Добавление железа для улучшения культивирования клеток

Изобретение относится к биохимии и представляет собой способ повышения плотности, жизнеспособности и/или титра клеток в среде для культивирования клеток, включающий этапы: (a) обеспечения клеток в среде для культивирования клеток для начала процесса культивирования клеток, где указанная среда для культивирования клеток содержит железо в качестве микроэлемента; и где концентрация железа составляет меньше чем 100 мкМ; и (b) добавления композиции, включающей железо, к вышеупомянутой среде для культивирования клеток в процессе культивирования клеток, таким образом, чтобы концентрация железа в среде для культивирования клеток повышалась на протяжении процесса культивирования клеток, где композицию, содержащую железо, добавляют на 3-й день или после него процесса культивирования клеток. 27 з.п. ф-лы, 14 ил., 3 пр.

 

РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

Настоящая заявка заявляет приоритет предварительной заявки США №61/550,058, поданной 21 октября 2011 г., полное содержание которой включено в данное описание путем ссылки.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Распространенной проблемой при культивировании клеток является гибель клеток в конце культивирования, которые могут быть вызваны разными факторами, такими, как потеря питательных веществ, накопление ингибитора, и/или окислительный стресс и другие. Большой интерес в целом и, в частности, для тех, кто использует системы культивирования клеток млекопитающих, вызывает экспрессия фармацевтически релевантных белковых продуктов, поддержание жизнеспособности клеток и/или задержка гибели клеток в процессе культивирования клеток. Применяются разные способы с целью повышения жизнеспособности культур клеток, такие, как применение добавок к питательной среде и сверхэкспрессия антиапоптозных генов. См., например, публикации Arden, et al. “Chemical caspase inhibitors enhance cell culture viabilities and protein titer” Biotechnol Prog. 2007 Mar-Apr; 23 (2): 506-511; Mastrangelo, et al. “Antiapoptosis chemicals prolong productive lifetimes of mammalian cells upon Sindbis virus vector infection” Biotechnol Bioeng. 1999 Nov 5; 65 (3): 298-305; Balcarcel, et al. “Rapamycin Reduces Hybridoma Cell Death and Enhances Monoclonal Antibody Production” Biotechnology and Bioengineering, 2001 Vol. 76, 1-10; Zanghi et al. “The growth factor inhibitor suramin reduces apoptosis and cell aggregation in protein-free CHO cell batch cultures. “Biotechnol. Prog. 2000, 16, 319-325; Simpson, et al. “Prevention of hybridoma cell death by bcl-2 during suboptimal culture conditions” Biotechnol Bioeng 1997, 54: 1-16; Singh, ef al. “Enhancement of survivability of mammalian cells by overexpression of the apoptosis suppressor gene bcl-2.” Biotechnol Bioeng. 1996, 52: 166-175; Mastrangelo, et al. “Overexpression of bcl-2 family members enhances survival of mammalian cells in response to various culture insults.” Biotechnology and Bioengineering, 2000, Vol 67, 555-564; Arden, et al. "Inhibiting the apoptosis pathway using MDM2 in mammalian cell cultures.” Biotechnology and Bioengineering, 2007; Vol. 97, 601-614). Однако в некоторых случаях применение добавок к питательной среде может задерживать прогрессирование клеточного цикла, в результате чего снижается плотность клеток, а значит, и производительность. Некоторые добавки к питательной среде могут защищать клетки от апоптоза во время фазы роста, однако они неэффективны во время фазы гибели. Кроме того, большинство добавок к питательной среде дороги, из-за чего крупномасштабное фармацевтическое производство может быть невыполнимым. Для сверхэкспрессии антиапоптозных генов трансфекция генов затруднена, и эффект может зависеть от конкретного случая.

Таким образом, существует необходимость в улучшении культивирования клеток для повышения жизнеспособности, плотности и/или титра клеток.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение включает неожиданное обнаружение того факта, что добавление железа, в частности, высокой концентрации железа, к среде для культивирования клеток, помимо обеспечения других преимуществ, может значительно улучшить плотность, жизнеспособность и/или титр клеток в культуре. Таким образом, настоящее изобретение обеспечивает эффективное, но недорогое и простое решение, касающееся улучшения культивирования клеток. Настоящее изобретение, в частности, может применяться для улучшения жизнеспособности в конце продленного культивирования клеток.

В одном аспекте настоящее изобретение обеспечивает способы повышения плотности, жизнеспособности и/или титра клеток в культуре клеток, включая этапы обеспечения клеток в среде для культивирования клеток для начала процесса культивирования клеток (например, процесса культивирования продуцирующих клеток) и добавление композиции, включающей железо, к вышеупомянутой среде для культивирования клеток в процессе культивирования клеток, таким образом, чтобы концентрация железа в среде для культивирования клеток повышалась в течение процесса культивирования клеток.

Согласно настоящему изобретению, композиция, включающая железо, может быть выбрана из различных железосодержащих соединений. В некоторых вариантах осуществления композицию, содержащую железо, выбирают из группы, к которой относятся FeSO₄, Fe-цитрат, Fe-трансферрин, Fe-хлорид, Fe-нитрат, Fe-EDTA, Fe(NO₃)₃, FeCl₂, FeCl₃ и их комбинации.

В некоторых вариантах осуществления способы в соответствии с настоящим изобретением включают добавление композиции, включающей железо, в ряд моментов на протяжении процесса культивирования клеток. В некоторых вариантах осуществления композицию, включающую железо, добавляют после 0-го дня. В некоторых вариантах осуществления композицию, включающую железо, добавляют в 1-й день или после него. В некоторых вариантах осуществления композицию, включающую железо, добавляют на 3-й день или после него. В некоторых вариантах осуществления композицию, включающую железо, добавляют на 6-й день или после него. В некоторых вариантах осуществления композицию, включающую железо, добавляют на 9-й день или после него. В некоторых вариантах осуществления композицию, включающую железо, добавляют в разные моменты времени в процессе культивирования клеток.

В некоторых вариантах осуществления концентрация железа в среде для культивирования клеток (например, после одного или нескольких добавлений композиции, включающей железо) составляет от 100 мкМ до 5 мМ. В некоторых вариантах осуществления концентрация железа в среде для культивирования клеток составляет от 300 мкМ до 1 мМ. В некоторых вариантах осуществления концентрация железа в среде для культивирования клеток составляет 1 мМ.

В соответствии с настоящим изобретением могут применяться различные типы клеток. Например, в некоторых вариантах осуществления, клетки являются клетками млекопитающих. В некоторых вариантах осуществления клетки млекопитающих выбирают из линии миеломы мыши BALB/c, ретинобластов человека (PER.C6), клеток почек обезьян, клеток мезонефроса человека (293), клеток почек новорожденного хомяка (ВНК), клетки яичника китайского хомячка (СНО), клеток Сертоли мыши, клеток почек африканской зеленой мартышки (VERO-76), клеток карциномы шейки матки человека (HeLa), клеток почек собаки, клеток печени серой крысы, клеток легких человека, клеток печени человека, клеток опухоли молочной железы мышей, клеток TRI, клеток MRC 5, клеток FS4 или линии гепатомы человека (Hep G2). В некоторых вариантах осуществления клетки млекопитающих являются клетками СНО.

В некоторых вариантах осуществления процесс культивирования клеток представляет собой процесс культивирования с подпиткой. В некоторых вариантах осуществления процесс культивирования клеток представляет собой процесс культивирования с повторной подпиткой. В некоторых вариантах осуществления процесс культивирования клеток представляет собой процесс перфузионного культивирования. В некоторых вариантах осуществления процесс культивирования клеток представляет собой процесс крупномасштабного культивирования. В некоторых вариантах осуществления объем среды для культивирования клеток составляет как минимум приблизительно 500 л. В некоторых вариантах осуществления культивирование клеток осуществляют во встряхиваемых колбах.

В некоторых вариантах осуществления добавляют дополнительные белки для улучшения плотности, жизнеспособности и/или титра культуры клеток. В некоторых вариантах осуществления среда для культивирования клеток не содержит гидролизатов. В некоторых вариантах осуществления среда для культивирования клеток содержит гидролизаты.

В некоторых вариантах осуществления клетки включают ген, кодирующий а рекомбинантный белок. В некоторых вариантах осуществления рекомбинантный белок представляет собой антитело или его фрагмент. В некоторых вариантах осуществления антитело представляет собой антитело против IL-22. В некоторых вариантах осуществления антитело представляет собой антитело против GDF8. В некоторых вариантах осуществления антитело представляет собой антитело Муо29. В некоторых вариантах осуществления антитело является однодоменным антителом. В некоторых вариантах осуществления однодоменное антитело является нанотелом против TNF. В некоторых вариантах осуществления рекомбинантный белок представляет собой гликопротеин. В некоторых вариантах осуществления рекомбинантный белок является терапевтическим белком. В некоторых вариантах осуществления терапевтический белок представляет собой антитело, фактор роста, коагулирующий фактор, цитокин, слитый белок, лекарственное вещество, вакцину, фермент или Small Modular ImmunoPharmaceutical™ (иммунофармацевтическое средство на основе модульного белка малого размера - SMIP). В некоторых вариантах осуществления описываемые авторами способы согласно изобретению также включают этап очистки рекомбинантного белка.

В другом аспекте настоящее изобретение обеспечивает рекомбинантный белок, вырабатываемый клетками, культивируемыми в соответствии с описываемыми авторами способами согласно изобретению.

В еще одном аспекте настоящее изобретение обеспечивает способы предотвращения или задержки гибели клеток в культуре клеток путем добавления композиции, включающей железо, в один или несколько моментов времени после начала процесса культивирования клеток.

В другом аспекте настоящее изобретение обеспечивает способы ингибирования апоптоза в культуре клеток путем добавления композиции, включающей железо, в один или несколько моментов времени после начала процесса культивирования клеток.

В некоторых вариантах осуществления композицию, включающую железо, добавляют после 0-го дня. В некоторых вариантах осуществления композицию, включающую железо, добавляют на 3-й день или после него. В некоторых вариантах осуществления композицию, включающую железо, добавляют на 6-й день или после него. В некоторых вариантах осуществления композицию, включающую железо, добавляют на 9-й день или после него.

В некоторых вариантах осуществления железо добавляют в таком количестве, чтобы концентрация в среде для культивирования клеток составляла от 100 мкМ до 5 мМ. В некоторых вариантах осуществления железо добавляют в таком количестве, чтобы концентрация в среде для культивирования клеток составляла от 300 мкМ до 1 мМ. В некоторых вариантах осуществления железо в таком количестве, чтобы концентрация в среде для культивирования клеток составляла 1 мМ.

В некоторых вариантах осуществления культивирование клеток представляет собой культивирование с подпиткой. В некоторых вариантах осуществления культивирование клеток представляет собой культивирование с повторной подпиткой. В некоторых вариантах осуществления культивирование клеток представляет собой перфузионное культивирование. В некоторых вариантах осуществления культивирование клеток представляет собой процесс крупномасштабного культивирования. В некоторых вариантах осуществления объем культуры клеток составляет как минимум приблизительно 500 л. В некоторых вариантах осуществления культивирование клеток осуществляют во встряхиваемых колбах.

В некоторых вариантах осуществления композицию, включающую железо, выбирают из группы, к которой относятся FeSO₄, Fe-цитрат, Fe-трансферрин, Fe-хлорид, Fe-нитрат, Fe-EDTA, Fe(NO₃)₃, FeCl₂, FeCl₃ и их комбинации.

В еще одном аспекте настоящее изобретение обеспечивает, помимо прочего, комплекты для приготовления среды для культивирования клеток, которая включает один или несколько реагентов для приготовления первичной среды для культивирования клеток, и отдельную композицию, включающую железо. В некоторых вариантах осуществления комплект включает инструкцию по добавлению отдельной композиции, включающей железо, к первичной среде для культивирования клеток в один или несколько моментов времени в течение процесса культивирования клеток, например, для повышения плотности, жизнеспособности и/или титра клеток.

В некоторых вариантах осуществления отдельная композиция, включающая железо, предусмотрена в таком количестве, чтобы концентрация составляла от 100 мкМ до 5 мМ в первичной среде для культивирования клеток. В некоторых вариантах осуществления отдельная композиция предусмотрена в таком количестве, чтобы концентрация составляла от 100 мкМ до 5 мМ в культуре клеток как минимум 500 л.

В некоторых вариантах осуществления отдельную композицию выбирают из группы, к которой относятся FeSO₄, Fe-цитрат, Fe-трансферрин, Fe-хлорид, Fe-нитрат, Fe-EDTA, Fe(NO₃)₃, FeCl₂, FeCl₃ и их комбинации.

В некоторых вариантах осуществления комплект также включает дополнительные компоненты для культивирования с подпиткой. В некоторых вариантах осуществления комплект также включает дополнительные компоненты для культивирования с повторной подпиткой. В некоторых вариантах осуществления комплект также включает дополнительные компоненты для перфузионного культивирования. В некоторых вариантах осуществления дополнительные компоненты выбирают из группы, к которой относятся гормоны и/или другие факторы роста, неорганические ионы, буферы, витамины, нуклеозиды или нуклеотиды, микроэлементы, аминокислоты, липиды, глюкоза или другие источники энергии, и их комбинации.

В этой заявке применение союза “или” означает “и/или”, если не указано иного. Применяемый в этой заявке термин “включать” и варианты этого термина, такие, как “включая” и “включает”, не предполагают исключения других добавок, компонентов, целых чисел или этапов. В контексте данного описания термины “приблизительно” и “примерно” употребляются как равноценные. Любые числительные, применяемые в этой заявке, с уточнением “приблизительно/примерно” или без него, охватывают любые нормальные отклонения, которые известны специалистам в данной области. В некоторых вариантах осуществления термин “приблизительно” или “примерно” относится к диапазону значений в пределах 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% или менее в любом направлении (более или менее) от указанного контрольного значения, если не указано иного, или если иного не вытекает из контекста (за исключением случаев, когда такое число превышает 100% положительного значения).

Другие особенности, цели и преимущества настоящего изобретения станут очевидными по ознакомлении с представленными далее подробным описанием, фигурами и формулой изобретения. Однако следует понимать, что подробное описание, фигуры и формула изобретения, представляя варианты осуществления настоящего изобретения, не ограничивают его объема, а только его поясняют. Различные изменения и модификации в пределах объема изобретения станут очевидными для специалистов в данной области.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фигуры предназначены лишь для иллюстрации и не ограничивают объем изобретения.

Фигура 1. Иллюстративные данные, демонстрирующие влияние различных доз железа, добавляемого после 3-го дня, на рост клеток СНО во встряхиваемых колбах. Рост клеток измеряют как плотность жизнеспособных клеток (VCD) (общее количество жизнеспособных клеток ×10⁶ клеток/мл) в данный момент времени.

Фигура 2. Иллюстративные данные, демонстрирующие влияние различных доз железа, добавляемого после 3-го дня, на жизнеспособность клеток СНО во встряхиваемых колбах. Жизнеспособность измеряют как процент (жизнеспособных клеток)/(общее количество клеток) в культуре в данный момент времени.

Фигура 3. Иллюстративные данные, демонстрирующие влияние различных доз железа, добавляемого после 3-го дня, на жизнеспособность клеток СНО на 16 день во встряхиваемых колбах. Жизнеспособность измеряют как процент (жизнеспособных клеток)/(общее количество клеток) в культуре в данный момент времени.

Фигура 4. Иллюстративные данные, демонстрирующие влияние различных доз железа, добавляемого после 3-го дня, на титр антитела клеток СНО на 16 день во встряхиваемых колбах. Титр антитела измеряют в граммах антитела/литр культуральной среды. Изменение титра антитела измеряют как соотношение [антитело]_{с железом}/[антитело]_{без железа} в данный момент времени.

Фигура 5. Иллюстративные данные, демонстрирующие улучшение на 14 день плотности, жизнеспособности и титра клеток по сравнению с контролем после добавления 1 мМ железа к процессу культивирования Линии клеток 2. Плотность клеток измеряют как общее количество жизнеспособных клеток ×10⁶ клеток/мл в данный момент времени. Улучшение плотности клеток представляется как соотношение плотности клеток_{с железом}/плотность клеток_{без железа}. Жизнеспособность измеряют как процент (жизнеспособных клеток)/(общее количество клеток) в культуре в данный момент времени. Улучшение жизнеспособности измеряют как соотношение % жизнеспособности_{с железом}/% жизнеспособности_{6ез железа}. Титр антитела измеряют в граммах антитела/литр культуральной среды. Изменение титра антитела измеряют как соотношение [антитела]_{с железом}/[антитела]_{без железа} в данный момент времени.

Фигура 6. Иллюстративные данные, демонстрирующие влияние добавления FeSO₄ или Fe-цитрата (600 мкМ) после 3-го дня на жизнеспособность и плотность жизнеспособных клеток Линии клеток 1 при культивировании с подпиткой на 14 день во встряхиваемых колбах. Плотность жизнеспособных клеток измеряют как общее количество жизнеспособных клеток ×10⁶ клеток/мл в данный момент времени. Улучшение плотности жизнеспособных клеток представлено как соотношение плотности клеток_{с железом}/плотности клеток_{без железа}.

Фигура 7. Иллюстративные данные, демонстрирующие влияние добавления FeSO₄ (1 мМ) на 6-й день на жизнеспособность клеток СНО, вырабатывающих нанотело, выращиваемое в подпитываемой культуре во встряхиваемых колбах.

Фигура 8. Иллюстративные данные, демонстрирующие влияние добавления FeSO₄ (1 мМ) на 6-й день на титр клеток СНО, вырабатывающих нанотело, выращиваемое в подпитываемой культуре во встряхиваемых колбах.

Фигура 9. Иллюстративные данные, демонстрирующие влияние добавления FeSO₄ (1 мМ) на 6-й день на общую продуктивность клеток СНО, вырабатывающих нанотело, выращиваемое в подпитываемой культуре во встряхиваемых колбах.

Фигура 10. Иллюстративные данные, демонстрирующие влияние добавления FeSO₄ (1 мМ) на 6-й день на выработку лактата клетками СНО, вырабатывающими нанотело, выращиваемое в подпитываемой культуре во встряхиваемых колбах.

Фигура 11. Иллюстративные данные, демонстрирующие влияние добавления FeSO₄ или Fe-цитрата (600 мкМ) на плотность клеток подпитываемой культуры клона 2.8 во встряхиваемых колбах.

Фигура 12. Иллюстративные данные, демонстрирующие влияние добавления FeSO₄ или Fe-цитрата (600 мкМ) на жизнеспособность подпитываемой культуры клона 2.8 во встряхиваемых колбах.

Фигура 13. Иллюстративные данные, демонстрирующие влияние добавления FeSO₄ или Fe-цитрата (600 мкМ) на общую продуктивность подпитываемой культуры клона 2.8 во встряхиваемых колбах.

Фигура 14. Иллюстративные данные, демонстрирующие влияние разных доз добавляемого железа на 0-й день на жизнеспособность Линии клеток 1 на 3-й день во встряхиваемых колбах. Жизнеспособность измеряют как процент (жизнеспособных клеток)/(общее количество клеток) в культуре в данный момент времени.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение обеспечивает, помимо прочего, способы и композиции для повышения плотности, жизнеспособности и/или титра клеток продукта путем добавления композиции, включающей железо, в один или несколько моментов времени на протяжении процесса культивирования клеток. Настоящее изобретение включает неожиданное обнаружение того факта, что добавление железа к культуре клеток может задерживать и/или предотвращать гибель клеток в конце культивирования клеток. В некоторых вариантах осуществления добавление железа к культуре клеток может ингибировать апоптоз в культуре клеток.

Железо является важным компонентом среды для культивирования клеток для выращивания клеток млекопитающих. Однако до настоящего изобретения считалось, что низкий уровень железа может ингибировать рост клеток после исчерпание железа, в то время, как высокий уровень железа может ингибировать рост клеток из-за токсичности (например, окислительного стресса и образования свободных радикалов). Таким образом, считалось, что баланс между благоприятными и токсичными свойствами железа важен для культивирования клеток млекопитающих. До настоящего изобретения в традиционных композициях сред применяли низкую концентрацию железа для достаточной поддержки роста клеток с одновременным сохранением уровня концентрации железа ниже токсичного. Как описывается в разделе примеров, авторами настоящего изобретения было неожиданно обнаружено, что добавление железа к культуре клеток, включение железа в концентрациях, которые считаются высокими, приводит к улучшению роста клеток и задержке гибели культивируемых клеток, в результате чего, помимо других преимуществ, значительно повышается плотность, жизнеспособность и титр клеток. Такой эффект не зависит от линии клеток, масштаба, продукта, и источника железа. Кроме того, на качество продукта не влияла высокая концентрация железа. Таким образом, настоящее изобретение обеспечивает новый и экономичных подход к улучшенному культивированию клеток.

Разные аспекты изобретения подробно описываются в следующих разделах. Эти разделы не ограничивают объем изобретения. Каждый раздел может относиться к любому аспекту изобретения. Однако специалистам в данной области станет понятно, что различные модификации этих вариантов осуществления охватываются объемом прилагаемой формулы изобретения. Именно формула изобретения и ее эквиваленты определяют объем настоящего изобретения, который не ограничивается и не должен ограничиваться этим описанием отдельных вариантов осуществления.

Композиции железа

Большое множество разнообразных железосодержащих композиций может применяться в соответствии с настоящим изобретением. В некоторых вариантах осуществления композицию, включающую железо, выбирают из группы, к которой относятся FeSO₄, Fe-цитрат, Fe-трансферрин, Fe-хлорид, Fe-нитрат, Fe-EDTA, Fe(NO₃)₃, FeCl₂, FeCl₃ и их комбинации.

В соответствии с настоящим изобретением, железо может применяться в разной концентрации. Как правило, железо обеспечивается в среде в концентрации, превышающей “следовую концентрацию”. Термин “следовая концентрация” в контексте данного описания касается концентрации, уровень которой может быть меньшим, чем поддающийся привычному и простому измерению. Например, следовой уровень соединения может составлять <10^-5, <10^-6, <10^-7 или <10^-8 М. В некоторых вариантах осуществления железо предусмотрено в среде в концентрации от приблизительно 100 мкМ до 5 мМ (например, приблизительно 100 мкМ - 4,5 мМ, 100 мкМ - 3,0 мМ, 100 мкМ - 2,5 мМ, 100 мкМ - 1,0 мМ, 100 мкМ - 1,0 мМ, 200 мкМ - 2,0 мМ, 200 мкМ - 1,5 мМ, 200 мкМ - 1,0 мМ, 150 мкМ - 4,5 мМ, 150 мкМ - 3,5 мМ, 150 мкМ - 2,5 мМ, 150 мкМ - 1,5 мМ, 150 мкМ - 1,0 мМ, 200 мкМ - 1,5 мМ, 200 мкМ - 1,0 мМ, 200 мкМ - 2,5 мМ, 300 мкМ - 2,5 мМ, 300 мкМ - 1,5 мМ, 300 мкМ - 2,0 мМ). В некоторых вариантах осуществления железо предусмотрено в среде в концентрации приблизительно 100 мкМ, 150 мкМ, 200 мкМ, 250 мкМ, 300 мкМ, 350 мкМ, 400 мкМ, 450 мкМ, 500 мкМ, 550 мкМ, 600 мкМ, 650 мкМ, 700 мкМ, 750 мкМ, 800 мкМ, 850 мкМ, 900 мкМ, 950 мкМ, 1 мМ, 1,5 мМ, 2 мМ, 2,5 мМ, 3 мМ, 3,5 мМ, 4 мМ, 4,5 мМ или 5 мМ, или в любом диапазоне этих концентраций. В некоторых вариантах осуществления железо предусмотрено в среде в концентрации от приблизительно 300 мкМ до 1 мМ. В некоторых вариантах осуществления концентрация железа в среде для культивирования клеток повышается на протяжении процесса культивирования клеток.

Настоящее изобретение также включает обнаружение того факта, что композиция, включающая железо, может обеспечиваться в среде в любой момент в процессе культивирования клеток. Композиция, включающая железо, может добавляться для достижения желаемой концентрации железа в культуральной среде путем добавления композиции в один или несколько моментов в течение периода времени. В некоторых вариантах осуществления композицию, включающую железо, добавляют в 0-й день или после 0-го дня процесса культивирования клеток. В некоторых вариантах осуществления композицию, включающую железо, добавляют после 0-го дня. В некоторых вариантах осуществления композицию, включающую железо, добавляют в 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20-й день процесса культивирования клеток (например, процесса культивирования продуцирующих клеток) или после них, или при любой комбинации вышеупомянутых моментов. В некоторых вариантах осуществления композицию, включающую железо, добавляют на 3-й день или после него.

Специалист в данной области сможет выбрать точную концентрацию железа и время добавления в этих пределах согласно изобретению на основе конкретных характеристик его экспериментального плана, включая характер культивируемых клеток, характер любого продукта (например, антитела или рекомбинантного белка), вырабатываемого клетками в культуре, присутствия или отсутствия других компонентов в среде, в которой выращивают клетки, и условий роста. Например, клетки, выращиваемые в статичной культуре, могут быть способны более или менее оптимально использовать железо по сравнению с клетками, выращиваемыми во встряхиваемой культуре (см., например, документ WO 94/02592).

Среды для выращивания культур

Термины “среда”, “среда для культивирования клеток” и “культуральная среда” в контексте данного описания означают раствор, содержащий питательные вещества, которые подпитывают растущие клетки млекопитающих. Как правило, такие растворы обеспечивают незаменимые и заменимые аминокислоты, витамины, источники энергии, липиды и микроэлементы, требуемые клетками для минимального роста и/или выживания. Такой раствор также может содержать дополнительные компоненты, увеличивающие рост и/или выживаемость до показателя, превышающего минимальный, включая, помимо прочих, гормоны и/или другие факторы роста, конкретные ионы (такие, как натрий, хлорид, кальций, магний и фосфат), буферы, витамины, нуклеозиды или нуклеотиды, микроэлементы (неорганические соединения, обычно присутствующие в очень низкой конечной концентрации), неорганические соединения, присутствующие в высокой конечной концентрации (например, железо), аминокислоты, липиды и/или глюкоза или другой источник энергии. В некоторых вариантах осуществления pH и концентрацию солей в среде надлежащим образом регулируют до оптимального для выживания и пролиферации клеток уровня. В некоторых вариантах осуществления среда является питательной средой, которую добавляют после начала культивирования клеток.

В соответствии с настоящим изобретением, могут применяться различные среды для роста клеток млекопитающих. В некоторых вариантах осуществления клетки могут выращиваться в одной из различных химически определенных сред, причем компоненты сред являются известными и контролируемыми. В некоторых вариантах осуществления клетки могут выращиваться в комплексной среде, в которой не все компоненты являются известными и/или контролируемыми.

Химически определенные среды для роста культивируемых клеток млекопитающих широко разрабатывались и публиковались в течение последних нескольких десятилетий. Все компоненты определенных сред хорошо изучены, и определенные таким образом среды не содержат сложных добавок, таких, как сыворотка или гидролизаты. Первые композиции сред разрабатывались таким образом, чтобы обеспечивалась возможность роста клеток и поддержания жизнеспособности, без учета или почти без учета выработки белка. В последнее время композиции сред разрабатывались с конкретной целью поддержки высокопродуктивных вырабатывающих рекомбинантный белок культур клеток.

Не все компоненты комплексных сред являются хорошо изученными, поэтому комплексные среды могут содержать добавки, к которым, помимо прочих, относятся простые и/или сложные источники углерода, простые и/или сложные источники азота и сыворотка. В некоторых вариантах осуществления комплексные среды, подходящие с точки зрения настоящего изобретения, содержит добавки, такие, как гидролизаты, в дополнение к другим компонентам описанной авторами определенной среды.

В некоторых вариантах осуществления определенные среды, как правило, включают примерно пятьдесят химических структурных единиц в известной концентрации в воде. Большинство из них также содержат один или несколько хорошо изученных белков, таких, как инсулин, IGF-1, трансферрин или BSA, а другие не требуют белковых компонентов и поэтому называются безбелковыми определенными средами. Типичные химические компоненты сред разделяются на пять широких категорий: аминокислоты, витамины, неорганические соли, микроэлементы и смешанную категорию, определяющую чистую категоризацию.

Среда для культивирования клеток необязательно может дополняться и другими компонентами. Термин “дополнительные компоненты” в контексте данного описания означает компоненты увеличивающие рост и/или выживаемость до показателя, превышающего минимальный, включая, помимо прочих, гормоны и/или другие факторы роста, конкретные ионы (такие, как натрий, хлорид, кальций, магний и фосфат), буферы, витамины, нуклеозиды или нуклеотиды, микроэлементы (неорганические соединения, обычно присутствующие в очень низкой конечной концентрации), аминокислоты, липиды, и/или глюкоза или другой источник энергии. В некоторых вариантах осуществления к первоначальной культуре клеток могут добавляться дополнительные компоненты. В некоторых вариантах осуществления дополнительные компоненты могут добавляться после начала культивирования клеток.

Как правило, к микроэлементам относятся различные неорганические соли, включенные на микромолярном или более низком уровне. Например, часто включаемыми микроэлементами являются цинк, селен, медь и другие. В некоторых вариантах осуществления железо (железистые или железные соли) может быть включено как микроэлемент в первичную среду для культивирования клеток в микромолярной концентрации. Как обсуждалось выше, настоящее изобретение обеспечивает способы, включающие добавление железа дополнительно к следовому количеству железа, присутствующему в первичной среде для культивирования клеток, таким образом, чтобы концентрация железа в среде для культивирования клеток превышала следовое количество (например, более 100 мкМ, 200 мкМ, 300 мкМ, 400 мкМ, 500 мкМ, 600 мкМ, 700 мкМ, 800 мкМ, 900 мкМ или 1 мМ). Марганец также часто включают среди микроэлементов как двухвалентный катион (MnCl₂ или MnSO₄) в диапазоне концентраций от наномолярной до микромолярной. В наномолярных концентрациях обычно добавляют многие менее распространенные микроэлементы.

Клетки

Любая клетка-хозяин, восприимчивая к культивированию клеток, может использоваться в соответствии с настоящим изобретением. В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин является клеткой млекопитающего. Неограничивающими примерами клеток млекопитающих, которые могут использоваться в соответствии с настоящим изобретением, могут быть линия миеломы мыши BALB/c (NSO/I, ЕСАСС No: 85110503); ретинобласты человека (PER.C6, CruCell, Leiden, Нидерланды); линия почек обезьян CV1, трансформированная SV40 (COS-7, АТСС CRL 1651); клетки мезонефроса человека (клетки 293 или 293, субклонированные для роста в суспензионной культуре, Graham et al., J. Gen Virol., 36:59, 1977); клетки почки новорожденного хомяка (ВНК, АТСС CCL 10); клетки яичника китайского хомячка +/-DHFR (СНО, Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4216, 1980); клетки Сертоли мыши (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23: 243-251, 1980); клетки почек обезьян (CV1 АТСС CCL 70); клетки почек африканской зеленой мартышки (VERO-76, АТСС CRL-1 587); клетки карциномы шейки матки человека (HeLa, АТСС CCL 2); клетки почек собаки (MDCK, АТСС CCL 34); клетки печени серой крысы (BRL 3А, АТСС CRL 1442); клетки легких человека (W138, АТСС CCL 75); клетки печени человека (Hep G2, НВ 8065); опухоль молочной железы мыши (ММТ 060562, АТСС CCL51); клетки TRI (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci., 383: 44-68, 1982); клетки MRC 5; клетки FS4; и линия гепатомы человека (Hep G2).

Кроме того, любое количество выпускаемых или не выпускаемых серийно линий клеток гибридомы может использоваться в соответствии с настоящим изобретением. Термин “гибридома” в контексте данного описания означает клетку или потомство клетки, получаемые от слияния иммортализованных и вырабатывающих антитело клеток. Такая образуемая в результате гибридома является иммортализованной и вырабатывает антитела. Отдельные клетки, используемые для создания гибридомы, могут быть взяты из организма любого млекопитающего, включая, помимо прочих, крысу, свинью, кролика, овцу, козу и человека. В некоторых вариантах осуществления гибридома представляет собой линию клеток триомы, которая образуется в случае, когда потомство слияний гетерогибридной миеломы, которые являются продуктами слияния между клетками человека и линией клеток миеломы мыши, впоследствии сливается с клетками плазмы. В некоторых вариантах осуществления гибридома может быть любой линией иммортализованных гибридных клеток, которая вырабатывает антитела такой, как, например, квадрогибридомы (см., например, Milstein et al., Nature, 537: 3053, 1983). Специалисту в данной области станет понятно, что линии клеток гибридомы могут иметь различные требования к питанию и/или могут требовать разных условий культивирования для оптимального роста, и существует возможность изменения условий согласно потребности.

Способы культивирования клеток

Термины “культура” и “культура клеток” в контексте данного описания означают популяцию клеток, суспендированную в среде в условиях, подходящих для выживания и/или роста популяции клеток. Как станет понятно специалистам в данной области, в некоторых вариантах осуществления эти термины в контексте данного описания означают комбинацию, включающую популяцию клеток и среду, в которой суспендирована популяция. В некоторых вариантах осуществления клетки культуры клеток включают клетки млекопитающих.

Настоящее изобретение может применяться с любым способом культивирования клеток, к которому применим соответствующий процесс (например, выработка рекомбинантного белка (например, антитела)). В качестве неограничивающего примера, клетки могут выращиваться в периодических или подпитываемых культурах, причем культивирование прекращают после достаточной экспрессии рекомбинантного белка (например, антитела), после чего экспрессированный белок (например, антитело) собирают. В альтернативном варианте, в качестве еще одного неограничивающего примера, клетки могут выращиваться в режиме культивирования с периодическим повторным подпитыванием или перфузионного культивирования, причем культивирование не прекращают и новые питательные вещества и другие компоненты периодически или непрерывно добавляют к культуре, и в это время периодически или непрерывно собирают экспрессированный рекомбинантный белок (например, антитело). Другие подходящие способы (например, культивирование с центрифугированием пробирок) известны специалистам в данной области и могут применяться для практического осуществления настоящего изобретения.

В некоторых вариантах осуществления культивирование клеток, подходящее для настоящего изобретения, является культивированием с подпиткой. Термин “культивирование с подпиткой” в контексте данного описания означает способ культивирования клеток, при котором в культуру вводят дополнительные компоненты один или несколько раз после начала процесса культивирования. К таким компонентам обычно относятся питательные компоненты для клеток, истощенных в процессе культивирования. В дополнительном или альтернативном варианте к таким дополнительным компонентам могут относиться описываемые авторами дополнительные компоненты. В некоторых вариантах осуществления дополнительные компоненты обеспечиваются в питательной среде, как описывается авторами. Культивирование с подпиткой обычно прекращают в определенный момент и клетки и/или компоненты в среде собирают и необязательно очищают.

В некоторых вариантах осуществления культивированием клеток, подходящим с точки зрения настоящего изобретения, является культивирование с повторной подпиткой. Термин “культивирование с повторной подпиткой” в контексте данного описания означает способ культивирования клеток, при котором часть клеток (например, приблизительно 50%, приблизительно 55%, приблизительно 60%, приблизительно 65%, приблизительно 70%, приблизительно 75%, приблизительно 80%, приблизительно 85%, приблизительно 90%, приблизительно 95% или более клеток) удаляют из культуры клеток после инокуляции и выращивания в течение определенного периода времени (например, 1 день, 2 дня, 3 дня, 4 дня, 5 дней, 6 дней, 7 дней и т.д.). Как правило, содержащую клетки среду, удаленную из культур с повторной подпиткой, заменяют равноценным объемом свежей среды. В некоторых вариантах осуществления в среде с повторной подпиткой, как описывается авторами, предусмотрены дополнительные компоненты. Культивирование с повторной подпиткой, как правило, представляет собой непрерывный процесс, который включает расширение и поддержание культур клеток в сосуде для культивирования (например, биореакторе).

В некоторых вариантах осуществления культивированием клеток, подходящим с точки зрения настоящего изобретения, является перфузионное культивирование. Как правило, перфузионное культивирование включает поддержание рабочего объема среды для культивирования клеток путем непрерывного введения свежей культуральной среды и удаление израсходованной среды путем применения системы удержания клеток. В некоторых вариантах осуществления клетки могут удерживаться в культуре с применением любого доступного способа, например, фильтрации, осаждения, центрифугирования и их комбинации. В некоторых вариантах осуществления перфузионную культуру выращивают в течение продленного периода времени (например, 2 недели, 3 недели, 4 недели, 5 недель или более).

Клетки выращивают в любом удобном объеме, выбираемом специалистом-практиком. Например, клетки могут выращиваться в маломасштабных реакционных сосудах объемом от нескольких миллилитров до нескольких литров. В альтернативном варианте клетки могут выращиваться в крупномасштабных промышленных биореакторах объемом от приблизительно как минимум 1 литра до 10, 100, 250, 500, 1000, 2500, 5000, 8000, 10000, 12000 литров или более, или в любом объеме между указанными значениями.

Температуру культуры клеток в первую очередь выбирают на основе диапазона температур, при котором культура клеток остается жизнеспособной, и диапазона, в котором обеспечивается высокий уровень выработки нужного продукта (например, рекомбинантного белка или антитела). Например, линия клеток 1 хорошо растет и может вырабатывать высокий титр антитела при приблизительно 37°C. В целом большинство клеток млекопитающих хорошо растут и могут вырабатывать нужные продукты (например, рекомбинантные белки или антитела) при температуре приблизительно от 25°C до 42°C, хотя способы, предлагаемые данным изобретением, не ограничиваются этими температурами. Некоторые клетки млекопитающих хорошо растут и могут вырабатывать нужные продукты (например, рекомбинантные белки или антитела) при температуре приблизительно от 35°C до 40°C. В некоторых вариантах осуществления культуру клеток выращивают при температуре 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45°C один или несколько раз в процессе культивирования клеток. Специалисты в данной области смогут выбрать надлежащую температуру или температуры, при которых следует выращивать клетки, в зависимости от конкретных потребностей клеток и конкретных требований специалиста-практика. Клетки могут выращиваться в течение любого периода времени, в зависимости от требований специалиста-практика и потребностей самих клеток.

Культура может подвергаться одному или нескольким сдвигам температуры в процессе культивирования. В случае сдвига температуры культуры такой сдвиг может быть относительно постепенным. Например, полное изменение температуры может занять несколько часов или дней. В альтернативном варианте, сдвиг температуры может быть относительно резким. Температура в процессе культивирования может неизменно повышаться или понижаться. В альтернативном варианте температура может повышаться или понижаться на определенную величину несколько раз в процессе культивирования. Дальнейшая(ие) температура(ы) или диапазон(ы) температур могут быть ниже или выше первоначальной(ых) или предыдущей(их) температур(ы) или диапазона(ов) температур. Специалисту в данной области станет понятно, что данный вариант осуществления охватывает несколько отдельных сдвигов температуры.

Например, температура может быть сдвинута один раз (к более высокой или более низкой температуре или диапазону температур), клетки поддерживают при этой температуре или диапазоне температур в течение определенного периода времени, после чего температура может быть снова сдвинута в сторону новой температуры или диапазона температур, и это может быть либо более высокая, либо более низкая температура или диапазон температур по сравнению с предыдущей температурой или диапазоном температур. Температура культуры после каждого отдельного сдвига может быть неизменной или может поддерживаться в определенном диапазоне температур.

В некоторых вариантах осуществления определяют плотность, жизнеспособность и/или титр клеток в культуре клеток. Термин “плотность клеток” в контексте данного описания означает количество клеток, присутствующих в данном объеме среды. Термин “жизнеспособность клеток” в контексте данного описания означает способность клеток в культуре к выживанию при данной совокупности условий культивирования или экспериментальных изменений. Этот термин в контексте данного описания также касается части клеток, которые являются живыми в определенное время, относительно общего количества клеток, живых и мертвых, которые находятся в культуре в это время. Специалистам в данной области станет понятно, что это изобретение охватывает один или несколько способов определения жизнеспособности клеток. Например, можно использовать краситель (например, трипановый синий), который не проходит сквозь мембрану живой клетки, но проходит сквозь поврежденную мембрану мертвой или умирающей клетки, с целью определения жизнеспособности клеток. Показатели жизнеспособности клеток в культурах, подвергнутых воздействию различных условий культивирования (например, концентрации железа или длительности культивирования) определяют и сравнивают для определения оптимальных условий роста для таких культур. Термин “титр” в контексте данного описания означает, например, общее количество рекомбинантно экспрессированного белка или антитела, вырабатываемого культурой клеток млекопитающего в данном количестве объема среды. Титр, как правило, выражают в миллиграммах белка, например, антитела, на миллилитр среды.

В некоторых вариантах осуществления периодические или подпитываемые реакции прекращают по достижении нужной плотности, жизнеспособности и/или титра клеток, которые определяются согласно требованиям специалиста-практика. В качестве неограничивающего примера культивирование может быть прекращено сразу после того, как клетки достигают 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 99 процентов максимальной плотности жизнеспособных клеток. В дополнительном или альтернативном варианте периодические или подпитываемые реакции могут быть прекращены перед избыточным накоплением конечных продуктов обмена веществ, таких, как лактат и аммоний. В некоторых вариантах осуществления периодические или реакции могут быть прекращены сразу после того, как содержание таких продуктов (например, лактата и/или аммония) достигает 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или больше г/л культуральной среды.

В некоторых случаях благоприятным может быть дополнение культуры клеток во время последующей продуктивной фазы питательными веществами или другими компонентами среды, которые были исчерпаны или метаболизированы клетками. В качестве неограничивающих примеров благоприятным может быть дополнение культуры клеток гормонами и/или другими факторы роста, неорганические ионы (такие, как, например, натрий, хлорид, кальций, магний и фосфат), буферы, витамины, нуклеозиды или нуклеотиды, микроэлементы, неорганические соединения на уровне, более высоком, чем следовая концентрация (например, железо), аминокислоты, липиды или глюкозу или другой источник энергии. Такие дополнительные компоненты могут добавляться к культуре клеток за один раз или могут обеспечиваться для культуры клеток путем серии добавлений.

Специалист в данной области сможет подобрать конкретные условия культивирования клеток с целью оптимизации определенных характеристик культуры клеток, включая, помимо прочего, скорость роста, жизнеспособность клеток, конечную плотность клеток в культуре, конечную концентрацию вредных побочных продуктов метаболизма, таких, как лактат и аммоний, конечный титр нужного продукта (например, рекомбинантного белка или антитела), или любую комбинацию этих или других условий, которые специалист-практик считает важными.

Экспрессия белков

Как было указано выше, во многих случаях клетки выбирают или подвергают инженерии таким образом, чтобы они обеспечивали высокий уровень выработки нужных продуктов (например, рекомбинантного белка или антитела). Часто клетки подвергают ручным манипуляциям для обеспечения высокого уровня рекомбинантного белка, например, путем введения гена, кодирующего нужный белок, и/или путем включения элементов генетического контроля, регулирующих экспрессию этого гена (эндогенного или включенного).

Некоторые белки могут иметь неблагоприятное воздействие на рост клеток, жизнеспособность клеток или некоторые другие характеристики клеток, что в конечном итоге определенным образом ограничивает выработку нужного белка. Даже среди популяции клеток одного определенного типа, подвергнутых инженерии для экспрессии конкретного белка, существует изменчивость в пределах популяции клеток, и, таким образом, некоторые отдельные клетки растут лучше, вырабатывают больше нужного белка или вырабатывают белок с более высоким уровнем активности (например, ферментной активности). В некоторых вариантах осуществления линия клеток опытным путем выбирается специалистом-практиком таким образом, чтобы обеспечивался устойчивый рост при конкретных условиях, выбранных для культивирования клеток. В некоторых вариантах осуществления отдельные клетки, подвергнутые инженерии для экспрессии конкретного белка, выбирают для крупномасштабной выработки на основе роста клеток, конечной плотности клеток, процента жизнеспособности клеток, титра экспрессированного белка или любой комбинации этих или любых других условий, которые специалист-практик может счесть важными.

Любой белок, экспрессируемый в клетке-хозяине, может вырабатываться в соответствии с представленным описанием. Термин “клетка-хозяин” в контексте данного описания означает клетку, которая подвергается манипуляции согласно настоящему изобретению для вырабатывания нужного белка, как описывается авторами. В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин является клеткой млекопитающего. Белок может быть экспрессирован из гена, который является эндогенным для клетки-хозяина, или из гетерологичного гена, введенного в клетку-хозяин. Белок может быть встречающимся в природе или, в альтернативном варианте, может иметь последовательность, подвергнутую генной инженерии или выбранную человеком вручную.

Белки, экспрессия которых требуется в соответствии с настоящим изобретением, часто выбирают на основе представляющей интерес или полезной биологической или химической активности. Например, настоящее изобретение может применяться для экспрессии любого фармацевтически или коммерчески релевантного фермента, рецептора, антитела, гормона, регулирующего фактора, антигена, связующего агента и т.п. В некоторых вариантах осуществления белок, экспрессируемый клетками в культуре, выбирают из антител или их фрагментов, нанотел, однодоменных антител, гликопротеинов, терапевтических белков, факторов роста, коагулирующих факторов, цитокинов, слитых белков, лекарственных веществ, вакцин, ферментов или Small Modular ImmunoPharmaceuticals™ (иммунофармацевтических средств на основе модульного белка малого размера - SMIP). Список белков, которые могут вырабатываться согласно настоящему изобретению, носит лишь иллюстративных характер и не является ограничивающим. Специалисту в данной области станет понятно, что может быть экспрессирован любой белок в соответствии с настоящим изобретением, и существует возможность выбора конкретного белка, вырабатываемого на основе конкретных потребностей.

Антитела

С учетом большого количества антител, которые в настоящее время применяются или исследуются в качестве фармацевтических средств или коммерческих продуктов, выработка антител представляет особый интерес в соответствии с настоящим изобретением. Антитела представляют собой белки, способные специфически связываться с конкретным антигеном. Любое антитело, которое может быть экспрессировано в клетке-хозяине, может вырабатываться в соответствии с настоящим изобретением. В некоторых вариантах осуществления экспрессируемое антитело является моноклональным антителом.

В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело является химерным антителом. Химерное антитело содержит аминокислотные фрагменты, взятые из более, чем одного организма. Молекулы химерного антитела могут включать, например, антиген-связывающий домен из антитела мыши, крысы или других видов с константными областями человека. Описывались различные подходы к созданию химерных антител. См., например, Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 6851 (1985); Takeda et al., Nature 314, 452 (1985), Cabilly et al., Патент США №4,816,567; Boss et al., Патент США №4,816,397; Tanaguchi et al., Публикацию европейского патента EP 171496; Публикацию европейского патента 0173494, Патент Великобритании GB 2177096 В.

В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело является человеческим антителом, полученным, например, путем применения библиотек рибосомных дисплеев или фаг-дисплейных библиотек (см., например, Winter et al., Патент США №6,291,159 и Kawasaki, Патент США №5,658,754) или применения ксенотрансплантатных видов, в которых гены природных антител инактивируются и функционально заменяются генами человеческого антитела, с сохранением неизменными других компонентов природной иммунной системы (см., например, Kucherlapati et al., Патент США №6,657,103).

В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело является гуманизированным антителом. Гуманизированное антитело является химерным антителом, в котором большинство аминокислотных остатков происходят от антител человека, что сводит к минимуму любую возможную иммунную реакцию при введении в организм человека. В гуманизированных антителах аминокислотные остатки в гипервариабельных участках заменяют, как минимум частично, остатками из отличных от человека видов, обеспечивающими нужную специфичность или аффинность к антигену. Такие измененные молекулы иммуноглобулина могут быть получены любым из нескольких известных специалистам способов (например, Teng et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80, 7308-7312 (1983); Kozbor et al., Immunology Today, 4, 7279 (1983); Olsson et al., Meth. Enzymol., 92, 3-16 (1982)), в оптимальном варианте - в соответствии с указаниями, содержащимися в Публикации РСТ WO 92/06193 или EP 0239400, которые включены в данное описание путем ссылки). Гуманизированные антитела могут производиться в промышленном масштабе, например, компанией Scotgen Limited, 2 Holly Road, Twickenham, Middlesex, Великобритания. Другие ссылки содержатся в публикациях Jones et al., Nature 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332: 323-329 (1988); и Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593-596 (1992), которые включены в данное описание путем ссылки.

В некоторых вариантах осуществления описанные выше моноклональные, химерные или гуманизированные антитела могут содержать аминокислотные остатки, которые в природе не встречаются ни в одном антителе ни одного вида. Эти инородные остатки могут применяться, например, для обеспечения новой или модифицированной специфичности, аффинности или эффекторной функции для моноклонального, химерного или гуманизированного антитела. В некоторых вариантах осуществления описанные выше антитела могут быть конъюгированы с медикаментами для системной фармакотерапии, такими, как токсины, низкомолекулярные цитотоксичные медикаменты, модификаторы биологической реакции и радионуклиды (см., например, Kunz et al., Calicheamicin derivative-carrier conjugates, документ US 20040082764 A1).

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение применяют для получения антитела, которое специфично связывается с Ар фрагментом амилоидного белка-прекурсора или с другими компонентами амилоидной бляшки и используется для борьбы с накоплением амилоидных бляшек в мозгу, которые характеризуют болезнь Альцгеймера (см., например, предварительную заявку США 60/636,684.) В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение применяют для выработки антитела, которое специфично связывается с рецептором HER2/neu. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение применяют для выработки антитела против CD20. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение применяют для выработки антител против TNFα, CD52, CD25, VEGF, EGFR, CD11a, CD33, CD3, IL-22, альфа-4 интегрина и/или IgE.

В другом варианте осуществления антитела согласно настоящему изобретению направлены против антигенов поверхности клеток, экспрессируемых на клетках- или тканях-мишенях и/или при пролиферативных заболеваниях, таких, как рак. В одном варианте осуществления антитело представляет собой антитело lgG1 против Lewis Y. Lewis Y является углеводным антигеном со структурой Fucą.1→2Galβ1→4[Fucą.1→3]GlcNacβ1→3R (Abe et al. (1983) J. Biol. Chem., 258 11793-11797). Антиген Lewis Y экспрессируется на поверхности от 60% до 90% эпителиальных опухолей человека (включая опухоли молочной железы, толстой кишки, легких и предстательной железы), как минимум 40% из которых сверхэкспрессируют этот антиген, и обладает ограниченной экспрессией в нормальных тканях.

Для воздействия на Ley и эффективного воздействия на опухоль в идеале требуется антитело с исключительной специфичностью к антигену. Таким образом, в предпочтительном варианте антитела против Lewis Y согласно настоящему изобретению не вступают в перекрестную реакцию со структурами 1-го типа (т.е., лакто-сериями групп крови (Lea и Leb)) и в предпочтительном варианте не связываются с другими эпитопами 2-го типа (т.е., нуклеолакто-структурами), такими, как структуры Lex и H 2-го типа. Пример предпочтительного антитела против Lewis Y называется hu3S193 (см. Патенты США №6,310,185; №6,518,415; №5,874,060, включенные в данное описание путем ссылки). Гуманизированное антитело hu3S193 (Attia, М.А., et al. 1787-1800) образовывали путем CDR-трансплантации из 3S193, которая является мышиным моноклональным антителом, выработанным против клеток аденокарциномы с исключительной специфичностью к Ley (Kitamura, К., 12957-12961). Hu3S193 не только сохраняет специфичность 3S193 к Ley, но также приобретает дополнительную способность к опосредованию комплементзависимой цитотоксичности (далее называемой CDC) и антителозависимой клеточноопосредованной цитотоксичностью (далее называемой ADCC) (Attia, М.А., et al. 1787-1800). Это антитело воздействует на Ley, экспрессирующий ксенотрансплантаты у мышей без вилочковой железы, о чем свидетельствуют исследования биораспределения с использованием hu3S193, меченного 1251, 111ln или 18F, а также другими метками, требующими хелатообразующего реагента, такого, как 111ln, 99mTc или 90Y (Clark, et al. 4804-4811).

В некоторых вариантах осуществления антитело является одним из человеческих антител против GDF-8 под названием Муо29, Муо28 и Муо22, а также производных от них антител и антигенсвязывающих фрагментов. Эти антитела способны связываться со зрелым GDF-8 с высокой аффинностью, ингибировать активность GDF-8 in vitro и in vivo, о чем свидетельствуют, например ингибирование связывания ActRIIB и анализы генов-репортеров, и могут ингибировать активность GDF-8, связанную с негативной регуляцией массы скелетных мышц и плотности костей. См., например, Veldman, et al, патентную заявку США №20040142382.

Рецепторы

Еще одним классом полипептидов, проявивших свою эффективность в качестве фармацевтических средств или коммерческих продуктов, являются рецепторы. Рецепторы обычно представляю собой трансмембранные гликопротеины, функционирующие путем распознавания внеклеточного сигнального лиганда. Рецепторы, как правило, имеют домен протеинкиназы, помимо лиганд-распознающего домена, который инициирует путь сигнала путем фосфорилирования внутриклеточных молекул-мишеней после связывания с лигандом, что приводит к изменениям в развитии и обмене веществ в пределах клетки. В одном варианте осуществления нужные рецепторы модифицируют таким образом, чтобы удалить трансмембранный(е) и/или внутриклеточный(е) домен(ы), на месте которого необязательно может быть присоединен lg-домен. В предпочтительном варианте осуществления рецепторы, вырабатываемые в соответствии с настоящим изобретением, являются рецепторными тирозинкиназами (RTK). Семейство RTK включает рецепторы, которые являются ключевыми для разных функций многих типов клеток (см., например, публикации Yarden and Ullrich, Ann. Rev. Biochem. 57: 433-478, 1988; Ullrich and Schlessinger, Cell 61: 243-254, 1990, включенные в данное описание путем ссылки). Неограничивающими примерами RTK являются представители семейства рецепторов факторов роста фибробластов (FGF), представители семейства рецепторов эпидермального фактора роста (EGF), рецептор тромбоцитарного фактора роста (PDGF), рецепторы тирозинкиназы с иммуноглобулин- и EGF-гомологичными доменами-1 (TIE-1) и TIE-2 (см. публикацию Sato et al., Nature 376(6535): 70-74 (1995), включенную в это описание путем ссылки) и рецептор c-Met, некоторые из которых указывались как способствующие ангиогенезу, прямо либо косвенно (Mustonen and Alitalo, J. Cell Biol. 129: 895-898, 1995). Другими неограничивающими примерами RTK являются фетальная печеночная киназа 1 (FLK-1) (иногда называемая рецептором, имеющим в составе домен, содержащий киназу (KDR) (Terman et al., Oncogene 6: 1677-83, 1991) или рецептор 2 сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGFR-2)), fms-подобная тирозинкиназа-1 (Flt-1) (DeVries et al. Science 255; 989-991, 1992; Shibuya et al., Oncogene 5: 519-524, 1990), иногда называемая рецептором 1 сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGFR-1), нейропилин-1, эндоглин, эндосиалин и Axl. Специалистам в данной области известны другие рецепторы которые в предпочтительном варианте могут экспрессироваться в соответствии с настоящим изобретением.

В некоторых вариантах осуществления ингибиторы фактора некроза клеток, в форме альфа- и бета-рецепторов фактора некроза клеток (TNFR-1; документ EP 417,563, публикация от 20 марта 1991 г.; и TNFR-2, документ EP 417,014, публикация от 20 марта 1991 г.), экспрессируются в соответствии с настоящим изобретением (обзор см. в публикации Naismith and Sprang, J Inflamm. 47(1-2): 1-7 (1995-96), включенной в данное описание путем ссылки). В соответствии с одним вариантом осуществления, ингибитор фактора некроза клеток включает растворимый рецептор TNF, в предпочтительном варианте TNFR-lg. В некоторых вариантах осуществления предпочтительными ингибиторами TNF согласно настоящему изобретению являются растворимые формы TNFRI и TNFRII, а также растворимые TNF-связывающие белки, в другом варианте осуществления слияние TNFR-lg представляет собой TNFR:Fc - термин, который в контексте данного описания относящийся к “этанерцепту,” который является димером двух молекул внеклеточной части рецептора р75 TNF-α, причем каждая молекула состоит из 235-аминокислотной Fc-части человеческого lgG1.

Факторы роста и другие сигнальные молекулы

Другой класс полипептидов, которые продемонстрировали свою эффективность в качестве фармацевтических средств или коммерческих продуктов, включает факторы роста и другие сигнальные молекулы. К факторам роста относятся гликопротеины, секретируемые клетками и связывающиеся с рецепторами, активируя их на других клетках и запуская изменения в обмене веществ или развитии в рецепторной клетке. В одном варианте осуществления нужный белок представляет собой слитый полипептид ActRIIB, включающий внеклеточный домен рецептора ActRIIB и Fc-часть антитела (см., например, публикацию Wolfman, et al., ActRIIB fusion polypeptides and uses therefor, документ US2004/0223966 A1). В другом варианте осуществления фактор роста может быть модифицированным пропептидом GDF-8 (см., например, Wolfman, et al., Modified and stabilized GDF propeptides and uses thereof, документ US 2003/0104406 A1). В альтернативном варианте нужный белок может быть содержащим домен фоллистатина белком (см., например, Hill, et al., GASP1: a follistatin domain containing protein, документ US 2003/0162714 A1, Hill, et al., GASP1: a follistatin domain containing protein, документ US 2005/0106154 A1, Hill, et al., Follistatin domain containing proteins, документ US 2003/0180306 A1).

Неограничивающими примерами факторов роста млекопитающих и других сигнальных молекул являются цитокины; эпидермальный фактор роста (EGF); фактор роста тромбоцитов (PDGF); факторы роста фибробластов (FGF), такие, как aFGF и bFGF; трансформирующие факторы роста (TGF), такие, как TGF-альфа и TGF-бета, включая TGF-бета 1, TGF-бета 2, TGF-бета 3, TGF-бета 4 или TGF-бета 5; инсулиноподобный фактор роста-I и -II (IGF-I и IGF-II); дез(1-3) -IGF-I (IGF-I головного мозга), белки, связывающие инсулиноподобный фактор роста; CD-белки, такие, как CD-3, CD-4, CD-8 и CD-19; эритропоэтин; остеоиндуктивные факторы; иммунотоксины; костный морфогенетический белок (BMP); интерферон, такой, как интерферон-альфа, -бета и -гамма; колониестимулирующие факторы (CSF), например, M-CSF, GM-CSF и G-CSF; интерлейкины (TL), например, с IL-1 по IL-10; цитокины надсемейства IL-10 (например, IL-19, IL-20, IL-22, IL-24, IL-26); фактор некроза клеток (TNF) альфа и бета; A-цепь инсулина; B-цепь инсулина; проинсулин; фолликулостимулирующий гормон; кальцитонин; лютеинизирующий гормон; глюкагон; коагулирующие факторы, такие, как фактор VIIIС, фактор IX, тканевый фактор и фактор фон Виллебранда; антикоагулирующие факторы, такие, как Протеин C; предсердный натрийуретический фактор; легочный сурфактант; активатор плазминогена, такой, как урокиназа или моча человека или тканевый активатор плазминогена (t-PA); бомбезин; тромбин, гемопоэтический фактор роста; энкефалиназа; RANTES (хемокин, экспрессируемый и секретируемый Т-клетками при активации); человеческий воспалительный белок макрофагов (MIP-1-альфа); мюллерова ингибирующая субстанция; A-цепь релаксина; B-цепь релаксина; прорелаксин; мышиный гонадотропин-ассоциированный пептид; нейротрофические факторы, такие, как костный нейротрофический фактор (BDNF), нейротрофин-3, -4, -5 или -6 (NT-3, NT-4, NT-5, или NT-6) или фактор роста нервной ткани, такой, как NGF-бета. Специалистам в данной области известны другие факторы роста или сигнальные молекулы, которые могут экспрессироваться в соответствии с настоящим изобретением. Рецепторы, сопряженные с G-белком

Еще один класс полипептидов, которые продемонстрировали свою эффективность в качестве фармацевтических средств или коммерческих продуктов, включает факторы роста и другие сигнальные молекулы. Рецепторы, сопряженные с G-белком (GPCR) являются рецепторами, имеющими семь трансмембранных доменов. После связывания лиганда с GPCR сигнал преобразуется в пределах клетки, в результате чего возникают изменения в биологических или физиологических свойствах клетки.

GPCR, наряду с G-белками и эффекторами (внутриклеточными ферментами и каналами, которые модулируются G-белками), являются компонентами модульной сигнальной системы, которая соединяет состояние внутриклеточных вторичных мессенджеров с внеклеточными входами. Эти гены и генные продукты являются потенциальными причинными факторами болезни.

Было продемонстрировано, что конкретные дефекты в гене родопсина и ген V2-рецептора вазопрессина вызывают различные формы аутосомно-доминантного и аутосомно-рецессивного пигментного ретинита, несахарного почечного диабета. Эти рецепторы являются имеют ключевое значение как для центральной нервной системы, так и для периферических физиологических процессов. Надсемейство белков GPCR ныне содержит более 250 типов паралогов, рецепторов, представляющих варианты, образованные при помощи дупликации генов (или других процессов), в отличие от ортологов, одинаковых рецепторов различных видов. Это надсемейство может подразделяться на пять семейств: Семейство I, которому относятся рецепторы, типичными представителями которого являются родопсин и бета2-адренергический рецептор, и которое ныне насчитывает более 200 уникальных представителей; Семейство II, представляющее недавно охарактеризованное семейство рецепторов паратироидный гормон/кальцитонин/секретин; Семейство III, представляющее семейство метаботропных рецепторов глутамата у млекопитающих; Семейство IV, представляющее семейство сАМР рецепторов, имеющих важное значение для хемотаксиса и развития D. discoideum; и Семейство V, рецепторы феромонов спаривания грибов, такие, как STE2.

GPCR включают рецепторы для биогенных аминов, для липидных медиаторов воспаления, пептидные гормоны и медиаторы сенсорных сигналов. GPCR активируется, когда рецептор связывается с внеклеточным лигандом. Конформационные изменения в GPCR, которые являются результатом взаимодействия лиганд-рецептор, воздействуют на аффинность связывания G-белка с внутриклеточными доменами GPCR. Это обеспечивает возможность связывания GTP с повышенной аффинностью с G-белком.

Активация G-белка при помощи GTP ведет к взаимодействию а субъединицы G-белка с аденилатциклазой или другими генераторами молекулы вторичного мессенджера. Это взаимодействие регулирует активность аденилатциклазы, а значит, и образование молекулы вторичного мессенджера, сАМР. сАМР регулирует фосфорилирование и активацию других внутриклеточных белков. В альтернативном варианте клеточный уровень других молекул вторичного мессенджера, таких, как cGMP или эйкозиноиды, может регулироваться в сторону повышения или понижения в зависимости от активности GPCR. α субъединица G-белка дезактивируется путем гидролиза GTP под действием ГТФазы, и субъединицы α, β и γ повторно ассоциируют. Гетеродимерный G-белок n затем диссоциирует из аденилатциклазы или другого генератора молекулы вторичного мессенджера. Активность GPCR также может регулироваться путем фосфорилирования внутри- и внеклеточных доменов или петель.

Рецепторы глутамата образуют группу GPCR, которая имеет важное значение для нейропередачи. Глутамат является главным нейротрансмиттером в ЦНС, и считается, что он играет важную роль в нейронной пластичности, познавательной способности, памяти, обучаемости и некоторых неврологических нарушениях, таких, как эпилепсия, инсульт и нейродегенерация (Watson, S. and S. Arkinstall (1994) The G- Protein Linked Receptor Facts Book, Academic Press, San Diego, CA, pp. 130-132). Эти эффекты глутамата опосредованы двумя отдельными классами рецепторов, называемых ионотропными и метаботропными. Ионотропные рецепторы содержат природный катионный канал и опосредует быстрое возбуждающее действие глутамата. Метаботропные рецепторы являются модулирующими, повышающими мембранную возбудимость нейронов путем ингибирования кальций-зависимой калиевой проводимости и ингибирования и стимулирования возбуждающей передачи ионотропных рецепторов. Метаботропные рецепторы подразделяются на пять подтипов на основе фармакологии агонистов и путей трансдукции сигнала и широко распространены в тканях головного мозга.

Семейство вазоактивных полипептидов кишечника (VIP) представляет группу родственных полипептидов, действие которых также опосредовано GPCR. Ключевыми представителями этого семейства является сам VIP, секретин и фактор, высвобождающий гормон роста (GRF). VIP обладает широким профилем физиологического действия, включая расслабление гладких мышц, стимулирование или ингибирование секреции в разных тканях, модуляцию различных видов активности иммунных клеток и различных видов возбуждающей или ингибирующей активности в ЦНС. Секретин стимулирует секрецию ферментов и ионов в поджелудочной железе и кишечнике и также присутствует в малых количествах в головном мозге. GRF является важным нейроэндокринным агентом, регулирующим синтез и высвобождение гормона роста из передней доли гипофиза (Watson, S. and S. Arkinstall, см. выше, стр. 278-283).

После связывания лигандов с GPCR конформационное изменение передается на G-белок, что вызывает в α-субъединице замену связанной молекулы GDP на молекулу GTP и диссоциацию βγ-субъединиц. GTP-связанная форма α-субъединицы обычно функционирует как модулирующий эффектор компонент, что приводит к образованию вторичных мессенджеров, таких, как цикличный АМР (например, путем активации аденилатциклазы), диацилглицерин или инозитофосфаты. В организме человека известно более 20 разных типов α-субъединиц, ассоциирующихся с меньшим набором β- и γ-субъединиц. Примерами G-белков млекопитающих являются Gi, Go, Gq, Gs и Gt. G-белки широко описываются в публикации Lodish Н. et al. Molecular Cell Biology, (Scientific American Books Inc., New York, N.Y., 1995), содержание которой включено в данное описание путем ссылки.

GPCR являются главной целью действия и разработки медикаментов. Фактически на основе рецепторов было создано более половины ныне известных медикаментов (Drews, Nature Biotechnology, 1996, 14: 1516), и GPCR представляют наиболее важную цель для терапевтического вмешательства, причем 30% клинически назначаемых медикаментов выступают либо антагонистами, либо агонистами GPCR (Milligan, G. and Rees, S., (1999) TIPS, 20: 118-124). Таким образом, демонстрируется, что эти рецепторы имеют устоявшуюся, доказанную историю в качестве терапевтических мишеней.

В целом исполнители настоящего изобретения смогут выбрать нужный полипептид и определить точную аминокислотную последовательность. Любой белок, который подлежит экспрессии в соответствии с настоящим изобретением, обладает собственными отличительными характеристиками и может влиять на плотность или жизнеспособность культивируемых клеток, и может быть экспрессирован на более низком уровне, чем другой полипептид или белок, выращиваемый в идентичных условиях культивирования. Специалист в данной области сможет надлежащим образом модифицировать этапы и композиции согласно настоящему изобретению с целью оптимизации роста клеток и/или выработки любого экспрессированного полипептида или белка.

Ферменты

Еще один класс белков, которые продемонстрировали свою эффективность в качестве фармацевтических средств или коммерческих продуктов, включает ферменты. Ферменты могут быть белками, на ферментную активность которых может влиять условия культивирования клеток, при которых они вырабатываются. Таким образом, выработка ферментов с необходимой ферментной активностью в соответствии с настоящим изобретением также представляет особый интерес. Специалистам в данной области известно много ферментов, которые могут быть экспрессированы клетками в культуре.

Неограничивающими примерами ферментов являются карбогидраза, такая, как амилаза, целлюлаза, декстраназа, глюкозидаза, галактозидаза, глюкоамилаза, гемицеллюлаза, пентозаназа, ксиланаза, инвертаза, лактаза, наринганаза, пектиназа и пуллуланаза; протеаза, такая, как кислая протеаза, щелочная протеаза, бромелаин, фицин, нейтральная протеаза, папаин, пепсин, пептидаза (например, аминопептидаза и карбоксипептидаза), химозин, реннин, субтилизин, термолизин, аспарагиновая протеиназа и трипсин; липаза или эстераза, такая, как триглицеридаза, фосфолипаза, преджелудочная эстераза, фосфатаза, фитаза, амидаза, иминоацилаза, глутаминаза, лизоцим и пенициллинацилаза; изомераза, такая, как глюкоизомераза; оксидоредуктазы, такие, как оксидаза аминокислоты, каталаза, хлоропероксидаза, глюкооксидаза, гидроксистероид-дегидрогеназа или пероксидаза; лиаза, такая, как ацетолактатдекарбоксилаза, аспарагиновая декарбоксилаза, фумараза или гистадаза; трансфераза, такая, как циклодекстрингликозилтрансфераза; лигаза; хитиназа, кутиназа, дезоксирибонуклеаза, лакказа, маннозидаза, мутаназа, пектинолитический фермент, полифенолоксидаза, рибонуклеаза и трансглутаминаза.

В целом исполнители настоящего изобретения смогут выбрать нужный белок и определить его точную аминокислотную последовательность. Любой белок, экспрессируемый в соответствии с настоящим изобретением, может иметь собственные конкретные характеристики и может влиять на плотность клеток или жизнеспособность культивируемых клеток, может быть экспрессирован на более низком уровне, чем другой белок, выращиваемый в идентичных условиях культивирования, и может обладать разной биологической активностью, в зависимости от конкретных условий культивирования и выполняемых этапов. Специалист в данной области сможет надлежащим образом модифицировать этапы и композиции, применяемые для образования конкретного белка в соответствии с идеей настоящего изобретения с целью оптимизации роста клеток и уровня продуктивности и/или активности любого экспрессируемого белка.

Введение генов для экспрессии белков в клетки-хозяева

Как правило, молекула нуклеиновой кислоты, введенная в клетку, кодирует белок, подлежащий экспрессии согласно настоящему изобретению. В альтернативном варианте молекула нуклеиновой кислоты может кодировать генный продукт, вызывающий экспрессию клеткой нужного белка. Например, введенный генетический материал может кодировать фактор транскрипции, который активирует транскрипцию эндогенного или гетерологичного белка. В альтернативном или дополнительном варианте введенная молекула нуклеиновой кислоты может повысить трансляцию или устойчивость белка, экспрессируемсто клеткой.

Способы, подходящие для введения нуклеиновых кислот, достаточных для достижения экспрессии нужного белка, в клетки-хозяева млекопитающих известны специалистам в данной области. См., например, публикации Gething et al., Nature, 293: 620-625, 1981; Mantei et al., Nature, 281: 40-46, 1979; Levinson et al. документы EP 117,060 и EP 117,058, каждая из которых включена в данное описание путем ссылки. Для клеток млекопитающих распространенные способы введения генетического материала в клетки млекопитающих включают способ осаждения фосфата кальция согласно Graham and van der Erb (Virology, 52: 456-457, 1978) или способ с применением липофектамина™ (Gibco BRL) по Hawley-Nelson (Focus 15: 73, 1993). Общие аспекты системных преобразований клеток-хозяев млекопитающих описываются автором Axel в Патенте США №4,399,216, выданном 16 августа 1983 г. Различные технологии введения генетического материала в клетки млекопитающих представлены в публикации Keown et al., Methods in Enzymology, 1989, Keown et al., Methods in Enzymology, 185: 527-537, 1990, и Mansour et al., Nature, 336: 348-352, 1988.

В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота, подлежащая введению, пребывает в форме молекулы оголенной нуклеиновой кислоты. Например, молекула нуклеиновой кислоты, вводимая в клетку, может состоять только из нуклеиновой кислоты, кодирующей белок и необходимых элементов генетического контроля. В альтернативном варианте нуклеиновая кислота, кодирующая белок (включая необходимые регулирующие элементы), может содержаться в пределах плазмидного вектора. Неограничивающими типичными примерами подходящих векторов для экспрессии белков в клетках млекопитающих являются рКДНК1; pCD; см. Okayama, et al. Mol. Cell Biol. 5: 1136-1142, 1985; pMCIneo Poly-A; см. Thomas, era/. Cell 51: 503-512, 1987; бакуловирусный вектор, такой, как рАС 373 или рАС 610; CDM8; см. Seed, В. Nature 329: 840, 1987; и рМТ2РС; см. Kaufman, et al. EMBO J. 6: 187-195, 1987; каждая из публикаций включена в данное описание путем ссылки в полном объеме. В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты, подлежащая введению в клетку, содержится в пределах вирусного вектора. Например, нуклеиновая кислота, кодирующая белок, может быть вставлена в вирусный геном (или частичный вирусный геном). Регулирующие элементы, направляющие экспрессию белка, могут включаться в нуклеиновую кислоту, вставленную в вирусный геном (т.е., связываться с геном, вставленным в вирусный геном), или могут обеспечиваться самим вирусным геномом.

Оголенная ДНК может быть вставлена в клетки путем образования осадка, содержащего ДНК и фосфат кальция. В альтернативном варианте оголенная ДНК также может быть вставлена в клетки путем образования смеси ДНК и DEAE-декстрана и инкубации смеси с клетками или путем инкубации клеток и ДНК вместе с соответствующим буфером и подвергания клеток высоковольтному электрическому импульсу (например, путем электропорации). Другой способ включения в клетки оголенной ДНК состоит в смешивании ДНК с суспензией липосом, содержащей катионные липиды. Комплекс ДНК/липосома затем инкубируют с клетками. Оголенная ДНК также может быть прямо введена в клетки, например, путем микроинъекции.

В альтернативном варианте оголенная ДНК также может быть включена в клетки путем образования комплекса ДНК с катионом, таким, как полилизин, который соединяется с лигандом для рецептора клеточной поверхности (см., например Wu, G. and Wu, С.Н. J. Biol. Chem. 263: 14621, 1988; Wilson et al. J. Biol. Chem. 267: 963-967, 1992; и Патент США №5,166,320, которые включены в это описание путем ссылки в полном объеме). Связывание комплекса ДНК-лиганда с рецептором способствует поглощению ДНК путем опосредованного рецепторами эндоцитоза.

Применение вирусных векторов, содержащих конкретные нуклеиновокислотные последовательности, например, кДНК, кодирующей белок, является распространенным подходом к включению в клетку нуклеиновокислотных последовательностей. Преимущество инфицирования клеток вирусным вектором состоит в том, что большая часть клеток получает нуклеиновую кислоту, что позволяет избавиться от необходимости в выборе клеток, которые получили нуклеиновую кислоту. Кроме того, молекулы, кодируемые в пределах вирусного вектора, например, кодируются кДНК, содержащейся в вирусном векторе, обычно эффективно экспрессируются в клетках, поглотивших нуклеиновую кислоту вирусного вектора.

Дефективные ретровирусы хорошо изучены для применения при передаче генов с целью генной терапии (обзор см. в публикации Miller, A.D. Blood 76: 271, 1990). Может быть построен рекомбинантный ретровирус, имеющий нуклеиновую кислоту, кодирующую нужный белок, вставленный в ретровирусный геном. Кроме того, части ретровирусного генома могут быть удалены, в результате чего репликация ретровируса становится дефектной. Такой ретровирус с дефектной репликацией затем упаковывают в вирионы, которые могут использоваться для инфицирования клетки-мишени путем применения хелперного вируса стандартными способами.

Геном аденовируса может быть подвергнут манипуляции, в результате которой он может кодировать и экспрессировать нужный белок, но является инактивированным в плане способности к репликации в нормальном жизненном цикле литического вируса. См., например, Berkner et al. BioTechniques 6: 616, 1988; Rosenfeld et al. Science 252: 431-434, 1991; и Rosenfeld et al. Cell 68: 143-155, 1992. Подходящие аденовирусные векторы, происходящие от аденовируса штамма Ad типа 5 dl324 или других штаммов аденовируса (например, Ad2, Ad3, Ad7 и т.д.) известны специалистам в данной области. Преимущество рекомбинантных аденовирусов состоит в том, что они не требуют деления клеток для того, чтобы быть эффективными носителями для доставки генов и могут использоваться для инфицирования различных типов клеток, включая эпителий дыхательных путей (Rosenfeld et al., 1992, указанный выше), эндотелиальные клетки (Lemarchand et al., Ргос. Natl. Acad. Sci. USA 89: 6482-6486, 1992), гепатоциты (Herz and Gerard, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2812-2816, 1993) и клетки мышц (Quantin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 2581-2584, 1992). Кроме того, введенная аденовирусная ДНК (и инородная ДНК, которая в ней содержится) не включается в геном клетки-хозяина, а остается эписомной, что позволяет избегать потенциальных проблем, которые могут возникать в результате инсерционного мутагенеза в ситуациях, в которых введенная ДНК объединяется с геномом-хозяином (например, ретровирусной ДНК). Кроме того, способность аденовирусного генома к переносу инородной ДНК является высокой (до 8 тысяч пар нуклеотидов) относительно других векторов доставки генов (Berkner et al., см. выше; Haj-Ahmand and Graham, J. Virol. 57: 267, 1986). Большинство ныне используемых аденовирусных векторов с дефектной репликацией удаляются из всех или части вирусных генов E1 и E3, но сохраняют 80% аденовирусного генетического материала.

Аденоассоциированный вирус (AAV) представляет собой природный дефектный вирус, требующий другого вируса, такого, как аденовирус или вирус герпеса, в качестве хелперного вируса для эффективной репликации и продуктивного жизненного цикла. (Обзор см. в публикации Muzyczka et al. Curr. Topics in Micro, and Immunol., 158: 97-129, 1992). Он также является одним из нескольких вирусов, которые могут интегрировать свою ДНК в неделимые клетки и демонстрирует высокую частоту устойчивой интеграции (см., например Flotte etai, Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 7: 349-356, 1992; Samulski et al., J. Virol. 63: 3822-3828, 1989; и McLaughlin et al., J. Virol. 62: 1963-1973, 1989). Векторы, содержащие всего 300 пар нуклеотидов AAV, могут быть упакованы и способны интегрироваться. Пространство для экзогенной ДНК ограничено приблизительно 4,5 т.н. Вектор AAV, такой, как описывается в публикации Tratschin et al. (Mol. Cell. Biol. 5: 3251-3260, 1985), может использоваться для введения ДНК в клетки. Различные нуклеиновые кислоты вводили в разные типы клеток с использованием векторов AAV (см., например, Hermonat et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6466-6470, 1984; Tratschin et al., Mol. Cell. Biol. 4: 2072-2081, 1985; Wondisford et al., Mol. Endocrinol. 2: 32-39, 1988; Tratschin et al., J. Virol. 51: 611-619, 1984; и Flotte era/., J. Biol. Chem. 268: 3781-3790, 1993).

Если способ применяется для введения молекул нуклеиновых кислот в популяцию клеток в результате приводит к модификации большой части клеток и эффективной экспрессии белка клетками, модифицированная популяция клеток может использоваться без дальнейшей изоляции или субклонирования отдельных клеток в пределах популяции. То есть, может обеспечиваться достаточная выработка белка популяцией клеток, таким образом, чтобы не требовалась дальнейшая изоляция клеток, и популяция могла сразу же использоваться для высевания культуры клеток для выработки белка. В альтернативном варианте желательной может быть изоляция и расширение гомогенной популяции клеток из нескольких клеток или одной клетки, которая(ые) эффективно вырабатывает(ют) белок.

В качестве альтернативы введению молекулы нуклеиновой кислоты в клетку, кодирующую нужный белок, введенная нуклеиновая кислота может кодировать другой полипептид или белок, который вызывает экспрессию или повышает уровень экспрессии белка, эндогенно вырабатываемого клеткой. Например, клетка может быть способна экспрессировать конкретный белок, но может быть и не способной к такой экспрессии без дополнительной обработки клетки. Подобным образом клетка может экспрессировать недостаточное количество белка для предусмотренной цели. Таким образом, может применяться агент, стимулирующий экспрессию нужного белка, для вызывания или повышения экспрессии этого белка клеткой. Например, введенная молекула нуклеиновой кислоты может кодировать фактор транскрипции, который активирует или повышает транскрипцию нужного белка. Экспрессия такого фактора транскрипции, в свою очередь, ведет к экспрессии или более устойчивой экспрессии нужного белка.

В некоторых вариантах осуществления нуклеиновую кислоту, направляющую экспрессию белка, устойчиво вводят в клетку-хозяин. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновую кислоту, направляющую экспрессию белка, временно вводят в клетку-хозяин. Специалист в данной области сможет выбрать, устойчивое или временное введение нуклеиновой кислоты в клетку на основе своих экспериментальных потребностей.

Ген, кодирующий нужный белок, необязательно может быть связан с одним или несколькими регулирующими элементами генетического контроля. В некоторых вариантах осуществления элемент генетического контроля направляет конститутивную экспрессию белка. В некоторых вариантах осуществления может применяться элемент генетического контроля, обеспечивающий индуцируемую экспрессию гена, кодирующего нужный белок. Применение индуцируемого элемента генетического контроля (например, индуцируемого промотора) позволяет модулировать выработку белка в клетке. Неограничивающими примерами потенциально полезных индуцируемых элементов генетического контроля для применения в эукариотных клетках могут быть гормонально-регулируемые элементы (например, см. Mader, S. and White, J.H., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5603-5607, 1993), регулируемые синтетическим лигандом элементы (см., например, Spencer, D.M. et al., Science 262: 1019-1024, 1993) и регулируемые ионизирующим излучением элементы (например, см. Manome, Y. et al., Biochemistry 32: 10607-10613, 1993; Datta, R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10149-10153, 1992). В соответствии с изобретением, могут применяться дополнительные клеточно-специфические или другие регулирующие системы, известные специалистам.

Специалист в данной области сможет выбрать и, необязательно, соответствующим образом модифицировать способ введения генов, которые вызывают экспрессию клетками нужного белка в соответствии с идеей настоящего изобретения.

Выделение экспрессированного белка

В целом, как правило, желательным является выделение и/или очищение белков, экспрессированных согласно настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления экспрессированный белок секретируется в среду и, таким образом, клетки и другие твердые вещества могут быть удалены, например, путем центрифугирования или фильтрования в качестве первого этапа процесса очистки.

В альтернативном варианте экспрессированный белок может быть связан с поверхностью клетки-хозяина. Например, среды могут удаляться и клетки-хозяева, экспрессирующие белок, подвергают лизису в качестве первого этапа процесса очистки. Лизис клеток-хозяев млекопитающих может достигаться любым из многих способов, хорошо известных специалистам в данной области, включая физическую дезинтеграцию стеклянными шариками и подвергание воздействию условий высокого уровня pH.

Экспрессированный белок может быть выделен и очищен стандартными способами, включая, помимо прочих, хроматографию (например, ионообменную, аффинную, эксклюзионную и гидроксиапатитную хроматографию), гель-фильтрацию, центрифугирование или дифференциальную растворимость, осаждение этанолом, и/или любыми другими доступными способами очистки белков (см., например, публикации Scopes, Protein Purification Principles and Practice 2nd Edition, Springer-Verlag, New York, 1987; Higgins, S.J. and Hames, B.D. (eds.), Protein Expression: A Practical Approach, Oxford Univ Press, 1999; и Deutscher, M.P., Simon, M.I., Abelson, J.N. (eds.), Guide to Protein Purification: Methods in Enzymology (Methods in Enzymology Series, Vol. 182), Academic Press, 1997, каждая из которых включена в данное описание путем ссылки). В частности, для иммуноаффинной хроматографии белок может быть выделен путем его связывания с колонкой для аффинной хроматографии, включающей антитела, выработанные против этого белка и прикрепленные к неподвижной подкладке. В альтернативном варианте аффинные метки, такие, как последовательность вируса гриппа, полигистидин или глутатион-S-трансфераза, могут прикрепляться к белку стандартными рекомбинантными способами для обеспечения простого способа очистки путем пропускания по соответствующей колонке для аффинной хроматографии. Ингибиторы протеазы, такие, как фенилметилсульфонилфторид (PMSF), лейпептин, пепстатин или апротинин могут добавляться на любом или на всех этапах с целью уменьшения или исключения распада белка в процессе очистки. Ингибиторам протеазы отдается особое предпочтение в случаях, когда клетки должны подвергаться лизису, с целью выделения и очистки экспрессированного белка.

Специалисту в данной области станет понятно, что конкретный способ очистки может меняться в зависимости от характера очищаемого белка, характера клеток, из которых экспрессируется белок, и/или состава среды, в которой выращивались клетки.

Фармацевтические композиции

В некоторых предпочтительных вариантах осуществления изобретения образовавшиеся полипептиды или белки имеют фармакологическую активность и могут применяться для приготовления фармацевтических средств. Описанные выше композиции согласно изобретению могут вводиться субъекту или сначала могут быть рецептированы для доставки любым доступным путем, включая, помимо прочих парентеральный (например, внутривенный), внутрикожный, подкожный, пероральный, назальный, бронхиальный, глазной, чрескожный (местный), трансмукозальный, ректальный и вагинальный пути. Фармацевтические композиции согласно изобретению, как правило, включают очищенный полипептид или белок, экспрессируемый из лини клеток млекопитающего, средство доставки (т.е., катионный полимер, пептидный молекулярный транспортер, поверхностно-активное вещество и т.п., как описывается выше) в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем. В контексте данного описания формулировка “фармацевтически приемлемый носитель” включает растворители, диспергаторы, покрытия, антибактериальные и противогрибковые средства, изотонические и замедляющие абсорбцию средства и т.п., совместимые с фармацевтическим введением. В композиции также могут включаться дополнительные активные соединения.

Фармацевтическую композицию рецептируют таким образом, чтобы она была совместимой с предусмотренным путем введения. Растворы или суспензии, применяемые для парентерального, внутрикожного или подкожного применения, могут включать следующие компоненты: стерильный разбавитель, такой, как вода для инъекций, солевой раствор, жирные масла, полиэтиленгликоли, глицерин, полипропиленгликоль или другие синтетические растворители; антибактериальные агенты, такие, как бензиловый спирт или метилпарабены; антиоксиданты, такие, как аскорбиновая кислота или бисульфит натрия; хелатообразующие реагенты, такие, как этилендиаминтетрауксусная кислота; буферы, такие, как ацетаты, цитраты или фосфаты, и агенты для регулирования тоничности, такие, как хлорид натрия или декстроза. Уровень pH регулируют кислотами или основаниями, такими как хлористоводородная кислота или гидроксид натрия. Композиция для парентерального введения может быть помещена в ампулы, одноразовые шприцы или многодозовые флаконы из стекла или пластика.

Фармацевтические композиции, подходящие для инъекций, как правило, включают стерильные водные растворы (в случае водорастворимости) или дисперсии и стерильные порошки для экстемпорального приготовления стерильных растворов или дисперсий для инъекций. Для внутривенного введения подходящими носителями могут быть физиологический раствор, бактериостатическая вода, Cremophor EL™ (BASF, Parsippany, NJ) или фосфатно-буферный раствор (PBS). Во всех случаях композиция должна быть стерильной и должна быть достаточно жидкой для возможности легкого введения через шприц. Предпочтительные фармацевтические композиции являются устойчивыми в условиях производства и хранения и должны быть защищены от загрязняющего воздействия микроорганизмов, таких, как бактерии и грибки. Как правило, соответствующим носителем может быть растворитель или дисперсионная среда, содержащая, например, воду, этанол, полиол (например, глицерин, полипропиленгликоль и жидкий полиэтиленгликоль и т.п.) и их подходящие смеси. Надлежащая текучесть может поддерживаться, например, путем применения покрытия, такого, как лецитин, путем поддержания необходимого размера частиц в случае дисперсии и путем применения поверхностно-активных веществ. Предотвращение воздействия микроорганизмов может достигаться благодаря различным антибактериальным и противогрибковым средствам, например, парабенам, хлоробутанолу, фенолу, аскорбиновой кислоте, тимеросалу и т.п. Во многих случаях предпочтение отдается включению в композицию изотонических агентов, например, Сахаров, многоатомных спиртов, таких, как маннит, сорбит, или хлорида натрия. Продленная абсорбция композиций для инъекций может быть вызвана включением в композицию агента, задерживающего абсорбцию, например, моностеарата алюминия и желатина.

Стерильные растворы для инъекций приготавливают путем включения очищенного полипептида или белка в нужном количестве в соответствующем растворителе с одним или с комбинацией вышеперечисленных ингредиентов, согласно требованиям, с последующей стерилизацией путем фильтрования. Как правило, дисперсии приготавливают путем включения очищенного полипептида или белка, экспрессированного из линии клеток млекопитающего, в стерильный носитель, содержащий основную дисперсионную среду и другие необходимые ингредиенты из числа вышеперечисленных. В случае стерильных порошков для приготовления стерильных растворов для инъекций предпочтительными способами приготовления являются вакуумная сушка и лиофилизация, которая обеспечивает порошок активного ингредиента и любого дополнительного необходимого ингредиента из его предварительно стерильно отфильтрованного раствора.

Композиции для перорального введения обычно включают инертный разбавитель или пищевой носитель. С целью перорального терапевтического введения очищенный полипептид или белок может быть соединяться с формообразующими и применяться в форме таблеток, пастилок или капсул, например, желатиновых капсул. Композиции для перорального введения также могут быть приготовлены с применением жидкого носителя, используемого в качестве ополаскивателя для полости рта. В состав композиции могут включаться фармацевтически совместимые связующие агенты и/или вспомогательные материалы. Таблетки, пилюли, капсулы, пастилки и т.п. могут содержать любой из нижеуказанных ингредиентов или соединений подобного характера: связующее вещество, такое, как микрокристаллическая целлюлоза, трагакантовая камедь или желатин; формообразующее, такое, как крахмал или лактоза, разрыхлитель, такой, как альгиновая кислота, Primogel или кукурузный крахмал; лубрикант, такой, как стеарат магния или Sterotes; скользящее вещество, такое, как коллоидный диоксид кремния; подсластитель, такой, как сахароза или сахарин; или ароматизатор, такой, как перечная мята, метилсалицилат или апельсиновый ароматизатор. Композиции для пероральной доставки могут в оптимальном варианте включать агенты, улучшающие устойчивость в желудочно-кишечном тракте и/или повышающие абсорбцию.

Для введения путем ингаляции композицию согласно изобретению, включающую очищенный полипептид или белок, экспрессированный из линии клеток млекопитающего, и средство доставки, в предпочтительном варианте доставляют в форме распыляемого аэрозоля из баллона под давлением или распылителя, который содержит подходящий газ-вытеснитель, например, такой, как диоксид углерода, или аэрозольного аппарата. Настоящее изобретение, в частности, предусматривает доставку композиций с применением аэрозоля, ингалятора или другого средства прямой доставки в верхние и/или нижние дыхательные пути. Было продемонстрировано, что интраназальное введение ДНК-вакцин, направленных против вирусов гриппа, вызывает реакции Т-клеток CD8, указывая на то, что как минимум некоторые клетки в дыхательных путях могут усваивать ДНК при введении этим путем, и средства доставки согласно изобретению повышают клеточное поглощение. Согласно некоторым вариантам осуществления изобретения, композиции, включающие очищенный полипептид, экспрессированный из линии клеток млекопитающего, и средство доставки, рецептируют в форме больших пористых частиц для аэрозольного введения.

Системное введение также может производиться трансмукозальным или чрескожным путем. Для трансмукозального чрескожного введения в композиции используют пенетранты, подходящие для проникновения через барьер. Такие пенетранты, как правило, известны специалистам в данной области, и к ним относятся, например, для трансмукозального введения, детергенты, соли желчных кислот и производные фусидовой кислоты. Трансмукозальное введение может производиться путем применения назальных спреев или суппозиториев. Для чрескожного введения очищенный полипептид или белок и средства доставки рецептируют в форме мазей, бальзамов, гелей или кремов, которые являются общеизвестными среди специалистов в данной области.

Композиции также могут приготавливаться в форме суппозиториев (например, с традиционными для суппозиториев основами, такими, как масло какао и другие глицериды) или удерживающие клизмы для ректального введения.

В одном варианте осуществления композиции приготавливают с носителями, которые защищают полипептид или белок от быстрого выведения из организма, такие, как композиция с контролируемым высвобождением, включая имплантаты и микроинкапсулированные системы доставки. Могут применяться биологически разрушаемые, биологически совместимые полимеры, такие, как этиленвинилацетат, полиангидриды, полигликолевая кислота, коллаген, полиортоэстеры и полимолочная кислота. Способы приготовления таких композиций очевидны для специалистов в данной области. Материалы также могут быть получены из коммерческих источников от Alza Corporation и Nova Pharmaceuticals, Inc. Липосомальные суспензии (включая липосомы, направленные на инфицированные клетки с моноклональными антителами к вирусным антигенам) также могут применяться в качестве фармацевтически приемлемых носителей. Они могут приготавливаться в соответствии с со способами, известными специалистам в данной области, например, как описано в Патенте США №4,522,811.

Преимущество отдается рецептированию композиций для перорального или парентерального введения в форме дозированной единицы для облегчения введения и единообразия дозы. Форма дозированной единицы в контексте данного описания означает физически отдельные единицы, приемлемые в качестве единичных доз для субъекта, подвергаемого лечению; каждая единица содержит заданное количество активного полипептида или белка, рассчитанное для обеспечения нужного терапевтического эффекта, в сочетании с требуемым фармацевтическим носителем.

Полипептид или белок, экспрессированный согласно настоящему изобретению, может вводиться с различными интервалами и с разной периодичностью, согласно потребности, например, раз в неделю в течение приблизительно от 1 до 10 недель, от 2 до 8 недель, приблизительно от 3 до 7 недель, приблизительно 4, 5 или 6 недель и т.д. Специалисту в данной области станет понятно, что различные факторы могут влиять на дозировку и время, необходимые для эффективного лечения субъекта, включая, помимо прочих, тяжесть болезни или нарушения, предыдущее лечение, общее состояние здоровья и/или возврат субъекта, а также наличие других болезней. Как правило, лечение субъекта полипептидом или белком, как описывается авторами, может включать одноразовое лечение или, во многих случаях, может включать серийное лечение. Также понятно, что соответствующие дозы могут зависеть от активности полипептида или белка и необязательно может быть подобрана к конкретному реципиенту, например, путем введения увеличивающихся доз до достижения заданной реакции. Следует понимать, что конкретный уровень дозы для любого конкретного животного может зависеть от различных факторов, включая активность конкретного применяемого полипептида или белка, возраста, массы тела, общего состояния здоровья, пола и режима питания субъекта, времени введения, пути введения, скорости экскреции, любой комбинации медикаментов и степени регулируемой экспрессии или активности.

Настоящее изобретение включает применение композиций согласно изобретению для лечения животных. Соответственно, дозы и способы введения могут быть выбраны соответствии с известными принципами ветеринарной фармакологии и медицины. Указания содержатся, например, в публикации Adams, R. (ed.), Veterinary Pharmacology and Therapeutics, 8^th edition, Iowa State University Press; ISBN: 0813817439; 2001.

Фармацевтические композиции согласно изобретению могут содержаться в таре, пакете или дозаторе вместе инструкциями по применению.

Комплекты

Настоящее изобретение также обеспечивает комплекты, включающие компоненты, применяемые для создания среды для культивирования клеток, включая композицию, включающую железо, как описывается авторами. Такие комплекты могут быть особенно полезны для повышения плотности, жизнеспособности и/или титра клеток в культуре клеток.

В некоторых вариантах осуществления такие комплекты согласно изобретению включают один или несколько реагентов для приготовления первичной среды для культивирования клеток. Такие комплекты могут включать один или несколько реагентов, применяемых для дополнения определенной среды для культивирования клеток (например, гормоны и/или другие факторы роста; неорганические ионы, такие, как натрий, хлорид, кальций, магний и фосфат; буферы; витамины; нуклеозиды или нуклеотиды; микроэлементы; аминокислоты; липиды; или глюкоза или другой источник энергии). Комплекты согласно изобретению могут включать отдельную композицию, включающую железо, (например, FeSO₄, Fe-цитрат, Fe-трансферрин, Fe-хлорид, Fe-нитрат, Fe-EDTA, Fe(NO₃)₃, FeCl₂ или FeCl₃). В некоторых вариантах осуществления комплекты согласно изобретению включают отдельную композицию, включающую железо, которая обеспечивает соответствующую концентрацию в описываемой авторами среде для культивирования клеток (например, от 100 мкМ до 5 мМ). Комплекты согласно изобретению также могут содержать инструкции (например, руководство для пользователя) по добавлению отдельной композиции железа к первичной среде для культивирования клеток в один или несколько моментов времени в течение процесса культивирования клеток, как описывается авторами.

Компоненты комплектов согласно изобретению могут находиться в отдельных вместилищах, и несколько таких вместилищ могут быть предусмотрены в общем корпусе.

Настоящее изобретение более подробно поясняется на следующих неограничивающих примерах. Примеры представлены лишь для пояснения и не должны рассматриваться как ограничивающие объем изобретения.

ПРИМЕРЫ

Пример 1: Добавление Fe к культуре с подпиткой после 3-го дня

Этот эксперимент демонстрирует, что добавление Fe во время культивирования с подпиткой клеток, вырабатывающих терапевтические белки, после 3-го дня обеспечивает значительное повышение плотности, жизнеспособности и титра клеток.

Клетки СНО, Линия клеток 1, культивировали в химически определенной обогащенной среде с применением процесса культивирования с подпиткой. Высокую концентрацию Fe (например, от 100 мкМ до 5 мМ) добавляли к культуре клеток после 3-го дня для обеспечения разных показателей концентрации Fe (например, 0 мМ, 0,1 мМ, 1,0 мМ, 2,0 мМ или 5,0 мМ). В этом эксперименте использовали лимоннокислое железо и клетки культивировали во встряхиваемых колбах. Клетки подвергали анализу на плотность, жизнеспособность и титр клеток в разные моменты времени в течение процесса культивирования клеток.

Плотность жизнеспособных клеток определяли при помощи CEDEX с применением способа распознавания изображения в цифровой форме. Влияние добавления разных доз Fe после 3-го дня на рост клеток в образце Линии клеток 1 показано на Фигуре 1. Как можно увидеть на Фигуре 1, добавление Fe после 3-го дня повышало плотность жизнеспособных клеток по сравнению с клетками, выращиваемыми при отсутствии железа.

Жизнеспособность клеток определяли при помощи CEDEX с применением способа вытеснения трипанового синего. Влияние добавления разных доз Fe после 3-го дня на жизнеспособность клеток в образце Линии клеток 1 показано на Фигуре 2. Как показано на Фигуре 2, добавление Fe после 3-го дня повышает жизнеспособность клеток по сравнению с клетками, выращиваемыми при отсутствии железа.

Кроме того, определяли влияние добавления Fe на жизнеспособность клеток на поздней стадии культивирования клеток. В частности, жизнеспособность клеток определяли на 16-й день для клеток, выращиваемых в присутствии и в отсутствие железа. Как показано на Фигуре 3, добавление Fe повышает жизнеспособность клеток на 16-й день.

Также определяли влияние добавления разных доз Fe после 3-го дня на титр антитела. Титр антитела определяли с применением способов HPLC на аффинность к Протеину A на 16-й день для клеток, выращиваемых в присутствии или в отсутствие различных концентраций железа. Как показано на Фигуре 4, добавление Fe повышает титр антитела на 16-й день.

Также наблюдалось, что оптимальная концентрация Fe, добавляемого после 3-го дня, может составлять от 0,3 мМ до 1 мМ. Эффективным является добавление Fe в любой день после 3-го дня. Распределение Fe по нескольким порциям может обеспечивать лучшие результаты, чем при одноразовом добавлении большого количества.

Подобные эксперименты осуществляли на втором образце линии клеток - Линии клеток 2, и результаты показаны на Фигуре 5. Как показано на Фигуре 5, добавление Fe улучшает плотность, жизнеспособность и титр клеток, в частности, на позднем этапе.

Помимо Fe-цитрата, также исследовали влияние других комплексов железа, таких, как FeSO₄ или Fe-трансферрин. На Фигуре 6 приводятся результаты, показывающие влияние добавления FeSO₄ и Fe-цитрата после 3-го дня на плотность жизнеспособных клеток и жизнеспособность на 14 день для Линии клеток 1 при культивировании с подпиткой.

Подобные эксперименты также осуществляли в экспериментах во встряхиваемых колбах и биореакторе, и эффект был одинаковым. Этот эффект наблюдался для разных продуктов (таких, как разные моноклональные антитела).

Таким образом, благоприятное влияние добавления Fe не зависит от линии клеток, масштаба культуры клеток, источника Fe и продукта. Также было определено, что на качество продукта не влияла высокая концентрация Fe.

Пример 2: Добавление Fe на 6-й день

Клетки СНО, экспрессирующие нанотело, выращивали путем культивирования с подпиткой во встряхиваемых колбах. Клетки сначала культивировали в инкубаторе с 7% CO₂ при 37°C в течение 0-4 дней и температуру снижали до 31°C после 4-го дня. FeSO₄ добавляли на 6-й день для обеспечения концентрации 1 мМ железа в среде для культивирования клеток. Клетки подвергали анализу на плотность, жизнеспособность, титр клеток, уровень лактата и анализу Qp в разные моменты времени в течение процесса культивирования клеток, как описывается в Примере 1. Типичные результаты показаны на Фигурах с 7 по 10. Как показано на Фигурах с 7 по 10, добавление Fe продемонстрировало значительное преимущество во время культивирования клеток, включая улучшение жизнеспособности (например, 96% в сравнении с 70% на 15-й день, как показано на Фигуре 7), улучшение титра (например, 3,2 г/л в сравнении с 1,5 г/л на 15-й день, как показано на Фигуре 8), улучшение Qp (например, 20 мкг/е6/день в сравнении с 10 мкг/е6/день, как показано на Фигуре 9) и снижение уровня лактата (например, лактат оставался близким к 0 для культуры клеток с добавлением Fe, но не для контрольной культуры без добавления Fe, где он повышался до 2,24 г/л на 15-й день, как показано на Фигуре 10).

Пример 3: Добавление Fe на 0-й день

Этот эксперимент разрабатывался для исследования наличия благоприятного влияния добавления высокой концентрации Fe на 0-й день. Клетки из линии клеток, вырабатывающих моноклональное антитело (клон 2.8) культивировали в pH-контролируемых встряхиваемых колбах с 7% CO₂ при ~120 об/мин с применением орбитального шейкера. Плотность посева составляла 1,5×10⁶ клеток/мл. Клетки культивировали в течение 14 дней. Базовой средой была химически определенная базовая среда, дополненная аминокислотами, включая 4 мМ глутамина. Питательная среда является химически определенной концентрированной питательной средой. Fe-цитрат или FeSO₄ добавляли на 0-й день или 9-й день для обеспечения концентрации 600 мкМ железа в среде для культивирования клеток. Клетки подвергали анализу на плотность, жизнеспособность, титр клеток и анализу Qp в разные моменты времени в течение процесса культивирования клеток, как описывается в предыдущих примерах. Типичные результаты показаны на Фигурах с 11 по 13.

Добавление Fe-цитрата на 0-й день приводило к повышенному росту клеток на ранней стадии культивирования клеток, а добавление Fe на 9-й день демонстрировало улучшенную плотность клеток на более поздней стадии культивирования клеток (Фигура 11). Однако добавление Fe-цитрата на 0-й день не способствовало поддержанию более высокой жизнеспособности в конце культивирования клеток. Например, как показано на Фигуре 12, жизнеспособность на 14 день для культуры клеток с добавлением Fe-цитрата в количестве 600 мкМ на 0-й день составляет приблизительно 75%, что сравнимо с 74-80% жизнеспособностью на 14 день для контрольной культуры без добавления Fe. Для сравнения, жизнеспособность клеток для культуры клеток с добавлением Fe на 9-й день составляет 85-90%.

Кроме того, как показано на Фигуре 13, показатель Qp культуры клеток с добавлением Fe-цитрата на 0-й день является более низким, чем при всех остальных условиях на протяжении всего культивирования.

В некоторых случаях, когда Fe добавляли в начале культивирования клеток, токсичность наблюдали при высоких концентрациях Fe. Например, Fe добавляли к Линии клеток 1 на 0-й день, и примеры влияния на жизнеспособность клеток на 3-й день во встряхиваемых колбах показаны на Фигуре 14. Как можно увидеть на Фигуре 14, токсичность наблюдалась для концентрации Fe более 100 мкМ. По сравнению с результатами, показанными в Примерах 1 и 2, неожиданным оказалось то, что высокая концентрация Fe, добавляемого на 0-й день, не только не была токсичной, но и продемонстрировала преимущества для культуры клеток, включая жизнеспособность клеток и рост клеток.

ЭКВИВАЛЕНТЫ

Специалисты в данной области, не выходя за рамки привычных экспериментов, смогут определить многие эквиваленты конкретных вариантов осуществления описанного авторами изобретения. Объем настоящего изобретения не ограничивается представленным выше описанием, а определяется прилагаемой формулой изобретения.

В формуле изобретения указание в единственном числе может подразумевать единственное или множественное число, если не указано иного, или если иного не вытекает из контекста. Пункты формулы изобретения или описания, включающие союз “или” между одним или несколькими элементами группы считаются приемлемыми, если один, несколько или группа элементов присутствуют, применяются или иным образом имеют отношение к данному продукту или процессу, если не указано иного, или если иного не вытекает из контекста. Изобретение включает варианты осуществления, в которых один конкретный элемент из группы присутствует, применяется или иным образом имеет отношение к данному продукту или процессу. Изобретение включает варианты осуществления, в которых более одного или все из группы элементов присутствуют, применяются или иным образом имеют отношение к данному продукту или процессу. Кроме того, следует понимать, что изобретение охватывает все варианты, комбинации и преобразования, в которых один или несколько ограничений, элементов, условий, описательных терминов и т.п. из одного или нескольких из перечисленных пунктов включены в другой пункт. Например, любой пункт формулы, зависимый от другого пункта, может быть изменен таким образом, чтобы включать одно или несколько ограничений, содержащихся в другом пункте, зависимом от того же основного пункта.

Если элементы представлены в виде списков, например, в формате группы Маркуша, следует понимать, что также раскрывается каждая подгруппа элементов, и любой(ые) элемент(ы) может (могут) быть удален(ы) из группы. Следует понимать, что, как правило, если изобретение или аспекты изобретения указываются как включающие конкретные элементы, особенности и т.п., некоторые варианты осуществления изобретения или аспекты изобретения состоят или по сути состоят из таких элементов, особенностей и т.п. С целью упрощения эти варианты осуществления специально не были изложены в такой формулировке. Следует заметить, что термин “включающий” предполагает открытость и допускает включение дополнительных элементов или этапов.

Если указаны диапазоны, включаются конечные точки. Кроме того, следует понимать, что, если не указано иного, или если иного не вытекает из контекста и понимания специалиста в данной области, значения, выраженные как диапазоны, могут допускать любое конкретное значение или поддиапазон в пределах указанных диапазонов разных вариантах осуществления изобретения до десятых долей единицы нижнего предела диапазона, если контекст прямо не диктует иного.

Кроме того, следует понимать, что любой конкретный вариант осуществления настоящего изобретения, охватываемый существующим уровнем техники, может быть прямо исключен из любых одного или нескольких пунктов формулы. Поскольку такие варианты осуществления считаются известными специалистам в данной области, они могут быть исключены, даже если исключение прямо не указывается. Любой конкретный вариант осуществления композиций согласно изобретению (например, направляющий компонент, любая болезнь, нарушение и/или состояние, любой связывающий агент, любой способ введения, любое терапевтическое применение и т.п.) могут быть исключены из любых одного или нескольких пунктов по любой причине, независимо от связи с существующим уровнем техники.

Публикации, обсуждаемые выше и по всему тексту, представлены исключительно для их раскрытия до даты подачи данной заявки. Ни одно положение этой заявки не должно истолковываться как признание того, что авторы изобретения не имеют права на датирование такого раскрытия задним числом через предыдущее раскрытие.

ВКЛЮЧЕНИЕ ССЫЛОК

Все публикации и патентные документы, приведенные в этой заявке, включаются путем ссылки в полном объеме в том объеме, в каком содержание каждой отдельной публикации или патентного документа было бы включено в это описание.

1. Способ повышения плотности, жизнеспособности и/или титра клеток в среде для культивирования клеток, включающий этапы:

(a) обеспечения клеток в среде для культивирования клеток для начала процесса культивирования клеток, где указанная среда для культивирования клеток содержит железо в качестве микроэлемента; и где концентрация железа составляет меньше чем 100 мкМ; и

(b) добавления композиции, включающей железо, к вышеупомянутой среде для культивирования клеток в процессе культивирования клеток, таким образом, чтобы концентрация железа в среде для культивирования клеток повышалась на протяжении процесса культивирования клеток, где композицию, содержащую железо, добавляют на 3-й день или после него процесса культивирования клеток.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что композицию, включающую железо, выбирают из группы, к которой относятся FeSO₄, Fe-цитрат, Fe-трансферрин, Fe-хлорид, Fe-нитрат, Fe-EDTA, Fe(NO₃)₃, FeCl₂, FeCl₃ и их комбинации.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что композицию, включающую железо, добавляют на 6-й день или после него в процессе культивирования клеток.

4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что композицию, включающую железо, добавляют в разные моменты времени в процессе культивирования клеток.

5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что концентрация железа в среде для культивирования клеток после добавления композиции, включающей железо, составляет от 100 мкМ до 5 мМ.

6. Способ по п. 1, отличающийся тем, что концентрация железа в среде для культивирования клеток после добавления композиции, включающей железо, составляет от 300 мкМ до 1 мМ.

7. Способ по п. 1, отличающийся тем, что концентрация железа в среде для культивирования клеток после добавления композиции, включающей железо, составляет 1 мМ.

8. Способ по п. 1, отличающийся тем, что клетки являются клетками млекопитающих.

9. Способ по п. 8, отличающийся тем, что клетки млекопитающих выбирают из линии миеломы мыши BALB/c, ретинобластов человека (PER.C6), клеток почек обезьян, клеток мезонефроса человека (293), клеток почек новорожденного хомяка (BHK), клеток яичника китайского хомячка (СНО), клеток Сертоли мыши, клеток почек африканской зеленой мартышки (VERO-76), клеток карциномы шейки матки человека (HeLa), клеток почек собаки, клеток печени серой крысы, клеток легких человека, клеток печени человека, клеток опухоли молочной железы мышей, клеток TRI, клеток MRC 5, клеток FS4 или линии гепатомы человека (Hep G2).

10. Способ по п. 9, отличающийся тем, что клетки млекопитающих являются клетками СНО.

11. Способ по п. 1, отличающийся тем, что процесс культивирования клеток представляет собой процесс культивирования с подпиткой.

12. Способ по п. 1, отличающийся тем, что процесс культивирования клеток представляет собой процесс культивирования с повторной подпиткой.

13. Способ по п. 1, отличающийся тем, что процесс культивирования клеток представляет собой процесс перфузионного культивирования.

14. Способ по п. 1, отличающийся тем, что процесс культивирования клеток представляет собой процесс крупномасштабного культивирования.

15. Способ по п. 14, отличающийся тем, что объем среды для культивирования клеток составляет как минимум приблизительно 500 л.

16. Способ по п. 1, отличающийся тем, что среда для культивирования клеток не содержит гидролизатов.

17. Способ по п. 1, отличающийся тем, что среда для культивирования клеток содержит гидролизаты.

18. Способ по п. 1, отличающийся тем, что клетки включают ген, кодирующий рекомбинантный белок.

19. Способ по п. 18, отличающийся тем, что рекомбинантный белок является антителом или его фрагментом.

20. Способ по п. 19, отличающийся тем, что антитело является антителом против IL-22.

21. Способ по п. 19, отличающийся тем, что антитело является антителом против GDF-8.

22. Способ по п. 19, отличающийся тем, что антитело представляет собой Муо29.

23. Способ по п. 19, отличающийся тем, что антитело является однодоменным антителом.

24. Способ по п. 23, отличающийся тем, что однодоменное антитело является нанотелом против TNF.

25. Способ по п. 18, отличающийся тем, что рекомбинантный белок представляет собой гликопротеин.

26. Способ по п. 18, отличающийся тем, что рекомбинантный белок является терапевтическим белком.

27. Способ по п. 26, отличающийся тем, что терапевтический белок представляет собой фактор роста, коагулирующий фактор, цитокин, слитый белок, лекарственное вещество, вакцину, фермент или Small Modular ImmunoPharmaceutical™ (иммунофармацевтическое средство на основе модульного белка малого размера -SMIP).

28. Способ по любому из пп. 18-27, отличающийся тем, что способ также включает очистку рекомбинантного белка.