Композиция среды и способ получения ботулинического токсина

Предложены композиция среды и способ для получения ботулинического токсина. Данная группа изобретений относится к биотехнологии. Композиция питательной среды содержит, по меньшей мере, один пептон растительного происхождения, выбранный из группы, состоящей из гидролизата садового гороха, гидролизата семян хлопчатника и гидролизата клейковины пшеницы, источник углерода и минеральные вещества. Способ получения ботулинического токсина предусматривает культивирование Clostridium botulinum с использованием указанной композиции среды в анаэробных условиях с последующим выделением ботулинического токсина. Группа изобретений позволяет повысить скорость роста бактерий Clostridium botulinum и предотвратить риск инфекции трансмиссивной губчатой энцефалопатии (TSE). 2 н. и 3 з.п. ф-лы, 18 ил., 13 табл., 10 пр.

 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к композиции среды для производства ботулинического токсина, более конкретно, к составу среды для культивирования штаммов Clostridium, способных продуцировать ботулинический токсин. Композиция среды по настоящему изобретению содержит, по меньшей мере, один пептон растительного происхождения, выбранный из группы, состоящей из гидролизата садового гороха, гидролизата семян хлопчатника и гидролизата клейковины пшеницы.

Предшествующий уровень техники

Множество штаммов Clostridium sp., которые выделяют нейротоксические токсины было обнаружено начиная с 1890-х годов, и описание характеристик токсинов, которые секретируются этими бактериями, была проведена в течение последних 70 лет (Schant, E. J. et al., Microbiol.Rev., 56:80, 1992).

Нейротоксические токсины, полученные из Clostridium sp., т.е., ботулинические токсины, подразделяются на семь серотипов (серотипы А-G) в зависимости от их серологических свойств. Каждый из токсинов имеет белок токсина размером около 150 кДа, и в природе содержит комплекс нескольких нетоксичных белков, связанных с ним. Средний комплекс (300 кДа) состоит из белка токсина и нетоксичного белка не гемагглютинина, а большой комплекс (450 кДа) и очень большой комплекс (900 кДа) состоит из средних размеров комплексов, связанных с гемагглютинином (Sugiyama H., Microbiol. Rev., 44:419, 1980). Такие нетоксичные гемагглютининовые белки, как известно, действуют, выполняя роль защиты токсина от низкого рН и различных протеаз в кишечнике.

Токсин синтезируется в клетках в виде одиночного полипептида, имеющего молекулярную массу около 150 кДа, а затем расщепляется в положении 1/3, начиная от N-конца под действием внутриклеточной протеазы или обработки искусственным ферментом, таким как трипсин, на две единицы: легкую цепь (L, молекулярная масса: 50 кДа) и тяжелую цепь (Н; молекулярная масса: 100 кДа). Расщепленный токсин имеет значимо увеличенную токсичность по сравнению с одиночным полипептидом. Два блока соединяются друг с другом дисульфидной связью и имеют различные функции. Тяжелая цепь связывается с рецептором клетки-мишени (Park. M.K. et al., FEMS Microbiol. Lett., 72:243, 1990) и выполняет функцию взаимодействия с биомембраной при низком рН (рН 4), образуя канал (Mantecucco, C. et al., TIBS., 18:324, 1993), а легкая цепь имеет фармакологическую активность нарушения секреции нейротрансмиттеров, когда проникает в клетки или вводится путем электропорации или т.п. (Poulain, B. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 85:4090, 1988).

Токсин ингибирует экзоцитоз ацетилхолина в холинергическом пресинапсе нервно-мышечного соединения, чтобы вызывает астению. Считается, что токсичность демонстрирует обработка очень небольшим количеством токсина, что позволяет предположить, что токсин имеет некую ферментативную активность (Simpson, L. L. et al., Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol., 26:427, 1986).

Согласно недавнему отчету, токсин обладает активностью металлопептидазы и его субстраты включают синаптобревин, синтаксин, cинаптосомально-ассоциированный белок, 25 кДа (SNAP-25) и т.д., которые являются единичными белками комплекса машинерии экзоцитоза. Каждый тип токсина использует один из описанных выше трех белков в качестве своего субстрата, и известно, что токсины типа B, D, F и G, расщепляют синаптобревин в конкретном участке, токсины типа А и Е расщепляют SNAP - 25 в конкретном участке, а типа C расщепляет синтаксин в конкретном участке (Binz, T.et al., J. Biol. Chem., 265:9153, 1994).

В частности, ботулинический токсин типа А, как известно, растворим в разбавленном водном растворе при рН 4,0-6,8. Известно, что стабильный нетоксичный белок отделяют от нейротоксина при рН около 7 или выше, и, как следствие, токсичность постепенно теряется. В частности, известно, что токсичность уменьшается по мере роста рН и температуры.

Ботулинический токсин является смертельным для человеческого организма даже в небольших количествах и легко производится в больших количествах. Таким образом, этот токсин представляет собой один из четырех основных боевых средств биотеррора вместе с Bacillus anthracis, Yersinia pestis и вирусом натуральной оспы. Тем не менее, было обнаружено, что, когда ботулинический токсин типа А вводят в дозе, которая систематически не влияет на человеческий организм, токсин может парализовать локальную мышцу в инъецируемом участке. На основании этой характеристики, ботулинический токсин типа А может быть использован в широком диапазоне применений, включая агенты для удаления морщин, агенты для лечения спастической гемиплегии и церебрального паралича и т.д. Таким образом, спрос на ботулинический токсин типа А растет и активно проводятся исследования способов получения ботулинического токсина для удовлетворения спроса.

Текущий типичный коммерческий продукт BOTOX^® (очищенный нейротоксиновый комплекс ботулинического токсина типа А) коммерчески доступен у Allergan, Inc., США. Флакон BOTOX^® на 100 единиц состоит из примерно 5 нг очищенного нейротоксинового комплекса ботулинического токсина типа А, 0,5 мг человеческого сывороточного альбумина и 0,9 мг хлорида натрия и восстанавливается с помощью стерильного физиологического раствора без консерванта (инъекция 0,9 % хлорид натрия). Другие коммерческие продукты включают Dysport^® (комплекс ботунилинического токсина А типа из Clostridium и гемагглютинин, который имеет лактозу и человеческий сывороточный альбумин в фармацевтической композиции, содержащей ботулинический токсин и восстанавливается 0,9% хлоридом натрия перед использованием), который является коммерчески доступным у Ipsen Ltd., Великобритания, Myobloc^® (инъекционный раствор (рН около 5,6), содержащий ботулинический токсин типа В, человеческий сывороточный альбумин, сукцинат натрия и хлорид натрия), который является коммерчески доступным у Solstice Neurosciences, Inc.

Среда для культивирования Clostridium botulinum, которая обычно используется в способе получения ботулинического токсина, как описано в патенте Кореи 10-1339349, содержит компоненты животного происхождения. Таким образом, если аномальный прион животного, известный как агент, который вызывает трансмиссивную губчатую энцефалопатию, содержится в компонентах животных из-за загрязнения, то это создает проблемы в процессе получения ботулинического токсина.

Трансмиссивная губчатая энцефалопатия (TSE) известна как нейродегенеративное расстройство, вызывающее серьезную дегенерацию нейронов, и ее примеры включают коровью губчатую энцефалопатию (BSE), почесуху, болезнь Крейтцфельдта-Якоба (CJD), синдром Герстманна-Штреусслера-Шейнкера, куру, трансмиссивную энцефалопатию норок, хроническую изнуряющую болезнь, кошачью губчатую энцефалопатию и т.д., которые влияют на людей и животных. Сообщалось, что BSE пересекает видовой барьер и поражает даже людей.

У агента, который вызывает трансмиссивную губчатую энцефалопатию (TSE), есть особенности, которые заключаются в том, что он не имеет иммуногенности и инкубационный период является длинным. Из гистопатологического анализа BSE-пораженной ткани головного мозга крупного рогатого скота, можно видеть, что специальные губчатые вакуоли сформировались в головном мозге из-за повреждения нейронов и отложения аномальных белковых волокон.

Причиной TSE является белковые инфекционные частицы, известные как аномальный прион. В отличие от обычных вирусов, которые требуют нуклеиновой кислоты, аномальный прион представляет собой инфекционную частицу, состоящую только из белка, без нуклеиновой кислоты. Что касается TSE, то известно, что, когда аномальный прион (PrPsc), который представляет собой инфекционную частицу связываются с аномальным прионом (PrPc), то он превращается в патогенный прион, который затем накапливается в головном мозге (Prusiner SB, Alzheimer Dis Assoc Disord., 3:52-78, 1989).

Болезнь Крейтцфельдта-Якоба является редким нейродегенеративным расстройством человеческой трансмиссивной губчатой энцефалопатии (TSE), при которой трансмиссивный агент представляет собой, по-видимому аномальную форму прионного белка. У индивидуума с болезнью Крейтцфельдта-Якоба кажущееся совершенное здоровье может ухудшиться в акинетический мутизм в течение шести месяцев. Таким образом, может иметь место потенциальный риск приобретения прион-опосредованного заболевания, такого как болезнь Крейтцфельдта-Якоба, из-за введения фармацевтической композиции, которая содержит биологический агент, такой как ботулинический токсин, полученный с использованием продуктов животного происхождения. Таким образом, если фармацевтическую композицию получают с помощью лекарственного вещества, полученного с использованием компонентов животного происхождения, она может подвергнуть пациента потенциальному риску получения различных патогенов или инфекционных агентов.

В соответствии с этим предшествующим уровнем техники, авторы настоящего изобретения обнаружили, что, когда среда содержит полученный из растений пептон без трансмиссивной губчатой энцефалопатии (TSE) и минеральные компоненты, используется для культивирования Clostridium botulinum для предотвращения риска развития вышеописанного прион-опосредованного заболевания, риск развития прион-опосредованного заболевания, которое может произойти в среде, используется в настоящее время (оригинальная среда) может быть исключен, а скорость роста Clostridium botulinum в среде может быть увеличена по сравнению со средой, которая используется в настоящее время, в результате чего выполняется настоящее изобретение.

Раскрытие изобретения

Техническая проблема

Задача настоящего изобретения заключается в создании композиции среды, содержащей пептоны растительного происхождения, не имеющие никакого риска инфекции трансмиссивной губчатой энцефалопатией (TSE), а также в способе производства ботулинического токсина, который улучшает выработку ботулинического токсина путем культивирования Clostridium botulinum в композиции среды.

Техническое решение

Для достижения вышеуказанной цели настоящее изобретение обеспечивает композицию среды для культивирования Clostridium botulinum, содержащей: по меньшей мере, один пептон растительного происхождения, выбранный из группы, состоящей из гидролизата садового гороха, гидролизата семян хлопчатника и гидролизата клейковины пшеницы.

Настоящее изобретение также относится к способу получения ботулинического токсина, включающему следующие стадии: (а) культивирование Clostridium botulinum, с использованием вышеописанной композиции среды для получения ботулинического токсина; и (b) выделение полученного ботулинического токсина.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1 демонстрирует рост Clostridium botulinum в среде (APF-среде), содержащей пептоны растительного происхождения.

Фиг. 2 демонстрирует рост Clostridium botulinum в среде, содержащей пептоны растительного происхождения, минеральные вещества, аминокислоты и витамины.

Фиг. 3 демонстрирует результаты изучения образования осадка после стерилизации среды, содержащей пептоны растительного происхождения, минеральные вещества, аминокислоты и витамины.

Фиг. 4 демонстрирует результаты изучения образования осадка после стерилизации среды, содержащей пептоны растительного происхождения и минеральные вещества.

Фиг. 5 демонстрирует рост Clostridium botulinum в средах, полученных путем дополнительного добавления витаминов, аминокислот и «BD Recharge™ without Glucose and L-Glutamine» к среде для культивирования бактерии, которая содержит пептоны растительного происхождения и минеральные вещества.

Фиг. 6 демонстрирует рост Clostridium botulinum в средах для культивирования бактерии, которые содержат различные виды пептонов растительного происхождения.

Фиг. 7 демонстрирует контурные диаграммы FFD для минерального скрининга и оптимизации отклика. Фиг. 7а (А) контурная диаграмма для высоких настроек; фиг. 7b (В) контурная диаграмма для средних настроек; фиг. 7c (С) контурная диаграмма для низких настроек; а фиг. 7d (D) Оптимизация ответа для максимального OD.

Фиг. 8 демонстрирует контурные диаграммы FFD для минерального скрининга и оптимизации ответа. Фиг. 8а контурная диаграмма для высоких настроек; фиг. 8b контурная диаграмма для средних настроек; фиг. 8c контурная диаграмма для низких настроек; а также фиг. 8d оптимизация ответа для максимальной оптической плотности.

Фиг. 9 демонстрирует контурные диаграммы для скрининга растительного пептона и оптимизации ответа. Фиг. 9а контурная диаграмма для средних настроек; фиг. 9b контурная диаграмма для низких настроек; и фиг. 9c оптимизация ответа для максимального OD.

Фиг. 10 демонстрирует кривую роста Clostridium botulinum в окончательно подобранной APF-среде, и изменение концентрации токсина.

Наилучшее воплощение изобретения

В настоящем изобретении, была сделана попытка приготовить среду, которая еще больше повысит скорость роста Clostridium botulinum по сравнению со средой, используется в настоящее время (исходной среде) и которая не имеет никакого риска инфекции TSE или чем-либо подобным. Таким образом, была использована среда без животных белков (APF), содержащая пептоны растительного происхождения и исследован рост бактерий в среде APF. В результате APF-среда показала повышенную скорость роста бактерий по сравнению со средой, которая используется в настоящее время. Таким образом, если используется APF-среда, может быть получена высокая концентрация ботулинического токсина путем культивирования бактерии безопасным образом в условиях, свободных от TSE.

При использовании в данном описании, термин «среда, используемая в настоящее время или исходная среда» означает среду, содержащую гидролизат казеина, дрожжевой экстракт и тиогликолевую среду, которые являются компонентами среды животного происхождения. Термин «APF-среда (среда без животного белка)» означает среду, которая содержит неживотный белок, и которая содержит пептоны растительного происхождения, минеральные вещества и глюкозу.

В одном из примеров настоящего изобретения, для того чтобы произвести ботулинический токсин путем культивирования Clostridium botulinum в условиях, свободных от трансмиссивной губчатой энцефалопатии (TSE), APF-среду, содержащую пептон растительного происхождения, свободный от TSE, готовили и сравнивали со средой, используется в настоящее время (содержащей животный компонент). В результате, можно увидеть, что оптимальная композиция среды для культивирования Clostridium botulinum является композицией, содержащей пептон растительного происхождения, по меньшей мере, одно минеральное вещество, выбранное из группы, состоящей из KH₂PO_4, K₂HPO₄ и Na₂HPO₄, и источник углерода (например, глюкозу), и в этой среде был обнаружен оптимальный рост бактерий. В результате, как показано в таблице 13, было установлено, что оптимальное содержание пептонов растительного происхождения в окончательно подобранной композиции среды для культивирования Clostridium botulinum представляет собой 5 г/л Hy-Pea™ 7404, 10 г/л UltraPep™ Cotton и 5 г/л HyPep™ 4601N, а оптимальное содержание минеральных веществ в композиции среды представляет собой 5,5 г/л К₂HPO₄ и 3 г/л Na₂HPO₄.

В другом примере настоящего изобретения, измеряли паттерн роста Clostridium botulinum в окончательно подобранной APF-среде, содержащей пептоны растительного происхождения и минеральные вещества, и концентрацию токсина. В результате, как показано в таблице 12 и на фиг. 10, значение OD начало расти после 12 часов культивирования Clostridium botulinum, а через 24 часов культивирования, культуральная среда продемонстрировала OD_540нм равное 3,5465 и OD_600нм равное 3,0695. Затем, значение OD постепенно уменьшалось, а через 48 часов культивирования, культуральная среда продемонстрировала OD_540нм равное 0,792 и OD_600нм равное 0,7224. Концентрация токсина в надосадочной жидкости культуральной среды Clostridium botulinum начала расти после 5 часов культивирования и показала конечное значение 31,41 мкг/мл. Когда концентрацию токсина измеряли после разрушения бактерии, токсин начал вырабатываться после 5 часов культивирования, и концентрация токсина продолжала расти, поддерживалась на одном уровне после 28 часов культивирования, и показала конечное значение 38,39 мкг/мл.

Исходя из этого, в одном аспекте, настоящее изобретение относится к составу среды для культивирования Clostridium botulinum, содержащей: по меньшей мере, один пептон растительного происхождения, выбранный из группы, состоящей из гидролизата садового гороха, гидролизата семян хлопчатника и гидролизата клейковины пшеницы.

При использовании в данном описании, термин «пептон растительного происхождения» означает пептон, извлеченный из садового гороха, семян хлопчатника или клейковины пшеницы. Предпочтительно, пептон растительного происхождения может быть коммерчески доступным Hy-Pea™ 7404, UltraPep™ Cotton, HyPep™ 7504 или HyPep™ 4601N, без ограничения указанным.

При использовании в данном описании, термин «пептон растительного происхождения» или «гидролизат растительного происхождения» означает продукт, полученный путем деградации белка, выделенного из растения. Например, пептон садового гороха (гидролизат садового гороха) означает продукт, полученный путем деградации общего белка, выделенного из садового гороха.

Деградацию белка растительного происхождения предпочтительно осуществляют путем частичного гидролиза. Деградацию белка предпочтительно осуществляют путем обработки кислотой, обработки основанием, ферментативной обработкой, обработки под высоким давлением, термической обработкой или физической обработкой. Более предпочтительно, пептон растительного происхождения может быть получен путем обработки ферментом. Физическая обработка представляет собой, например, дробление.

Пептон растительного происхождения, который используется в настоящем изобретении, представляет собой продукт частичной деградации белка растительного происхождения, представляет собой смесь, содержащую не только аминокислоты, которые являются отдельными молекулами, но также и пептиды, состоящие от нескольких до нескольких десятков аминокислот, и интактные молекулы белка.

В настоящем изобретении, содержание пептонов растительного происхождения в составе среды могут составлять 0,1-10% масс./об. (1-100 г/л), предпочтительно 0,2-5% масс./об. (2-50 г/л), более предпочтительно, 0,5-2% масс./об. (5-20 г/л).

В настоящее изобретении композиция среды содержит все из числа гидролизата садового гороха, гидролизата семян хлопка и гидролизата пшеничной клейковины, и относительное содержание гидролизата садового гороха, гидролизата семян хлопчатника и гидролизата клейковины пшеницы в композиции среды может составлять 1: 0,24-43,62: 0,01-50,57 по массе, предпочтительно от 1: 0,68-14,46: 0,09-9,87 по массе, более предпочтительно от 1: 1,6-2,4: 0,6-1,4 по массе.

В настоящем изобретении композиция среды для культивирования Clostridium botulinum может дополнительно содержать источник углерода и, по меньшей мере, одно минеральное вещество, выбранное из группы, состоящей из K₂HPO₄ (дикалий фосфат), Na₂HPO₄ (динатрий фосфат) и КН₂РО₄ (монокалийфосфат).

В данном случае примеры источника углерода включают, без ограничения указанным, моносахариды (например, глюкозу, фруктозу и т.д.), дисахариды (например, мальтозу, сахарозу и т.д.), олигосахариды, полисахариды (например, декстрин, циклодекстрин, крахмал и т.д.), сахарные спирты (например, ксилит, сорбит, эритрит и т.д.).

В настоящем изобретении содержание минерала в композиции среды может составлять 0,05-3,5 масс./об.% (0,5-35 г/л), предпочтительно 0,1-1,75 масс./об.% (1-17,5 г/л), и более предпочтительно 0,25-0,7 масс./об.% (2,5-7 г/л).

В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу получения ботулинического токсина, включающему следующие стадии: (а) культивирование Clostridium botulinum, с использованием описанной выше композиции среды для получения ботулинического токсина; и (b) выделение полученного ботулинического токсина.

В настоящем изобретении, культивирование можно проводить в анаэробных условиях, и ботулинический токсин может быть выбран из группы, состоящей из ботулинического токсина типов A, B, C, D, E, F и G.

Примеры

В дальнейшем настоящее изобретение будет описано более подробно со ссылкой на примеры. Для специалиста, имеющего обычный опыт в данной области техники, будет очевидно, что эти примеры представлены только в иллюстративных целях и не должны рассматриваться как ограничивающие объем настоящего изобретения. Таким образом, существенный объем настоящего изобретения будет определен приложенной формулой изобретения и ее эквивалентами.

Пример 1. Культивирование Clostridium botulinum в среде с пептоном растительного происхождения

1-1. Композиция среды, используемой в настоящее время при культивировании

Реагенты и компоненты среды, используемые в настоящем изобретении, были приобретены у Sigma (США), Kerry Inc. (США), BD Biosciences (США), Gibco Life Technologies (США) и Quest (США).

Среда, используемая в настоящее время, имеет композицию, включающую 2% гидролизата казеина (20 г/л), 1% дрожжевого экстракта (10 г/л), 1% глюкозы (10 г/л) и 0,5% тиогликолевой среды (5 г/л), использовалась для посевной культуры и основной культуры Clostridium botulinum для выработки ботулинического токсина. 5 г тиогликолевой среды на литр среды, используемой в настоящее время, которая состоит из 2,52 г ферментативного гидролизата казеина, 0,84 г дрожжевого экстракта, 0,925 г декстрозы, 0,085 г тиогликолята натрия, 0,42 г NaCl, 0,085 г L-цистеина, 0,00014 г ресазурина и 0,125 г бактериологического агара.

1-2. Композиция APF-среды, используемой при культивировании

Среду отрицательного контроля получали путем удаления гидролизата казеина, дрожжевого экстракта и тиогликолевой среды из среды, используемой в настоящее время (оригинальная среда), для культивирования Clostridium botulinum, и среду, которая не содержит белки животного происхождения (APF), получали путем добавления четырех кандидатов пептонов растительного происхождения (Hy-Pea™ 7404, UltraPep™ Cotton, HyPep™ 7504 и HyPep™ 4601N) к среде отрицательного контроля (таблица 1).

В таблице 1 показаны компоненты APF-среды, содержащей пептон растительного происхождения для культивирования Clostridium botulinum, в сравнении со средой, которая используется в настоящее время.

Таблица 1

Компоненты среды	Концентрация (г/л)	Среда, которая используется в настоящее время	Отрицательный контроль	APF-среда
Глюкоза	10	10	10	10
Хлорид натрия (NaCl)	0,42	0,42	0,42	0,42
Гидролизат казеина	20	20	-	-
Экстракт дрожжей	10	10	-	-
Тиогликолевая среда	5	5	-	-
Hv-Pea™ 7404	20	-	-	20
UltraPep™ Cotton	10	-	-	10
HyPep™ 7504	10	-	-	10
HyPep™ 4601N	10	-	-	10

1-3. Посевная культура Clostridium botulinum

20 мкл Clostridium botulinum (Корейские центры по контролю и профилактике заболеваний, Учетный номер: 4-029-CBB-IS-001) высевали в культуральную пробирку, содержащую 10 мл стерильной среды, имеющей каждую из композиций, описанных в примерах 1 -1 и 1-2 и подвергали первичному посевному культивированию (стационарные культуры) при 35°C в течение 22-30 часов в анаэробных условиях. Когда рост бактерий в первичной посевной культуре был подтвержден, 8 мл первичной посевной культуры инокулировали в 1-литровую культуральную бутыль, содержащую 800 мл стерильной среды, имеющей такую же композицию среды, и подвергали второму посевному культивированию (стационарная культура) при 35°C в течение 8-15 часов в анаэробных условиях.

1-4. Основная культура Clostridium botulinum

Для того чтобы получить ботулинический токсин путем культивирования Clostridium botulinum, была получена основная культура бактерий. В частности, 9,3 литра среды, имеющей каждую из композиций, описанных в примерах 1-1 и 1-2, получали и помещали в 10 литровый инкубатор после стерилизации среды. Подавали азот для создания анаэробных условий и рост бактерий проводили при температуре 35°C и скорости перемешивания 50 оборотов в минуту.

Вторичную посевную культуру в 1-литровой культуральной бутыли в примере 1-3, вносили в 10-литровый инкубатор через инокуляционную линию, подключенную к порту для инокуляции 10-литрового инкубатора. Clostridium botulinum в 10-литровом инкубаторе культивировали в условиях 35°C при 50 оборотах в минуту, и набор условий культивирования контролировали и записали. Когда бактерии культивировали в течение 100 часов или более, основную культуру завершали.

Рост Clostridium botulinum в среде без животных белков (AFP), полученной путем добавления четырех пептонов-кандидатов растительного происхождения (Hy-Pea™ 7404, UltraPep™ Cotton, HyPep™ 7504 и HyPep™ 4601N) к среде отрицательного контроля сравнивали с ростом бактерии в среде отрицательного контроля, полученной путем удаления гидролизат казеина, дрожжевого экстракта и тиогликолевой среды из среды, которая используется в настоящее время (исходная среда) (таблица 1).

В результате, как показано в таблице 1 и на фиг. 1, Clostridium botulinum не росли в среде отрицательного контроля, но начали расти в исходной среде (среде, которая используется в настоящее время) в течение 24 часов после инокуляции бактерий и начали расти в среде содержащей пептон растительного происхождения через 30 часов после инокуляции бактерии.

Пример 2. Культура Clostridium botulinum в среде, содержащей пептоны растительного происхождения, минеральные вещества, аминокислоты и витамины

Поскольку рост Clostridium botulinum в среде, приготовленной путем добавления четырех пептонов растительного происхождения в примере 1, был медленнее, чем в исходной среде, к ней были добавлены растворы, как указано далее.

1) Для того чтобы изучить эффект функционирования тиогликолята для получения анаэробных условий, тиогликолят удаляли из исходной среды (среды, используемой в настоящее время), и анализировали изменение скорости роста бактерий в среде без тиогликолята.

2) Поскольку замедленная скорость роста может быть результатом отсутствия источника азота, концентрация пептона в среде, используемой для культивирования бактерий, была увеличена в два раза.

3) Рост Clostridium botulinum в среде, полученной добавлением минеральных веществ, аминокислот и витаминов в среду, содержащую пептон растительного происхождения, сравнивали с ростом Clostridium botulinum в AFP-среде, раскрытой в патенте США № 8 012 716 (Allergan) (таблица 2).

В таблице 2 показаны компоненты среды для культивирования Clostridium botulinum, которая содержит пептоны растительного происхождения, минеральные вещества, аминокислоты и витамины.

Таблица 2

Компоненты среды	г/л	Среда, которая используется в настоящее время	1 (Кандидат APF-среды)	2 (Кандидат APF-среды)	3 (Кандидат APF-среды)	4 (Кандидат APF-среды)	APF Среда Allergan Company
глюкоза	10	10	10	10	10	10	15
Хлорид натрия (NaCl)	0,42	0,42	0,42	0,42	0,42	0,42	-
Гидролизат казеина	20	20	20	-	-	-	-
Экстракт дрожжей	10	10	10	-	-	-	12
Тиогликолевая среда	5	5	-	-	-	-	-
Hy-Pea™ 7404	20	-	-	20	40	20	-
UltraPep™ Cotton	10	-	-	10	20	10	-
HyPep™ 7504	10	-	-	10	20	10	-
HyPep™ 4601N	10	-	-	10	20	10	-
KH2PO4	7	-	-	-	-	4	-
K2HPO4	5,5	-	-	-	-	5,5
Na2HPO4	5	-	-	-	-	5	-
MgSO4 7H2O	10	-	-	-	-	10	-
Витаминный набор 100X		-	-	-	-	1X	-
Аминокислотная смесь 50X		-	-	-	-	1X	-
Соевый пептон	32,5	-	-	-	-	-	32,5

В результате, как показано в таблице 2 и на фиг. 2, когда бактерию культивировали в среде, используемой в настоящее время, без тиогликолята, скорость роста бактерий в среде была медленнее, чем в тиогликолят-содержащей среде, что говорит о том, что тиогликолят влияет на скорость роста бактерии. Когда концентрация пептона в среде выросла в два раза, бактерия в среде не росла. В случае, когда минеральные компоненты, аминокислоты и витамины были добавлены к пептон-содержащей среде, скорость роста бактерии была похожа на скорость в среде, которая используется в настоящее время, но после стерилизации среды образовался осадок. Кроме того, было видно, что скорость роста бактерий в APF-среде Allergan’s была похожа на скорость в среде, которая используется в настоящее время.

Пример 3. Получение осадка путем стерилизации среды, содержащей пептоны растительного происхождения, минеральные вещества, аминокислоту и витамин

В примере 2, было обнаружено, что скорость роста Clostridium botulinum в среде, содержащей пептоны растительного происхождения, минеральные вещества, аминокислоты и витамины, из числа кандидатов APF-среды 2-4, представленных в таблице 2, были похожими на среду, используемую в настоящее время. Однако после стерилизации среды имело место образование осадка, и была исследована причина этого (таблица 3).

В таблице 3 показаны компоненты среды для культивирования Clostridium botulinum, которая была использована для стерилизации, включающие пептоны растительного происхождения, минеральные вещества, аминокислоты и витамины.

Таблица 3

Компоненты среды	г/л	Среда, которая используется в настоящее время	1 (Кандидат APF-среды)	2 (Кандидат APF-среды)	3 (Кандидат APF-среды)	4 (Кандидат APF-среды)
Глюкоза	10	10	10	10	10	10
Хлорид натрия (NaCl)	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5
Гидролизат казеина	20	20	-	-	-	-
Экстракт дрожжей	10	10	-	-	-	-
Тиогликолевая среда	5	5	-	-	-	-
Hv-Pea™ 7404	20	-	20	20	20	20
UltraPep™ Cotton	10	-	10	10	10	10
HyPep™ 7504	10	-	10	10	10	10
HyPep™ 4601N	10	-	10	10	10	10
KH2PO4	7	-	-	7	-	-
K2HPO4	5,5	-	5,5	5,5	-	-
Na2HPO4	5	-	5	5	-	-
MgSO4 7H2O	10	-	10	10	-	-
Витаминный набор 100x		-	1X	-	1X	1X (добавление после стерилизации)
Аминокислотная смесь 50 х		-	1X	-	1X	1X (добавление после стерилизации)

В результате, как показано в таблице 3 и на фиг. 3, осадок после стерилизации среды образовывался только в том случае, когда минеральные вещества были добавлены к среде, содержащей пептон растительного происхождения, что свидетельствует о том, что основной причиной образования осадка являлись минеральные вещества. Это, как предполагается, происходило потому, что минеральные компоненты взаимодействуют друг с другом в условиях высокой температуры и высокого давления во время стерилизации среды.

Пример 4. Образование осадка при стерилизации среды, содержащей пептоны растительного происхождения и минеральные вещества

Для того чтобы определить минеральные компоненты, участвующие в формировании осадка, вызванного стерилизацией, подтвержденного в примере 3, добавляли различные комбинации различных компонентов в среды с последующей стерилизацией (таблица 4).

В таблице 4 показаны компоненты сред для культивирования Clostridium botulinum, которые содержат пептоны растительного происхождения и минеральные вещества, а также результаты стерилизации этих сред.

Таблица 4

Компоненты среды	г/л	Среда, которая используется в настоящее время	1 (кандидат APF- Среды)	2 (кандидат APF- Среды)	3 (кандидат APF- Среды)	4 (кандидат APF- Среды)	5 (кандидат APF- Среды)	6 (кандидат APF- Среды)	7 (кандидат APF- Среды)	8 (кандидат APF- Среды)	9 (кандидат APF- Среды)	10 (кандидат APF- Среды)	11 (кандидат APF- Среды)	12 (кандидат APF- Среды)
глюкоза	10	10	10	10	10	10	10	10	10	10	10	10	10	10
Хлорид натрия (NaCl)	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5
Гидролизат казеина	20	20	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
Экстракт дрожжей	10	10	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
Тиогликолевая среда	5	5	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
Hv-Pea™ 7404	20	-	20	20	20	20	20	20	20	20	20	20	20	20
UltraPep™ Cotton	10	-	10	10	10	10	10	10	10	10	10	10	10	10
HyPep™ 7504	10	-	10	10	10	10	10	10	10	10	10	10	10	10
HyPep™ 4601N	10	-	10	10	10	10	10	10	10	10	10	10	10	10
KH2PO4	7	-	-	7	-	7	7	7	-	7	7	-	-	10
K2HPO4	5,5	-	-	5,5	5,5	-	5,5	5,5	-	-	5,5	5,5	5,5	-
Na2HPO4	5	-	-	5	5	5	-	5	5	-	-	5	-	5
MgSO4 7H2O	10	-	-	10	10	10	10	-	10	10	-	-	10	-
осадок, агрегация			x	0	0	0	0	x	0	x	x	x	0	x

В результате, как показано в таблице 4 и на фиг. 4, среди сред, содержащих пептоны растительного происхождения и минеральные вещества, среда, содержащая MgSO₄ 7H₂O и K₂HPO₄ и среда, содержащая MgSO₄ 7H₂O и Na₂HPO₄, образовали осадок после стерилизации.

Пример 5. Культивирование Clostridium botulinum в условиях, в которых не образуется осадок в APF-среде

Эксперимент был проведен для того, чтобы определить, возможно ли культивирование Clostridium botulinum, когда в APF-среду примера 4, содержащей пептоны растительного происхождения и минеральные вещества, дополнительно добавлены витамины и аминокислоты. Кроме того, был проведен эксперимент для исследования возможности культивировании бактерии в среде, которая не содержит пептон растительного происхождения и минеральные вещества и содержит витамины, аминокислоты и/или «BD Recharge™ without Glucose and L-Glutamine» (каталожный № 670002, BD Bioscience) (компонент среды на основе дрожжевого экстракта без глюкозы и L-глутамина) (таблица 5).

В таблице 5 показаны компоненты сред, полученных путем дополнительного добавления витаминов, аминокислот и «BD Recharge™ без глюкозы и L-глутамин» к среде для культивирования Clostridium botulinum, которая содержит пептоны растительного происхождения и минеральные вещества, и темпы роста бактерии в средах.

Таблица 5

Компоненты среды	г/л	Среда, которая используется в настоящее время	1 (кандидат APF- Среды)	2 (кандидат APF- Среды)	3 (кандидат APF- Среды)	4 (кандидат APF- Среды)	5 (кандидат APF- Среды)	6 (кандидат APF- Среды)	7 (кандидат APF- Среды)	8 (кандидат APF- Среды)	9 (кандидат APF- Среды)	10 (кандидат APF- Среды)	11 (кандидат APF- Среды)	12 (кандидат APF- Среды)
глюкоза	10	10	10	10	10	10	10	10	10	10	10	10	10	10
Хлорид натрия (NaCl)	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5
Гидролизат Казеина	20	20	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
Экстракт дрожжей	10	10	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
Тиогликолевая среда	5	5	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
Тиогликолят натрия	1	-	-	-	-	-	-	-	-	-	1	-	-	-
Hy-Pea™ 7404	20	-	20	20	20	20	20	20	20	20	2d	20	-	-
UltraPep™ Cotton	10	-	10	10	10	10	10	10	10	10	10	10	-	-
HyPep™ 7504	10	-	10	10	10	10	10	10	10	10	10	10	-	-
НуPep™ 460IN	10	-	10	10	10	10	10	10	10	10	10	10	-	-
KH2PO4	7	-	-	7	7	7	-	7	-	-	-	-	-	-
K2HPO4	5,5	-	-	5,5	-	5,5	5,5	-	-	-	-	-	-	-
Na2HPO4	5	-	-	5	-	-	-	5	-	-	-	-	-	-
MgSO4 7H2O	10	-	-	-	10	-	-	-	-	-	-	-	-	-
Витаминный набор, 100X		-	-	1X	1X	1X	1X	1X	1X	-	-	1X	-	1X
Аминокислотная смесь, 50X		-	-	1X	1X	1X	1X	1X	1X	-	-	1X	-	1X
Без глюкозы и L-глютамина	45,42	-	-	-	-	-	-	-	-	45,42	-	45,42	45,42	45,42
Рост			X	0	X	0	0	0	X	X	X	X	Х	0
Подробности				Рост в те-че-ние 24 ч		Рост в те-че-ние 24 ч	Рост в тече-ние 24 ч	Рост в тече-ние 24 ч						Рост в тече-ние 24 ч

В результате, как показано в таблице 5 и на фиг. 5, только в том случае, когда среда содержала пептоны растительного происхождения и комбинацию двух или более минералов KH₂PO_4, K₂HPO₄ и Na₂HPO₄ и дополнительно содержала витамины и аминокислоты, Clostridium botulinum росли в пределах 24 часов после инокуляции бактерий. Кроме того, в случае, когда среда не содержала пептона растительного происхождения и содержала минеральные вещества и витамины, аминокислоты и «BD Recharge™ without Glucose and L-Glutamine», бактерия росла в пределах 48 часов после инокуляции бактерии. В заключение необходимо отметить, что наиболее подходящая композиция среды для культивирования Clostridium botulinum включает пептоны растительного происхождения, KH₂PO_4, K₂HPO_4, Na₂HPO_4, аминокислоты и витамины.

Пример 6. Культивирование Clostridium botulinum в среде, содержащей различные пептоны растительного происхождения

Эксперимент проводили с целью изучения возможности культивирования Clostridium botulinum при добавлении различных комбинаций пептонов растительного происхождения к APF-среде примера 5.

В таблице 6 показаны компоненты сред для культивирования Clostridium botulinum, которые содержат различные пептоны растительные происхождения, и результаты изучения роста бактерии в средах.

Таблица 6

Компоненты среды	г/л	Среда, которая используется в настоящее время	1 (кандидат APF- Среды)	2 (кандидат APF- Среды)	3 (кандидат APF- Среды)	4 (кандидат APF- Среды)	5 (кандидат APF- Среды)	6 (кандидат APF- Среды)	7 (кандидат APF- Среды)	8 (кандидат APF- Среды)	9 (кандидат APF- Среды)	10 (кандидат APF- Среды)	11 (кандидат APF- Среды)	12 (кандидат APF- Среды)	13 (кандидат APF- Среды)
Глюкоза	10	10	10	10	10	10	10	10	10	10	10	10	10	10	10
Хлорид натрия (NaCl)	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5
Гидролизат казеина	20	20	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
Дрожжевой экстракт	10	10	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
Тиогликолевая среда	5	5	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
Тиогликолят натрия	0,1	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	0,1	-
Hy-Pea™ 7404	10	-	10	10	-	-	-	-	-	-	10	10	10	-	-
UltraPep™ Cotton	10	-	10	-	10	-	-	-	10	10	-	-	10	-	-
Ну Pep™ 7504	10	-	10	-	-	10	-	10	-	10	-	10	-	-	-
HyPep™ 4601N	10	-	10	-	-	-	10	10	10	-	10	-	-	-	-
KH2PO4		-	7	-	7	7	7	7	7	7	7	7	7	-	7
K2HPO4	5,5	-	5,5	5,5	5,5	5,5	5,5	5,5	5,5	5,5	5,5	5,5	5,5	-	5,5
Na2HPO4	5	-	5	5	5	5	5	5	5	5	5	5	5	-	5
MgSO4 7H2O	10	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
Витаминный набор 100X		-	-	1X	1X	1X	1X	1X	1X	1X	1X	1X	1X	1X	1X
Аминокислотная смесь 50 X		-	-	1X	1X	1X	1X	1X	1X	1X	1X	1X	1X	1X	1X
Без глюкозы и L-глютамина	45,42	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	45,42	45,42
Рост			0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	x	x

В результате, как показано в таблице 6 и на фиг. 6, даже тогда, когда только или два из четырех пептонов растительного происхождения были добавлены к среде, культивирование Clostridium botulinum было возможно.

Принимая в расчет результаты примеров 5 и 6, можно увидеть, что, по меньшей мере, один пептон растительного происхождения должен содержаться в среде и что пептон растительного происхождения не может быть замещен «BD Recharge™ without Glucose and L-Glutamine» (кат. № 670002, BD Bioscience) (компонент среды на основе дрожжевого экстракта без глюкозы и L-глутамина).

Пример 7. Эксперимент по отбору двух из трех типов минеральных веществ, содержащихся в среде

В примерах с 1 по 7, было установлено, что композиция APF-среды, используемой для культивирования Clostridium botulinum, включает глюкозу, хлорид натрия (NaCl), четыре пептона растительного происхождения, три минеральных вещества, аминокислоты и витамины. Из числа этих компонентов среды, компоненты среды, не оказывающие существенного влияния на рост бактерии, были удалены для того, чтобы уменьшить количество компонентов среды. Таким образом, был сделан вывод, что аминокислоты и витамины не оказывают существенного влияния на рост Clostridium botulinum, и согласно этому суждению, аминокислоты и витамины были удалены из компонентов среды. Кроме того, для того чтобы выбрать два из трех типов минеральных веществ, бактерию культивировали с использованием композиций среды, приведенной в таблице 7, и значения OD (540 нм и 600 нм) через 24 и 48 часов после инокуляции бактерии измеряли и сравнивали.

В таблице 7 представлены композиции сред, полученные в результате отбора минеральных веществ первой стадии, и рост Clostridium botulinum в этих средах.

Таблица 7

Компоненты среды	г/л	Среда, которая используется в настоящее время	1 (кандидат APF- Среды)	2 (кандидат APF- Среды)	3 (кандидат APF- Среды)	4 (кандидат APF- Среды)	5 (кандидат APF- Среды)	6 (кандидат APF- Среды)	7 (кандидат APF- Среды)	8 (кандидат APF- Среды)	9 (кандидат APF- Среды)	10 (кандидат APF- Среды)	11 (кандидат APF- Среды)
глюкоза	10	10	10	10	10	10	10	10	10	10	10	10	10
Хлорид натрия (NaCl)	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5
Гидролизат казеина	20	20	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
Экстракт дрожжей	10	10	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
Тиогликолевая кислота	5	5	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
Hv-Pep™ 7404	10		10	10	10	10	10	10	10	10	10	10	10
UltraPep™ Cotton	10	_	10	10	10	10	10	10	10	10	10	10	10
HyPep™ 7504	10	-	10	10	10	10	10	10	10	10	10	10	10
Ну Pep™ 460 IN	10	-	10	10	10	10	10	10	10	10	10	10	10
KH2PO4	7	-	-	7	-	7	-	7	-	7	3,5	3,5	3,5
K2HPO4	5,5	-	-	-	5,5	5,5	-	-	5,5	5,5	2,75	2,75	2,75
Na2HPO4	5	-	-	-	-	-	-	-	5	5	2,5	2,5	2,5
OD 24 ч культуры	540 нм	0,942	-0,017	-0,024	4,396	3,226	4,218	3,214	4,964	3,991	3,951	3,938	3,594
600 нм	0,780	-0,016	-0,020	3,832	2,691	3,593	2,680	4,304	3,351	3,341	3,335	3,036
OD 48 ч культуры	540 нм	2,459	-0,014	-0,019	4,716	5,220	3,502	5,460	2,056	2,603	5,726	5,682	5,434
600 нм	2,057	-0,015	-0,018	3,852	4,288	2,989	4,480	1,587	2,020	4,688	4,647	4,459

В результате, как показано в таблице 7, через 24 часа после инокуляции бактерии, среда, которая используется в настоящее время, продемонстрировала значение OD (540 нм) 0,942, а APF-среда, содержащая K₂HPO₄ и Na₂HPO₄, показала самое высокое значение OD (540 нм), равное 4,964, среди AFP-сред. Кроме того, через 48 часов после инокуляции бактерий, APF-среда, содержащая KH₂PO₄ и Na₂HPO₄ показала самое высокое значение OD и активный бактериальный рост.

Тем временем, как показано на фиг. 7а–7d, были созданы контурные диаграммы K₂HPO₄ и Na₂HPO₄, демонстрирующие высокие основные эффекты. В результате, поскольку концентрации K₂HPO₄ и Na₂HPO₄ увеличились, увеличилось и значение OD. И Clostridium botulinum показали самый высокий рост, когда к среде были добавлены минеральные вещества в концентрации КН₂РО₄ = 0 г/л, K₂HPO₄ = 5,5 г/л, и Na₂HPO₄ = 5 г/л.

Тем временем, для того чтобы подтвердить результаты бактериальной культуры в соответствии с более точным добавлением минералов, провели вторую стадию эксперимента с использованием методологии поверхности отклика. Так как композиция среды не может иметь отрицательное значение, был запланирован эксперимент с использованием центрального композиционного плана (CCF, central composite faced) и было проведено культивирование бактерии в композициях среды, показанных в таблице 8. Затем, экспериментальные результаты были объединены с результатами ранее выполненного FFD и подвергнуты статистическому анализу.

В таблице 8 представлены композиции сред, полученные в результате отбора минеральных веществ второй стадии, и рост Clostridium botulinum в этих средах.

Таблица 8

Компоненты среды	г/л	1 (кандидат APF- Среды)	2 (кандидат APF- Среды)	3 (кандидат APF- Среды)	4 (кандидат APF- Среды)	5 (кандидат APF- Среды)	6 (кандидат APF- Среды)	7 (кандидат APF- Среды)	8 (кандидат APF- Среды)	9 (кандидат APF- Среды)	Среда, которая используется в настоящее время
Глюкоза	10	10	10	10	10	10	10	10	10	10	10
Хлорид натрия (NaCl)	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	-
Гидролизат казеина	20	-	-	-	-	-	-	-	-	-	20
Экстракт дрожжей	10	-	-	-	-	-	-	-	-	-	10
Тиогликолевая среда	5	-	-	-	-	-	-	-	-	-	5
Hy-Pea™ 7404	10	10	10	10	10	10	10	10	10	10	-
UltraPep™ Cotton	10	10	10	10	10	10	10	10	10	10	-
Ну Pep™ 7504	10	10	10	10	10	10	10	10	10	10	-
Ну Pep™ 4601N	10	10	10	10	10	10	10	10	10	10	-
KH2PO4	7	-	7	3,5	3,5	3,5	3,5	3,5	3,5	3,5	-
К2НРО4	5,5	2,75	2,75	2,75	2,75	2,75	2,75	2,75	2,75	2,75	-
Na2HPO4	5	2,5	2,5	2,5	2,5	-	5	2,5	2,5	2,5	-
OD 24 ч	540 нм	4,408	3,587	2,233	4,639	1,778	4,332	3,904	3,907	4,046	1,556
600 нм	3,836	3,086	1,896	4,068	1,503	3,777	3,366	3,368	3,505	1,307
OD 48 ч	540 нм	5,021	5,760	4,359	3,594	4,529	4,054	6,492	5,621	5,473	3,622
600 нм	4,284	4,925	3,695	3,049	3,832	3,457	5,603	4,830	4,677	3,062

Контурные диаграммы были составлены и использованы для сравнения. Как показано на фиг. 8а-8d, значение OD увеличивается по мере уменьшения концентрации КН₂РО₄. При сравнении оптимальных условий, результаты отличались от результатов FFD из-за эффекта кривизны, а величина K₂HPO₄ была такой же, но величина Na₂HPO₄ изменяется от 5 г/л до 3,1313 г/л. Таким образом, путем статистического анализа было подтверждено, что оптимальные минеральные условия среды представляют собой 5,5 г/л К₂HPO₄ и 3 г/л Na₂HPO₄.

Пример 8. Эксперимент по отбору пептонов растительного происхождения, содержащихся в среде

Как показано в таблицах 9 и 10, пептоны растительного происхождения были объединены в соответствии с дизайном смеси, и был исследован рост Clostridium botulinum в среде, содержащей комбинацию пептонов растительного происхождения.

В таблице 9 представлены композиции сред, полученных отбором первой стадии из пептонов растительного происхождения и рост Clostridium botulinum с использованием данных сред.

Таблица 9

Компоненты среды	г/л	1 (кандидат APF- Среды)	2 (кандидат APF- Среды)	3 (кандидат APF- Среды)	4 (кандидат APF- Среды)	5 (кандидат APF- Среды)	6 (кандидат APF- Среды)	7 (кандидат APF- Среды)	8 (кандидат APF- Среды)	9 (кандидат APF- Среды)	10 (кандидат APF- Среды)	11 (кандидат APF- Среды)	Среда, которая используется в настоящее время
глюкоза	10	10	10	10	10	10	10	10	10	10	10	10	10
Хлорид натрия (NaCl)	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	-
Гидролизат казеина	20	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	20
Экстракт дрожжей	10	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	10
Тиогликолевая среда	5	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	5
Hy-Pea™ 7404	10	5	10	5	5	-	-	6,667	6,667	-	-	10	-
UltraPep™ Cotton	10	5	-	5	5	10	-	6,667	6,667	20	-	10	-
HyPep™ 7504	10	5	10	5	5	-	10	-	6 667	-	20	10	-
HyPep™ 4601N	10	5	-	5	5	10	10	6,667	-	-	-	10	-
K2HPO4	5,5	5,5	5,5	5,5	5,5	5,5	5,5	5,5	5,5	5,5	5,5	5,5	-
NA2HPO4	3	3	3	3	3	3	3	3	3	3	3	3	-
OD 24 ч	540 нм	3,541	2,440	3,345	3,305	3,317	2,852	3,695	2,772	2,353	1,688	4,842	2,239
600 нм	3,058	2,066	2,868	2,831	2,853	2,445	3,183	2,376	2,014	1,419	4,245	1,893
OD 48 ч	540 нм	0,811	0,935	0,731	0,799	1,400	0,777	1,660	1,090	1,810	1,402	2,093	3,341
600 нм	0,714	0,795	0,647	0,694	1,199	0,680	1,403	0,929	1,548	1,210	1,764	2,812

В таблице 10 представлены композиции сред, полученные отбором второй стадии из пептонов растительного происхождения и рост Clostridium botulinum с использованием данных сред.

Таблица 10

Компоненты среды	г/л	1 (кандидат APF- Среды)	2 (кандидат APF- Среды)	3 (кандидат APF- Среды)	4 (кандидат APF- Среды)	5 (кандидат APF- Среды)	6 (кандидат APF- Среды)	7 (кандидат APF- Среды)	8 (кандидат APF- Среды)	9 (кандидат APF- Среды)	10 (кандидат APF- Среды)	11 (кандидат APF- Среды)	12 (кандидат APF- Среды)	13 (кандидат APF- Среды)	Среда, которая используется в настоящее время
глюкоза	10	10	10	10	10	10	10	10	10	10	10	10	10	10	10
Хлорид натрия (NaCl)	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	-
Гидролизат казеина	20	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	20
Экстракт дрожжей	10	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	10
Тиогликолевая среда	5	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	5
Hy-Pea™ 7404	10	5	5			10	10	5	20		6,667	10	10	10	-
UltraPep™ Cotton	10	5	5	10	6,667	10	-	5	-	-	-	10	10	10	-
HyPep™ 7504	10	5	5	10	6,667	-	-	5	-	-	6,667	10	10	10	-
Ну Pep™ 4601N	10	5	5	-	6,667	-	10	5	-	20	6,667	10	10	10	-
K2HPO4	5,5	5,5	5,5	5,5	5,5	5,5	5,5	5,5	5,5	5,5	5,5	5,5	5,5	5,5	-
Na2HPO4	3	3	3	3	3	3	3	3	3		3	3	3	3	-
OD 24 ч	540 нм	3,425	3,640	2,349	2,581	3,272	1,289	3,514	0,776	1,257	3,457	5,376	5,235	4,809	2,208
600 нм	2,969	3,159	2,029	2,244	1,096	1,096	3,032	0,649	1,098	2,950	4,689	4,534	4,246	1,863
OD 48 ч	540 нм	0,769	0,836	1,633	0,961	1,501	1,148	0,803	0,880	1,278	0,962	1,986	1,994	2,010	3,185
600 нм	0,675	0,732	1,420	0,854	1,270	0,982	0,698	0,744	1,124	0,818	1,708	1,710	1,717	2,708

В результате, как показано на фиг. 9а-9с, были получены контурные диаграммы, которые использовались для анализа. Было установлено, что HyPep™ 7504, соответствующий компоненту С, оказывает самое слабое влияние на рост Clostridium botulinum. Исходя из этого определения, HyPep™ 7504 был исключен из компонентов среды. В заключение, было установлено, что композиция окончательно подобранных пептонов растительного происхождения, которые содержатся в среде, включает 5 г/л Hy-Pea™ 7404, 10 г/л UltraPep™ Cotton и 5 г/л HyPep™ 4601N.

Пример 9. Культивирование Clostridium botulinum в среде, содержащей или не содержащей NaCl

Композиции сред, используемых в примерах 1-8, содержат небольшое количество (0,5 г/л) NaCl. Для того чтобы исследовать рост Clostridium botulinum в соответствии с изменением концентрации NaCl, содержание NaCl в среде доводили до диапазона от 0 до 1 г/л, с последующим культивированием бактерии в среде.

В таблице 11 показаны компоненты NaCl-содержащей среды для культивирования Clostridium botulinum и рост Clostridium botulinum в средах.

Таблица 11

Компоненты среды	г/л	1 (кандидат APF- Среды)	2 (кандидат APF- Среды)	3 (кандидат APF- Среды)	4 (кандидат APF- Среды)	5 (кандидат APF- Среды)	6 (кандидат APF- Среды)	7 (кандидат APF- Среды)	8 (кандидат APF- Среды)	9 (кандидат APF- Среды)
глюкоза	10	10	10	10	10	10	10	10	10	10
Хлорид натрия (NaCl)	0,5	-	-	-	0,5	0,5	0,5	1	1	1
Hy-Pea™ 7404	5	5	5	5	5	5	5	5	5	5
UltraPep™ Cotton	10	10	10	10	10	10	10	10	10	10
HyPep™ 4601N	5	5	5	5	5	5	5	5	5	5
K2HPO4	5,5	5,5	5,5	5,5	5,5	5,5	5,5	5,5	5,5	5,5
Na2HPO4	3	3	3	3	3	3	3	3	3	3
OD 24 ч	540 нм	2,166	2,154	2,151	2,148	2,115	2,120	2,145	2,147	2,140
600 нм	1,940	1,923	1,922	1,922	1,892	1,896	1,919	1,922	1,917

В результате, как показано на фиг. 11, не было никакой разницы в росте бактерий, из-за наличия или отсутствия в среде NaCl. Таким образом, NaCl, был исключен из конечных компонентов APF-среды.

Пример 10. Измерение паттерна роста Clostridium botulinum в окончательно подобранной APF-среде и концентрации токсина

Clostridium botulinum высевали в окончательно подобранную среду для культивирования Clostridium botulinum (10 г/л глюкозы, 5 г/л Hy-Pea™ 7404, 10 г/л UltraPep™ Cotton, 5 г/л HyPep™ 4601N, 5,5 г/л К₂HPO_4, и 3 г/л Na₂HPO₄₎, определенной на основании результатов примеров 1-9, а затем измеряли паттерн роста бактерий и концентрацию токсина.

Таблица 12 показывает времязависимое значение OD и концентрации токсина Clostridium botulinum, выращенной в окончательно подобранной AFP-среде.

Таблица 12

Время Культивирования (час)	OD	Концентрация токсина в надосадочной жидкости (мкг/мл)	Общая концентрация токсина после разрыва штамма (мкг/мл)
540 нм	600 нм
0	0	0	0	0
6	0,0953	0,0393	0,00	0,00
9	0,0648	0,0525	0,00	0,00
12	0,5003	0,4411	0,00	0,00
14	1,1328	0,9958	2,18	2,04
16	1,6252	1,4484	4,64	10,22
18	2,3435	2,0215	6,77	18,15
20	2,777	2,4015	8,47	29,26
22	3,3485	2,896	9,46	31,86
24	3,5465	3,0695	-	31,73
28	3,452	2,982	-	37,31
36	2,5955	2,242	21,20	38,00
48	0,792	0,7224	31,41	38,39

В результате, как показано в таблице 12 и на фиг. 10, значение OD начало расти через 12 часов культивирования Clostridium botulinum, а через 24 часа культивирования культуральная среда показала OD_540нм 3,5465 и OD_600нм 3,0695. Затем, значение OD постепенно уменьшалось, а через 48 часов культивирования, культуральная среда показала OD_540нм 0,792 и OD_600нм 0,7224. Концентрация токсина в надосадочной жидкости Clostridium botulinum начала расти после 24 часов культивирования и показала конечное значение 31,41 мкг/мл. Когда концентрацию токсина измеряли после разрушения бактерии, токсин начал продуцироваться после 5 часов культивирования, и концентрация токсина продолжала расти, поддерживалась на одном уровне через 28 часов культивирования, и показала конечное значение 38,39 мкг/мл.

В заключении следует отметить, что, окончательно подобранная APF-композиция (среда без животных белков) была определена на основании результатов примеров 1-10, резюмированных в таблице 13.

Таблица 13

Компоненты среды	г/л
Источник углерода	глюкоза	10
Источник азота (растительный пептон)	Hy-Pea™ 7404	5
	UltraPep™ Cotton	10
HyPep™ 4601N	5
Минерал	K2HPO4	5,5
Na2HPO4	3

Промышленная применимость

Как описано выше, когда среда в соответствии с настоящим изобретением, которая содержит пептоны растительного происхождения и минеральные вещества, используется для культивирования Clostridium botulinum, скорость роста бактерий в данной среде оказалась почти в 1,5-2 раза выше, чем в среде, которая используется в настоящее время. Кроме того, когда ботулинический токсин получают культивированием бактерии в данной среде, инфекция трансмиссивной губчатой энцефалопатией (TSE) или чем-либо подобным может быть предотвращена путем блокирования введения компонентов животного происхождения.

Хотя настоящее изобретение было подробно описано со ссылкой на специфические признаки, специалистам в данной области техники будет очевидно, что это описание предназначено только для описания предпочтительного воплощения и не ограничивает объем настоящего изобретения. Таким образом, существенный объем настоящего изобретения будет определен приложенной формулой изобретения и ее эквивалентами.

1. Композиция среды для культивирования Clostridium botulinum, которая включает:

0,1-10 масс./об.% по меньшей мере одного пептона растительного происхождения, выбранного из группы, состоящей из гидролизата садового гороха, гидролизата семян хлопчатника и гидролизата клейковины пшеницы,

0,25-1,5 масс./об.% источника углерода,

0,05-3,5 масс./об.% по меньшей мере одного минерального вещества, выбранного из группы, включающей K₂HPO₄ (дикалийфосфат), Na₂HPO₄ (динатрийфосфат) и KH₂PO₄ (монокалийфосфат).

2. Композиция среды по п. 1, отличающаяся тем, что содержание гидролизата садового гороха, гидролизата семян хлопка и гидролизата клейковины пшеницы в композиции среды имеет соотношение 1:0,24-43,62:0,01-50,57 по массе, при условии, что композиция среды содержит гидролизат садового гороха, гидролизат семян хлопка и гидролизат клейковины пшеницы.

3. Композиция среды по п. 1, отличающаяся тем, что пептон растительного происхождения подвергают обработке ферментом.

4. Способ получения ботулинического токсина, включающий следующие стадии:

(а) культивирование Clostridium botulinum с использованием композиции среды по любому из пп. 1-3 в анаэробных условиях, и

(b) выделение полученного ботулинического токсина.

5. Способ по п. 4, отличающийся тем, что ботулинический токсин выбран из группы, состоящей из серотипов ботулинического токсина A, B, C, D, E, F и G.