Генетическая конструкция pmitoascpf1, кодирующая нуклеазу ascpf1 с детерминантной импорта в митохондрии клеток человека

Изобретение относится к биотехнологии, медицине и терапии наследственных заболеваний. Предложена генетическая конструкция pMitoAsCpfl, обеспечивающая экспрессию нуклеазы AsCpfl, специфически импортируемую в митохондрии клеток человека. Указанная конструкция содержит промотор цитомегаловируса, митохондриальную лидерную последовательность гена СОХ8А, 3xFLAG, нуклеазу AsCpfl с SEQ ID NO:1, Т2А, ген TurboGFP, 3’-UTR гена SOD2, ориджин репликации, ген устойчивости к ампицилину. Изобретение может быть использовано для элиминирования митохондриальной ДНК, содержащей патогенные мутации, ассоциированные с наследственными митохондриальными патологиями. 1 ил.

 

Изобретение относится к медицине, терапии наследственных заболеваний и молекулярной биологии и может, в комплексе с направляющей РНК, быть использовано для элиминирования патогенных мутаций митохондриальной ДНК (мтДНК), ассоциированных с различными наследственными митохондриальными патологиями.

Известен «Способ лечения атрофии зрительного нерва различной этиологии» (патент РФ №2375019, A61F 9/007, A61K 35/28, А61Р 27/02, 2003 г.), обеспечивающий улучшение или стойкую стабилизацию зрительных функций на небольшом временном промежутке, поскольку не направлен на коррекцию наследственного материала митохондрий.

Известно изобретение «Митохондриальные таргетные антиоксиданты» (Mitochondrially targeted antioxidants) (патент США № US 6331532, C07F 9/54, C07F 9/572, C07F 9/655, A61K 31/665, A61K 31/66, 1998 г.), которое является технологией импорта функциональных молекул в митохондрии, с использованием липофильных агентов с иммобилизованными молекулами антиоксидантов, но не дает возможности осуществлять редактирование патогенных мутаций в митохондриальной ДНК.

Известно изобретение «Система доставки нуклеиновых кислот в митохондрии» (Mitochondrial nucleic acid delivery systems) (патент Канады № CA 2678572 2008 г. A61K48/00D2, C12N15/864A, C12N15/90B4). Недостатками данной технологии является то, что она не подразумевает доставку в митохондрии белков, поэтому не может быть использована для импорта нуклеазы AsCpf1 в митохондрии, следовательно, не подходит для работы с системой CRISPR/Cpf1.

Из данных отечественной и зарубежной литературы, патентов и патентных заявок авторам не известно использование генетических конструкций на базе системы редактирования генома CRISPR/Cpf1 для элиминирования патогенных мутаций мтДНК путем доставки нуклеазы AsCpf1 в митохондрии; генетические конструкции отличаются модификацией последовательности кодирующей AsCpf1, обеспечивающей доставку данной нуклеазы в митохондрии.

Отличительным признаком изобретения является модификация нуклеазы AsCpf1, обеспечивающая ее доставку в митохондрии для обеспечения универсального механизма для специфической элиминации дефектной мтДНК, несущей ту или иную мутацию. Новизну представляют нуклеотидные последовательности конструкции, которая кодирует модифицированный белок AsCpf1.

Задачей заявляемого изобретения является элиминирование митохондриальной ДНК, содержащей патогенные мутации, ассоциированные с наследственными митохондриальными патологиями.

Поставленная задача решается тем, что генетическая конструкция заявляемого изобретения, после попадания в цитоплазму клеток, обеспечивает экспрессию кодируемых ею молекул нуклеазы AsCpf1, которые, используя собственный аппарат клетки, транспортируются в митохондрии, где обеспечивают элиминирование мутантных молекул мтДНК путем распознавания специфического участка последовательности посредством взаимодействия со специфической направляющей РНК и последующей рестрикцией обеих цепей мтДНК. Поскольку в митохондриях отсутствуют системы репарации двухцепочечных разрывов, такие «разрезанные» мтДНК элиминируются экзонуклеазами. Общий пул мтДНК в митохондриях восстанавливается за счет мтДНК, не имеющих мутации.

Техническим результатом изобретения является обеспечение системы элиминации мутантной мтДНК и способа ее доставки в органеллы.

Принцип функционирования предлагаемых веществ базируется на особенностях работы системы CRISPR/Cpf1. Нуклеаза AsCpf1 взаимодействует с особыми направляющими молекулами РНК, образуя комплекс, который специфически взаимодействует с участком двухцепочечной ДНК комплементарным участку направляющей РНК. В результате такого взаимодействия функциональный домен AsCpf1 вносит разрывы в обе цепи ДНК.

Генетическая конструкция pMitoAsCpf1, кодирующая нуклеазу AsCpf1 с детерминантной импорта в митохондрии клеток человека, представляет собой плазмидные векторы, разработанные на базе векторов pUC19 и pTurboGFP-mito. Плазмидный вектор обеспечивает возможность трансформации компетентных клеток E.coli с последующей наработкой большого количества копий. Позволяют отбирать трансформированные колонии на селективной среде, содержащей антибиотик. Обеспечивают экспрессию нуклеазы AsCpf1 в клетках млекопитающих и человека, а также доставку продуктов трансляции в митохондрии. Проникая в митохондрии, нуклеаза AsCpf1 может быть использована для специфической элиминации мтДНК, содержащей любую из описанных мутаций благодаря взаимодействию с определенной направляющей РНК.

Белок AsCpf1 обладает нуклеазной активностью и имеет два активных центра, каждый их которых участвует в расщеплении одной из цепей двухцепочечной ДНК. Нуклеаза AsCpf1 связывается с направляющей РНК, образуя комплекс. Данный комплекс сканирует молекулу ДНК и в случае обнаружения гомологичной последовательности формирует дуплекс с участком направляющей РНК. После образования дуплекса нуклеаза AsCpf1 вносит разрывы в обе цепи ДНК в определенной структуре дуплекса, названной РАМ (protospacer adjacent motif). Ближайший аналог нуклеазы семейства Cpf1 является нуклеаза Cas9. Последняя, однако, обладает большим размером, в силу чего хуже импортируется в митохондрии.

Генетическая конструкция pMitoAsCpf1 содержит ориджин репликации, ген устойчивости к ампициллину, промотор цитомегаловируса митохондриальную лидерную последовательность гена СОХ8А, 3×FLAG, последовательность, кодирующую модифицированную нуклеазу AsCpf1, Т2А, ген TurboGFP, 3' UTR гена SOD2.

Описание способа получения генетической конструкции заявляемого изобретения.

Карта генетической конструкции pMitoAsCpf1 была построена при помощи программного обеспечения SnapGene. Для сборки использовали фрагменты плазмид pTurboGFP-mito (# FP517, Evrogen), pUC19 и pY010 AsCpf1, а также синтезированные по заказу двухцепочечные фрагменты ДНК - gBloks (IDT, США). Амплификацию фрагментов ДНК проводили при помощи полимеразы PfuTurbo Сх (Agilent Technologies, США) на амплификаторе С1000 Touch (Bio-Rad, США). Олигонуклеотидные праймеры синтезировали с помощью фосфорамидитного метода на AMS-2000 («Биоссет», Россия), очищали методом обращено-фазовой хроматографии на OPS-1000 («Биоссет») с применением реагентов компании «Glen Research» (США). Сборку плазмид осуществляли с использованием ферментативной системы USER (NEB, США), а также классических методов молекулярного клонирования. «Бесшовное» соединение фрагментов ДНК проводили путем сборки по Гибсону (NEB, США) согласно инструкции фирмы производителя.

На фиг. 1 представлена карта генетической конструкции pMitoAsCpf1, кодирующего нуклеазу AsCpf1, импортируемую в митохондрию.

Оценки эффективности заявляемой генетической конструкции для реализации указанного назначения проводилась на культуре клеток.

Клетки выращивали на покровных стеклах 15×15 мм в 12-луночных планшетах. Через 48 ч после трансфекции генетической конструкцией митохондрии окрашивали 150 нМ красителем MitoTracker® Red CMXRos (Life Technologies, США) в течение 30 мин. при 37°C согласно инструкции фирмы-производителя. Далее клетки промывали фосфатно-солевым буфером (PBS), фиксировали в течение 15 мин при комнатной температуре в 4% растворе параформальдегида, приготовленном на PBS, промывали 2 раза по 5 мин раствором PBS, обрабатывали клетки 0,2% Triton Х-100 на PBS в течение 10 мин и промывали клетки 2 раза по 5 мин PBS. Для блокирования неспецифического связывания антител клетки инкубировали в течение 30 мин с 10% раствором бычьего сывороточного альбумина (Sigma, США) в фосфатно-солевом буфере при 37°C. Инкубирование с первичными антителами против эпитопа 3×FLAG (Sigma, США) в разведении 1:500 в 3% BSA проводили при 37°C в течение 2 ч. После трехкратной промывки раствором PBS в течение 5 мин добавляли вторичные антитела (Life Technologies, США), конъюгированные с Alexa Fluor® 488 в разведении 1:500 в 3% BSA на PBS, и инкубировали при 37°C в течение 45 мин. Клетки промывали 3 раза по 5 мин буфером PBS, ядра окрашивали раствором 1 мкг/мл DAPI в PBS в течение 5 мин, промывали два раза по 5 мин в PBS и под покровное стекло наносили по 10 мкл раствора антифейда (90% глицерин, 0,1 М Tris-HCl и 23,3 мг/мл DABCO (1,4диазабисцикло(2,2,2)октан). Изображения получали с помощью инвертированного флуоресцентного микроскопа Axio Observer.Z1 (Carl Zeiss, Германия).

Использование заявляемых генетических конструкций позволяет осуществлять терапию наследственных митохондриальных патологий.

Генетическая конструкция pMitoAsCpfl, обеспечивающая экспрессию нуклеазы AsCpfl, специфически импортируемую в митохондрии клеток человека, представленная на фиг. 1 и содержащая промотор цитомегаловируса, митохондриальную лидерную последовательность гена СОХ8А, 3xFLAG, нуклеазу AsCpfl с SEQ ID NO:1, Т2А, ген TurboGFP, 3'-UTR гена SOD2, ориджин репликации, ген устойчивости к ампицилину.



 

Похожие патенты:

Представленная группа изобретений касается полинуклеотида, кодирующего вариант хоминг-эндонуклеазы (ХЭ) I-OnuI, экспрессионного вектора, содержащего такой полинуклеотид, полипептида эндонуклеазы, композиции для лечения гемоглобинопатии и клетки, содержащей указанные полинуклеотид, вектор или полипетид эндонуклеазы.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано при получении гетерогенных биокатализаторов для процессов биокаталитической трансформации органических соединений.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к ферментным биокатализаторам для детоксификации фосфорорганических соединений (ФОС) и нейтрализации активных форм кислорода.

Группа изобретений относится к способу понижения содержания ДНК в ферментационном бульоне, полученном от культивирования клеток-хозяев, являющихся клетками нитчатых грибов.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к способу получения биспецифичного антитела. Также раскрыт способ определения комбинации антигенсвязывающих сайтов.

Изобретение относится к области биологического обезвреживания микотоксинов. Способ основан на применении гексагистидинсодержащей органофосфатгидролазы, проявляющей высокую лактоназную активность с широким спектром действия, которую вводят в виде высокоочищенного растворимого или регидратированного лиофилизованного препарата, или ферментного полиэлектролитического комплекса, или препарата иммобилизованного фермента, или супернатанта клеточного гомогената в реакционную среду, содержащую микотоксины в концентрации до 0,5 г/кг или 0,5 г/л с последующим проведением процесса гидролиза лактона до 95-100%.

Изобретение относится к способу получения 2,4-дигидроксипентановой кислоты, включающему превращение пирувата в 4-гидрокси-2-оксопентановую кислоту с помощью альдольного присоединения и превращение 4-гидрокси-2-оксопентановой кислоты в 2,4-дигидроксипентановую кислоту посредством химического или ферментативного восстановления.

Группа изобретений относится к области биотехнологии. Предложен полинуклеотид, кодирующий трегалоза-6-фосфатфосфатазный полипептид.

Изобретение относится к области биохимии, генной инженерии и биотехнологии, в частности к нуклеиновым кислотам, кодирующим белки, которые обладают активностью фосфатазы фосфатидной кислоты.

Изобретение относится к области биохимии, генной инженерии и биотехнологии, в частности к способу получения рекомбинантной фосфатазы бактериальных липополисахаридов.

Предложен способ получения L-метионина, в котором О-фосфо-L-гомосерин (OPHS) и метантиол ферментативно превращают в L-метионин и Н3РО4 согласно схеме реакции: О-фосфо-L-гомосерин + CH3-SH <=> L-метионин + H3PO4.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению светочувствительного химерного белка, способного включать световой сигнал в сигнальный каскад метаботропного глутаматного рецептора 6 (mGluR6), который является природным компонентом клеточной мембраны ON-биполярных клеток во внутреннем слое сетчатки, что может быть использовано в медицине.

Изобретение относится к биотехнологии и биофармакологии. Предложен способ получения рекомбинантного пептидогликан-ассоциированного липопротеина (PAL) Legionella pneumophila.

Изобретение относится к биохимии. Описана молекула нуклеиновой кислоты для генетической терапии мукополисахаридозов.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к антигенсвязывающей молекуле (АСМ), которая специфически связывает связанный с мембраной человеческий карциноэмбриональный антиген (CEA).

Настоящее изобретение относится к биотехнологии и представляет собой экспрессионную плазмиду без устойчивости к антибиотику, которая содержит полинуклеотид, кодирующий белок-репрессор cI.

Изобретение относится к биохимии и представляет собой новый бифункциональный белок PSH, включающий человеческий пероксиредоксин Prx6 и марганцевую супероксиддисмутазу MnSOD, обладающий антиоксидантной активностью супероксиддисмутазы и пероксидазы.

Изобретение относится к области биотехнологии. Представлена рекомбинантная плазмида рСНВН для экспрессии в Pichia pastoris последовательности, кодирующей прокарбоксипептидазу Б, имеющая размер 10466 т.п.о и состоящая из XhoI/EcoRI - фрагмента ДНК вектора рР1С9К размером 9246 т.п.о.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к рекомбинантному фактору VIII, содержащему одну или более мутаций, приводящих к увеличению стабильности как фактора VIII, так и фактора VIIIa, а также к фармацевтической композиции для лечения гемофилии ее содержащей.

Изобретение относится к биохимии, в частности к моноклональному антителу человека, специфичному к альфа-токсину S. aureus.

Группа изобретений относится к области биотехнологии. Предложена плазмидная ДНК pQE30-A2.1, обеспечивающая экспрессию щелочной сериновой протеиназы, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую рекомбинантную щелочную сериновую протеиназу семейства S1 из Streptomyces avermitilis VKM Ac-1301.

Изобретение относится к биотехнологии, медицине и терапии наследственных заболеваний. Предложена генетическая конструкция pMitoAsCpfl, обеспечивающая экспрессию нуклеазы AsCpfl, специфически импортируемую в митохондрии клеток человека. Указанная конструкция содержит промотор цитомегаловируса, митохондриальную лидерную последовательность гена СОХ8А, 3xFLAG, нуклеазу AsCpfl с SEQ ID NO:1, Т2А, ген TurboGFP, 3’-UTR гена SOD2, ориджин репликации, ген устойчивости к ампицилину. Изобретение может быть использовано для элиминирования митохондриальной ДНК, содержащей патогенные мутации, ассоциированные с наследственными митохондриальными патологиями. 1 ил.

Наверх