Способ предпосевной обработки семян редких и реликтовых растений методом искусственного глубокого промораживания
Владельцы патента RU 2663062:
федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Воронежский государственный университет" (ФГБОУ ВО "ВГУ") (RU)
Изобретение относится к сельскому хозяйству, интродукции и реинтродукции растений на базе ботанических садов и может быть применено для обработки семян редких и реликтовых растений флоры Среднерусской лесостепи. Способ предпосевной обработки семян редких и реликтовых растений заключается в том, что после длительного сухого хранения семян осуществляют фасовку семян в бумажные пакеты, промораживание их при температуре от -51 до -30°С в течение не менее 35 дней. После этого постепенно повышают температуру до низкой положительной температуры (5-10)°С в течение 2-3 дней. Использование изобретения позволит повысить энергию прорастания и всхожесть семян после длительного сухого хранения для получения сеянцев высокой жизнеспособности. 2 табл., 2 ил.
Заявляемое изобретение относится к сельскому хозяйству, интродукции и реинтродукции растений на базе ботанических садов и может быть применено для обработки семян редких и реликтовых растений флоры Среднерусской лесостепи.
Традиционные методы предпосевной обработки, такие как стратификация, скарификация и обработка стимуляторами, не всегда позволяют получить высокий результат показателей энергии прорастания и всхожести семян одновременно для избранной группы растений. Это связано с целым комплексом причин: от размера семян, типа покоя семян до степени развития зародыша.
Из патента РФ 2548884 (МПК A01G 1/00, опубл. 10.02.2015) известен способ предпосевной обработки семян сильфии пронзеннолистной, включающий стратификацию семян в течение 40 дней при постоянной низкой положительной температуре 1-3°С, замачивание семян после стратификации в течение 12 часов в комплексном водном растворе солей микроэлементов: MnSO4 концентрацией 100 мг/л, ZnSO4 - 40 мг/л и CuSO4 - 15 мг/л, стратификацию проводят в холодильной камере. Холодная стратификация низкими положительными температурами широко используется при проращивании различных видов растений, в том числе редких (Николаева М.Г., Разумова М.В., Гладкова В.Н. Справочник по проращиванию покоящихся семян. Л.: Наука, 1985. 348 с.; 2. Баранова О.Г. Особенности прорастания семян и развитие на ювенильном этапе ряда редких растений Удмуртии / О.Г. Баранова, Е.А. Китова, Е.Н. Кузнецова, Е.Ю. Лукиных // Вестник Удмуртского университета. Биология. Науки о Земле. - 2010-. - Вып. 3. - С. 19-24). Однако слабо разработанными остаются аспекты, связанные с оценкой воздействия низких отрицательных температур на энергию прорастания и всхожесть семян аборигенной флоры Среднерусской лесостепи.
Известен способ стимулирования прорастания семян бобовых и твердо-семенных растений по патенту РФ 2601588 (МПК А01С 1/00, опубл. 15.05.2015), включающий механическую скарификацию в течение 1.5-5.0 мин на льняном полотне или металлической решетке.
Известен способ (патент РФ 2439869, МПК А01С 1/00, опубл. 20.01.2012) увеличения семенной продуктивности и всхожести семян копеечника альпийского Hedysarum alpinum L., включающий предпосевную обработку и скарификацию, предпосевную обработку семян проводят замачиванием в 0,1%-ном рабочем растворе агробиологического стимулятора эффективных микроорганизмов, приготовленного из микробиологического препарата «Байкал ЭМ-1» и питательной среды «ЭМ-патока».
Однако из известных источников ничего не представлено о способах реанимации семенного материала после длительного сухого хранения. Проращивание семян однолетних и многолетних травянистых растений и кустарничков после длительного сухого хранения дает невысокие показатели энергии прорастания и всхожести (Серикова В.И. Начальные этапы онтогенеза некоторых редких степных растений в ботаническом саду Воронежского госуниверситета / В.И. Серикова // Особо охраняемые природные территории. Интродукция растений - 2014: материалы заочной международной научно-практической конференции. - Воронеж, 2014. - С. 189-198), что недопустимо при интродукционной работе с редкими видами растений.
Задачей настоящего изобретения является разработка универсального эффективного способа предпосевной обработки семян после длительного (3-5 лет) сухого хранения.
Технический результат заключается в повышении энергии прорастания и всхожести семян после длительного сухого хранения при комнатной температуре для получения сеянцев высокой жизненности.
Технический результат достигается тем, что способ предпосевной обработки семян редких и реликтовых растений методом искусственного глубокого промораживания включает фасовку семян в бумажные пакеты, промораживание при температуре от -51 до -30°С в течение не менее 35 дней, постепенное повышение температуры до 5-10°С в течение 2-3 дней, извлечение готовых для проращивания семян.
Безусловно, существуют и более глубокие заморозки, например, криоконсервация семян в жидком азоте при -198°С. В целом криохранение семян направлено на изучение долгосрочного сохранения генетического разнообразия растений, а не для решения актуальных вопросов проращивания семян после длительного сухого хранения (3-5 лет). Выявлено, что криоустойчивость семян разных видов редких растений неоднозначна (есть результаты как повышения всхожести, так и ее снижение), также отмечено изменение динамики прорастания (Нестерова С.В. Криокосервация семян дикорастущих растений Приморского края: автореферат дис. кандидата биол. наук / С.В. Нестерова. - Воронеж, 2004. -24 с.), что сильно отличается от результатов заявленного нами изобретения.
При разработке способа исследовались морфологические особенности семян редких и реликтовых растений; изучалось и оценивалось влияние разных температур промораживания на энергию прорастания, всхожесть семян и размеры клеток эндосперма семени. Изучение морфологических особенностей семян избранных видов проводили по методике З.Т. Артюшенко (Артюшенко З.Т. Атлас по описательной морфологии высших растений. Семя. - Л.: Наука, 1990. - 204 с.), получали данные по размеру, форме, характеристике поверхности семенной кожуры, окраске, особенностям семенного рубчика (его форме, размеру и местоположению).
В отличие от классических способов стратификации, семена не помещают во влажную смесь песка и торфа, а также не замачивают предварительно. В предлагаемом способе сухие семена находятся в бумажных пакетах, что значительно снижает риск инфицирования семян грибковыми заболеваниями через грунт при последующем проращивании. Также отпадает необходимость проведения дополнительной их дезинфекции перед закладкой в бумажные пакеты. Глубокое промораживание (до -51°С) семян ингибирует развитие на них грибковых заболеваний в ходе эксперимента.
На фиг. 1 приведена таблица характеристик морфологических признаков семян исследуемых видов растений.
На фиг. 2 приведена таблица показателей всхожести семян исследуемых растений после промораживания.
Пример.
В качестве объектов изучения были выбраны семена редких и реликтовых растений региональной флоры: копеечник меловой (Hedysarum cretaceum Fisch.), левкой пахучий (Matthiola fragrans Bunge), лапчатка бедренцеволистная (Potentilla pimpinelloidesL.), проломник Козо-Полянского (Androsace koso-poljanskii Ovcz.), хвойник двухколосковый (Ephedra distachya L.), которые были ранее собраны с фенотипически здоровых растений, а затем подверглись длительному сухому хранению (3-5 лет). Все виды из разных родов и семейств. Семенной материал исследуемых видов помещали в пакеты из крафт-бумаги. На каждом пакете размещали этикетку, где указывали видовое название растения и число семян (100 шт. каждого виды в двукратной повторности). Пакеты с семенами одновременно закладывали в лабораторные морозильные камеры с различным режимом отрицательных температур: -15°С, -30°С, -51°С. Таким образом, семена каждого вида промораживались при температуре -15°С, -30°С, -51°С. Продолжительность воздействия низких температур на семена не менее 35 дней. После промораживания температуру в морозильных камерах постепенно (в течение 2-3 дней) повышали до низкой положительной температуры (5-10°С) и затем извлекали пакеты с семенами.
На следующем этапе методом микроскопии изучали размеры и форму клеток зародыша промороженных и не промороженных семян. Для проведения микроскопических исследований использовали микропрепараты семян проломника Козо-Полянского (Androsace koso-poljanskii Ovcz.) и левкоя пахучего (Matthiola fragrans Bunge) после глубокого промораживания (-51°С) и не подвергавшихся влиянию отрицательных температур. Микропрепараты были подготовлены по фармакопейной методике ГФ XI (Государственная фармакопея СССР. 11-е изд. Вып. 1: Общие методы анализа. М., 1987. С. 57). Каждый препарат анализировали на световом микроскопе при помощи окуляр-микрометра и увеличении 10×10 и 40×10 с последующим определением размеров клеток эндосперма. Для каждого вида просматривалось не менее 50 микропрепаратов эндосперма промороженных семян и не подвергавшихся влиянию отрицательных температур. Проводилось измерение клеток эндосперма (не менее 50 измерений для каждого микропрепарата). На основании опытных данных проводился расчет средних размеров (длина, ширина) клеток эндосперма для каждого вида растения. После завершения расчетов для каждого вида растения сравнивались средние размеры клеток эндосперма семян глубокого промораживания (-51°С) и не подвергавшихся влиянию отрицательных температур (сухого хранения при комнатной температуре 20-23°С). В результате было установлено значительное увеличение размеров клеток эндосперма промороженных семян при температуре -51°С по сравнению с не подвергавшимися влиянию отрицательных температур. Клетки эндосперма проломника Козо-Полянского (Androsace koso-poljanskii) до промораживания имеют следующие размеры: 14,6×7,3 мкм, а после промораживания 33,8×16,2 мкм, что почти в 2 раза больше. У левкоя пахучего (Matthiola fragrans) до испытания эндосперм состоит из клеток, размер которых 11,9×11,9 мкм, а после промораживания 13,8×13,8 мкм, что в 1,2 раза больше.
Увеличение размеров клеток эндосперма семени указывает на физиологические и биохимические процессы, которые активируются в нем при воздействии экстремальных отрицательных температур. Наблюдаются признаки активной мобилизации запасных веществ эндосперма и доразвитие зародыша. Таким образом, значительно повышается жизнеспособность диаспор. Возможно, именно этот адаптационный признак позволил данным видам выжить в условиях непостоянного климата Среднерусской лесостепи в период ледниковых и межледниковых эпох.
Далее определяли зависимость показателей энергии прорастания и всхожести семян изученных видов растений от температуры глубокого промораживания. Семена проращивали в лабораторных условиях в чашках Петри при искусственном освещении и температуре +20-23°С. Для каждого вида растения берут 100 штук семян в двукратной повторности трех температур промораживания. Продолжительность опыта составляет 12 суток. Оценку и учет проросших семян проводят на 2, 4, 6, 8, 10 и 12-ые сутки от начала опыта.
В результате морфологического описания семян избранных видов получили данные по их размеру, форме, окраске, особенностям поверхности кожуры и размещения рубчика (фиг 1).
Сроки массового прорастания у исследуемых растений в целом одинаковые и составляют 4-8 суток. Исключением являлись семена проломника Козо-Полянского (Androsace koso-poljanskii), которые проросли лишь на 8 сутки после посева.
В результате выявили что, чем ниже температура промораживания, тем выше энергия прорастания и всхожесть семян изученных видов растений. Определили, что после промораживания при -15°С семена копеечника мелового (Hedysarum cretaceum) в течении 12 дней не прорастают, а после воздействия более низких температур (-30°С и -51°С) основная их часть прорастает на 6-ой день, а всхожесть достигает 11% и 20% соответственно. Основная часть семян хвойника двухколоскового (Ephedradistachya) проросла на 4-ый день, а всхожесть увеличилась от 17%:до 48 при воздействии -15°С и до 50 при -30°С и -51°С, т.е. более чем в три раза. Всхожесть семян левкоя пахучего (Matthiola fragrans) увеличилась более, чем в два раза (таблица 2). Семена лапчатки бедренцеволистной дружно проросли на 4-ый день, причем после режима воздействия при -51°С, они проросли только на 4-ый день и с максимальной всхожестью - 88%. Всхожесть семян проломника Козо-Полянского (Androsace koso-poljanskii) увеличилась в 5 раз, а основная часть проростков появилась только на 8-ой день.
Согласно увеличению значений энергии прорастания и всхожести семян выстроили следующий ряд: копеечник меловой (Hedysarum cretaceum) < проломник Козо-Полянского (Androsace koso-poljanskii) < хвойник двухколосковый (Ephedra distachya) < левкой пахучий (Matthiola fragrans) < лапчатка бедренцеволистная (Potentilla pimpinelloides).
Таким образом, выявлено четкое положительное влияние глубокого промораживания (-51-30°С) семян исследуемых растений на показатели энергии прорастания и всхожести. Максимальные значения энергии прорастания и всхожести семян для всех изученных видов отмечаются при температуре промораживания -51°С.
Способ предпосевной обработки семян редких и реликтовых растений после длительного сухого хранения при комнатной температуре методом искусственного глубокого промораживания, заключающийся в фасовке семян в бумажные пакеты, промораживании при температуре от -51 до -30°С в течение не менее 35 дней, постепенном повышении температуры до низкой положительной температуры 5-10°С в течение 2-3 дней.
