Способ клонального микроразмножения кирказона маньчжурского (aristolochia manshuriensis kom.)

Изобретение относится к области биотехнологии растений. Изобретение представляет собой способ клонального микроразмножения эндемика Маньчжурского флористического района Aristolochia manshuriensis Kom., включающий вычленение апикальных и латеральных почек, стерилизацию гипохлоритом натрия (экспозиция 7-10 мин), высаживание на питательные среды MS с добавлением 0,8 мг/л 6-ВАР и 0,05 мг/л ИУК, размножение микропобегов, их последующее укоренение на среде MS, содержащей 20 мг/л сахарозы и ИМК в концентрации 3-5 мг/л, адаптацию растений-регенерантов к условиям ex vitro посредством высаживания на смесь песка, торфа и дерновой листовой земли в соотношении 1:1:1, предварительно простерилизованной при 85-90°С в течение 1-2 ч. Изобретение позволяет увеличить выход растений-регенерантов более чем до 150 тысяч саженцев в год. 6 ил.

 

Изобретение относится к области биотехнологии растений, в частности к способам размножения редких и исчезающих растений, и может быть использовано для массового получения качественного посадочного материала лекарственного и декоративного растения кирказона маньчжурского, трудно размножаемого генеративным и вегетативным способами. Полученные растения могут использоваться для реинтродукции кирказона маньчжурского в качестве ценного ресурса для медицинской промышленности и посадочного материала в ландшафтном дизайне.

Предлагаемое изобретение является новым, так как в патентной и научно-технической литературе не найдено решения с заявленной совокупностью отличительных признаков, то есть оно не известно из уровня техники, значит, соответствует критерию "новизна".

Реликтовые растения, в частности представитель семейства Aristolochiaceae (кирказоновые), к которому относится Aristolochia manshuriensis Kom. (кирказон маньчжурский), представляют особый интерес для клонального микроразмножения. Вид внесен в Красную книгу РФ, имеет категорию редкости 1(E). Таксоны и популяции, численность особей которых уменьшилась до критического уровня таким образом, что в ближайшее время они могут исчезнуть (таких видов насчитывается порядка сорока) [1, 2].

Специфически протекающие процессы опыления и оплодотворения у реликтов, которые изначально существовали в условиях, отличающихся от современных, обусловливают слабое завязывание плодов. К лимитирующим факторам также относится малая численность в популяции, слабая семенная продуктивность, отсутствие естественных агентов распространения семян, а также заготовка сырья для использования в народной медицине. С этим связано постоянное уменьшение численности кирказона маньчжурского. Все это делает необходимым проведение исследований по разработке методики клонального размножения и определяет актуальность данной работы [3, 4].

Известен способ размножения кирказона маньчжурского семенами. В литературе отмечено, что семена кирказона хорошо прорастают (всхожесть до 95%) при осеннем и весеннем посеве, однако завязываемость плодов является низкой из-за узкой специализации цветка кирказона маньчжурского к опылению [5]. Вегетативное размножение Aristolochia manshuriensis также затруднено, о чем свидетельствуют результаты по размножению кирказона в условиях интродукции и слабое укоренение черенков - 15% [6].

Альтернативой семенному размножению и зеленому черенкованию кирказона маньчжурского является метод клонального микроразмножения через культуру меристем. Однако до настоящего времени так и не определен оптимальный состав питательной среды, обеспечивающей интенсивное формирование микропобегов кирказона из изолированных меристем [7, 8].

Изобретение представляет собой способ размножения растений Aristolochia manshuriensis Kom. методом культуры in vitro, включающий вычленение апикальных и латеральных почек, стерилизацию, высаживание на питательные среды, размножение микропобегов, их последующее укоренение, адаптацию растений-регенерантов к условиям ex vitro. После адаптации к нестерильным условиям и доращивания получают стандартные саженцы кирказона маньчжурского с закрытой корневой системой. Преимущества предлагаемой нами технологии и использование заявленного способа позволяет получить более 150 тысяч саженцев в год от одного экспланта.

Ход работы

В ходе наших исследований разработана методика клонального микроразмножения Aristolochia manshuriensis Kom.

В качестве первичных эксплантов использовали апикальные и латеральные почки, фрагменты стебля длиной 1 см с 1-2 пазушными почками, взятые как с молодых растений (1-2-летних), так и с взрослых (до 10 лет).

Стерилизацию эксплантов проводили с помощью хлорсодержащего (гипохлорит натрия) стерилизующего агента. Экспозиция составила 7-10 минут.

На стадии пролиферации используется питательная среда Мурасиге-Скуга (1962), дополненная регулятором роста 6-ВАР (6-бензиламинопурин) в различных концентрациях (0,3; 0,5; 0,8; 1; 2 мг/л). При культивировании на средах, сочетающих ауксины и цитокинины, для многих видов растений было установлено увеличение регенерационного потенциала [9], поэтому дополнительно были испытаны среды, содержащие регуляторы роста как цитокининовой природы - 6-БАП (0,3; 0,5; 0,8; 1; 2 мг/л), так и ауксиновой природы - ИУК (индолил-3-уксусная кислота) в концентрации 0,05 мг/л. Оптимальной средой для культивирования является среда с добавлением 6-БАП в концентрации 0,8 мг/л и ИУК 0,05 мг/л. На этой среде были отмечены максимальные морфометрические показатели: коэффициент размножения составил 14,84, а длина побега - 38,80±5,25 мм (фиг. 1-2). В условиях лаборатории микропобеги Aristolochia manshuriensis выращивают при искусственном освещении (3000 лк) и фотопериоде 16/8 ч, температуре 23-25°C и влажности 70%. Укореняют побеги на агаризированной среде MS, содержащей 20 мг/л сахарозы. На данном этапе были испытаны два регулятора роста: ИУК и ИМК (индолилмасляная кислота) в концентрации 3; 5 мг/л. Наилучшие результаты были достигнуты на среде с добавлением ИМК, разница между сравниваемыми концентрациями (3 и 5 мг/л) оказалась недостоверной (фиг. 3). Затем растения-регенеранты высаживают на смесь песка, торфа и дерновой листовой земли в соотношении 1:1:1, предварительно простерилизованной при 85-90°C в течение 1-2 ч.

Различные стадии клонального микроразмножения кирказона маньчжурского показаны на фиг. 4-6.

Источники информации

1. Красная книга Российской Федерации (растения и грибы). - М.: Товарищество научных изданий КМК, 2008. - 855 с.

2. Красная книга. Дикорастущие виды флоры СССР, нуждающиеся в охране. Л.: 1975, С. 72-73.

3. Наконечная О.В. Репродуктивная биология Aristolochia manshuriensis (Aristolochiaceae) в условиях интродукции. / О.В. Наконечная, О.Г. Корень, B.C. Сидоренко // Растительные ресурсы. - Вып. 3. - 2005. - С. 14-24.

4. Растительные ресурсы СССР. М.: Наука, 2005. - С. 45-46.

5. Наконечная О.В. Биология размножения и генетическая изменчивость кирказона маньчжурского (Aristolochia manshuriensis Kom.) в Приморском крае: Автореф. … дис. д-ра биол. наук. - Владивосток, 2007. - 22 с.

6. Шульгина В.В. Древесные лианы и их культура в Ленинграде // Интродукция растений и зеленое строительство. - М. - Л.: Изд-во Академии наук СССР, 1955. - С. 157-194.

7. Доан Т.Т., Клональное микроразмножение редких и исчезающих видов растений. / Т.Т. Доан, Е.А. Калашникова, О.И. Молканова // Известия ТСХА. - Вып. 5. - 2012. - С. 48-52.

8. Демиденко Е.Н., Гафицкая И.В., Михеева (Бабикова) А.В. К вопросу микроклонального размножения видов рода кирказон (Aristolochia L.). Водные и экологические проблемы, преобразование экосистем в условиях глобального изменения климата: VI Дружининские чтения: Материалы Всероссийской конференции с международным участием. 28-30 сентября. Хабаровск, 2016. - С. 128-130.

9. Муратова С.А. Индукция морфогенеза из изолированных соматических тканей растений. - Мичуринск: МичГАУ, 2011. - 107 с.

Способ клонального микроразмножения эндемика Маньчжурского флористического района Aristolochia manshuriensis Kom., включающий вычленение апикальных и латеральных почек, стерилизацию гипохлоритом натрия (экспозиция 7-10 мин), высаживание на питательные среды MS с добавлением 0,8 мг/л 6-ВАР и 0,05 мг/л ИУК, размножение микропобегов, их последующее укоренение на среде MS, содержащей 20 мг/л сахарозы и ИМК в концентрации 3-5 мг/л, адаптацию растений-регенерантов к условиям ex vitro посредством высаживания на смесь песка, торфа и дерновой листовой земли в соотношении 1:1:1, предварительно простерилизованной при 85-90°С в течение 1-2 ч.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ клонального микроразмножения иван-чая узколистного Chamaenerion angustifolium L.Holub, включающий вычленение пазушных меристем, стерилизацию эксплантов 7%-ным гипохлоритом кальция в течение 7 минут, высаживание на питательные среды MS с добавлением 6-ВАР в количестве 0,5 мг/л и MS с добавлением FeSO4⋅7H2O в количестве 30 мл/л, 6-ВАР в количестве 0,5 мг/л, IAA в количестве 0,01 мг/л, размножение микропобегов, их последующее укоренение на среде MS, дополненной 1 мг/л IBA, адаптацию растений-регенерантов к условиям ex vitro.

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ отбора материнских растений Rhododendron ledebourii Pojark., продуцирующих семенное потомство с разным уровнем стабильности генетического материала, включающий сбор и проращивание семян фенотипически здоровых материнских растений Rhododendron ledebourii Pojark., приготовление из корешка каждого проростка длиной 0,5-1 см постоянно-давленного микропрепарата, анализ следующих цитогенетических показателей каждого микропрепарата: «митотическая активность» как отношение числа делящихся клеток к общему числу подсчитанных клеток (%), «уровень патологий митоза» как отношение числа клеток с нарушениями митоза к общему числу делящихся клеток (%), «спектр патологий митоза» как отношение числа клеток с нарушением деления к числу делящихся клеток с аберрациями (%), «уровень клеток с остаточными ядрышками» на стадии метафазы-телофазы митоза как отношение числа клеток с остаточными ядрышками к общему числу клеток на указанных стадиях (%), «средняя площадь поверхности одиночных ядрышек» (в мкм2); где проводят анализ не менее 19 микропрепаратов и не менее 500 клеток каждого микропрепарата, «средняя площадь поверхности одиночных ядрышек» определяется по 200 клеткам на каждом микропрепарате, полученные значения цитогенетических показателей сравнивают со значениями для мутабильной или слабомутабильной группы, причем показатель «митотическая активность» относится к мутабильной группе при значении не более 8%, «уровень патологий митоза» - при значении более 2,5%, «спектр патологий митоза» - более 50%, «уровень клеток с остаточными ядрышками» - более 8%, «площадь поверхности одиночных ядрышек» - при значении не менее 76 мкм2, в противном случае показатели относятся к слабомутабильной группе; если более 2 показателей оказались в мутабильной группе, то и проросток относят к мутабильной группе, а если 2 и менее, то к слабомутабильной; если не менее половины проростков оказались в слабомутабильной группе, уровень стабильности генетического материала материнского растения оценивается как высокий, если менее - то, как низкий.

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к изолированным цис-регуляторным элементам для придания промотору индуцируемости патогеном, химерному промотору, обладающему индуцируемостью патогеном, рекомбинантному гену для экспрессии в растительной клетке после контакта с патогеном, экспрессирующим вектору для повышения устойчивости растения к патогенам, где патоген представляет собой грибок или оомицет.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к мутантному растению сорго, содержащему в своем геноме по меньшей мере один полинуклеотид, где указанный полинуклеотид кодирует полипептид, имеющий замену аланина на треонин в положении 93 большой субъединицы белка AHAS сорго, причем указанное растение имеет повышенную устойчивость к одному или более имидазолиноновым гербицидам, к его семени, а также к способу его получения и способу его идентификации.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к трансгенному растению, для получения неполярного липида. Также раскрыты часть трансгенного растения для получения неполярного липида, рекомбинантная клетка для получения неполярного липида.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к способу интегрирования интересующей последовательности нуклеиновой кислоты в ген FAD2 в клетку сои, включающему расщепление сайт-специфическим образом гена FAD2 клетки сои с использованием нуклеазы с «цинковыми пальцами».

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ оценки по цитогенетическим показателям качества семян Rhododendron ledebourii Pojark., включающий сбор и проращивание семян фенотипически здоровых материнских растений Rhododendron ledebourii Pojark, приготовление постоянно-давленного микропрепарата из корешка каждого проростка длиной 0,5-1 см, анализ цитогенетических показателей каждого микропрепарата, таких как «митотическая активность» как отношение числа делящихся клеток к общему числу подсчитанных клеток (%), «доля клеток на стадии профазы митоза» (%) как отношение числа клеток в профазе к числу делящихся клеток, «доля клеток на стадии метафазы митоза» (%) как отношение числа клеток в метафазе к числу делящихся клеток, «доля клеток на стадии анафазы-телофазы митоза» (%) как отношение числа клеток в анафазе-телофазе к числу делящихся клеток, «уровень патологий митоза» как отношение числа клеток с нарушениями митоза к общему числу делящихся клеток (%), ядрышковые характеристики «уровень клеток с остаточными ядрышками на стадии метафазы-телофазы митоза» как отношение числа клеток с остаточными ядрышками к общему числу клеток на указанных стадиях (%) и «средняя площадь поверхности одиночных ядрышек» (мкм2), где сбор семян производят от каждого материнского растения в отдельности, проводят анализ не менее 19 микропрепаратов и не менее 500 клеток каждого микропрепарата, «средняя площадь поверхности одиночных ядрышек» определяется по 200 клеткам на каждом микропрепарате, полученные значения цитогенетических показателей сравнивают со значениями для мутабильной или слабомутабильной групп, причем показатель «митотическая активность» относится к мутабильной группе при значении не более 8%, «доля клеток на стадии профазы митоза» - при значении свыше 45%, «доля клеток на стадии метафазы митоза» - при значении свыше 25%, «доля клеток на стадии анафазы-телофазы митоза» - при значении не более 30%, «уровень клеток с остаточными ядрышками на стадии метафазы-телофазы митоза» - при значении свыше 8%, «средняя площадь поверхности одиночных ядрышек» - при значении от 76 мкм2 и более, в противном случае показатели относятся к слабомутабильной группе; если более 3 показателей оказались в мутабильной группе, то и проросток относят к мутабильной группе, а если 3 и менее - то к слабомутабильной; если не менее половины проростков оказались в слабомутабильной группе, качество семян материнского растения оценивается как высокое, если менее - то как низкое.

Изобретение относится к области биотехнологии растений. Изобретение представляет собой способ клонального микроразмножения алычи in vitro, включающий культивирование микропобегов алычи на этапе мультипликации на среде QL с добавлением сахарозы 30 г/л, агар-агара 9 г/л, БАП 0,5-2 мг/л и зеатина 0,05-1 мг/л, укоренение микропобегов на половинной по макросолям среде QL с добавлением сахарозы 20 г/л, агар-агара 9 г/л, ИУК 0,1-1 мг/л и/или ИМК 0,1-1 мг/л, и/или НУК 0,1-1 мг/л, при этом этап мультипликации проводят в два пассажа по три недели каждый, причем на второй пассаж переносят целые конгломераты почек и побегов без разделения, а этап укоренения проводят в течение первых 2-7 суток в темноте, а затем - 1-2 недели на свету.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к нуклеиновой кислоте, кодирующей белок слияния из многих субъединиц гликолатдегидрогеназы, а также трансгенной клетке растения, трансгенному растению и трансгенному семени, содержащим вышеуказанную нуклеиновую кислоту.

Изобретение относится к биотехнологии. Изобретение представляет собой способ, включающий индукцию микропобегов непосредственно из апикальной недифференцированной ткани вегетативных почек экспланта на агаризованной среде, содержащей минеральную основу по Мурасиге-Скуга и дополнительно включающей 0,25-2,0 мг/л БАП, 20-30 г/л сахарозы, 6 г/л агара.

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ клонального микроразмножения иван-чая узколистного Chamaenerion angustifolium L.Holub, включающий вычленение пазушных меристем, стерилизацию эксплантов 7%-ным гипохлоритом кальция в течение 7 минут, высаживание на питательные среды MS с добавлением 6-ВАР в количестве 0,5 мг/л и MS с добавлением FeSO4⋅7H2O в количестве 30 мл/л, 6-ВАР в количестве 0,5 мг/л, IAA в количестве 0,01 мг/л, размножение микропобегов, их последующее укоренение на среде MS, дополненной 1 мг/л IBA, адаптацию растений-регенерантов к условиям ex vitro.

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ сохранения ювенильного статуса культуры in vitro малины (Rubus idaeus), включающий перенос микрорастений малины на стадиях мультипликации или укоренения на питательные среды в условиях с пониженным уровнем освещенности и пониженной температурой, где смена освещенности и температуры происходит через 5 дней на стадии мультипликации и через 14 дней на стадии укоренения после начала очередного пассажа культивирования, при этом в качестве питательной среды на стадии мультипликации используют питательную среду MS с добавлением сахарозы 30 г/л, инозитола 100 мг/л, пиридоксина 0,1 мг/л, тиамина 0,1 мг/л, никотиновой кислоты 0,5 мг/л, 6-БАП 0,8 мг/л и зеатина 0,1 мг/л, а на стадии укоренения в качестве питательной среды используют питательную среду 1/2 QL с добавлением сахарозы 20 г/л, инозитола 100 мг/л, пиридоксина 0,1 мг/л, тиамина 0,1 мг/л, никотиновой кислоты 0,5 мг/л, индолилмасляной кислоты (ИМК) 0,1 мг/л, ИУК 0,1 мг/л, при этом уровень интенсивности освещенности снижается до 1000±200 люкс, а температура - до 4-8°С.

Изобретение относится к области биотехнологии растений и может быть использовано в питомниководстве для производства посадочного материала с помощью технологии клонального микроразмножения.

Изобретение относится к области сельского хозяйства, а именно к картофелеводству. Способ включает получение оздоровленных растений картофеля для черенкования (промежуточный продукт), мини-клубней картофеля (промежуточный продукт), клубней супер – суперэлиты (промежуточный продукт), клубней суперэлиты (промежуточный продукт), клубней элиты (промежуточный продукт), клубней первой полевой репродукции (конечный продукт).

Изобретение относится к области биотехнологии растений. Изобретение представляет собой способ клонального микроразмножения алычи in vitro, включающий культивирование микропобегов алычи на этапе мультипликации на среде QL с добавлением сахарозы 30 г/л, агар-агара 9 г/л, БАП 0,5-2 мг/л и зеатина 0,05-1 мг/л, укоренение микропобегов на половинной по макросолям среде QL с добавлением сахарозы 20 г/л, агар-агара 9 г/л, ИУК 0,1-1 мг/л и/или ИМК 0,1-1 мг/л, и/или НУК 0,1-1 мг/л, при этом этап мультипликации проводят в два пассажа по три недели каждый, причем на второй пассаж переносят целые конгломераты почек и побегов без разделения, а этап укоренения проводят в течение первых 2-7 суток в темноте, а затем - 1-2 недели на свету.
Изобретение относится к области биохимии, в частности к кукурузному продукту, содержащему семя кукурузы от растения кукурузы, несущего генотип коричневой центральной жилки 3 (bm3) в гомозиготном состоянии и генотип мучнистости-2 (fl2) в гомозиготном состоянии.

Изобретение относится к биотехнологии. Изобретение представляет собой способ, включающий индукцию микропобегов непосредственно из апикальной недифференцированной ткани вегетативных почек экспланта на агаризованной среде, содержащей минеральную основу по Мурасиге-Скуга и дополнительно включающей 0,25-2,0 мг/л БАП, 20-30 г/л сахарозы, 6 г/л агара.

Изобретение относится к области сельского хозяйства, в частности к биотехнологии. Способ включает высадку микрорастений на пластиковые поддоны, покрытые лутрасилом с предварительно выполненными в нем посадочными отверстиями, путем погружения корневой системы растений в водный антисептический раствор с последующим обеспечением проточной циркуляции воды в поддоне и верхнего мелкодисперсного увлажнения растений.

Изобретение относится к биотехнологии. Изобретение представляет собой способ микроклонального размножения картофеля, при котором выделяют апикальные этиолированные проростки (1-1,5 см), стерилизуют в 0,3%-ном растворе диацида в течение 3-5 минут с последующей трехкратной промывкой стерильной H2O, культивируют меристемы, получают оздоровленные растения, проводят микрочеренкование, черенки вносят в стеклянные банки с металлической крышкой.

Изобретение относится к сельскохозяйственной биотехнологии. Изобретение представляет собой питательную среду для ввода меристем винограда в условия in vitro, содержащую аммоний азотнокислый, калий азотнокислый, кальций азотнокислый, кальций хлористый, магний сернокислый, натрий фосфорнокислый, железо сернокислое, этилендиаминотетраацетат натрия, борную кислоту, марганец сернокислый, цинк сернокислый, калий йодистый, натрий молибденовокислый, медь сернокислую, кобальт хлористый, миоинозит, тиамин, пиридоксин, 6-бензиламинопурин, сахарозу, агар, воду при следующем соотношении компонентов, мг/л: аммоний азотнокислый 350-450; калий азотнокислый 1000-1200; кальций азотнокислый 400-500; кальций хлористый 50-70; магний сернокислый 300-350; натрий фосфорнокислый 150-200; железо сернокислое 27,8-30,0; этилендиаминотетраацетат натрия 37,3-40,0; борная кислота 6,0-6,4; марганец сернокислый 22,0-22,6; цинк сернокислый 8,0-9,2; калий йодистый 0,40-0,80; натрий молибденовокислый 0,2-0,3; медь сернокислая 0,02-0,03; кобальт хлористый 0,02-0,03; миоинозит 50-100; тиамин 0,2-0,5; пиридоксин 0,2-0,5; 6-бензиламинопурин 0,2-0,5; сахароза 20000-30000; агар 5000-6000; вода остальное до 1,0 л.

Изобретение относится к области биотехнологии растений. Изобретение представляет собой способ клонального микроразмножения эндемика Маньчжурского флористического района Aristolochia manshuriensis Kom., включающий вычленение апикальных и латеральных почек, стерилизацию гипохлоритом натрия, высаживание на питательные среды MS с добавлением 0,8 мгл 6-ВАР и 0,05 мгл ИУК, размножение микропобегов, их последующее укоренение на среде MS, содержащей 20 мгл сахарозы и ИМК в концентрации 3-5 мгл, адаптацию растений-регенерантов к условиям ex vitro посредством высаживания на смесь песка, торфа и дерновой листовой земли в соотношении 1:1:1, предварительно простерилизованной при 85-90°С в течение 1-2 ч. Изобретение позволяет увеличить выход растений-регенерантов более чем до 150 тысяч саженцев в год. 6 ил.

Наверх