является хроматографической колонкой с мультимодальной смолой (смолой смешанного типа). Мультимодальная смола взаимодействует с целевым белком посредством нескольких механизмов с мАт:ионными, гидрофобными взаимодействиями и образованием водородных связей. Более конкретно, в хроматографической колонке с мультимодальной смолой, мАт:ионное взаимодействие является мАт:катионным взаимодействием, в противоположность мАт:анионным взаимодействиям, которые встречаются в классической анионообменной хроматографической (AEX) колонке.

В одном определенном варианте осуществления раскрытого способа мультимодальная смола является смолой Capto MMC (GE Healthcare). Capto MMC является мультимодальной катионообменной смолой с матрицей на основе агарозы с высокой степенью сшивания. Характеристики Capto MMC приведены ниже (см. GE Healthcare Life Sciences, data file 11-0035-45 AA).

Матрица	агароза с высокой степенью сшивания
Функциональная группа	мультимодальная слабая катионообменная смола
Полная ионная емкость	0,07-0,09 ммоль H+/мл среды
Размер частиц	75 мкм (d50v)
Скорость потока	по меньшей мере 600 см/ч в колонке диаметром 1 м с высотой слоя 20 см при 20°C с использованием рабочих буферов с такой же вязкостью, как у воды, при давлении <3 бар (0,3 мПа).
Динамическое связывание	> 45 мг BSA/мл среды при 30 мСм/см
pH-стабильность
кратковременная	2-14
долговременная	2-12
Рабочая температура	от +4°C до +30°C

В других конкретных вариантах осуществления раскрытого способа вторая хроматографическая матрица является катионообменным мембранным адсорбером.

В одном другом определенном варианте осуществления раскрытого способа катионообменный мембранный адсорбер является мембранным адсорбером Sartobind S (Sartorius). В другом определенном варианте осуществления раскрытого способа катионообменный мембранный адсорбер является мембранным адсорбером NatriPur HD-C (Natrix).

В дополнительных вариантах осуществления раскрытого способа третья хроматографическая матрица является анионообменной хроматографической матрицей. В конкретных вариантах осуществления раскрытого способа третья хроматографическая матрица является анионообменной хроматографической колонкой. В других конкретных вариантах осуществления раскрытого способа третья хроматографическая матрица является анионообменным мембранным адсорбером. Положительно заряженная органическая группа, ковалентно связанная с инертным полимерным носителем анионообменной матрицы, в частности анионообменной смолы, взаимодействует с целевым белком посредством мАт:анионного взаимодействия. В одном варианте осуществления раскрытого способа анионообменной хроматографической колонкой является BioPro Q75 (YMC). Характеристики BioPro Q75 приведены ниже (см. спецификацию YMC-BioPro Q75 & S75).

Матрица	гидрофильные полимерные сферы
Заряженная группа	-CH2N+(CH3) 3
Ионообменная емкость	0,13 мэкв/мл смолы
Размер частиц	75 мкм
Линейная скорость	3,0 см/мин (180 см/ч)
Динамическое связывание	Смола на 187 мг/мл
Диапазон pH	2,0-12,0

В другом варианте осуществления раскрытого способа анионообменный мембранный адсорбер является мембранным адсорбером Sartobind Q (Sartorius). В другом варианте осуществления раскрытого способа анионообменный мембранный адсорбер является мембранным адсорбером Sartobind STIC (Sartorius). В другом варианте осуществления раскрытого способа анионообменный мембранный адсорбер является мембранным адсорбером HD-Q (Natrix).

В одном варианте осуществления способ согласно изобретению не включает регулирование pH неочищенного белкового элюента и/или белкового элюата в конце первой хроматографической стадии и/или в конце второй хроматографической стадии.

В конкретном варианте осуществления неочищенный белковый элюент, полученный в конце первой хроматографической стадии, непосредственно пропускают через вторую хроматографическую матрицу, в особенности через вторую хроматографическую колонку или мембранный адсорбер. Более конкретно, никакой обработки (такой как регулирование pH, замена или разбавление буфера) при этом между двумя стадиями не проводят. В таком способе хроматографическая колонка с мультимодальной смолой может, например, соответствовать колонке Capto MMC. В таком способе катионообменный мембранный адсорбер может, например, соответствовать мембранному адсорберу Sartobind S. Кроме того, в конкретном варианте осуществления белковый элюат, полученный в конце второй хроматографической стадии, непосредственно пропускают через третью хроматографическую матрицу, в особенности через третью хроматографическую колонку или мембранный адсорбер. Более конкретно, никакой обработки (такой как регулирование pH, замена или разбавление буфера) при этом между двумя стадиями не проводят. В таком способе хроматографическая колонка с мультимодальной смолой может, например, соответствовать колонке Capto MMC, и/или анионообменная хроматографическая колонка может, например, соответствовать колонке BioPro Q75. Определенный пример этого способа раскрыт в Примере 4. В таком способе катионообменный мембранный адсорбер может, например, соответствовать мембранному адсорберу Sartobind S, и/или анионообменный хроматографический мембранный адсорбер может, например, соответствовать мембранному адсорберу Sartobind Q. Определенный пример этого метода раскрыт в Примере 8.

В таком способе обработки, выполняемые между стадиями, требующие ручной операции и открывания системы очистки (например, разбавление в инактивационном сосуде, фильтрация после инактивации и регулирование pH в сосуде с пулом белка A), полностью отсутствуют.

Хроматографическая матрица, используемая в настоящих способах, может быть хроматографической матрицей со сниженной бионагрузкой (например, хроматографической матрицей, обработанной гамма-излучением). Примеры хроматографической матрицы со сниженной бионагрузкой раскрыты в предварительной заявке на патент США 61/928,906, которая полностью включена в настоящую заявку посредством отсылки.

Способ согласно изобретению может быть, таким образом, выполнен в MCCS, включающей первую, вторую и третью хроматографические матрицы.

Термин "многоколоночная система хроматографии" или "MCCS" означает систему в общей сложности из двух или более связанных между собой или переключающихся хроматографических колонок и/или хроматографических мембран. Неограничивающим примером многоколоночной системы хроматографии является периодическая противоточная система хроматографии (PCCS), содержащая в общей сложности две или более связанных между собой или переключающихся хроматографических колонок и/или хроматографических мембран. Дополнительные примеры многоколоночных систем хроматографии описаны в настоящей заявке и известны в уровне техники.

Хроматографическая колонка(и) и/или хроматографическая мембрана(ы), присутствующие в MCCS, могут быть связаны или перемещены относительно друг друга с помощью переключающего механизма (например, переключающего колонки механизма). MCCS также может включать один или более (например, два, три, четыре или пять) насосов (например, автоматических, например, автоматических перистальтических насосов). Переключающие колонки события могут быть вызваны обнаружением уровня очищаемого белка, детектируемого по УФ поглощению, соответствующему определенному уровню белка в жидкости, проходящей через MCCS (например, в поступающей на вход и/или в элюате из одной или более хроматографических колонок и/или хроматографических мембран в MCCS), определенным объемом жидкости (например, буфера) или определенным истекшим периодом времени. Переключение колонки в целом означает механизм, посредством которого по меньшей мере две различные хроматографические колонки и/или хроматографические мембраны в MCCS (например, две или более различных хроматографических колонок и/или хроматографических мембран, присутствующих в MCCS) могут перейти в другую стадию (например, уравновешивание, нанесение, элюирование или промывку) по существу в то же время в течение, по меньшей мере, части процесса.

Хроматографическая колонка(и) и/или хроматографическая мембрана(ы), присутствующие в MCCS, могут иметь одну или более из любых примерных форм, размеров, объемов (объемов слоя) и/или технологических функций, описанных в настоящей заявке.

Хроматографическая колонка(и) и/или хроматографическая мембрана(ы), присутствующие в MCCS, могут содержать одну или более из любых примерных смол, описанных в настоящей заявке или известных в уровне техники. Например, смола, содержащаяся в одной или более хроматографических колонках и/или хроматографических мембранах, присутствующих в MCCS, может быть смолой, в которой используется механизм захвата (например, механизм захвата посредством связывания белком A, механизм захвата посредством связывания белком G, механизм захвата посредством связывания антителом или фрагментом антитела, механизм захвата посредством связывания субстратом, механизм захвата посредством связывания кофактором, механизм захвата посредством связывания аптамером и/или механизм захвата посредством связывания меткой). Смола, содержащаяся в одной или более хроматографических колонках и/или хроматографических мембранах в MCCS, может быть катионообменной смолой, анионообменной смолой, смолой с эффектом молекулярного сита или смолой с эффектом гидрофобных взаимодействий или их любой комбинацией. Дополнительные примеры смол, которые могут использоваться для очистки белка, известны в уровне техники и могут содержаться в одной или более хроматографических колонок и/или хроматографических мембран, присутствующих в MCCS. Хроматографическая колонка(и) и/или хроматографические мембраны, присутствующие в MCCS, могут содержать одинаковые и/или разные смолы (например, любую из смол, описанных в настоящей заявке или известные в уровне техники, используемые при очистке рекомбинантных белков).

Хроматографическая колонка(и) и/или хроматографическая смола(ы), присутствующие в MCCS, могут выполнять одну или более типовых операций (например, захват белка, очистку белка, окончательную очистку белка, инактивацию вирусов, регулирование концентрации ионов и/или pH жидкости, содержащей белок, или фильтрование жидкости, содержащей белок). В неограничивающих примерах MCCS может выполнять типовые операции захвата белка из жидкости (например, жидкой среды культивирования) и инактивации вирусов, присутствующих в жидкости, содержащей рекомбинантный терапевтический белок. MCCS может выполнять любые комбинации двух или более типовых операций, описанных в настоящей заявке или известных в уровне техники.

MCCS может быть оборудована: одним или более (например, двумя, тремя, четырьмя, пятью, шестью, семью, восемью, девятью или десятью) УФ-мониторами, одним или более (например, двумя, тремя, четырьмя, пятью, шестью, семью, восемью, девятью или десятью) клапанами, одним или более (например, двумя, тремя, четырьмя, пятью, шестью, семью, восемью, девятью или десятью) pH-метрами и/или одним или более (например, двумя, тремя, четырьмя, пятью, шестью, семью, восемью, девятью или десятью) измерителями электропроводности. MCCS может быть также снабжена операционной системой, которая использует программное обеспечение (например, программу на основе Unicorn, GE Healthcare, Piscataway, NJ) для определения, когда требуется переключение колонки (например, на основе УФ поглощения, объема жидкости или прошедшего времени), и осуществления (инициирования) переключающих колонку событий. В примерах, где MCCS включает один или более УФ детекторов, УФ детекторы могут быть расположены необязательно на входе в одну или более (например, две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять или десять) хроматографических колонок и/или хроматографических мембран в MCCS и/или на выходе из одной или более хроматографических колонок и/или хроматографических мембран в MCCS.

MCCS может дополнительно включать одну или более (например, две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать, двенадцать, тринадцать, четырнадцать, пятнадцать, шестнадцать, семнадцать, восемнадцать, девятнадцать, двадцать, двадцать одну, двадцать две, двадцать три или двадцать четыре) поточных емкостей для регулирования состава буфера и/или емкостей с буфером. В других примерах MCCS может включать один или более (например, два, три, четыре, пять или шесть) буферные резервуары, которые могут содержать жидкость, которая не может полностью пройти в одну или больше хроматографических колонок и/или хроматографических мембран в MCCS. Системы, описанные в настоящей заявке, могут содержать один или более буферных резервуаров. Другие примеры систем, описанных в настоящей заявке, не включают буферный резервуар.

MCCS могут включать вход, через который жидкость (например, жидкая среда культивирования, которая по существу не содержит клеток), может поступать в указанную MCCS. Вход может быть любой структурой, известной в уровне техники для таких целей. Он может включать, например, резьбу, рифление или уплотнение, которые позволяют подсоединить линию подачи жидкости таким образом, что после подсоединения линии подачи жидкости к входу жидкость будет поступать в MCCS через вход без значительной утечки жидкости из входа. Неограничивающие входы, которые могут использоваться в существующих системах, известны и будут знакомы специалистам. Некоторые примеры систем, представленных в настоящей заявке, также включают биореактор, который обладает возможностью жидкостного соединения с входом MCCS. Любой из примеров биореакторов, описанных в настоящей заявке или известных в уровне техники, может использоваться в существующих системах.

MCCS могут включать выход, через который белок может выходить из системы. Выход может включать, например, резьбу, рифление или уплотнение, которые позволяют подсоединить линию подачи жидкости или сосуд, предназначенный для приема или хранения белка. Выход может содержать поверхность, которая может использоваться для герметичного присоединения стерильного сосуда или другой подобной емкости для хранения к выходу, что позволяет белку поступать непосредственно в стерильный сосуд или емкость для хранения. Неограничивающие выходы, которые могут использоваться в существующих системах, известны и будут знакомы специалистам.

Некоторые примеры систем, представленные в настоящей заявке, также включают насосную систему. Насосная система может включать одно или более следующего: один или более (например, два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять или десять) насосов (например, любой из насосов, описанных в настоящей заявке или известных в уровне техники), один или более (например, два, три, четыре или пять) фильтров (например, любой из фильтров, описанных в настоящей заявке или известных в уровне техники), один или более (например, два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять или десять), УФ-детекторов и один или более (например, два, три, четыре или пять) буферных резервуаров.

Некоторые примеры систем, описанных в настоящей заявке, также включают дополнительную линию подачи жидкости, связанную с линией подачи жидкости между насосом и входом MCCS, где один конец дополнительной линии подачи жидкости жидкостно соединен с биореактором, и другой конец жидкостно соединен с линией подачи жидкости между насосом и входом. Эта дополнительная линия подачи жидкости может включать фильтр, который способен удалять клетки из жидкой среды культивирования, удаляемой из биореактора (например, система улавливания клеток ATF). В некоторых примерах эта конкретная линия подачи жидкости может включать один или более (например, два, три или четыре) насосов (например, любой из насосов, описанных в настоящей заявке или известный в уровне техники) и/или один или более (например, два, три или четыре) буферных резервуаров (например, любой из примерных буферных резервуаров, описанных в настоящей заявке), где указанные насос(ы) и/или буферный резервуар(ы) находятся в жидкостном соединении с жидкостью, содержащейся в линии подачи жидкости.

Системы, описанные в настоящей заявке, необязательно могут включать линию подачи жидкости, расположенную между последней хроматографической колонкой или хроматографической мембраной и выходом. Системы, описанные в настоящей заявке, могут дополнительно включать один или более фильтров в жидкостном соединении с линией подачи жидкости, расположенной между последней хроматографической колонкой или хроматографической мембраной и выпускным отверстием, при этом фильтр может удалять, например, осажденный материал, частицы или бактерии из жидкости, содержащейся в линии подачи жидкости, расположенной между последней хроматографической колонкой или хроматографической мембраной в MCCS и выходом.

Способ согласно изобретению можно осуществлять в непрерывном режиме. Другими словами, способ согласно изобретению может быть непрерывным способом очистки белка из раствора.

Термин "непрерывный способ" или "способ в непрерывном режиме" означает способ, в котором жидкость непрерывно проходит, по меньшей мере, через часть системы.

Под термином "жидкость" в настоящем описании понимается любая жидкость, такая как раствор, содержащий очищаемый белок, буфер или раствор с низким или кислым pH для инактивации вирусов.

В предпочтительном варианте осуществления через первую, вторую и третью матрицы непрерывно проходит жидкость.

Термин "интегрированный процесс" означает процесс, который выполняют, используя структурные элементы, которые функционируют совместно, достигая определенного результата (например, получение очищенного белка из жидкой среды культивирования).

Примеры интегрированного процесса раскрыты в предварительной заявке на патент США 61/775,060 (полностью включенной в настоящую заявку посредством отсылки).

Масштабирование способа согласно изобретению может также включать использование переключения колонки и/или увеличение объема слоя в каждой хроматографической колонке.

Кроме того, способ согласно изобретению можно осуществлять в закрытой системе с первой стадии способа до последней стадии. В частности, хроматографические стадии и, необязательно, стадию(и) фильтрации (например, стадию нанофильтрация и/или стадию ультрафильтрации и диафильтрации) можно проводить в закрытой системе. В определенном варианте осуществления способа согласно изобретению раствор, включающий белки, пропускают порциями через три хроматографических матрицы, в особенности через три хроматографических колонки или мембранных адсорбера, при этом каждый проход части раствора соответствует циклу. Белки, выделенные в конце каждого цикла, затем собирают и объединяют в пулы. Определенные примеры этого способа раскрыты в Примерах 5, 6 и 8. В таком способе колонка или мембранный адсорбер хроматографической стадии используют несколько раз и, необязательно, очищают с использованием, например, буфера для очистки, как определено выше, что приводит, таким образом, к уменьшению требуемого количества смолы или мембранных адсорбирующих устройств и буфера. Например, последовательность из 3-50 циклов (например, 3-30 циклов, 5-25 циклов, 10-20 циклов или 15 циклов) можно выполнять непрерывно. Более конкретно, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 циклов могут выполняться в непрерывном режиме, после чего производится очистка этих 3 колонок или мембранных адсорберов (например, при использовании буфера для очистки). Это можно повторить, например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более раз.

Способ, раскрытый в настоящей заявке, может применяться для выделения очищенных белков. При использовании в настоящем описании, "очищенный" относится к чистоте, которая обеспечивает возможность эффективного применения белка in vitro, ex vivo или in vivo. Чтобы белок можно было применять in vitro, ex vivo или in vivo, он должен по существу не содержать примесей, других белков и/или химических веществ, которые могут мешать применению данного белка в таких областях, или которые, по меньшей мере, будут нежелательны для включения с целевым белком. Такие области применения включают получение терапевтических композиций, введение белка в терапевтической композиции и другие способы, раскрытые в настоящем описании. Предпочтительно "очищенный" белок, как указано в настоящем описании, является белком, который может быть получен любым способом (то есть путем прямой очистки из природного источника, рекомбинантно или искусственно), и при этом он очищен от других белковых компонентов таким образом, что данный белок составляет по меньшей мере приблизительно 80% вес/вес от суммарного белка в данной композиции, и более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 85%, и более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 90%, и более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 91%, и более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 92%, и более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 93%, и более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 94%, и более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 95%, и более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 96%, и более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 97%, и более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 98%, и более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 99% вес/вес от суммарного белка в данной композиции.

При использовании в настоящем описании, "неочищенный белок" относится к белку, который может быть получен любым способом (то есть путем прямой очистки из природного источника, рекомбинантно или искусственно), и при этом он очищен от других белковых компонентов таким образом, что данный белок составляет меньше чем приблизительно 80% вес/вес от суммарного белка в данной композиции.

В конкретном варианте осуществления способ очистки белка из раствора согласно изобретению включает:

(a) первую хроматографическую стадию, включающую:

(i) пропускание уравновешивающего буфера через колонку с белком A;

(ii) пропускание раствора через колонку с белком A;

(iii) пропускание уравновешивающего буфера через колонку с белком A;

(iv) пропускание промывочного буфера через колонку с белком A;

(v) пропускание уравновешивающего буфера через колонку с белком A; и

(vi) элюирование неочищенного белкового элюента из колонки с белком A при использовании первого элюирующего буфера;

(b) вторую хроматографическую стадию, включающую:

(i) пропускание уравновешивающего буфера через хроматографическую колонку с мультимодальной смолой;

(ii) пропускание неочищенного белкового элюента из стадии (a) через хроматографическую колонку с мультимодальной смолой;

(iii) пропускание уравновешивающего буфера через хроматографическую колонку с мультимодальной смолой; и

(iv) элюирование белкового элюата из хроматографической колонки с мультимодальной смолой при использовании второго элюирующего буфера;

(c) третью хроматографическую стадию, включающую:

(i) пропускание уравновешивающего буфера через анионообменную хроматографическую колонку;

(ii) пропускание белкового элюата из стадии (b) через анионообменную хроматографическую колонку в режиме пропускания непрерывного потока; и

(iii) выделение очищенного белка из элюата с анионообменной хроматографической колонки,

где уравновешивающий буфер включает 15-25 мМ бис-триса и 15-25 мМ NaCl, доведенные до pH 7-8 уксусной кислотой, промывочный буфер включает 15-25 мМ бис-триса и 0,9-1,1 М NaCl, доведенные до pH 7-8 уксусной кислотой, первый элюирующий буфер включает 15-25 мМ бис-триса и 15-25 мМ NaCl, доведенные до pH 3-4 уксусной кислотой, и второй элюирующий буфер включает 15-25 мМ бис-триса, 40-50 мМ NaCl и 20-30 мМ NH₄Cl, доведенные до pH 7-8 уксусной кислотой.

В другом варианте осуществления способ очистки белка из раствора согласно изобретению включает:

(a) первую хроматографическую стадию, включающую:

(i) пропускание уравновешивающего буфера через колонку с белком A;

(ii) пропускание части раствора через колонку с белком A;

(iii) пропускание уравновешивающего буфера через колонку с белком A;

(iv) пропускание промывочного буфера через колонку с белком A;

(v) пропускание уравновешивающего буфера через колонку с белком A; и

(vi) элюирование неочищенного белкового элюента из колонки с белком A при использовании первого элюирующего буфера;

(b) вторую хроматографическую стадию, включающую:

(i) пропускание уравновешивающего буфера через хроматографическую колонку с мультимодальной смолой;

(ii) пропускание неочищенного белкового элюента из стадии (a) через хроматографическую колонку с мультимодальной смолой;

(iii) пропускание уравновешивающего буфера через хроматографическую колонку с мультимодальной смолой; и

(iv) элюирование белкового элюата из хроматографической колонки с мультимодальной смолой при использовании второго элюирующего буфера;

(c) третью хроматографическую стадию, включающую:

(i) пропускание уравновешивающего буфера через хроматографическую колонку анионообменн;

(ii) пропускание белкового элюата из стадии (b) через анионообменную хроматографическую колонку в режиме пропускания непрерывного потока; и

(iii) выделение очищенного белка из элюата с анионообменной хроматографической колонки,

(d) последовательный повтор стадий a), b) и c) с использованием другой части раствора до полного использования всего раствора, и

(e) сбор очищенных белков, выделенных в конце каждой третьей хроматографической стадии;

где уравновешивающий буфер включает 15-25 мМ бис-триса и 15-25 мМ NaCl, доведенные до pH 7-8 уксусной кислотой, промывочный буфер включает 15-25 мМ бис-триса и 0,9-1,1 М NaCl, доведенные до pH 7-8 уксусной кислотой, первый элюирующий буфер включает 15-25 мМ бис-триса и 15-25 мМ NaCl, доведенные до pH 3-4 уксусной кислотой, и второй элюирующий буфер включает 15-25 мМ бис-триса, 40-50 мМ NaCl и 20-30 мМ NH₄Cl, доведенные до pH 7-8 уксусной кислотой.

В другом конкретном варианте осуществления способ очистки белка из раствора согласно изобретению включает:

(a) первую хроматографическую стадию, включающую:

(i) пропускание уравновешивающего буфера через мембранный адсорбер с белком A;

(ii) пропускание раствора через мембранный адсорбер с белком A;

(iii) пропускание уравновешивающего буфера через мембранный адсорбер с белком A;

(iv) пропускание промывочного буфера через мембранный адсорбер с белком A;

(v) пропускание уравновешивающего буфера через мембранный адсорбер с белком A; и

(vi) элюирование неочищенного белкового элюента из мембранного адсорбера с белком A при использовании первого элюирующего буфера;

(b) вторую хроматографическую стадию, включающую:

(i) пропускание уравновешивающего буфера через катионообменный мембранный адсорбер;

(ii) пропускание неочищенного белкового элюента из стадии (a) через катионообменный мембранный адсорбер;

(iii) пропускание уравновешивающего буфера через катионообменный мембранный адсорбер; и

(iv) элюирование белкового элюата из катионообменного мембранного адсорбера при использовании второго элюирующего буфера;

(c) третью хроматографическую стадию, включающую:

(i) пропускание уравновешивающего буфера через анионообменный мембранный адсорбер;

(ii) пропускание белкового элюата из стадии (b) через анионообменный мембранный адсорбер в режиме пропускания непрерывного потока; и

(iii) выделение очищенного белка из элюата с анионообменного мембранного адсорбера,

где уравновешивающий буфер включает 15-25 мМ бис-триса и 15-25 мМ NaCl, доведенные до pH 7-8 уксусной кислотой, промывочный буфер включает 15-25 мМ бис-триса и 0,9-1,1 М NaCl, доведенные до pH 7-8 уксусной кислотой, первый элюирующий буфер включает 15-25 мМ бис-триса и 15-25 мМ NaCl, доведенные до pH 3-4 уксусной кислотой, и второй элюирующий буфер включает 15-25 мМ бис-триса, 50-150 мМ NaCl и 20-30 мМ NH₄Cl, доведенные до pH 6-7 уксусной кислотой.

В другом варианте осуществления способ очистки белка из раствора согласно изобретению включает:

(a) первую хроматографическую стадию, включающую:

(i) пропускание уравновешивающего буфера через мембранный адсорбер с белком A;

(ii) пропускание части раствора через мембранный адсорбер с белком A;

(iii) пропускание уравновешивающего буфера через мембранный адсорбер с белком A;

(iv) пропускание промывочного буфера через мембранный адсорбер с белком A;

(v) пропускание уравновешивающего буфера через мембранный адсорбер с белком A; и

(vi) элюирование неочищенного белкового элюента из мембранного адсорбера с белком A при использовании первого элюирующего буфера;

b) второй хроматографической стадии, включающей:

(i) пропускание уравновешивающего буфера через катионообменный мембранный адсорбер;

(ii) пропускание неочищенного белкового элюента от стадии (a) через катионообменный мембранный адсорбер;

(iii) пропускание уравновешивающего буфера через катионообменный мембранный адсорбер; и

(iv) элюирование белкового элюата от катионообменного мембранного адсорбера при использовании второго элюирующего буфера;

(c) третью хроматографическую стадию, включающую:

(i) пропускание уравновешивающего буфера через анионообменный мембранный адсорбер;

(ii) пропускание белкового элюата из стадии (b) через анионообменный мембранный адсорбер в режиме пропускания непрерывного потока; и

(iii) выделение очищенного белка из элюата с анионообменного мембранного адсорбера,

(d) последовательный повтор стадий a), b) и c) с использованием другой части раствора до полного использования всего раствора, и

(e) сбор очищенных белков, выделенных в конце каждой третьей хроматографической стадии;

где уравновешивающий буфер включает 15-25 мМ бис-триса и 15-25 мМ NaCl, доведенные до pH 7-8 уксусной кислотой, промывочный буфер включает 15-25 мМ бис-триса и 0,9-1,1 М NaCl, доведенные до pH 7-8 уксусной кислотой, первый элюирующий буфер включает 15-25 мМ бис-триса и 15-25 мМ NaCl, доведенные до pH 3-4 уксусной кислотой, и второй элюирующий буфер включает 15-25 мМ бис-триса, 50-150 мМ NaCl и 20-30 мМ NH₄Cl, доведенные до pH 6-7 уксусной кислотой.

Способ очистки белка из раствора может включить по меньшей мере одну стадию фильтрации, такую как стадия нанофильтрации, стадия ультрафильтрации и/или стадия диафильтрация. Стадия(и) фильтрации может быть выполнена до и/или после хроматографических стадий. При очистке рекомбинантных белков в фармацевтических целях, хроматографические стадии обычно сопровождаются стадиями фильтрации. Таким образом, способ изобретения может дополнительно включить стадию нанофильтрации после стадии (c). Стадия ультрафильтрации и диафильтрации может быть также выполнена после стадии нанофильтрации. При использовании в настоящем описании, "ультрафильтрация" или "УФ" относится к методике фильтрации с использованием полупроницаемой мембраны для физического и селективного удаления частиц и/или ионов из раствора на основе размера частиц и размера пор в УФ мембране. При использовании в настоящем описании, "нанофильтрация" относится к фильтрации раствора через нанофильтр, который используется для удаления, например, вирусных частиц. При использовании в настоящем описании, "диафильтрация" относится к методике, в которой ультрафильтрационные мембраны используются для полного удаления, замены или понижения концентрации солей или растворителей в растворах.

Способ согласно изобретению может также дополнительно включать по меньшей мере одну стадию инактивации вирусов. Указанная по меньшей мере одна стадия инактивации вирусов может быть выполнена в любой стадии способа согласно изобретению, например, перед стадией (a), после стадии (a), после стадии (b), после стадии (c), после стадии нанофильтрации и/или после стадии диафильтрации и ультрафильтрации. Такая стадия инактивации вирусов обычно может быть стадией инактивации при низком или кислотном pH. При использовании в настоящем описании, "инактивация при низком или кислотном pH" относится к методике инактивации вирусов с использованием кислотного pH для денатурирации вирусов, в частности оболочечных вирусов. Как правило, стадию инактивации при низком или кислотном pH проводят при инкубировании выделенных белков при pH приблизительно 3,0-5,0 (например, от приблизительно 3,5 до приблизительно 4,5, от приблизительно 3,5 до приблизительно 4,25, от приблизительно 3,5 до приблизительно 4,0, например 4,0) в течение по меньшей мере 30 минут (например, в течение периода продолжительностью от 1 часа до 21 дня, в течение периода продолжительностью от приблизительно 2 часов до 21 дня или в течение периода продолжительностью от приблизительно 4 часов до 21 дня). Например, стадию инактивации при низком или кислотном pH проводят при инкубировании выделенных белков при pH 4 в течение, например, от 6 часов до 21 дня.

Способ согласно изобретению может также включать, перед стадией (a), стадию получения жидкой среды культивирования, содержащей очищаемый белок, который по существу не содержит клеток, где указанная жидкая среда культивирования поступает в первую хроматографическую матрицу.

Например, способ очистки белка из раствора согласно изобретению может включать:

(пре-a) стадию получения жидкой среды культивирования, содержащей очищаемый белок, который по существу не содержит клеток,

(a) первую хроматографическую стадию, включающую:

- пропускание указанной жидкой среды культивирования стадии (пре-a) через первую хроматографическую матрицу;

- элюирование неочищенного белкового элюента из первой хроматографической матрицы при использовании первого элюирующего буфера;

(b) вторую хроматографическую стадию, включающую:

- пропускание неочищенного белкового элюента, полученного в конце стадии (a), через вторую хроматографическую матрицу;

- элюирование белкового элюата с второй хроматографической матрицы при использовании второго элюирующего буфера; и

(c) третью хроматографическую стадию, включающую:

- пропускание белкового элюата, полученного в конце стадии (b), через третью хроматографическую матрицу в режиме пропускания непрерывного потока;

- выделение очищенного белка из элюата с третьей хроматографической матрицы;

где каждый из буферов включает бис-трис.

Наконец, очищенный белок может быть включен в композицию, подходящую для хранения, и/или в фармацевтическую композицию, подходящую для введения животным и/или людям.

Одним из многочисленных преимуществ раскрытого способа является то, что он позволяет получать очень чистый белок с хорошими выходами. Очищенный белок, который выделен с применением способа согласно изобретению, может, например, демонстрировать чистоту по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,2%, 99,5% или 99,9%. Более конкретно, одним из многочисленных преимуществ раскрытого способа является то, что он позволяет получать раствор очень чистого белка, содержащего сниженное количество контаминирующей ДНК, высокомолекулярных (ВММ) соединений (которые соответствуют белковым агрегатам) и/или белков клетки-хозяина (БКХ). Раствор, включающий очищенный белок, который выделен с применением способа согласно изобретению, может, например, демонстрировать количество контаминирующей ДНК менее 0,4 млрд.д., менее 0,3 млрд.д., менее 0,2 млрд.д. или менее 0,1 млрд.д. Раствор, включающий очищенный белок, который выделен с применением способа согласно изобретению, может также, например, демонстрировать концентрацию ВММ соединении менее 0,9%, менее 0,8%, менее 0,7%, менее 0,6%, менее 0,5% или менее 0,4%. Раствор, включающий очищенный белок, который выделен с применением способа согласно изобретению, может также, например, демонстрировать концентрацию БКХ менее 23 м.д., менее 22 м.д., менее 21 м.д., менее 20 м.д., менее 19 м.д. или менее 18 м.д. Кроме того, способ согласно изобретению может позволять выделять очищенный белок с выходом по меньшей мере 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%.

Другой аспект изобретения относится к способу приготовления буферов, подходящих для применения в способе согласно изобретению. Действительно, все эти буферы могут быть очень легко и быстро приготовлены из одного исходного раствора.

Такой способ приготовления буферов может включать или состоять из следующих стадий:

i) получение раствора (например, 100 л раствора) с конечной концентрацией 15-25 мМ (например, 20 мМ) бис-триса и 15-25 мМ (например, 20 мМ) NaCl;

ii) доведение pH раствора до значения в пределах 7-8 (например, 7,4) уксусной кислотой;

iii) сбор одной четверти раствора с получением в результате уравновешивающего буфера;

iv) доведение pH одной четверти из оставшихся трех четвертей раствора из стадии (iii) до значения в пределах 3-4 (например, 3,7) уксусной кислотой с получением в результате элюирующего буфера;

v) сбор одной четверти из оставшихся двух четвертей раствора из стадии (iii), добавление NaCl с получением конечной концентрации NaCl в пределах 40-50 мМ (например, 45 мМ), затем добавление NH₄Cl с получением четвертей концентрации NH₄Cl в пределах 20-30 мМ (например, 25 мМ) и доведение pH до значения в пределах 7-8 (например, 7,25) уксусной кислотой с получением в результате другого элюирующего буфера;

vi) добавление NaCl к оставшейся четверти раствора из стадии (iii) и добавление NaCl с получением конечной концентрации NaCl в пределах 0,9-1,1 М (например, 1M), с получением в результате промывочного буфера.

Такой способ схематично изображен на Фигуре 1.

Другой способ приготовления буферов может включать или состоять из следующих стадий:

i) получение раствора (например, 100 л раствора) с конечной концентрацией 15-25 мМ (например, 20 мМ) бис-триса и 15-25 мМ (например, 20 мМ) NaCl;

ii) доведение pH раствора до значения в пределах 7-8 (например, 7,4) уксусной кислотой;

iii) сбор одной четверти раствора с получением в результате уравновешивающего буфера;

iv) доведение pH одной четверти из оставшихся трех четвертей раствора из стадии (iii) до значения в пределах 3-4 (например, 3,7) уксусной кислотой с получением в результате элюирующего буфера;

v) сбор одной четверти из оставшихся двух четвертей раствора из стадии (iii), добавление NaCl с получением конечной концентрации NaCl в пределах 70-90 мМ (например, 80 мМ), затем добавление NH₄Cl с получением конечной концентрации NH₄Cl, в пределах 20-30 мМ (например, 25 мМ) и доведение pH до значения в пределах 6-7 (например, 6,2) уксусной кислотой, с получением в результате другого элюирующего буфера;

vi) добавление NaCl к оставшейся четверти раствора из стадии (iii) и добавление NaCl с получением конечной концентрации NaCl в пределах 0,9-1,1 М (например, 1M), с получением в результате промывочного буфера.

Вышеуказанный способ приготовления буферов может также соответствовать самой первой стадии способа согласно изобретению, перед выполнением трех хроматографических стадий.

Изобретение также относится к набору, включающему или состоящему из следующего:

(a) мультимодальная смола или катионообменная хроматографическая матрица, аффинная хроматографическая матрица, такая как матрица с белком A, и/или анионообменная хроматографическая матрица; и

(b) по меньшей мере один буфер согласно изобретению (например, включающий или состоящий из бис-триса, уксусной кислоты, NaCl, воды и, необязательно, NH₄Cl), и/или инструкции по приготовлению по меньшей мере одного буфера согласно изобретению (например, включающего или состоящего из бис-триса, уксусной кислоты, NaCl, воды и, необязательно, NH₄Cl).

В одном варианте осуществления набор включает или состоит из следующего:

(a) хроматографическая колонка с мультимодальной смолой, аффинная хроматографическая колонка, такая как колонка с белком A, и/или анионообменная хроматографическая колонка; и

(b) по меньшей мере один буфер согласно изобретению (например, включающий или состоящий из бис-триса, уксусной кислоты, NaCl, воды и, необязательно, NH₄Cl) и/или инструкции по приготовлению по меньшей мере одного буфера согласно изобретению (например, включающего или состоящего из бис-триса, уксусной кислоты, NaCl, воды и, необязательно, NH₄Cl).

В другом варианте осуществления набор включает или состоит из следующего:

(a) катионообменный мембранный адсорбер, аффинный хроматографический мембранный адсорбер, такой как мембранный адсорбер с белком A, и/или анионообменный хроматографический мембранный адсорбер; и

(b) по меньшей мере один буфер согласно изобретению (например, включающий или состоящий из бис-триса, уксусной кислоты, NaCl, воды и, необязательно, NH₄Cl) и/или инструкции по приготовлению по меньшей мере одного буфера согласно изобретению (например, включающего или состоящего из бис-триса, уксусной кислоты, NaCl, воды и, необязательно, NH₄Cl).

ПРИМЕРЫ

Примеры, которые следуют ниже, дают представление относительно определенных вариантов осуществления раскрытого способа и их различных применений. Они представлены исключительно в поъяснительных целях и не должны рассматриваться как какое-либо ограничение объема изобретения.

Пример 1: Оптимизация буферов очистки

Буферы с бис-трисом могут предпочтительно использоваться в качестве буферов для хроматографической колонки с мультимодальной смолой.

Неочищенный белковый элюент, полученный после прохода через хроматографическую колонку с белком A, пропускали через хроматографическую колонку с мультимодальной смолой Capto MMC.

Эта смола способна фиксировать мАт даже при низком pH, как в случае мАт, полученных после хроматографической стадии на колонке с белком A. Однако эта смола также требует присутствия соли для получения хорошей элюции. Впрочем, слишком высокая концентрация соли нарушает стабильность мАт, так как она увеличивает уровень высокомолекулярных (ВММ) соединений в элюируемых образцах и слишком эффективна в отношении примесей, зафиксированных на среде, что приводит к снижению чистоты мАт.

Чтобы избежать этих недостатков, авторы изобретения разработали схему эксперимента (DOE) с целью уменьшить концентрацию соли и pH в элюирующем буфере стадии (a).

С этой целью авторы изобретения задействовали новый тип соли, хлорид аммония, который дает такую же удельную электропроводность, что и NaCl, но сильнее по показателю взаимодействий, чем Na⁺.

Параметры DOE

Центральный композиционный гранецентрированный план (CCF) применяли для оптимизации условий элюции с использованием программы MODDE 9 (UMETRICS). План CCF был составлен из полного факторного плана и трех центральных точек (во всех 17 экспериментах). Показатель pH при элюции изменялся от 7,2 до 7,8, и так же изменялась концентрация NaCl от 0 до 100 мМ, а концентрация NH₄Cl изменялась от 0 до 50 мМ.

Факторы и результаты приведены ниже.

Факторы
Назва-ние	Единицы	Тип	Использ.	Параметры	Трансф.	Точн.	Шкала MLR	Шкала PLS
	pHu	Колич.	Контрол.	7,2-7,8	Нет	Свободн.	Ортог.	Единич. диспер.
Na	мМ	Колич.	Контрол.	0-100	Нет	Свободн.	Ортог.	Единич. диспер.
NH4	мМ	Колич.	Контрол.	0-50	Нет	Свободн.	Ортог.	Единич. диспер.
Реакции
Назва-ние	Единицы	Трансф.	Шкала MLR	Шкала PLS	Тип	Min	Цель	Max
Выход	%	Нет	Нет	Единич. диспер.	Регуляр ный	0	95	100
БКХ	м.д.	Нет	Нет	Единич. диспер.	Регуляр ный	0	50	80
ВММ	%	Нет	Нет	Единич. диспер.	Регуляр ный	0	0,7	1
Сокращения: Колич.: количественный; Контрол.: контролируемый; Трансф.: трансформация; Точн.: точность; MLR: множественная линейная регрессия; Ортог.: ортогональный; PLS: частные наименьшие квадраты; Единич. диспер.: единичная дисперсия; БКХ: белок клетки-хозяина; ВММ: высокомолекулярные соединения

Эксперименты DOE

17 экспериментов представлены ниже.

	Условия	Препарат (250 мл)
Номер эксп.	Название эксп.	pH	Na (мМ)	NH4 (мМ)		NaCl (мг)	MH4Cl (мг)
1	N1	7,2	0	0	7,2	0	0
2	N2	7,8	0	0	7,8	0	0
3	N3	7,2	100	0	7,2	1,461	0
4	N4	7,8	100	0	7,8	1,461	0
5	N5	7,2	0	50	7,2	0	0,67
6	N6	7,8	0	50	7,8	0	0,67
7	N7	7,2	100	50	7,2	1,461	0,67
8	N8	7,8	100	50	7,8	1,461	0,67
9	N9	7,2	50	25	7,2	0,73	0,334
10	N10	7,8	50	25	7,8	0,73	0,334
11	N11	7,5	0	25	7,5	0	0,334
12	N12	7,5	100	25	7,5	1,761	0,334
13	N13	7,5	50	0	7,5	0,73	0
14	N14	7,5	50	50	7,5	0,73	0,67
15	N15	7,5	50	25	7,5	0,73	0,334
16	N16	7,5	50	25	7,5	0,73	0,334
17	N17	7,5	50	25	7,5	0,73	0,334

Результаты DOE

Как оказалось, во время циклов четыре эксперимента не согласовывались по выходу продуктов. В циклах N1 и N2 не было элюции из-за условий, а во время циклов N5 и N11 элюцию пришлось остановить после 10 объемов колонки (CV). Указанные эксперименты, таким образом, были исключены из анализа.

Все эксперименты подвергали ЭК-ВЭЖХ и БКХ анализу.

Результаты приведены ниже.

Номер эксп.	Название эксп.	Порядок циклов	Вкл/искл	pH	Na	NH4	Выход	БКХ	ВММ
1	N1	17	Искл.	7,2	0	0	0	0	0
2	N2	9	Искл.	7,8	0	0	0	0	0
3	N3	4	Вкл.	7,2	100	0	99,8	25	1,5
4	N4	3	Вкл.	7,8	100	0	94,9	42	1,84
5	N5	14	Искл.	7,2	0	50	14,6	98	0,19
6	N6	6	Вкл.	7,8	0	50	92,2	73	0,52
7	N7	8	Вкл.	7,2	100	50	99,1	34	1,94
8	N8	16	Вкл.	7,8	100	50	98,5	45	1,96
9	N9	5	Вкл.	7,2	50	25	95,6	25	0,76
10	N10	15	Вкл.	7,8	50	25	96,7	68	1,65
11	N11	1	Искл.	7,5	0	25	0,5	4370	0
12	N12	2	Вкл.	7,5	100	25	99,4	35	1,98
13	N13	13	Вкл.	7,5	50	0	87,4	38	0,43
14	N14	7	Вкл.	7,5	50	50	97,5	39	1,72
15	N15	11	Вкл.	7,5	50	25	97,2	39	1,22
16	N16	12	Вкл.	7,5	50	25	98,6	39	1,21
17	N17	10	Вкл.	7,5	50	25	95,8	42	1,21

С помощью средств прогнозирования MODDE 9.0 авторы изобретения определили область максимальной эффективности, которая означает зону, содержащую требуемые условия, фиксируя следующие результаты:

- выход: 95-100%

- БКХ: 20-30 м.д.

- ВММ: 0,4-0,8%

Области максимальной эффективности представлены на Фигуре 2 для трех типов концентрации NH₄Cl (0, 25 и 50 мМ).

Черная область представляет собой зону, содержащую первый удовлетворенный критерий: выход 90-100%. Светло-серая область представляет собой зону, содержащую выход и уровень БКХ (20-30 м.д.). Темно-серая область представляет собой область максимальной эффективности, которая является зоной, содержащей 3 удовлетворенных критерия: выход, уровень БКХ и уровень ВММ (0,4-0,8%).

Авторы изобретения, таким образом, продемонстрировали, с помощью данного графического описания, что чем больше NaCl использовали, тем больше увеличивались ВММ и выход. Кроме того, чем больше повышался pH, тем более важным становился уровень БКХ. Таким образом, авторы изобретения продемонстрировали, что для получения высокого выхода с хорошей чистотой элюцию следовало проводить при низком pH и низкой концентрации NaCl.

Авторы изобретения продемонстрировали, что NH₄Cl можно было использовать для снижения концентрации NaCl. Наиболее подходящая концентрация NH₄Cl составляла 25 мМ, давая область максимальной эффективности с больше чем 95% выходом, уровнем БКХ приблизительно 30 м.д. и уровнем ВММ 0,6%.

Авторы изобретения, таким образом, продемонстрировали, что оптимальным элюирующим буфером для второй хроматографической стадии являлся буфер, содержащий 20 мМ бис-трис, 45 мМ NaCl, 25 мМ NH₄Cl, уксусную кислоту в количестве, достаточном для получения pH 7,25.

Пример 2: Оптимизация третьей хроматографической стадии

Первоначально был разработан способ очистки, в котором мембрану Sartobind STIC из-за ее солестойкости использовали в качестве третьей стадии для окончательного удаления примесей после двух первых хроматографических стадий и для удаления вирусов.

Однако в непрерывном процессе каждую стадию проводят много раз. Одноразовые мембраны, такие как мембраны Sartobind STIC, нельзя использовать повторно. Поэтому авторы изобретения разработали альтернативную третью хроматографическую стадию, которая дает возможность выполнить окончательное удаление примесей, удаление вирусов и допускает многократное применение, и может, таким образом, использоваться в непрерывном процессе.

Три вида сред тестировали в качестве стадии конечной очистки:

- Sartobind STIC (Sartorius)

- Sartobind Q (Sartorius), и

- BioPro Q75 (YMC), смола AEX.

Во-первых, изобретатели проверили эти смолы после Capto MMC элюция (100 мМ NaCl, 20 мМ Бис-трис 8.0), чтобы оценить способность третьего стадии удалить примеси даже с 100-миллиметровыми условиями NaCl. Sartobind STIC и мембраны Q были оценены в однопроцессной операции. BioPro Q75 был оценен в трех циклах: 100 мм, 50-миллиметровая и 25-миллиметровая концентрация NaCl. Результаты показывают ниже.

	Sartobind STIC	Sartobind Q	BioPro Q75
Условия (мМ NaCl)	100	100	100/50/25
Размер (мл)	0,08	0,08	2,5
ВММ (%)	1,6	1,8	1,8/1,7/1,7
БКХ (м.д.)	9	6	20/15/14
ДНК (млрд.д.)	2,8	0,01	0,1

Эти результаты, таким образом, показывают, что мембрана Sartobind STIC, из-за ее солестойкости, обеспечивает хорошее удаление примесей. Однако увеличение давления во время цикла с 1 до 3 бар показывает, что такие мембраны нельзя использовать в технологии многократного применения, тем более, поскольку давление не снижается после промывки 1M NaCl и после очистки 0,1н NaOH. Наилучшие результаты, исходя из содержания примесей, были получены с мембраной Sartobind Q. Однако из-за трудностей с возможностью многократного применения и доступностью авторы изобретения сочли данную мембрану не подходящей.

Наконец, смола BioPro Q75 показала промежуточные результаты по удалению примесей. Кроме того, никакого давления во время циклов не наблюдали. Наконец, возможность многократного применения была гарантирована благодаря классической технологии с использованием смолы.

Авторы изобретения, таким образом, продемонстрировали, что анионообменная хроматографическая колонка являлась хорошей альтернативой мембране в стадиях окончательной очистки для выполнения очистки белка в непрерывном процессе.

Пример 3: Приготовление буферов очистки

В трехстадийном способе очистки, описанном в настоящей заявке, используется четыре буфера: уравновешивающий буфер, промывочный буфер и два элюирующего буфера, которые приготовлены из одного исходного раствора. Схема методики показана на Фигуре 1 и является следующей: экв. 20 мМ бис-трис и экв. 20 мМ NaCl доводили до 100 л водой для инъекций (WFI) и использовали в качестве исходного раствора, затем раствор доводили до pH 7,4 с использованием уксусной кислоты. Затем 25 л полученного раствора отбирали и хранили в качестве уравновешивающего буфера. Затем 25 л исходного раствора удаляли и добавляли экв. 1M NaCl. Полученные 25 л раствора являлись промывочным буфером. Затем 25 л исходного раствора доводили до pH 3,7 уксусной кислотой. Полученные 25 л раствора являлись первым элюирующим буфером. Затем оставшиеся 25 л исходного раствора доводили до pH 7,25 с использованием уксусной кислоты и добавляли экв. 45 мМ NaCl и экв. 25 мМ NH₄Cl, получив другой элюирующий буфер.

Пример 4: Мелкомасштабный непрерывный многостадийный процесс

Способ согласно изобретению использовали для очистки малых партий гуманизированного моноклонального антитела, которое специфично связывается с трансмембранным гликопротеином CD38 (мАт против CD38).

Материалы и методы

Материалы

- Первая стадия: 60 мл смолы Absolute High Cap в колонке XK50/20, модифицированной трубкой Fast Flow

- Второй стадия: 100 мл смолы Capto MMC в колонке XK50/20, модифицированной трубкой Fast Flow

- Третий стадия: 50 мл смолы BioPro Q75 в колонке XK50/20, модифицированной трубкой Fast Flow

- Трубка Akta Purifier, модифицированная трубкой PEEK с внутр. диам. 1,0 мм

Детали первой стадии

Колонку XK50/20 наполняли смолой Absolute High Cap (Ref. AbSHC 35 P1-A-V-00200). Конечный объем составлял 60 мл. ВЭТТ составила 13538 N/м, а асимметрия - 1,2.

Для этой стадии использовали три типа буферов:

- Уравновешивающий буфер, приготовленный с 20 мМ бис-трис, 2 мМ NaCl, уксусной кислотой до pH 7,4

- Промывочный буфер, приготовленный с 20 мМ бис-трис, 1 M NaCl, уксусной кислотой до pH 7,4

- Элюирующий буфер, приготовленный с 20 мМ бис-трис, 20 мМ NaCl, уксусной кислотой до pH 3,7.

Скорость потока, согласно размеру колонки, устанавливали на 24 мл/мин (ВП 2,5 мин) для стадий уравновешивания, промывки, нанесения и элюции.

Детали второй стадии

Колонку XK50/20 наполняли смолой Capto MMC (Ref 17-5317-02). Конечный объем составлял 100 мл. ВЭТТ составила 5686 N/м, а асимметрия - 1,3.

Для этой стадии использовали два типа буфера:

- Уравновешивающий буфер, приготовленный с 40 мМ бис-трис, 20 мМ NaCl, уксусной кислотой до pH 7,4

- Элюирующий буфер, приготовленный с 20 мМ бис-трис, 45 мМ NaCl, 25 мМ NH₄Cl, уксусной кислотой до pH 7,25.

Скорость потока, согласно размеру колонки, устанавливали на 24 мл/мин (ВП 4,8 мин) для стадий уравновешивания, нанесения и элюции.

Детали третьей стадии

Колонку XK50/20 наполняли смолой BioPro Q75 (Ref QAA0S75). Конечный объем составлял 50 мл. ВЭТТ составил 4875 N/м, а асимметрия - 1,6.

Для этой стадии использовали один тип буфера:

- Уравновешивающий буфер, приготовленный с 40 мМ бис-трис, 20 мМ NaCl, уксусной кислотой до pH 7,4.

Скорость потока, согласно размеру колонки, устанавливали на 24 мл/мин (ВП 2,1 мин) для стадий элюции и уравновешивания.

Результаты

2,325 г суммарного продукта (при концентрации 1,71 г/л) наносили на смолу Absolute High Cap. Общая длительность очистки 2,325 г составляла 2 ч 10 мин. Выделяли 2,125 г, что соответствовало выходу 91%. Технически очистка была успешно выполнена без обратного давления, даже если колонки использовали в последовательной конфигурации.

Результаты удаления примесей из конечного продукта, полученного данным 3-стадийным способом, приведены и сравнены с результатами, полученными 2-стадийным способом, описанным в PCT/EP2012/059528, ниже.

	Суммарный продукт	Конечный продукт 3-стадийного способа	Конечный продукт 2-стадийного способа
Выход (%)		91	92
ВММ (%)	8,7	0,4	0,9
БКХ (м.д.)	2,2×105	18	23
ДНК (млрд.д.)	3×106	<0,1	0,4

Авторы изобретения, таким образом, показали, что новый способ непрерывной многостадийной очистки был таким же эффективным, как 2-стадийный способ, описанный в PCT/EP2012/059528, применительно к тому же продукту.

Мелкомасштабные исследования проводили для оценки уровня примесей, полученного после каждой стадии. Авторы изобретения показали, что каждая стадия обеспечивала эффективное удаление примесей, как представлено ниже.

	ВММ (%)	БКХ (м.д.)	ДНК (млрд.д.)
Суммарный продукт	8,7	2,2×105	3×106
Absolute HC	1,0	1×103	2×104
Capto MMC	0,4	40	10
BioPro Q75	0,4	18	<0,1

Данный пример, таким образом, показывает, что непрерывный способ, разработанный авторами изобретения, так же эффективен, как и периодический способ.

Пример 5: Полномасштабный непрерывный многостадийный способ

Вышеуказанный способ был применен для крупномасштабной очистки гуманизированного моноклонального антитела, которое специфично связывается с трансмембранным гликопротеином CD38 (мАт против CD38).

Материалы и методы

Материалы

- Первая стадия: 50 мл смолы Absolute High Cap с динамической связывающей способностью (DBC) 50 мг/мл

- Вторая стадия: 100 мл смолы Capto MMC с DBC 35 мг/мл

- Третья стадия: 50 мл смолы BioPro Q75 с DBC 170 мг/мл

- Периодическая противоточная система производства GE (модифицированная система очистки Akta purifier), включающая соединенные вышеуказанные 3 колонки и обеспечивающая мониторинг всех колонок.

Методы

Последовательность из 15 циклов проводили непрерывно. Более конкретно, 5 циклов проводили в непрерывном режиме с последующей очисткой 3 колонок 0,1 Н NaOH, перед тем как начать новую последовательность.

Результаты

Последовательность обеспечила очистку 10 г мАт против CD38 за менее чем 500 мин.

29,5 г суммарного продукта наносили и выделяли 28 г очищенного мАт. Непрерывный многостадийный способ согласно изобретению, таким образом, обеспечил достижение среднего выхода 95%. Указанные 28 г очищенного мАт были получены за 25 ч.

Дополнительно результаты анализа конечного продукта были сопоставимы с результатами анализа конечного продукта, полученного 2-стадийным способом, описанным в PCT/EP2012/059528. Эти результаты анализа представлены ниже.

	Суммарный продукт	2-стадийный способ	Непрерывный многостадийный способ
Выход (%)		94	95
ВММ (%)	8,7	0,9	0,2
БКХ (м.д.)	2,2×105	4	5
ДНК (млрд.д.)	3×106	1,3	<0,1

Это также имело место, когда каждый стадия был проанализирован отдельно, как показано ниже.

	ВММ (%)	БКХ (м.д.)	ДНК (млрд.д.)
Суммарный продукт	8,7	2,2×105	3×106
Absolute HC	1,0	800	2×104
Capto MMC	0,2	40	10
BioPro Q75	0,2	5	<0,1

Дополнительно, как показано на Фигуре 3, тенденции не обнаружили значимых различий между каждым циклом.

Пример 6: Периодическая очистка в непрерывном режиме

Процесс, описанный в Примере 5, использовали для очистки мАт против CD38 в полномасштабной непрерывной партии.

В этом примере 43 л мАт в концентрации 1,66 г/л непрерывно очищали в течение 69 ч. Более конкретно, проводили 45 циклов, в каждом цикле наносили 960 мл осветленного продукта. Это привело к выделению 19,5 л очищенного мАт в концентрации 3,42 г/л, что соответствует выходу 93%, при использовании только 70 л буферов.

Ниже приведены характеристики этого способа очистки в сравнении с характеристиками способа 2-стадийной очистки, описанного в PCT/EP2012/059528.

	2-стадийный способ	Непрерывный многостадийный способ
Количество стадий	2	3
Количество циклов	1+1	45
Продолжительность (ч)	72	69
Используемая система	Akta process	Периодическая противоточная система
Объем буферов (л)	99,2	69,7
Тип колонок	BPG140	XK50/20
Объем смолы (л)	7,5	0,2

Таким образом, Непрерывный многостадийный способ согласно изобретению обеспечивает уменьшение объема используемых буферов на 33% и объема используемых смол на 97%.

Пример 7: Очистка различных моноклональных антител

В дополнение к гуманизированному антителу против CD38, непрерывный многостадийный способ, описанный выше, использовали для очистки дополнительных антител, а именно полностью человеческого антитела, которое специфично связывается с поверхностным бактериальным полисахаридом поли-N-ацетилглюкозамином (PNAG), моноклонального антитела, которое специфично связывается с раково-эмбриональный антиген связанной молекулой клеточной адгезии 5 (CEACAM5), и гуманизированного мАт 13C3, которое связывается с протофибриллярной формой человеческого β-амилоидного белка, как описано в Международной заявке WO 2009/065054.

Ниже показан общий выход и чистота, полученные при очистке этих трех антител.

Антитело	Общий выход (%)1	Чистота (%)
Гуманизированное мАт 13C3	86	96
мАт против PNAG	89	96
мАт против CD38	93	99
мАт против CEACAM5	92	96
1Общий выход соответствует выходу перед стадиями нанофильтрации, ультрафильтрации и диафильтрации.

В заключение при использовании четырех различных антител было подтверждено, что непрерывный многостадийный способ позволяет получать хорошие выходы очищенных антител с превосходной степенью чистоты, очищенные антитела, обладающие качеством, подходящим для введения человеку.

Пример 8: Непрерывный многостадийный способ очистки с использованием мембранных адсорберов

Способ согласно изобретению, в котором используются одноразовые мембранные адсорберы, применяли для крупномасштабной очистки гуманизированного моноклонального антитела, которое специфично связывается с CD38 (мАт против CD38).

Материалы и методы

Материалы

- Первая стадия: 4 мембранных адсорбера Sartobind с белком A (Sartorius) по 2 мл каждый

- Вторая стадия: 2 мембранных адсорбера Sartobind S "nano" (Sartorius) по 3 мл каждый

- Третья стадия: 1 мембранный адсорбер Sartobind Q "nano" (Sartorius) 3 мл

Используемые буферы были такими же, как описанные в Примере 4, за исключением элюирующего буфера второй стадии, приготовленного с 20 мМ бис-триса, 80 мМ NaCl, 25 мМ NH₄Cl, уксусной кислотой до pH 6,2.

Методы

Способ проводили с целью очистить 1,5 г антитела в 50 циклах, по 30 мг в каждом, с 3 стадиями в непрерывном режиме.

Кратко, мембранный адсорбер с белком A уравновешивали уравновешивающим буфером, затем наносили белок. После нанесения мембранный адсорбер снова уравновешивали перед элюцией первым элюирующим буфером. Элюат с мембранного адсорбера с белком A непосредственно наносили на катионообменный мембранный адсорбер. В то время как катионообменную мембрану уравновешивали уравновешивающим буфером, мембранный адсорбер с белком A очищали буфером для очистки перед следующим нанесением. Катионообменный мембранный адсорбер элюировали вторым элюирующим буфером и элюат непосредственно наносили на анионообменный мембранный адсорбер.

Результаты

Было возможно очистить 1,5 г антитела за 750 минут (15 минут управляемым). Выход составил приблизительно 80%.

Результаты анализа представлены ниже.

	Непрерывный многостадийный способ с использованием мембран
ВММ (%)	1,8
НММ (%)	0,6
БКХ (м.д.)	10
ДНК (млрд.д.)	0,9

Таким образом, непрерывный многостадийный способ согласно изобретению с использованием одноразовых мембранных адсорберов позволяет получить удовлетворительные уровни удаления примесей, в рамках внутренних требований, без дополнительной оптимизации способа и буферов по сравнению со способом, в котором используются смолы многократного применения.

Дополнительно, как показано на Фигуре 4, тенденции не обнаруживали значительных различий между каждым циклом. Таким образом, авторы изобретения неожиданно продемонстрировали, что одноразовые мембранные адсорберы фактически являлись стабильными и могли повторно использоваться более 50 циклов без какого-либо уменьшения эффективности.

Главные преимущества использования мембранных адсорберов, а не колонок, в способе согласно изобретению представлены ниже:

- при сопоставимом масштабе мембранные адсорберы могут использоваться при скорости потока, в 10 раз более высокой, чем в случае колонки, что существенно уменьшает продолжительность процесса. Например, 5 мл колонка, набитая смолой, будет использоваться при скорости потока 1 мл/мин, тогда как соответствующий 5 мл мембранный адсорбер будет использоваться при минимальной скорости потока 10 мл/мин. Соответственно, если способ с 3 хроматографическими стадиями согласно изобретению будет выполнен за 2 ч 30 при использовании 3 колонок, набитых смолами, он может быть закончен за 15 мин при использовании мембранных адсорберов.

- даже если их можно использовать многократно, мембранные адсорберы являются одноразовыми устройствами, которые могут, таким образом, быть выброшены после нанесения и не должны храниться длительный срок. Поэтому нет необходимости тестировать их, чтобы гарантировать долговременную стабильность.

- способ согласно изобретению, в котором используются мембранные адсорберы, является более дешевым, поскольку исключается стоимость колонки, набивки колонны и хранения колонки.

Пример 9: GMP масштабный непрерывный многостадийный способ

Вышеуказанный способ был применен для крупномасштабной очистки гуманизированного моноклонального антитела, которое специфично связывается с трансмембранным гликопротеином CD38 (мАт против CD38).

Материалы и методы

Материалы

- Первая стадия: 6 л смолы MabSelect Sure с динамической связывающей способностью (DBC) 35 мг/мл

- Вторая стадия: 6 л смолы Capto MMC с DBC 35 мг/мл

- Третий стадия: 6 л смолы BioPro Q75 с DBC 170 мг/мл

- 2 AktaProcess производства GE (управляющая 3 колонками) и один Flexact производства Sartorius (выполняющий стадию инактивации при низком pH между Первой стадией и Второй стадией), включающие вышеуказанные соединенные 3 колонки и обеспечивающие мониторинг всех колонок.

Методы

Последовательность из 7 циклов выполняли непрерывно.

Результаты

Последовательность обеспечивала очистку 1,3 кг мАт против CD38 за менее чем 16 ч.

Наносили 14,4 кг суммарного продукта и получали 1,30 кг очищенного мАт. Непрерывный многостадийный способ согласно изобретению, таким образом, обеспечивал достижение среднего выхода 90%. Эти 1,3 кг очищенного мАт были получены за 16 ч.

Для сравнения, очистка партии 500 л с применением 2-стадийного способа занимает 3 дня, при этом используют 20 л колонки.

Непрерывный способ согласно изобретению, таким образом, является достижением, позволяющим экономить время и расходные материалы (экономия более 66% объема смол).

Дополнительно, результаты анализа конечного продукта были сопоставимы с результатами анализа конечного продукта, полученного 2-стадийным способом, описанным в PCT/EP2012/059528. Эти результаты анализа представлены ниже.

	Суммарный продукт	Существующий способ (2-стадийный способ) и без обработки при низком pH	Непрерывный многостадийный способ
Выход (%)		95	90
ВММ (%)	6,5	0,9	1,3
БКХ (м.д.)	3×105	5	5
ДНК (млрд.д.)	3×106	<0,1	<0,1

1. Способ очистки антитела из раствора, включающий:

(a) первую хроматографическую стадию, включающую:

- пропускание указанного раствора через первую хроматографическую колонку, где указанная первая хроматографическая колонка является аффинной хроматографической колонкой с белком A;

- элюирование белкового элюата А с первой хроматографической колонки при использовании первого элюирующего буфера;

(b) вторую хроматографическую стадию, включающую:

- пропускание белкового элюата А, полученного в конце стадии (a), через вторую хроматографическую колонку, где указанная вторая хроматографическая колонка является колонкой с мультимодальной смолой;

- элюирование белкового элюата В со второй хроматографической колонки при использовании второго элюирующего буфера; и

(c) третью хроматографическую стадию, включающую:

- пропускание белкового элюата В, полученного в конце стадии (b), через третью хроматографическую колонку в режиме пропускания непрерывного потока, где указанная третья хроматографическая колонка является анионообменной колонкой;

- выделение очищенного антитела из элюата с третьей хроматографической колонки;

где каждый из буферов состоит из бис-триса, уксусной кислоты, NaCl, воды и, необязательно, NH₄Cl, и способ выполняется в непрерывном режиме.

2. Способ по п.1, где белковый элюат А, полученный в конце стадии (a), непосредственно пропускают через вторую хроматографическую колонку без проведения обработки, такой как регулирование pH, замена или разбавление буфера.

3. Способ по п.1 или 2, где белковый элюат В, полученный в конце стадии (b), непосредственно пропускают через третью хроматографическую колонку без проведения обработки, такой как регулирование pH, замена или разбавление буфера.

4. Способ по п.1, где способ осуществляют в закрытой системе от первой до последней стадии.

5. Способ по п.1, где каждая из двух первых хроматографических стадий включает:

- пропускание уравновешивающего буфера через хроматографическую колонку;

- пропускание раствора или белкового элюата А через хроматографическую колонку;

- пропускание уравновешивающего буфера через хроматографическую колонку;

- необязательно, пропускание промывочного буфера через хроматографическую колонку;

- необязательно, пропускание уравновешивающего буфера через хроматографическую колонку;

- элюирование белкового элюата А или белкового элюата с хроматографической колонки при использовании элюирующего буфера,

где каждый из буферов состоит из бис-триса, уксусной кислоты, NaCl, воды и, необязательно, NH₄Cl.

6. Способ по п.1, где указанный способ включает следующие стадии:

(a) первую хроматографическую стадию, включающую:

(i) пропускание уравновешивающего буфера через первую хроматографическую колонку, где указанная первая хроматографическая колонка является аффинной хроматографической колонкой с белком A;

(ii) пропускание раствора через первую хроматографическую колонку;

(iii) пропускание уравновешивающего буфера через первую хроматографическую колонку;

(iv) пропускание промывочного буфера через первую хроматографическую колонку;

(v) пропускание уравновешивающего буфера через первую хроматографическую колонку; и

(vi) элюирование белкового элюата А с первой хроматографической колонки при использовании первого элюирующего буфера;

(b) вторую хроматографическую стадию, включающую:

(i) пропускание уравновешивающего буфера через вторую хроматографическую колонку, где указанная вторая хроматографическая колонка является колонкой с мультимодальной смолой;

(ii) пропускание неочищенного белкового элюата А из стадии (a) через вторую хроматографическую колонку;

(iii) пропускание уравновешивающего буфера через вторую хроматографическую колонку; и

(iv) элюирование белкового элюата В со второй хроматографической колонки при использовании второго элюирующего буфера;

и

(c) третью хроматографическую стадию, включающую:

(i) пропускание уравновешивающего буфера через третью хроматографическую колонку, где указанная третья хроматографическая колонка является анионообменной колонкой;

(ii) пропускание белкового элюата В из стадии (b) через третью хроматографическую колонку в режиме пропускания непрерывного потока;

(iii) необязательно, пропускание промывочного буфера через третью хроматографическую колонку; и

(iv) выделение очищенного антитела из элюата с третьей хроматографической колонки.

7. Способ по п.1, где антителом является моноклональное антитело.

8. Способ по п.7, где указанное моноклональное антитело выбрано из группы, состоящей из антитела, которое специфично связывается с протофибриллярной формой человеческого β-амилоидного белка, антитела, которое специфично связывается с поверхностным бактериальным полисахаридом поли-N-ацетилглюкозамином (PNAG), антитела, которое специфично связывается с раково-эмбриональный антиген связанной молекулой клеточной адгезии 5 (CEACAM5), и антитела, которое специфично связывается с трансмембранным гликопротеином CD38.

9. Способ по п.1, дополнительно включающий стадия нанофильтрации после стадии (c).

10. Способ по п.9, дополнительно включающий стадию ультрафильтрации и диафильтрации после стадии нанофильтрации.

11. Способ по п.1, где первый элюирующий буфер включает 15-25 мМ бис-триса и 15-25 мМ NaCl, доведенные до pH 3-4 уксусной кислотой.

12. Способ по п.1, где второй элюирующий буфер включает 15-25 мМ бис-триса, 40-50 мМ NaCl и 20-30 мМ NH₄Cl, доведенные до pH 7-8 уксусной кислотой.

13. Способ по п.5, где уравновешивающий буфер включает 15-25 мМ бис-триса и 15-25 мМ NaCl, доведенные до pH 7-8 уксусной кислотой.

14. Способ по п.5, где промывочный буфер включает 15-25 мМ бис-триса и 0,9-1,1 М NaCl, доведенные до pH 7-8 уксусной кислотой.

15. Способ по п.1, где очищенное антитело выделено с выходом по меньшей мере 95%.

16. Способ по п.1, где выделенное очищенное антитело имеет чистоту по меньшей мере 99%.

17. Способ по п.1, дополнительно включающий стадию включения выделенного очищенного антитела в фармацевтическую композицию.