Штамм halobacterium salinarum, используемый для получения бактериальных препаратов

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для приготовления бактериальных препаратов для применения в медицине, ветеринарии, косметологии. Штамм Halobacterium salinarum 353П-1, регистрационный номер ВКПМ В-12794, получен многоступенчатой селекцией исходного штамма Halobacterium halobium 353 Пущинский без использования методов генетической модификации и обработки химическими или физическими мутагенными агентами. Штамм Halobacterium halobium ВКПМ В-12794 превосходит исходный по выходу биомассы, каротиноидов, важнейших ненасыщенных жирных кислот, обладает повышенной устойчивостью к фаговому поражению. Штамм может быть использован при производстве высокоактивных бактериальных препаратов для применения в различных областях. 1 табл., 3 пр.

 

Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии и может быть использовано для приготовления бактериальных препаратов для использования в медицине, ветеринарии, косметологии.

Известны патенты, касающиеся получения новых штаммов галобактерий - продуцентов бактериородопсина (1,2).

Известны патенты, касающиеся получения с использованием методов генной инженерии штаммов галобактерий с новыми специфическими характеристиками. В США разработано изобретение, касающееся получения мутантных штаммов галобактерий, обладающих устойчивостью к радиационному воздействию (3).

Известен патент Японии, касающийся получения С₅₀-каротиноида, конкретно бактериоруберина, проявляющего антиоксидантную активность, для использования в продуктах здорового питания, путем культивирования галофильных бактерий в специально разработанной питательной среде с последующим выделением бактериоруберина (4).

Известны патенты, касающиеся получения биологически активных фракций галобактерий путем выделения протеинов или гликопротеинов клеточной стенки для последующей обработки и получения биологически активных фракций, предназначенных для использования в медицине (5).

Все вышеперечисленные разработки касаются получения штаммов галобактерий с использованием методов генной инженерии или выделения различных биологически активных фракций микробной клетки для последующей разработки на их основе новых лекарственных препаратов.

Известен штамм Halobacterium halobium 353 Пущинский, регистрационный номер ВКПМ В-1739, - продуцент бактериородопсина (6). В процессе дальнейшего изучения этого штамма было выявлено, что штамм продуцирует такие биологически активные соединения, как каротиноиды и ненасыщенные жирные кислоты, что позволило применить его для создания препарата, обладающего антиоксидантной активностью и модулирующего физиологические и иммунологические процессы в организме (7).

Штамм Halobacterium halobium ВКПМ В-1739 является прототипом заявляемого штамма.

Штамм получен в Институте биологической физики АН СССР (Пущино-на-Оке), селекционным путем как форма с хорошими ростовыми характеристиками и высоким содержанием бактериородопсина от штамма Halobacterium halobium расса 353, выделенного в Институте зоологии АН Туркменской ССР. Микроорганизм идентифицирован в Институте биологической физики АН СССР (Пущино-на-Оке).

Характеристика штамма.

Морфологические и тинкториальные свойства.

Одиночные подвижные палочки 2-5×0,5-0,9 мкм, спор не образует, вакуолей не содержат. Колонии красного цвета полупрозрачные, гладкие с гладким краем, в среду не врастают, легко снимаются петлёй. Клеточные мембраны характеризуются наличием специфического фоточувствительного белка бактериородопсина. При попадании в среду с содержанием NaCl менее 15% клетки очень быстро лизируются.

Культуральные свойства.

Культура является экстремальным галофилом - требует присутствия в среде 250 г/л NaCl. В качестве источника углерода использует аминокислоты. Хорошо растёт при 38-42°C. Уровень накопления биомассы составляет 2,0 г/л/час, максимальная продуктивность бактериородопсина (2,5 мкМ/л) достигается на 70-80-й час культивирования при освещении лампами дневного света. Предшественников нуклеиновых компонентов клеток стимулируют рост культуры. Факультативный аэроб, сахарозу, мальтозу, лактозу, фруктозу не подкисляет, не растет на картофеле. Фаги не описаны.

Иммуногенные свойства. Препараты высушенной биомассы обнаруживают сильное иммуностимулирующее действие.

Вирулентные и токсигенные свойства.

Бактерии не обладают зоопатогенными или фитопатогенными свойствами и не представляют опасность по другим причинам. Водные экстракты биомассы подавляют рост условно-патогенных микроорганизмов. Условия хранения штамма на предприятии.

Культура штамма хорошо хранится на стандартной агаризованной среде на косяках и в бакпечатках, долго сохраняет жизнеспособность в виде пасты. Для длительного хранения штамма используется лиофилизация свежей биомассы.

Условия пассирования штамма.

Культуру поддерживают и выращивают на среде следующего состава (г/л): NaCl - 250, MgSO₄×7H₂O - 20, цитрат натрия - 3, KCl - 2, пептон - 10, дрожжевой экстракт - 2, pH - 7,2. Твердую питательную агаровую среду готовят, добавляя 1,9% агар-агара.

Условия получения маточной культуры.

Жидкую питательную среду, разлитую в качалочную колбу Эрленмейера (объемом 350 мл с заполнением средой 70-80 мл), засевают смывом (5 мл питательной среды) с косяка бактериальной культуры и инкубируют на качал очной установке в течение 24-36 часов при температуре 38-40°С, скорости вращения 150-180 об./мин. и при освещении установки люминесцентными лампами. При достижении концентрации биомассы не менее 2,5 г/л АСБ, полученная чистая культура используется в качестве посевного материала для получения маточной культуры в малом ферментере. Стандартная питательная ростовая среда заливается в объеме 18 л в ферментер с рабочим объемом 20 л, добавляется раствор микроэлементов, значение pH среды доводится до рабочего уровня - 7,2-7,4. Засевают малый ферментер чистой культурой в объеме 1,5 л.

Процесс периодического культивирования галобактерий в малом ферментере осуществляется при постоянном освещении, при аэрации среды, в условиях поддержания постоянной температуры и pH среды в течение 2-3 суток. При достижении концентрации биомассы не менее 1,25 г/л АСБ, процесс выращивания маточной культуры галобактерий в малом ферментере завершается, а полученная биомасса используется для засева производственного ферментера.

Состав и подготовка среды культивирования:

Основа среды - солевой раствор готовят заранее и хранят продолжительное время; содержит компоненты, г/л: NaCl - 250, MgSO₄×7H₂O - 20, KCl - 3, цитрат Na - 3, CaCl₂ - 0,2, вода - дистиллированная. Органические компоненты, г/л: триптон (пептон) - 5, дрожжевой экстракт - 2, глицерин - 1,25 (1 мл). Концентрат микроэлементов: 1 мл/л. Концентрат микроэлементов, г/л: FeSO₄×7H₂O - 5,0, ZnSO₄×7H₂O - 1,0, MnSO₄×H₂O - 0,3. Органические компоненты в солевом растворе (pH 6,8-7,2) стерилизуют отдельно 20 мин. при 121°C, быстро охлаждают и смешивают в стерильных условиях с концентрированным раствором микроэлементов. Для агаризованной среды органические компоненты в солевом растворе с добавлением агар-агара после стерилизации охлаждают до 55-60°C и смешивают в стерильных условиях с концентрированным раствором микроэлементов, далее разливают в чашки Петри.

Условия выращивания на твердой среде:

Особенностями выращивания галобактерий на агаризованной среде является наполнение чашек Петри на 2/3 от общего объема, 1,3-1,5% агар-агара (принимают во внимание высыхание при длительном культивировании и хранении), освещение лампами PHILIPS TL-B 18W/33-640 (500 Лк на уровне чашек, спектр ламп приближен к солнечному), температура 38,5°C, повышенная влажность, которую создают, например, установкой открытой емкости с водой в прозрачный закрытый пластиковый мешок с чашками (следить за образованием излишнего конденсата, при необходимости убирать емкость с водой). Культивирование продолжается до 1,5 недель.

Глубинное культивирование в колбах:

Культивирование в колбах проводят стерильно в периодических условиях на шейкере при 150 об./мин, освещении лампами PHILIPS TL-D 18W/33-640 (500 Лк на уровне колб), температуре 38,5°C. Степень заполнения колб питательной средой составляет 50%, для засева колб используют клетки, находящиеся в начале стационарной фазы, объём посевного материала составляет 8% об. Культивирование продолжают до 7 суток.

Глубинное культивирование в биореакторе:

Используют стеклянный стерилизуемый биореактор рабочим объемом 3л (общий объем 5л) с лопастной мешалкой и автоматическим регулированием pH (поддерживают на уровне 7,5), pO₂ (20-25% от насыщения, регулируют оборотами мешалки и количеством подаваемого воздуха), температуры (38,5°C) при освещении лампами PHILIPS TL-D 18W/33-640 через стекло биореактора (мощность облучения 70 мВт/л среды). На начальном этапе культивирования в биореактор вносят 8% об. посевного материала, подготовленного в колбах и находящегося в начале стационарной фазы. В периодическом режиме культивирование проходит 4 суток до максимального накопления биомассы и каротиноидов. В непрерывном режиме биомасса накапливается до 2,5 г/л, после чего включают проток среды культивирования через биореактор перистальтическим насосом, степень разбавления постепенно доводят до D=0,03-0,035 ч^-1, параметры фиксируют в установившемся состоянии.

Штамм хранится во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов ФГБУ «ГосНИИгенетика» по адресу 117545, Москва, 1-й Дорожный проезд, 1, регистрационный номер ВКПМ В-1739, дата депонирования 13 декабря 1978 г.

Задачей настоящего изобретения является получение на основе штамма Halobacterium halobium ВКПМ В-1739 нового штамма, более технологичного - с повышенным выходом биомассы и высокой устойчивостью к фаголизису, и обладающего более высокой биологической активностью за счет повышения продукции каротиноидов и ненасыщенных жирных кислот.

Заявляемый штамм Halobacterium salinarum 353П-1, регистрационный номер ВКПМ В-12794, получен многоступенчатой селекцией исходного штамма Halobacterium halobium В-1739 без использования методов генетической модификации и обработки химическими реагентами или жестким ультрафиолетом при глубинном и поверхностном культивировании с адсорбентом, высоком уровне освещения, pH и отбором клонов на агаризованной среде: глубинное культивирование в колбах проводят с внесением адсорбентов MN500 или инкапсулированного в агар-агар активированного угля АГ-3 для удаления вырабатывающихся в процессе жизнедеятельности при сильном освещении (10000 Лк) и высоком pH (8) метаболитов. Многократное чередование из пересевов на твердую среду с внесением тех же сорбентов, отбор колоний, глубинных культивирований с адсорбентом отобранных вариантов позволили отобрать заявленный штамм, устойчивый к высоким уровням освещения и pH.

Культурально-морфологические и физиолого-биохимические свойства штамма.

Клетки представляют собой одиночные подвижные палочки 3-7×0,5-0,8 мкм, спор не образуют, газовых вакуолей не содержат, колонии на агаризованной среде полупрозрачные, гладкие с гладким краем, выпуклые, насыщенного красного цвета, в среду не врастают, легко снимаются петлей. Факультативный аэроб, сахарозу, мальтозу, лактозу, фруктозу не потребляет. Экстремальный галофил, для поддержания жизнедеятельности и нормальной формы клеток требует присутствия в среде 250 г/л NaCl, ионов Mg, K, при попадании в среду с содержанием NaCl менее 1M клетки лизируют. Рост наблюдается в диапазоне температур 34-48°C, оптимальная температура для роста 38,5°C, для лучшего синтеза каротиноидов, бактериородопсина и прироста биомассы требуется дополнительное освещение. Среди синтезируемых каротиноидов присутствуют, в основном, C₅₀-каротиноиды группы бактериоруберина (до 90-95% от общего количества), ликопин и β-каротин. Бактериородопсин - ретиналь-содержаший белок находится в пурпурных мембранах (липопротеиновый комплекс) и обеспечивает клетку энергией при освещении и недостатке кислорода. Штамм синтезирует ненасыщенные жирные кислоты (омега-3,6,9). Результаты 16S рРНК анализа показывают 100%-ную идентичность с видами Halobacterium salinarum. Штамм непатогенен, манипуляции с ним не требуют специальных мер предосторожности. Не является генетически модифицированным штаммом. Сохраняется длительное время на агаризованной среде и в лиофильно высушенном состоянии.

Процесс культивирования заявляемого штамма полностью идентичен процессу культивирования штамма-прототипа.

Штамм хранится во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов ФГБУ «ГосНИИгенетика» Минобрнауки России (ВКПМ).

Адрес ВКПМ: 117545 Москва, 1-й Дорожный проезд, д. 1.

ВКПМ приняло культуру Halobacterium salinarum 353П-1 на национальное патентное депонирование 30 января 2017 года. Регистрационный номер В-12794. Депозитер: ООО «Никофарм».

Продукты, продуцируемые штаммом (область применения штамма): C₅₀-каротиноиды группы бактериоруберина, бактериородопсин, ненасыщенные жирные кислоты.

Содержание общих каротиноидов в биомассе определяют по методике Dummer с соавторами (8) путем экстракции каротиноидов из навески биомассы ацетоном и далее смесью гексана с водой. Пигменты высушивают в инертной атмосфере и ресуспендируют в этилацетате для последующего анализа путем жидкостной хроматографии с обращенной фазой с использованием градиента растворителей А (90% ацетонитрил, 9,9% вода, 0,1% триэтиламин) и В (этилацетат) при расходе мобильной фазы 1 мл/мин.

Содержание жирных кислот в биомассе определяют методом Soares с соавторами (9). Из навески галобактериальной биомассы жирные кислоты экстрагируют смесью метанол/хлороформ/вода (2:1:0,5 об.) при перемешивании и комнатной температуре. Органическую фазу частично испаряют, образец экстракта смешивают с этерифицирующей смесью содержащей метанол. Реакцию этерификации проводят при 90°C. После охлаждения полученный образец переносят в смесь н-гептана с водой - метиловые эфиры жирных кислот экстрагируют н-гептаном и анализируют с помощью газовой хроматографии высокого разрешения.

Устойчивость галобактерий определяют при нестерильном культивировании заявляемого штамма и прототипа в периодических условиях с пересевами и непрерывном режиме. У штамма-прототипа до 20% ферментаций приводят к фаголизису при пересевах, а также срыву или сокращению периода непрерывного культивирования. У заявленного штамма вероятность срыва цикла культивирования снизилась до 1-2% за счет повышенной устойчивости к интенсивному освещению, высокому pH, температуре. Стрессовые условия окружающей среды являются индукторами профагов - фаголизиса.

Технологические и биологические характеристики заявленного штамма по сравнению с исходным представлены в таблице 1.

Таблица 1.
Сравнительная характеристика штамма-прототипа Halobacterium halobium (salinarum) ВКПМ В-1739 и заявленного штамма Halobacterium salinarum ВКПМ В-12794
Параметр	Штамм-прототип	Заявляемый штамм
	Режимы культивирования	Режимы культивирования
	периодический	непрерывный	периодический	непрерывный
Общие каротиноиды, мг/100 г АСБ	25-33	18-24	29-42	26-36
Биомасса (АСБ), г/л	3,2-3.6	3,5-3,9	4,1-4,5	4,5-4,9
Устойчивость к фаголизису	18-20% ферментаций - фаголизис и сокращение периода непрерывного культивирования	1-2% ферментаций - фаголизис и сокращение периода непрерывного культивирования
Важнейшие ненасыщенные жирные кислоты (мкг/г АСБ)
Арахидоновая (ω-6)	3-5	2-4	3-5	3-5
Эйкозапентаеновая (ω-3)	3-5	5-7	16-20	25-29
Докозагексаеновая (ω-3)	8-12	8-12	13-17	11-15

Из таблицы следует, что заявляемый штамм устойчив к фаголизису, превосходит штамм-прототип по выходу биомассы, содержанию каротиноидов и ненасыщенных жирных кислот.

Известно, что качество бактериальных препаратов во многом обусловлено свойствами штамма, его специфической биологической активностью. Для галобактерий очень важным показателем, влияющим на эффективность препаратов, является уровень продукции каротиноидов и ненасыщенных жирных кислот, особенно эйкозапентаеновой (ω-3) и

докозагексаеновой (ω-3), являющимися необходимыми для жизнедеятельности млекопитающих. Заявляемый штамм существенно превосходит исходный по этим показателям, что перспективно в плане создания эффективных бактериальных препаратов. Усовершенствованные технологические характеристики заявляемого штамма (повышенный выход биомассы и существенное повышение устойчивости штамма к фаголизису) позволят значительно повысить рентабельность производства. Заявляемый штамм может быть использован при производстве препаратов, обладающих широким спектром биологической активности, в частности высокой антиоксидантной и иммуномодулирующей активностью, для применения в медицине, ветеринарии, животноводстве, птицеводстве, косметологии. Техническим результатом заявленного изобретения является получение высокотехнологичного штамма Halobacterium salinarum ВКПМ В-12794, который превосходит исходный по выходу биомассы, каротиноидов, важнейших ненасыщенных жирных кислот, обладает повышенной устойчивостью к фаговому поражению. Заявляемый штамм может быть использован для создания бактериальных препаратов с более высокой биологической активностью для применения в медицине, ветеринарии, животноводстве, птицеводстве, косметологии в различных лекарственных формах (таблетки, капсулы, мази, кремы, спреи, пластыри) и в различных композициях с другими препаратами.

Пример 1. Получение сухой биомассы Halobacterium salinarum ВКПМ В-12794. Процесс выращивания биомассы галобактерий включает три технологические стадии:

- выращивание чистой культуры на качалочных колбах;

- выращивание чистой культуры в малом ферментере;

- выращивание биомассы галобактерий.

Выращивание чистой культуры на качалочных колбах

Музейную культуру Halobacterium salinarum ВКПМ В-12794, выращенную на косяках, помещают в раствор питательной среды в колбах. Основа среды культивирования - солевой раствор. Солевой раствор готовят заранее и хранят продолжительное время, раствор содержит следующие компоненты, г/л: NaCl - 250, MgSO₄×7H₂O - 20, KCl - 3, цитрат Na - 3, CaCl₂ - 0,2, вода - дистиллированная. Органические компоненты, г/л: триптон (пептон) - 5, дрожжевой экстракт - 2, глицерин - 1,25 (1 мл). Концентрат микроэлементов: 1 мл/л. Концентрат микроэлементов, г/л: FeSO₄×7H₂O - 5,0, ZnSO₄×7H₂O - 1,0, MnSO₄×H₂O - 0,3. Органические компоненты в солевом растворе (pH 6,8-7,2) стерилизуют отдельно 20 мин. при 121°C, быстро охлаждают и смешивают в стерильных условиях с концентрированным раствором микроэлементов. Для агаризованной среды органические компоненты в солевом растворе с добавлением агар-агара после стерилизации охлаждают до 55-60°C и смешивают в стерильных условиях с концентрированным раствором микроэлементов, далее разливают в чашки Петри.

Процесс выращивания чистой культуры на качалочных колбах ведут в течение 24-30 часов в режиме качания 150-180 об./мин. при температуре 38-40°C. При содержании биомассы 2-2,5 г/л полученную суспензию используют в качестве засевного материала для выращивания биомассы галобактерий в малом ферментере.

Выращивание чистой культуры в малом ферментере.

Готовый раствор питательной среды, полученной на предыдущей стадии, заливают в малую ферментационную кювету до заданного объема и нагревают до температуры 38-40°C, доводят pH среды раствором NaOH до 7,2. В него выливают содержимое колб, полученное на предыдущей стадии и начинают процесс периодического выращивания при подаче воздуха для аэрации и перемешивании, термостатировании, поддержании постоянного pH среды и освещении. При содержании биомассы 4,3±0,2 г/л процесс выращивания в малом ферментере завершается. Дальнейшее выращивание биомассы галобактерий осуществляется на установке непрерывного культивирования с последовательностью операций, аналогичной описанной выше. Суспензию биомассы галобактерий собирают во вспомогательные накопительные емкости и из них подают на центробежный сепаратор типа АСГ-3М. Сепарацию проводят в периодическом режиме. Отработанная среда выращивания частично может быть использована для приготовления раствора питательной среды.

Выход сырой биомассы составляет 13-15 г/л суспензии (при содержании биомассы 4,5-4,9 г/л по АСБ).

Для высушивания биомассы галобактерий используется метод лиофилизации в сублимационной сушилке. Продолжительность цикла сушки составляет 65-75 часов. Для получения порошка с неоднородным гранулометрическим составом используют шаровую мельницу периодического действия для тонкого измельчения. Выход сухого продукта составляет 6,5-7 г/л (при содержании биомассы 4,7±0,2 г/л по АСБ).

Пример 2. Использование штамма Halobacterium salinarum ВКПМ В-12794 для приготовления биологически активной добавки (БАД) к пище.

Перед началом производства БАД производится входной контроль качества сухой порошкообразной биомассы Halobacterium salinarum ВКПМ В-12794 по внешнему виду, массовой доле влаги (не более 5%), массовой доле каротиноидов C₅₀ (в пересчете на абсолютно сухое вещество, мг/%, не менее 6), массовой доле токсичных элементов, количеству мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов, бактерий группы кишечных палочек, патогенных микроорганизмов, дрожжей, плесени.

Далее проводят капсулирование сухого препарата галобактерий, фасовку, упаковку и блистирование. Употребляют перорально. Высушенная субстанция галобактерий обладает иммуностимулирующим действием, радиопротекторной активностью.

Пример 3. Использование Halobacterium salinarum ВКПМ В-12794 для получения препарата в форме мази.

Для получения мази готовят эмульсионную смесь - жировую основу мази. В варочный котел при температуре 85°C заливают жидкие жировые компоненты (масло вазелиновое, масло подсолнечное, пентол), перемешивают в мешалке при скорости вращения 60-100 об./мин). Взвешивают и измельчают твердые жировые компоненты (церезин, воск, ланолин, жир кулинарный), загружают во вспомогательную емкость, медленно при температуре 80°C производят расплавление жировых компонентов в течение 1,5-2,0 часов при периодическом помешивании. По достижении в варочном котле температуры 75-80°C расплавленные твердые жировые компоненты выливают в котел.

Рецептурное количество очищенной воды заливают во вспомогательную емкость, при температуре 80°C в воду засыпают навески нипагина и нипазола (консерванты). Производят плавный нагрев водной фазы и растворение консервантов в течение 45-60 мин. при периодическом помешивании. Нагревшуюся водную фазу выливают в варочный котел (при непрерывной работе низкоскоростной мешалки).

Отключают низкоскоростную мешалку варочного котла и включают высокоскоростную мешалку (1300-1500 об./мин).

Эмульгирование проводят при температуре 75-80°C в течение 20-30 мин.

По завершении процесса эмульгирования охлаждают эмульсионную смесь (основу).

Охлаждение ведут в течение 1,5-2,0 часов до достижения температуры 35-40°C.

Часть эмульсионной основы смешивают с сухой биомассой Halobacterium salinarum ВКПМ В-12794 из расчета 1 л основы на 1 кг сухого препарата, перемешивают. Добавляют антисептик - салициловую кислоту при периодическом помешивании.

Смесь выдерживают 30 мин., периодически помешивая.

В варочный котел содержащий полупродукт - эмульсионную смесь (основу), перегружают эмульсионную основу с сухим продуктом биомассы Halobacterium salinarum ВКПМ В-12794 и эмульсионную основу с салициловой кислотой. Полученную массу эмульгируют в течение 30 мин при вращении низкоскоростной мешалки.

Полученный продукт представляет собой мазь.

Рецептура мази в %.

Сухой продукт биомассы

Halobacterium salinarum ВКПМ В-12794	5,0
Кислота салициловая (ГФ X изд., ст. 21)	1,0
Масло вазелиновое (ГФ X, ст. 481)	10,0
Масло подсолнечное (ГОСТ 1129-73)	20,0
Церезин (ГОСТ 2488-79)	3,0
Воск белый (ГФ X, ст. 89)	5,0
Ланолин (ГФ X, ст. 373)	5,0
Пентол (ТУ 18-16-350-80)	5,0
Нипагин (ФС 42-1460-80)	0,45
Нипазол(ТУ18-16-387-75)	0,05
Жир кулинарный (ОСТ 18-197-74)	10,0
Вода очищенная (ФС 42-2619-89)	до 100,0

Мазь может быть использована в медицине, в частности дерматологии и косметологии.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Патент РФ № 2321627 Штамм бактерий Halobacterium salinarum В-9451 - продуцент бактериородопсина. Заявлено 2006 г. МПК C12N 1/20.

2. Патент РФ № 2416634 Штамм бактерий Halobacterium salinarum - продуцент бактериородопсина. Заявлено 2006, МПК C12N 1/20.

3. Патент США № 97494507 Radiation-resistant mutants of a halophilic archaeon and uses thereof. Заявлено 2007 г., МПК C12N 1/20.

4. Патент Японии №71132096. Заявлено 1993 г., МПК C12P 7/04; A23L 1/30. Правообладатель Micro Arujie Corp KK.

5. Патент Германии №3716669, приоритет 1987 г. Process for the preparation of cell wall components from Halobacteria, and their use as medicaments. МПК A61K 35/74.

6. Авторское свидетельство СССР №770184. Штамм Halobacterium halobium 353 Пущинский - продуцент бактериородопсина. М. кл. C12K 1/00. Заявлено 19.06.1978.

7. Патент РФ №2109515. Препарат, обладающий антиоксидантной активностью и модулирующий физиологические и иммунологические процессы в организме. МПК A61K 35/74, C12N 1/20. Заявлено 18.03.1997 г.

8. Dummer, А.М., Bonsall, J.C., Cihla, J.B., Lawry, S.M., Johnson, G.C., Peck, R.F. Bacterioopsin-mediated regulation of bacterioruberin biosynthesis in Halobacterium salinarum. Journal of bacteriology. - 2011, 193 (20), 5658-5667.

9. Soares, A.T., Da Costa, D.C. Silva, B.F., Lopes, R.G., Derner, R.B., & Antoniosi Filho, N.R. Comparative analysis of the fatty acid composition of microalgae obtained by different oil extraction menhods and direct biomass transesterification. BioEnergy Research, 2014, 7(3),1035-1044.

Штамм Halоbacterium salinarum ВКПМ В-12794, предназначенный для получения бактериальных препаратов.