Набор даб-содержащего субстрата для окрашивания, производимого ферментом для мечения
Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к набору диаминобензидин (ДАБ)-содержащего субстрата для окрашивания с использованием антитела, меченного пероксидазой. Набор содержит хромофор-содержащий раствор (А), включающий от 0,1 до 10 мг/мл ДАБ в качестве хромофора пероксидазы и воду, и хромогенный реагент (В), содержащий от 0,1 до 10 мМ по меньшей мере одного хелатирующего средства, от 0,02 до 30 масс.% неионогенного поверхностно-активного вещества из алкилового эфира полиоксиэтилена (ПОЭ), от 3 до 300 мМ имидазола, от 0,001 до 0,3 масс.% пероксида водорода, и воду. Причем содержание указанных компонентов указано в пересчете на концентрацию в растворе ДАБ-содержащего субстрата для применения, приготовленного посредством смешивания или смешивания и разведения компонентных растворов набора. Хелатирующее средство выбрано из дигидрата динатриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты, диаммониевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты, гликолевого эфира диаминтетрауксусной кислоты и нитрилтриуксусной кислоты. Набор находится в системе из двух или более компонентов, причем по меньшей мере хромофор-содержащий раствор (А) и хромогенный реагент (В) хранятся раздельно. Изобретение позволяет увеличивать интенсивность специфического окрашивания и уменьшать осаждение вследствие агрегации ДАБ в растворе ДАБ-содержащего субстрата и неспецифическое окрашивание, такое как фоновое окрашивание, в хромогенной реакции с использованием антитела. 8 з.п. ф-лы, 7 табл., 20 пр.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Настоящее изобретение относится к набору диаминобензидин(ДАБ)-содержащего субстрата, который способен к подавлению осаждения вследствие агрегации ДАБ в растворе ДАБ-содержащего субстрата, уменьшая неспецифическое окрашивание, такое как фоновое окрашивание, и увеличивая интенсивность специфического окрашивания, в хромогенной реакции иммунного окрашивания, такого как иммуногистохимическое окрашивание (ИГХ) или иммуноцитохимическое окрашивание (ИЦХ), или при гибридизации in situ (ИСГ), с использованием антитела, меченного пероксидазой, с применением хромогенной жидкости, содержащей ДАБ и его сенсибилизатор имидазол.
ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
В области патологии или молекулярной биологии различные реагенты применяют в хромогенных жидкостях для ИГХ, ИЦХ или ИСГ в зависимости от ферментов для мечения для хромогенной реакции. Наиболее часто применяемым ферментом для мечения является пероксидаза, которая, в основном, представляет собой пероксидазу хрена растительного происхождения (ПХ) (молекулярная масса 40-45 кДа), как раскрыто в Непатентной Публикации 1. Донором водорода для ферментативной реакции ПХ для рутинного применения является раствор ДАБ-содержащего субстрата, содержащий диаминобензидин (ДАБ), который проявляется коричневым цветом, и пероксид водорода.
Раствор ДАБ-содержащего субстрата обычно обеспечивают в двух- или трех-компонентной системе (ДАБ и пероксид водорода обычно разделяют, чтобы избежать реакцию с ДАБ), и он является доступным для приобретения в виде высококонцентрированных исходных растворов для приготовления при применении или сухих таблеток. Примерами таких промышленных продуктов являются Жидкая ДАБ+ Система Хромогенного Субстрата (Код: К3468) (DAKO), DAB Quanto (Код: TA-XXX-QHDX) (THERMO SCIENTIFIC), Stable DAB (Код: 750118) (LIFE TECHNOLOGIES) и набор субстрата ДАБ (NICHIREI BIOSCIENCES, INC.). Составы большинства таких продуктов не раскрыты.
Непатентная Публикация 1 раскрывает применение имидазола в качестве сенсибилизатора для окрашивания ДАБ. Опыт показал, что имидазол является эффективным при ускорении реакции с ДАБ, но с другой стороны, вызывает агрегацию ДАБ, чтобы запустить осаждение ДАБ в реакционной жидкости после определенного периода времени. Было также показано, что высокий сенсибилизирующий эффект приводит к неспецифическому окрашиванию, такому как фоновое окрашивание, в области, отличающейся от целевого вещества в присутствии ПХ в ткани.
В Патентной Публикации 1 сообщается, что неионогенное поверхностно-активное вещество может содержаться в растворе ДАБ-содержащего субстрата по желанию, а в Патентных Публикациях 2 и 3 сообщается, что ЭДТК может содержаться в растворе ДАБ-содержащего субстрата. Однако в этих публикациях обсуждение проблем с имидазолом отсутствует.
Патентная Публикация 1: JP-3503890-В2
Патентная Публикация 2: СА-2417671-А1
Патентная Публикация 3: DE-3812605-A1
Непатентная Публикация 1: Hiroshi Nagura, Yoshiyuki Osamura, Yutaka Tsutsurai, "Watanabe-Nakane Kouso Koutai Hou (immunoenzymatic technique)", 4th Ed., Interdisciplinary Planning (2002).
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Целью настоящего изобретения является предоставить набор ДАБ-содержащего субстрата, который способен увеличивать интенсивность специфического окрашивания и уменьшать неспецифическое окрашивание, в хромогенной реакции иммунного окрашивания, такого как иммуногистохимическое окрашивание или иммуноцитохимическое окрашивание, или при гибридизации in situ с использованием антитела, меченного пероксидазой, посредством применения раствора ДАБ-содержащего субстрата, содержащего ДАБ и его сенсибилизатор имидазол.
Еще одной целью настоящего изобретения является предоставить набор ДАБ-содержащего субстрата, который способен увеличивать интенсивность специфического окрашивания, подавляя осаждение вследствие агрегации ДАБ в растворе ДАБ-содержащего субстрата и уменьшать неспецифическое окрашивание, в хромогенной реакции при иммунном окрашивании или гибридизации in situ с использованием антитела, меченного пероксидазой, посредством применения раствора ДАБ-содержащего субстрата, содержащего ДАБ и его сенсибилизатор имидазол.
Дополнительной целью настоящего изобретения является предоставить набор ДАБ-содержащего субстрата, который увеличивает интенсивность специфического окрашивания, уменьшает неспецифическое окрашивание, такое как фоновое окрашивание, и подавляет осаждение вследствие агрегации ДАБ в растворе ДАБ-содержащего субстрата в течение продолжительного периода времени, в хромогенной реакции при иммунном окрашивании или гибридизации in situ с использованием антитела, меченного пероксидазой, посредством применения раствора ДАБ-содержащего субстрата, содержащего ДАБ и его сенсибилизатор имидазол, посредством чего улучшаются применимость и стабильность при хранении набора субстрата.
Авторы настоящего изобретения провели интенсивные исследования для достижения вышеуказанных целей, чтобы обнаружить, что присутствие конкретного хелатирующего средства и конкретного неионогенного поверхностно-активного вещества может уменьшать неспецифическое окрашивание, например, фоновое окрашивание, которое может происходить, когда применяют предметное стекло, даже, когда имидазол, который известен в качестве сенсибилизатора, содержится для увеличенного специфического окрашивания в составе раствора ДАБ-содержащего субстрата, обычно используемого для проявления цвета при иммуноокрашивании, таком как иммуноферментный метод, или гибридизация in situ. Дополнительно, агрегация в приготовленном растворе ДАБ-содержащего субстрата может подавляться, а стабильность при хранении значительно улучшается посредством обеспечения раствора субстрата в системе из двух или более компонентов с регулируемым составом, т.е. никакого осаждения не происходит в течение двух недель от смешивания компонентных растворов, при хранении в тени при 4°С, и может достигаться способность к окрашиванию, сравнимая с окрашиваемостью сразу же после приготовления раствора ДАБ-содержащего субстрата. Таким образом, создание настоящего изобретения было завершено.
Как используют в настоящем документе, раствор ДАБ-содержащего субстрата означает раствор субстрата, полученный посредством смешивания или смешивания и разведения, компонентов набора настоящего изобретения. Также, как используют в настоящем документе, термин "окрашивание" иногда означает окрашивание или раскраску.
В соответствии с настоящим изобретением, предоставлен набор раствора ДАБ-содержащего субстрата для окрашивания с использованием антитела, меченного пероксидазой, такого как при ИГХ, ИЦХ или ИСГ, причем указанный набор содержит: хромофор-содержащий раствор (А), содержащий диаминобензидин (ДАБ) в качестве хромофора пероксидазы, и воду; и хромогенный реагент (В), содержащий: по меньшей мере одно хелатирующее средство, выбранное из группы, состоящей из дигидрата динатриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТК-2Na), диаммониевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТК-2NH4), гликолевого эфира диаминтетрауксусной кислоты (ГЭДТК) и нитрилтриуксусной кислоты (НТК); по меньшей мере одно неионогенное поверхностно-активное вещество, выбранное из группы, состоящей из неионогенного поверхностно-активного вещества из алкилового эфира полиоксиэтилена (сокращаемого здесь и далее как ПОЭ) и неионогенного поверхностно-активного вещества из алкилового эфира полиоксипропилена (сокращаемого здесь и далее как ПОП); имидазол; пероксид водорода; и воду, где указанный набор находится в системе из двух или более компонентов, причем по меньшей мере указанный хромофор-содержащий раствор (А) и указанный хромогенный реагент (В) хранятся раздельно, (иногда именуется здесь ниже как набор настоящего изобретения).
В соответствии с настоящим изобретением, также предоставлен набор, где указанный хромогенный реагент (В) находится в двухкомпонентной системе, где хромогенный раствор (В1), содержащий указанный пероксид водорода и указанную воду, и субстрат-стабилизирующий раствор (В2), содержащий указанное хелатирующее средство, указанное по меньшей мере одно неионогенное поверхностно-активное вещество выбрано из группы, состоящей из неионогенного поверхностно-активного вещества из алкилового эфира ПОЭ и ПОП, указанный имидазол и указанную воду, хранятся раздельно, и, где указанный набор находится в трехкомпонентной системе.
В соответствии с настоящим изобретением, предоставлен способ ИГХ, ИЦХ или ИСГ, в котором набор настоящего изобретения применяют при окрашивании ткани, клеток или их частей с использованием ДАБ.
В соответствии с настоящим изобретением, также предоставлен способ окрашивания, отличающийся тем, что набор настоящего изобретения применяют при окрашивании ткани, клеток или их частей с использованием ДАБ.
Набор настоящего изобретения содержит хромофор-содержащий раствор (А), содержащий хромофор пероксидазы ДАБ и воду; и хромогенный реагент (В), содержащий конкретное хелатирующее средство, конкретное поверхностно-активное вещество, имидазол, пероксид водорода и воду, и находится в системе из двух или более компонентов, где по меньшей мере хромофор-содержащий раствор (А) и хромогенный реагент (В) хранятся раздельно. Таким образом, набор настоящего изобретения способен увеличивать интенсивность специфического окрашивания, уменьшая неспецифическое окрашивание и подавляя осаждение вследствие агрегации ДАБ в растворе ДАБ-содержащего субстрата, при ИГХ, ИЦХ или ИСГ с использованием пероксидазы. Дополнительно, набор настоящего изобретения способен к подавлению осаждения в течение продолжительного периода времени, чтобы улучшить применимость и стабильность при хранении. Набор настоящего изобретения, имеющий такие преимущества, является особенно применимым при окрашивании препаратов ткани, нанесенных на предметные стекла, посредством ИГХ, окрашивании клеточных препаратов посредством ИЦХ или окрашивании тканей или клеточных препаратов посредством ИСГ.
ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНЫЕ ВАРИАНТЫ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение теперь будет подробно описано.
Набор настоящего изобретения представляет собой набор ДАБ-содержащего субстрата, обеспечиваемый в системе из двух или более компонентов, для окрашивания с помощью хромофора ДАБ, конкретных веществ, таких как антигены, мРНК или ДНК, присутствующих в нормальных или опухолевых тканях или клетках биологических объектов при патологической диагностике или молекулярно-биологических тестах, на основе окрашивания при ИГХ или ИЦХ или придании цвета при ИСГ, с использованием антитела, меченного пероксидазой.
В настоящем изобретении, препараты тканей, предназначенные для анализа ИГХ, клеточные образцы, предназначенные для анализа ИЦХ, или тканевые или клеточные препараты для анализа ИСГ, были фиксированы для предотвращения денатурализации и затем получены в виде срезов для применения. Например, в настоящем изобретении могут предпочтительно использоваться препараты, которые, с целью длительного хранения, были зафиксированы обычно с использованием формалина или спирта, погружены в среду для погружения, содержащую, например, парафин, получены в виде срезов и нанесены на предметное стекло. Реакция антиген-антитело перед окрашиванием или реакция антитела после гибридизации с использованием зонда, меченного с помощью ДИГ (дигоксигенина), могут проводиться посредством известного процесса, такого как прямой или косвенный метод, с использованием антитела, меченного пероксидазой. В данном описании, пероксидаза предпочтительно представляет собой ПХ.
Набор настоящего изобретения может предпочтительно применяться при опосредованной иммуноферментативной реакции с использованием предметного стекла, на которую наносят тканевые или клеточные препараты. Например, препарат, фиксированный в формалине и погруженный в парафин на предметном стекле, подвергают депарафинизации, регидратации и необязательно демаскированию антигенности для удаления эндогенной пероксидазы. Затем препарат взаимодействует с первичным антителом или ДИГ-меченым зондом и затем взаимодействует с полимером, меченным пероксидазой, который был конъюгирован с вторичными антителами или анти-ДИГ антителами. Полученный в результате препарат взаимодействует с раствором ДАБ-содержащего субстрата, полученного посредством смешивания компонентных растворов набора настоящего изобретения, для специфического окрашивания и визуализации взаимодействующей области с использованием пероксидазы в качестве катализатора. После специфического окрашивания для визуализации, может проводиться ядерное окрашивание с помощью гематоксилина или т.п. для улучшения наблюдаемости морфологии.
Раствор ДАБ-содержащего субстрата может быть приготовлен, например, посредством смешивания компонентных растворов набора настоящего изобретения или посредством смешивания концентрированных компонентных растворов набора настоящего изобретения с конкретным количеством воды, такой как дистиллированная вода.
Примеры тканей, которые могут использоваться при окрашивании посредством ИГХ или раскраске посредством ИСГ, могут включать толстый кишечник (нормальный или неопластический), тонкий кишечник (нормальный), двенадцатиперстную кишку (нормальную), толстую кишку (нормальную), желудок (нормальный или неопластический), пищевод (нормальный), язык (нормальный), печень (неопластическую), поджелудочную железу (нормальную), почку (нормальную), мозг (нормальный), мозжечок (нормальный), сердце (нормальное), молочную железу (нормальную или неопластическую), плаценту, предстательную железу (нормальную или неопластическую), легкое (нормальное или неопластическое), щитовидную железу (нормальную), миндалину (нормальную), лимфатический узел (нормальный), шейку матки (нормальную), злокачественную меланому, лимфому Ходжкина, случай гиперплазии тимуса, GIST (желудочно-кишечную стромальную опухоль) и мезотелиому. Среди них, ткани, содержащие мышечную или соединительную ткани, такие как толстый кишечник (нормальный или неопластический), тонкий кишечник (нормальный), двенадцатиперстная кишка (нормальная), толстая кишка (нормальная) и желудок (нормальный или неопластический), являются особенно подверженными фоновому окрашиванию, так что набор настоящего изобретения является особенно эффективным при окрашивании таких тканей.
Предпочтительные примеры клеток, подходящих для окрашивания посредством ИГХ или раскраски посредством ИСГ с использованием набора настоящего изобретения, могут включать клетки злокачественного новообразования молочной железы, клетки рака легкого и лимфобласты (нормальные).
Набор настоящего изобретения включает хромофор-содержащий раствор (А), содержащий хромофор пероксидазы ДАБ и воду. ДАБ, содержащийся в растворе (А), функционирует в качестве донора водорода в ферментативной реакции пероксида водорода и пероксидазы. Полимеризация ДАБ специфически окрашивает часть, связанную с пероксидазой, коричневым цветом.
В растворе (А), содержание ДАБ не ограничивается конкретно, поскольку, в конечном счете, полученный раствор ДАБ-содержащего субстрата производит хромогенную реакцию при окрашивании посредством ИГХ или ИЦХ или раскраски посредством ИСГ, и может предпочтительно составлять от 0,1 до 10 мг/мл, в пересчете на концентрацию в растворе ДАБ-содержащего субстрата для применения. При менее чем 0,1 мг/мл достаточная хромогенная реакция может не протекать, в то время как при свыше 10 мг/мл, ДАБ в растворе ДАБ-содержащего субстрата может агрегировать и осаждаться.
В растворе (А), вода может представлять собой, например, дистиллированную или сверхчистую воду. Количество воды является достаточным для растворения ДАБ в растворе (А), и может подходящим образом выбираться таким образом, что содержание каждого составляющего компонента находится в соответствующем интервале в конечном растворе ДАБ-содержащего субстрата.
Раствор (А) может необязательно содержать, в дополнение к ДАБ и воде, различные органические растворители для улучшения растворимости или стабильности ДАБ, при содержании, подходящим образом выбранном для цели.
Набор настоящего изобретения включает хромогенный реагент (В), содержащий конкретное хелатирующее средство, неионогенное поверхностно-активное вещество из алкилового эфира ПОЭ и/или неионогенное поверхностно-активное вещество из алкилового эфира ПОП, имидазол, пероксид водорода и воду.
Хромогенный реагент (В) может подразделяться на, например, хромогенный раствор (В1), содержащий пероксид водорода и воду, и субстрат-стабилизирующий раствор (В2), содержащий конкретное хелатирующее средство, неионогенные поверхностно-активные вещества из алкилового эфира ПОЭ и/или ПОП, имидазол и воду.
Набор настоящего изобретения может находиться в системе из любого числа компонентов, если только он находится в системе из двух или более компонентов, где ДАБ и пероксид водорода хранятся раздельно. С позиций эффективности, двухкомпонентная система, составленная из хромофор-содержащего раствора (А) и хромогенного реагента (В), и трехкомпонентная система, составленная из хромофор-содержащего раствора (А), хромогенного раствора (В1) и субстрат-стабилизирующего раствора (В2), являются предпочтительными.
Конкретное хелатирующее средство, содержащееся в хромогенном реагенте (В) или субстрат-стабилизирующем растворе (В2), представляет собой по меньшей мере один компонент, выбранный из группы, состоящей из ЭДТК-2Na, ЭДТК-2NH4, ГЭДТК и НТК, причем ЭДТК-2Na или ГЭДТК являются особенно предпочтительными с позиций его эффекта. Эти хелатирующие средства, в частности, подавляют неспецифическое связывание ДАБ, конкретно, фоновое окрашивание препаратов ткани, нанесенных на предметные стекла. Дополнительно, в комбинации с конкретным неионогенным поверхностно-активным веществом, которое будет обсуждаться позднее, хелатирующее средство может эффективно уменьшать неспецифическое связывание ДАБ, даже когда препарат ткани является мышечной или соединительной тканью.
Хелатирующее средство в хромогенном реагенте (В) или субстрат-стабилизирующем растворе (В2) имеет тенденцию проявлять зависимое от количества усиление их функциональных эффектов, и его содержание может быть выбрано подходящим образом, с учетом функциональных эффектов. Конкретно, содержание хелатирующего средства может быть таким, что концентрация в растворе ДАБ-содержащего субстрата для применения может предпочтительно составлять от 0,1 до 10 мМ, более предпочтительно от 0,3 до 3 мМ.
Конкретное поверхностно-активное вещество, содержащееся в хромогенном реагенте (В) или субстрат-стабилизирующем растворе (В2), может представлять собой по меньшей мере одно поверхностно-активное вещество, выбранное из группы, состоящей из алкиловых эфиров ПОЭ, таких как лауриловый эфир ПОЭ (23) (Brij 35), цетиловый эфир ПОЭ (20) (Brij 58), стеариловый эфир ПОЭ, олеиловый эфир ПОЭ, миристиловый эфир ПОЭ, октилдодециловый эфир ПОЭ, и алкиловых эфиров ПОП, таких как лауриловый эфир ПОП, цетиловый эфир ПОП, стеариловый эфир ПОП, олеиловый эфир ПОП, миристиловый эфир ПОП, октилдодециловый эфир ПОП, причем Brij 35 является предпочтительным. Эти неионогенные поверхностно-активные вещества имеют превосходные эффекты, особенно, в растворе ДАБ-содержащего субстрата, содержащем ДАБ и пероксид водорода, подавления полимеризации или осаждения ДАБ в растворе, и усиления интенсивности окрашивания ДАБ. Желательные эффекты не могут быть получены с другими поверхностно-активными веществами, такими как Тритон Х-100 (4-(1,1,3,3-тетраметилбутил)фенил-полиэтиленгликоль), NP-40 (4-нонилфенил-полиэтиленгликоль) или Твин 2 0 (полиоксиэтиленсорбитана монолаурат), или апротонными полярными растворителями, такими как ДМСО (диметилсульфоксид).
Неионогенное поверхностно-активное вещество из алкилового эфира ПОЭ и/или неионогенное поверхностно-активное вещество из алкилового эфира ПОП в хромогенном реагенте (В) или субстрат-стабилизирующем растворе (В2) имеет тенденцию проявлять зависимое от количества усиление их функциональных эффектов, и его содержание может быть выбрано подходящим образом, с учетом функциональных эффектов. Конкретно, содержание поверхностно-активного вещества может быть таким, что концентрация в растворе ДАБ-содержащего субстрата для применения при ИГХ, ИЦХ или ИСГ может предпочтительно составлять от 0,05 до 30 масс. %, более предпочтительно, от 0,1 до 5 масс. %.
Имидазол, содержащийся в хромогенном реагенте (В) или субстрат-стабилизирующем растворе (В2) функционирует в качестве сенсибилизатора для увеличения интенсивности окрашивания ДАБ. Имидазол, имеющий такой функциональный эффект, увеличивает интенсивность окрашивания, но, с другой стороны, индуцирует агрегацию ДАБ в присутствии пероксида водорода, вызывая осаждение в растворе ДАБ-содержащего субстрата после некоторого периода времени, и также индуцирует неспецифическое окрашивание веществ, отличающихся от целевого вещества, такое как фоновое окрашивание, в образце тканей или клеток. Принимая это во внимание, в наборе настоящего изобретения имидазол содержится в хромогенном реагенте (В) или субстрат-стабилизирующем растворе (В2), содержащем комбинацию конкретного хелатирующего средства и конкретного неионогенного поверхностно-активного вещества.
Имидазол в хромогенном реагенте (В) или субстрат-стабилизирующем растворе (В2) проявляет зависимое от количества увеличение интенсивности окрашивания ДАБ, но слишком много имидазола может увеличить риск возникновения проблем, обсуждаемых выше. Таким образом, содержание имидазола предпочтительно является таким, что концентрация в растворе ДАБ-содержащего субстрата для применения при ИГХ, ИЦХ или ИСГ, обычно равна от 3 до 300 мМ, в частности, от 5 до 100 мМ. В случае желательной более высокой концентрации имидазола, концентрация конкретного хелатирующего средства также предпочтительно увеличивается в пределах вышеуказанного интервала.
Пероксид водорода, содержащийся в хромогенном реагенте (В) или хромогенном растворе (В1), действует на пероксидазу, чтобы способствовать хромогенной реакции ДАБ. Содержание пероксида водорода может представлять собой избыточное количество, но слишком много пероксида водорода может уменьшать интенсивность специфического окрашивания. С другой стороны, когда содержание пероксида водорода является слишком малым, хромогенная реакция может не протекать достаточным образом, и стабильность полученного раствора ДАБ-содержащего субстрата является очень низкой.
Принимая во внимание изложенное выше, содержание пероксида водорода может быть таким, чтобы содержание в растворе ДАБ-содержащего субстрата для применения при ИГХ, ИЦХ или ИСГ предпочтительно составляло от 0,001 до 0,3 масс %, более предпочтительно от 0,01 до 0,05 масс %.
Вода, содержащаяся в хромогенном реагенте (В), хромогенном растворе (В1) и субстрат-стабилизирующем растворе (В2), может представлять собой, например, дистиллированную или сверхчистую воду. Содержание воды может подходящим образом выбираться таким образом, чтобы содержание каждого составляющего компонента находилось в подходящем интервале.
В наборе настоящего изобретения, для эффективного достижения желательных эффектов настоящего изобретения, рН хромогенного реагента (В) или субстрат-стабилизирующего раствора (В2) может предпочтительно регулироваться таким образом, что рН полученного в результате раствора ДАБ-содержащего субстрата равен обычно 5-9, в частности, 6-8.
рН может регулироваться с помощью регулятора рН, такого как хлористоводородная кислота или буфер, такой как фосфорная кислота, Трис, MOPS, HEPES, ADA, CHES или MES. Регулятор рН, такой как хлористоводородная кислота, является особенно предпочтительным с позиций улучшенной стабильности при хранении хромогенного реагента (В), содержащего пероксид водорода, или полученного в результате раствора ДАБ-содержащего субстрата.
Каждый из компонентных растворов набора настоящего изобретения может необязательно содержать дополнительные составные компоненты, если только они не ухудшают эффекты настоящего изобретения, и для обеспечения дополнительных эффектов. Примеры таких дополнительных составных компонентов могут включать консерванты и дезинфицирующие средства.
Набор настоящего изобретения может применяться либо в ручном или автоматизированном процессе. В частности, набор настоящего изобретения может предпочтительно и удобным образом применяться в процессе с использованием автоматизированного прибора с температурным контролем, автоматизированного прибора для иммуногистохимического окрашивания или автоматизированного прибора для гибридизации in situ.
Окрашивание или раскраска при ИГХ, ИЦХ или ИСГ с использованием набора настоящего изобретения может выполняться посредством смешивания компонентных растворов набора или смешивания и разбавления компонентных растворов набора в предписанном количестве воды, чтобы приготовить раствор ДАБ-содержащего субстрата и, например, в случае иммуноферментного метода с использованием препарата ткани или клеток на предметном стекле, добавления раствора ДАБ-содержащего субстрата по каплям на отмеченную область обычно при комнатной температуре (15-30°С) и взаимодействия в течение от 1 до 20 минут.
ПРИМЕРЫ
Далее следует подробное объяснение настоящего изобретения со ссылкой на Примеры, Контроли и Сравнительные Примеры, которые не ограничивают настоящее изобретение.
В следующих примерах, были проведены следующие оценки.
Параметр оценки (1)
Интенсивность специфического окрашивания: Интенсивность специфического окрашивания полученного образца наблюдали под оптическим микроскопом.
Оценку выражали в величинах, кратных интенсивности специфического окрашивания в Контроле 1 или 2, являющейся "+".
Параметр оценки (2)
Фоновое окрашивание: Фоновое окрашивание полученного образца наблюдали под оптическим микроскопом.
Оценку выражали на основании Сравнительного Примера 1 или 8, где фоновое окрашивание наблюдали с указанием как "±", и Контролей 1 или 2, где фоновое окрашивание не наблюдали с указанием как "-", и фонового окрашивания, большего, чем указанные, с указанием как "+", и фонового окрашивания, большего указанных приблизительно в два раза, с указанием как "2+".
Параметр оценки (3)
Цвет раствора ДАБ-содержащего субстрата: Цвет смешанного раствора, полученного посредством смешивания компонентных растворов наборов, полученных в Примерах и Сравнительных Примерах, обсуждаемых ниже, наблюдали визуально.
Параметр оценки (4)
Осаждение в растворе ДАБ-содержащего субстрата: Состояния осадка в смешанном растворе, полученном посредством смешивания компонентных растворов набора, полученного в Примерах и Сравнительных Примерах, обсуждаемых ниже, наблюдали визуально.
Параметр оценки (5)
Стабильность при хранении: Определяли период хранения, при котором интенсивность специфического окрашивания и фоновое окрашивание, определяемые в растворе ДАБ-содержащего субстрата, полученного из набора, хранимого при 37°С, оценивали в сравнении с этими характеристиками, определенными для раствора ДАБ-содержащего субстрата, полученного посредством смешивания компонентов свежеприготовленного набора.
Получение образца для иммуногистохимического окрашивания с использованием антитела, меченного пероксидазой
(A) Депарафинизация и регидратация
Фиксированный в формалине погруженный в парафин срез ткани тонкого кишечника человека нарезали по 3 мкм с помощью микротома, наносили на покрытое силаном предметное стекло и сушили при 37°С в течение 16 часов. Предметное стекло депарафинизировали посредством трехминутного выдерживания в слое ксилола три раза, и затем регидратировали посредством трехминутного выдерживания в слое этанола четыре раза.
(B) Промывка
После окончательного выдерживания в слое этанола, предметное стекло промывали фосфатным буфером при рн 7,6 в течение 3 минут три раза.
(C) Иммуногистохимическое окрашивание
Иммуногистохимическое окрашивание вручную
Предметное стекло после промывки (В), после дренирования, помещали в 3% раствор пероксида водорода/метаноле в течение 10 минут для реакции, чтобы удалить эндогенную пероксидазу, и затем промывали фосфатным буфером с рН 7,6 в течение 3 минут три раза.
После дренирования полученного предметного стекла, препарат ткани обводили кружком, используя ручку PAP (DAIDO SANGYO СО., LTD.) для образования панели для реагента.
После дренирования предметного стекла, 100 мкл мышиного первичного антитела, моноклонального антитела против актина (мягкой мускулатуры) (клон 1А4) (торговое наименование NICHIREI BIOSCIENCES, INC.) добавляли по каплям на предметное стекло, и взаимодействие проводили при 25°С в течение 60 минут. После завершения реакции, предметное стекло промывали фосфатным буфером с рН 7,6 в течение 3 минут три раза.
После дренирования промытого предметного стекла, 100 мкл меченого полимера, Simple Stain MAX РО (MULTI) (торговое наименование NICHIREI BIOSCIENCES, INC.), который был получен посредством связывания с аминокислотным полимером, пероксидазу и фрагменты Fab' против мышиных Ig и против кроличьих Ig в качестве вторичных антител, добавляли по каплям на предметное стекло, и взаимодействие проводили при 25°С в течение 30 минут. После завершения реакции, предметное стекло промывали фосфатным буфером с рН 7,6 в течение 3 минут три раза.
После промывки, предметное стекло дренировали и добавляли раствор ДАБ-содержащего субстрата, полученный из набора, полученного в каждом из Примеров и Сравнительных Примеров, в качестве хромогенного субстрата, по каплям на предметное стекло, и проводили взаимодействие при комнатной температуре в течение 5 минут. Затем предметное стекло промывали в проточной воде в течение 5 минут. После дренирования, для контрастного окрашивания, предметное стекло подвергали реакции в гематоксилине Майера в течение 30 секунд для ядерного окрашивания и промывали в проточной воде в течение 5 минут.
Затем, после дренирования, предметное стекло подвергали дегидратации и очистке посредством пропускания через слой этанола три раза, однократному трехминутному выдерживанию в слое этанола, однократному пропусканию через слой ксилола и пятиминутному выдерживанию в слое ксилола дважды, и затем заливали в неводную среду для заливки (NICHIREI BIOSCIENCES, INC.) с получением образца.
Контроль 1: Набор ДАБ-содержащего субстрата в трехкомпонентной системе без имидазола, конкретного хелатирующего средства и конкретного поверхностно-активного вещества
Количество ДАБ растворяли в дистиллированной воде таким образом, что его концентрация в конечном полученном растворе ДАБ-содержащего субстрата была равна 15 мг/мл, чтобы получить хромофор-содержащий раствор (А). Отдельно, хромогенный раствор (В1) готовили посредством растворения 0,6 масс. % пероксида водорода в дистиллированной воде, и готовили субстрат-стабилизирующий раствор (В2') Трис-HCl с рн 7,6. С использованием набора из полученного хромофор-содержащего раствора (А), хромогенного раствора (В1) и субстрат-стабилизирующего раствора (В2'), по капле каждого компонентного раствора (приблизительно 40 мкл) смешивали в 1 мл дистиллированной воды при перемешивании, чтобы приготовить раствор ДАБ-содержащего субстрата.
Используя полученный раствор ДАБ-содержащего субстрата, образцы для иммуногистохимического окрашивания получали в соответствии со способом, описанным выше. Полученные образцы оценивали по Параметрам Оценки (1) и (2). Результаты показаны в Таблице 1.
Сравнительный Пример 1: Набор ДАБ-содержащего субстрата в трехкомпонентной системе без конкретного поверхностно-активного вещества
Количество ДАБ растворяли в дистиллированной воде таким образом, что его концентрация в конечном полученном растворе ДАБ-содержащего субстрата была равна 15 мг/мл, чтобы получить хромофор-содержащий раствор (А). Отдельно, хромогенный раствор (В1) готовили посредством растворения 0,6 масс. % пероксида водорода в дистиллированной воде, субстрат-стабилизирующий раствор (В2') готовили посредством растворения имидазола и ЭДТК-2Na в дистиллированной воде при концентрациях, равных 0,5 М и 20 мМ, соответственно, и доведения рН до 7,5 с помощью хлористоводородной кислоты. С использованием набора из полученного хромофор-содержащего раствора (А), хромогенного раствора (В1) и субстрат-стабилизирующего раствора (В2'), по капле каждого компонентного раствора (приблизительно 40 мкл) смешивали в 1 мл дистиллированной воды при перемешивании, чтобы приготовить раствор ДАБ-содержащего субстрата. В полученном растворе, содержание пероксида водорода было равно 0,024 масс. %, концентрация имидазола составляла 20 мМ, концентрация ЭДТК-2Na составляла 0,8 мМ, и рН был равен 7,5.
Используя полученный раствор ДАБ-содержащего субстрата, образцы для иммуногистохимического окрашивания получали в соответствии со способом, описанным выше. Полученные образцы оценивали по Параметрам Оценки (1)-(4). Оценки по Параметрам Оценки (3) и (4) были сделаны после интервала, равного одному часу, после приготовления раствора ДАБ-содержащего субстрата. Результаты показаны в Таблицах 1 и 2.
Пример 1: Набор ДАБ-содержащего субстрата в трехкомпонентной системе, содержащей ЭДТК-2Na в качестве хелатирующего средства
Вместо субстрат-стабилизирующего раствора (В2'), был приготовлен субстрат-стабилизирующий раствор (В2) посредством растворения имидазола, ЭДТК-2Na и лаурилового эфира ПОЭ (23) (Brij 35, SIGMA-ALDRICH) в дистиллированной воде при концентрациях 0,5 мМ, 20 мМ и 1 масс. %, соответственно, и доведения рН до 7,5 с помощью хлористоводородной кислоты. За исключением приготовления раствора (В2), раствор ДАБ-содержащего субстрата был приготовлен с использованием полученного в результате набора таким же образом, как в Сравнительном Примере 1. В полученном растворе, концентрация пероксида водорода была равна 0,024 масс. %, а рН был равен 7,5. Оценки были сделаны таким же образом, как в Сравнительном Примере 1. Для Параметров Оценки (3) и (4), дополнительные оценки были сделаны после периода, равного 3 дням, после приготовления раствор ДАБ-содержащего субстрата. Результаты показаны в Таблицах 1 и 2.
Сравнительные Примеры 2-4: Набор ДАБ-содержащего субстрата в трехкомпонентной системе, содержащей различные поверхностно-активные вещества
Субстрат-стабилизирующий раствор (В2') был приготовлен таким же образом, как в Примере 1, за исключением того, что Brij 35 заменяли на полиоксисорбитановое неионогенное поверхностно-активное вещество Твин 20, неионогенное поверхностно-активное вещество Тритон Х-100 на основе полиоксиалкилфенилового эфира или жирнокислотный сложный эфир сахарозы "DK сложный эфир SS" (торговое наименование DKS CO., LTD.), как показано в Таблице 1.
Хромофор-содержащий раствор (А) и хромогенный раствор (В1) были приготовлены таким же образом, как в Сравнительном Примере 1, чтобы получить набор в трехкомпонентной системе. Раствор ДАБ-содержащего субстрата был приготовлен с использованием полученного набора таким же образом, как в Сравнительном Примере 1, и оценки были сделаны таким же образом, как в Примере 1. Результаты показаны в Таблицах 1 и 2. Концентрации в полученном растворе ДАБ-содержащего субстрата были такими же, как концентрации в Примере 1.
Примеры 2-5: Набор ДАБ-содержащего субстрата в трехкомпонентной системе, с видом и концентрацией хелатирующего средства, измененными по сравнению с Примером 1
Субстрат-стабилизирующий раствор (В2) был приготовлен таким же образом, как в Примере 1, за исключением того, что 20 мМ ЭДТК-2Na заменяли на ЭДТК-2NH4, НТК, ГЭДТК или ЭДТК-2Na при концентрации, показанной в Таблице 1. Хромофор-содержащий раствор (А) и хромогенный раствор (В1) были приготовлены таким же образом, как в Сравнительном Примере 1, чтобы получить набор в трехкомпонентной системе. Раствор ДАБ-содержащего субстрата был приготовлен с использованием полученного набора таким же образом, как в Сравнительном Примере 1, и оценки были сделаны таким же образом, как в Примере 1. Результаты показаны в Таблицах 1 и 2. В растворе ДАБ-содержащего субстрата, полученном в Примере 5, концентрация пероксида водорода составляла 0,024 масс. %, концентрация имидазола была равна 20 мМ, концентрация ЭДТК-2Na составляла 0,8 мМ, содержание Brij 35 составляло 0,04 масс. %, и рН был равен 7,5.
Сравнительные Примеры 5-7: Набор ДАБ-содержащего субстрата в трехкомпонентной системе с различными хелатирующими средствами
Субстрат-стабилизирующий раствор (В2) был приготовлен таким же образом, как в Сравнительном Примере 2, за исключением того, что ЭДТК-2Na заменяли на лимонную кислоту, винную кислоту или галловую кислоту при концентрации, показанной в Таблице 1. Хромофор-содержащий раствор (А) и хромогенный раствор (В1) были приготовлены таким же образом, как в Сравнительном Примере 1, чтобы получить набор в трехкомпонентной системе. Раствор ДАБ-содержащего субстрата был приготовлен с использованием полученного набора таким же образом, как в Сравнительном Примере 1, и оценки были сделаны таким же образом, как в Примере 1, за исключением того, что оценки цвета раствора и состояний осадка после интервала, равного 1 часу, после смешивания не были сделаны. Результаты показаны в Таблицах 1 и 2. В растворах ДАБ-содержащего субстрата, полученных в Сравнительных Примерах 5-7, концентрация пероксида водорода составляла 0,024 масс. %, концентрация имидазола была равна 2 0 мМ, концентрация лимонной или винной кислот была равна 0,8 мМ, концентрация галловой кислоты составляла 0,08 мМ, и содержание Твина 20 составляло 0,04 масс %.
Таблицы 1 и 2 показывают, что в Контроле 1 без имидазола, имеющего эффект увеличения окрашивания, интенсивность специфического окрашивания была низкой, но фоновое окрашивание не наблюдалось. Напротив, в Сравнительном Примере 1 с имидазолом, фоновое окрашивание наблюдали даже, несмотря на содержание конкретного хелатирующего средства ЭДТК-2Na, и осаждение наблюдали в растворе через такое короткое время, как один час после смешивания. Сравнительные Примеры 3 и 4 с неионогенными поверхностно-активными веществами, отличающимися от неионогенных поверхностно-активных веществ из алкилового эфира ПОЭ и/или ПОП, проявляли еще более превосходную интенсивность специфического окрашивания в сравнении со Сравнительным Примером 1, но фоновое окрашивание также было увеличено, и осаждение наблюдали в растворах после трехдневного интервала от смешивания. Сравнительные Примеры 5 и 6 с хелатирующим средством, имеющим меньший хелатирующий эффект в сравнении с ЭДТК-2Na, проявляли низкую интенсивность специфического окрашивания в сравнении со Сравнительным Примером 2 с ЭДТК-2Na, но фоновое окрашивание и состояния раствора, сравнимые со Сравнительным Примером 2. Напротив, в Примере 1, интенсивность специфического окрашивания увеличивалась, фоновое окрашивание не наблюдали, и осаждение не наблюдали в растворе после трехдневного интервала от смешивания. Дополнительно, Примеры 2-4 демонстрируют, что конкретные хелатирующие средства, отличающиеся от ЭДТК-2Na, также проявляли эффекты, сравнимые с Примером 1.
Пример 6: Набор ДАБ-содержащего субстрата в трехкомпонентной системе с различными концентрациями имидазола
Субстрат-стабилизирующий раствор (В2) был приготовлен таким же образом, как в Примере 1, за исключением того, что концентрацию имидазола, равную 0,5 М изменяли на 0,1 М (концентрация имидазола в растворе ДАБ-содержащего субстрата была равна 4 мМ), 0,2 М (концентрация имидазола в растворе ДАБ-содержащего субстрата была равна 8 мМ), 0,3 М (концентрация имидазола в растворе ДАБ-содержащего субстрата была равна 12 мМ) или 0,4 М (концентрация имидазола в растворе ДАБ-содержащего субстрата была равна 16 мМ), и оценки были сделаны таким же образом, как в Примере 1 для набора в трехкомпонентной системе. Результаты показывают, что интенсивность специфического окрашивания находилась в интервале от +1,5 до +2,5, возрастая зависимым от количества образом по мере увеличения концентрации имидазола. Фоновое окрашивание, цвет смешанного раствора и состояния осаждения были сравнимыми с аналогичными характеристиками в Примере 1.
Примеры 7-13: Набор ДАБ-содержащего субстрата в трехкомпонентной системе с различными концентрациями поверхностно-активного вещества
Субстрат-стабилизирующий раствор (В2) был приготовлен таким же образом, как в Примере 1, за исключением того, что концентрацию Brij 35 изменяли на концентрацию, показанную в Таблице 3. Хромофор-содержащий раствор (А) и хромогенный раствор (В1) были приготовлены таким же образом, как в Сравнительном Примере 1, чтобы получить набор в трехкомпонентной системе. Раствор ДАБ-содержащего субстрата был приготовлен с использованием полученного набора, и образцы для иммуногистохимического окрашивания были подготовлены с использованием раствора сразу же после смешивания. Образцы оценивали по Параметрам Оценки (1) и (2). Результаты показаны в Таблице 3. Дополнительно, образцы для иммуногистохимического окрашивания также были подготовлены с использованием раствора ДАБ-содержащего субстрата, хранящегося в тени при 4°С в течение 2 недель после получения. Полученные образцы оценивали по Параметрам Оценки (1) и (2), и раствор, хранящийся в тени при 4°С в течение 2 недель подвергали оценке по Параметрам Оценки (3) и (4). Результаты показаны в Таблице 4. В полученном растворе ДАБ-содержащего субстрата концентрация Brij 35 была равна 0,02 масс.% в Примере 7, 0,06 масс.% в Примере 8, 0,08 масс.% в Примере 9, 0,1 масс.% в Примере 10, 0,12 масс.% в Примере 11, 0,2 масс.% в Примере 12 и 0,4 масс.% в Примере 13.
| Таблица 3 | |||
| Концентрация Brij 35 (масс.%) | Интенсивность специфического окрашивания | Фоновое окрашивание | |
| Пример 7 | 0,5 | 3+ | - |
| Пример 8 | 1,5 | 3+ | - |
| Пример 9 | 2,0 | 3+ | - |
| Пример 10 | 2,5 | 3+ | - |
| Пример 11 | 3,0 | 3,5+ | - |
| Пример 12 | 5,0 | 3,5+ | - |
| Пример 13 | 10,0 | 3,5+ | - |
| Таблица 4 | ||||
| Концентрация Brij 35 (масс.%) | После хранения в тени при 4°С в течение 2 недель после смешивания | |||
| Интенсивность специфического окрашивания | Фоновое окрашивание | Состояние осаждения после хранения раствора | ||
| Пример 7 | 0,5 | 3+ | - | Осаждается |
| Пример 8 | 1,5 | 3+ | - | Осаждается |
| Пример 9 | 2,0 | 3+ | - | Осаждается |
| Пример 10 | 2,5 | 3+ | - | Небольшой осадок |
Таблица 4 показывает, что с более высокой концентрацией конкретного поверхностно-активного вещества, никакого осадка не наблюдали в растворе ДАБ-содержащего субстрата даже после долговременного хранения, проявляющего хорошую стабильность при хранении.
Набор Примера 13 дополнительно подвергали ускоренному тесту при 37°С в течение 3 месяцев и тесту на замораживание-оттаивание при хранении при -20°С в течение 3 дней, и компонентные растворы смешивали и оценивали. Результаты не показали проблемы при окрашиваемости и осаждении. Дополнительно, после ускоренного теста и теста на замораживание-оттаивание, смешанный раствор хранили в тени при 4°С в течение 5 дней и оценивали, получая в результате небольшое снижение интенсивности специфического окрашивания и отсутствие фонового окрашивания. Однако, для смешанного раствора после периода в 7 дней, наблюдали окрашивание с небольшим снижением интенсивности специфического окрашивания в сравнении с раствором, полученным в день оценки.
Пример 14: Набор ДАБ-содержащего субстрата в двухкомпонентной системе
Количество ДАБ растворяли в дистиллированной воде таким образом, что его концентрация в конечном полученном растворе ДАБ-содержащего субстрата была равна 20 мг/мл, чтобы получить хромофор-содержащий раствор (А). Хромогенный раствор (В) готовили посредством растворения пероксида водорода, имидазола, ЭДТК-2Na и Brij 35 в дистиллированной воде при концентрациях, равных 0,025 масс. %, 20 мМ, 2 мМ и 0,4 масс. % соответственно, и доведения рН до 7,5 только с помощью хлористоводородной кислоты. С использованием набора в двухкомпонентной системе, составленной из хромофор-содержащего раствора (А) и хромогенного раствора (В) 500 мкл раствора (В) смешивали с каплей раствора (А) (приблизительно 20 мкл) при перемешивании, чтобы приготовить раствор ДАБ-содержащего субстрата. В полученном растворе, содержание пероксида водорода было равно 0,025 масс. %, концентрация имидазола составляла 2 0 мМ, концентрация ЭДТК-2Na составляла 2 мМ, содержание Brij 35 составляло 0,4 масс. %, и рН был равен 7,5.
Используя полученный раствор ДАБ-содержащего субстрата, образцы для иммуногистохимического окрашивания получали в соответствии со способом, описанным выше. Полученные образцы оценивали по Параметрам Оценки (1) и (2), и полученный набор подвергали тесту на стабильность при хранении по Параметру Оценки (5). Результаты показаны в Таблице 5.
Примеры 15-18
Хромогенный реагент (В) получали таким же образом, как в Примере 14, за исключением того, что вместо доведения рН до 7,5 только с помощью хлористоводородной кислоты, буферный раствор, показанный в Таблице 5, титровали HCl или NaOH, чтобы иметь рН, показанный в Таблице 5. Оставшееся приготовление хромофор-содержащего раствора (А) и оценки проводили таким же образом, как в Примере 14. Результаты показаны в Таблице 5.
Таблица 5 показывает, что все хромогенные реагенты (В) проявляли превосходную стабильность при хранении в тесте на хранение, причем Пример 14 без буфера был особенно превосходным.
Пример 19
Хромогенный реагент (В) получали таким же образом, как в Примере 14, за исключением того, что концентрация ЭДТК-2Na, равная 2 мМ, изменялась до 1 мМ или 1,5 мМ. Готовили хромофор-содержащий раствор (А), и были сделаны оценки интенсивности специфического окрашивания и фонового окрашивания с получением результатов, аналогичных результатам в Примере 14. Цветовой тон окрашивания наблюдали, чтобы обнаружить, что окрашивание было коричневато-желтым до концентрации ЭДТК-2Na, равной 1 мМ, но темно-коричневым при 1,5 мМ или выше, показывая более предпочтительный цветовой тон.
ХИСГ (Хромогенная гибридизация in situ) вручную
(А) Подготовка тканевого среза, депарафинизация и регидратация)
Фиксированный в формалине погруженный в парафин срез ткани злокачественной опухоли молочной железы человека, подтвержденной, как HER2-положительной, нарезали по 5 мкм с помощью микротома, наносили на покрытое силаном предметное стекло и сушили при 37°С в течение 16 часов. Предметное стекло депарафинизировали посредством трехминутного выдерживания в слое ксилола три раза и затем регидратировали посредством трехминутного выдерживания в слое этанола четыре раза.
(В) Предварительная обработка
После окончательного выдерживания в этаноле предметное стекло дренировали, помещали в 3% пероксид водорода/воде для удаления эндогенной пероксидазы, и обеспечивали взаимодействие при 25°С в течение 5 минут. Затем, срез промывали фосфатным буфером (рН 7,6) в течение 1 минуты дважды.
После дренирования, предметное стекло помещали в 10 мМ цитратный буфер (рН 6,0), ранее нагретый до 98°С в теплой бане, и обеспечивали взаимодействие в течение 30 минут. Затем предметное стекло промывали в фосфатном буфере (рН 7,6) в течение 2 минут дважды.
После дренирования предметного стекла, 100 мкл 5-кратно разбавленного раствора протеазы (NICHIREI BIOSCIENCES, INC.) добавляли по каплям на предметное стекло, и взаимодействие обеспечивали при 25°С в течение 3 минут, а затем промывали фосфатным буфером (рН 7,6) в течение пяти минут три раза.
Для дегидратации, предметное стекло взаимодействовало с 70%, 90% и 100% этанолом (балансом являлась деионизированная вода) при 25°С в течение 1 минуты в каждом случае, и подвергали воздействию прямого потока холодного воздуха из сушилки, чтобы высушить ткань.
Денатурализация и гибридизация
Зонд HER-2 получали посредством ДИГ-мечения, с использованием линкера, причем последовательность длиной приблизительно 220 тысяч оснований была комплементарна области на человеческой хромосоме 17 (17q21.1), и 10 мкл зонда HER-2, полученного таким образом, добавляли по каплям вокруг высушенной ткани.
Покровное стекло 22 мм × 22 мм (MATSUNAMI GLASS IND., LTD) помещали над тканью, исключая воздушные пузырьки, и герметически закрывали бумажной лентой вокруг периферии. Затем предметное стекло помещали на горячую панель, установленную на 75°С, и термически денатурировали в течение 5 минут. Затем, предметное стекло переносили во влажную камеру, и взаимодействие осуществляли при 37°С.
Пост-гибридизация и обнаружение
Далее бумажную ленту осторожно отслаивали, и предметное стекло подвергали взаимодействию в буфере 2Х SSC (цитратном буфере) при 25°С в течение 5 минут, затем в буфере 2Х SSC, прежде нагретом до 72°С в течение 5 минут, и промывали фосфатным буфером (рН 7,6) в течение 1 минуты дважды.
Аминокислотный полимер конъюгировали с пероксидазой и фрагментом Fab' антитела против ДИГ для получения меченого полимера, и 100 мкл меченого полимера, полученного таким образом, добавляли по каплям на предметное стекло, проводили взаимодействие при 25°С в течение 30 минут, и промывали фосфатным буфером (рН 7,6) в течение 1 минуты три раза.
Перед реакцией раствор ДАБ-содержащего субстрата готовили из набора, составленного из компонентных растворов, приготовленных в Примерах и Сравнительных Примерах. После дренирования предметного стекла, 100 мкл раствора ДАБ-содержащего субстрата добавляли по каплям на предметное стекло, взаимодействие проходило при комнатной температуре в течение 10 минут, и затем проводили промывку в проточной воде в течение 5 минут.
После дренирования, для контрастного окрашивания, предметное стекло подвергали реакции в гематоксилине Майера в течение 15 секунд для ядерного окрашивания и промывали в проточной воде в течение 5 минут.
После промывки, предметное стекло дренировали и подвергали дегидратации и очистке посредством пропускания через слой этанола три раза, однократного трехминутного выдерживания в этаноле, однократного пропускания через слой ксилола и пятиминутного выдерживания в ксилоле дважды, и затем заливали в неводную среду для заливки (NICHIREI BIOSCIENCES, INC.) с получением образца.
Контроль 2: Набор ДАБ-содержащего субстрата в трехкомпонентной системе без имидазола, конкретного хелатирующего средства и конкретного поверхностно-активного вещества
Количество ДАБ растворяли в дистиллированной воде таким образом, что его концентрация в конечном полученном растворе ДАБ-содержащего субстрата была равна 15 мг/мл, чтобы получить хромофор-содержащий раствор (А). Отдельно, хромогенный раствор (В1) готовили посредством растворения 0,6 масс. % пероксида водорода в дистиллированной воде, и готовили субстрат-стабилизирующий раствор (В2') Трис-HCl с рн 7,6. С использованием набора из полученного хромофор-содержащего раствора (А), хромогенного раствора (В1) и субстрат-стабилизирующего раствора (В2'), по капле каждого компонентного раствора (приблизительно 4 0 мкл) смешивали в 1 мл дистиллированной воды при перемешивании, чтобы приготовить раствор ДАБ-содержащего субстрата.
Используя полученный раствор ДАБ-содержащего субстрата, образцы для ХИСГ получали в соответствии со способом, описанным выше. Полученные образцы оценивали по Параметрам Оценки (1) и (2). Результаты показаны в Таблице 6.
Сравнительный Пример 8: Набор ДАБ-содержащего субстрата в трехкомпонентной системе без конкретного поверхностно-активного вещества
Количество ДАБ растворяли в дистиллированной воде таким образом, что его концентрация в конечном полученном растворе ДАБ-содержащего субстрата была равна 15 мг/мл, чтобы получить хромофор-содержащий раствор (А). Отдельно, хромогенный раствор (В1) готовили посредством растворения 0,6 масс. % пероксида водорода в дистиллированной воде, и субстрат-стабилизирующий раствор (В2') готовили посредством растворения имидазола и ЭДТК-2Na в дистиллированной воде при концентрациях, равных 0,5 Ми 20 мМ, соответственно, и доведения рН до 7,5 с помощью хлористоводородной кислоты. С использованием набора из полученного хромофор-содержащего раствора (А), хромогенного раствора (В1) и субстрат-стабилизирующего раствора (В2'), по капле каждого компонентного раствора (приблизительно 4 0 мкл) смешивали в 1 мл дистиллированной воды при перемешивании, чтобы приготовить раствор ДАБ-содержащего субстрата. В полученном растворе, содержание пероксида водорода было равно 0,024 масс. %, концентрация имидазола составляла 2 0 мМ, концентрация ЭДТК-2Na составляла 0,8 мМ, и рН был равен 7,5.
Используя полученный раствор ДАБ-содержащего субстрата, образцы для ХИСГ получали в соответствии со способом, описанным выше. Полученные образцы оценивали по Параметрам Оценки (1) (4). Оценки по Параметрам Оценки (3) и (4) были сделаны после интервала, равного одному часу, после приготовления раствора ДАБ-содержащего субстрата. Результаты показаны в Таблице 6.
Пример 20: Набор ДАБ-содержащего субстрата в трехкомпонентной системе, содержащей ЭДТК-2Na в качестве хелатирующего средства
Вместо субстрат-стабилизирующего раствора (В2'), был приготовлен субстрат-стабилизирующий раствор (В2) посредством растворения имидазола, ЭДТК-2Na и Brij 35 (SIGMA-ALDRICH) в дистиллированной воде при концентрациях 0,5 мМ, 20 мМ и 10 масс. %, соответственно, и доведения рН до 7,5 с помощью хлористоводородной кислоты. За исключением приготовления раствора (В2), раствор ДАБ-содержащего субстрата был приготовлен с использованием полученного в результате набора таким же образом, как в Сравнительном Примере 8. В полученном растворе, концентрация пероксида водорода была равна 0,024 масс. %, концентрация имидазола составляла 20 мМ, концентрация ЭДТК-2Na была равна 0,8 мМ, содержание Brij 35 составляло 0,4 масс. %, и рН был равен 7,5. Оценки были сделаны таким же образом, как в Сравнительном Примере 8. Для Параметров Оценки (3) и (4), дополнительные оценки были сделаны после интервала, равного 3 дням, после приготовления раствор ДАБ-содержащего субстрата. Результаты показаны в Таблицах 6 и 7.
Результаты показывают, что набор настоящего изобретения, также, когда его применяют при ХИСГ, увеличивал интенсивность специфического окрашивания, уменьшал фоновое окрашивание и подавлял осаждение в растворе ДАБ-содержащего субстрата.
1. Набор диаминобензидин (ДАБ)-содержащего субстрата для окрашивания с использованием антитела, меченного пероксидазой, содержащий:
хромофор-содержащий раствор (А), включающий ДАБ в качестве хромофора пероксидазы и воду; и
хромогенный реагент (В), содержащий: по меньшей мере одно хелатирующее средство, выбранное из группы, состоящей из дигидрата динатриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты, диаммониевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты, гликолевого эфира диаминтетрауксусной кислоты и нитрилтриуксусной кислоты; неионогенное поверхностно-активное вещество из алкилового эфира полиоксиэтилена (ПОЭ), имидазол; пероксид водорода; и воду,
причем содержание указанного ДАБ в хромофор-содержащем растворе (А) составляет от 0,1 до 10 мг/мл, содержание указанного хелатирующего средства в хромогенном реагенте (В) составляет от 0,1 до 10 мМ, содержание указанного неионогенного поверхностно-активного вещества из алкилового эфира полиоксиэтилена (ПОЭ) в хромогенном реагенте (В) составляет от 0,02 до 30 масс.%, содержание указанного имидазола в хромогенном реагенте (В) составляет от 3 до 300 мМ, и содержание указанного пероксида водорода в хромогенном реагенте (В) составляет от 0,001 до 0,3 масс.%, соответственно, в пересчете на концентрацию в растворе ДАБ-содержащего субстрата для применения, приготовленного посредством смешивания или смешивания и разведения компонентных растворов набора ДАБ-содержащего субстрата для окрашивания, и
где указанный набор находится в системе из двух или более компонентов, причем по меньшей мере указанный хромофор-содержащий раствор (А) и указанный хромогенный реагент (В) хранятся раздельно.
2. Набор по п.1, где указанный хромогенный реагент (В) находится в двухкомпонентной системе, где хромогенный раствор (В1), содержащий указанный пероксид водорода и указанную воду, и субстрат-стабилизирующий раствор (В2), содержащий указанное хелатирующее средство, указанное неионогенное поверхностно-активное вещество из алкилового эфира ПОЭ, указанный имидазол и указанную воду, хранятся раздельно, и, где указанный набор находится в трехкомпонентной системе.
3. Набор по п.1 или 2 для применения при иммуноокрашивании или окрашивании при гибридизации in situ.
4. Набор по п.1 или 2, где указанное неионогенное поверхностно-активное вещество из алкилового эфира ПОЭ представляет собой по меньшей мере одно поверхностно-активное вещество, выбранное из группы, состоящей из лаурилового эфира ПОЭ (23) (Brij 35), цетилового эфира ПОЭ (20) (Brij 58), стеарилового эфира ПОЭ, олеилового эфира ПОЭ, миристилового эфира ПОЭ и октилдодецилового эфира ПОЭ.
5. Набор по п.4, где указанное неионогенное поверхностно-активное вещество представляет собой лауриловый эфир ПОЭ (23) (Brij 35).
6. Набор по п.5, где указанное хелатирующее средство представляет собой ЭДТК-2Na.
7. Набор по п.1 или 2, где рН хромогенного реагента (В) или субстрат-стабилизирующего раствора (В2) регулируют таким образом, что рН раствора ДАБ-содержащего субстрата для применения, приготовленного посредством смешивания или смешивания и разведения компонентных растворов набора ДАБ-содержащего субстрата для окрашивания, равен 5-9.
8. Набор по п.1 или 2, где указанная пероксидаза представляет собой пероксидазу хрена.
9. Набор по п.1 или 2, где указанное неионогенное поверхностно-активное вещество из алкилового эфира ПОЭ представляет собой лауриловый эфир ПОЭ (23) (Brij 35), и указанное хелатирующее средство представляет собой ЭДТК-2Na,
причем содержание указанного ЭДТК-2Na составляет от 0,3 до 3 мМ, содержание указанного лаурилового эфира ПОЭ (23) (Brij 35) составляет от 0,1 до 5 масс.%, содержание указанного имидазола составляет от 5 до 100 мМ, и содержание указанного пероксида водорода составляет от 0,01 до 0,05 масс.%, соответственно.
