Антитело к pd-1 и его применение

Авторы патента:


Антитело к pd-1 и его применение
Антитело к pd-1 и его применение
Антитело к pd-1 и его применение
Антитело к pd-1 и его применение
Антитело к pd-1 и его применение
Антитело к pd-1 и его применение
Антитело к pd-1 и его применение
Антитело к pd-1 и его применение
Антитело к pd-1 и его применение
Антитело к pd-1 и его применение
Антитело к pd-1 и его применение
Антитело к pd-1 и его применение
Антитело к pd-1 и его применение
Антитело к pd-1 и его применение
Антитело к pd-1 и его применение
Антитело к pd-1 и его применение
Антитело к pd-1 и его применение
Антитело к pd-1 и его применение
Антитело к pd-1 и его применение
Антитело к pd-1 и его применение
Антитело к pd-1 и его применение
Антитело к pd-1 и его применение
Антитело к pd-1 и его применение
Антитело к pd-1 и его применение
Антитело к pd-1 и его применение
Антитело к pd-1 и его применение
Антитело к pd-1 и его применение
Антитело к pd-1 и его применение
Антитело к pd-1 и его применение
Антитело к pd-1 и его применение
Антитело к pd-1 и его применение
Антитело к pd-1 и его применение
Антитело к pd-1 и его применение
Антитело к pd-1 и его применение
C07K2317/565 - Пептиды (пептиды в пищевых составах A23, например получение белковых композиций для пищевых составов A23J, препараты для медицинских целей A61K; пептиды, содержащие бета-лактамовые кольца, C07D; циклические дипептиды, не содержащие в молекуле любого другого пептидного звена, кроме образующего их кольцо, например пиперазин-2,5-дионы, C07D; алкалоиды спорыньи циклического пептидного типа C07D519/02; высокомолекулярные соединения, содержащие статистически распределенные аминокислотные единицы в молекулах, т.е. при получении предусматривается не специфическая, а случайная последовательность аминокислотных единиц, гомополиамиды и блоксополиамиды, полученные из аминокислот, C08G 69/00; высокомолекулярные продукты, полученные из протеинов, C08H 1/00; получение

Владельцы патента RU 2663795:

ЦЗЮНЬМЭН БИОСАЙЕНСИЗ КО., ЛТД (CN)
ШАНХАЙ ЦЗЮНЬШИ БИОСАЙЕНСИЗ ИНК. (CN)

Настоящее изобретение относится к области иммунологии. Предложены антитело и его функциональный фрагмент, способные к связыванию с PD-1. Также рассмотрена молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая антитело или его фрагмент, экспрессионный вектор, клетка-хозяин и способ получения антитела или его функционального фрагмента. Кроме того, описан иммуноконъюгат и фармацевтическая композиция, а также способ лечения заболеваний, ассоциированных с PD-1. Данное изобретение может найти дальнейшее применение в терапии различных состояний, в частности различных видов рака, инфекционных и воспалительных заболеваний. 8 н. и 6 з.п. ф-лы, 13 ил., 14 пр.

 

ПРЕДПОСЫЛКИ ДЛЯ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0001] Уровень техники

[0002] Данное изобретение принадлежит к области биомедицины и относится к антителу (антителам) или его функциональному фрагменту (их функциональным фрагментам), которые с высокой степенью аффинности специфически связываются с PD-1. Оно также обеспечивает молекулу (молекулы), кодирующие антитело (антитела) или его фрагмент (их фрагменты) в соответствии с настоящим изобретением, экспрессионный вектор (экспрессионные векторы) и клетки для экспрессирования антитела (антител) или его функционального фрагмента (их функциональных фрагментов) в соответствии с настоящим изобретением, а также способ (способы) получения антитела (антител) или его функционального фрагмента (функциональных фрагментов) в соответствии с настоящим изобретением. Настоящее изобретение также обеспечивает иммуноконъюгат (иммуноконъюгаты) и фармацевтическую композицию (фармацевтические композиции), содержащие антитела или их функциональные фрагменты в соответствии с настоящим изобретением, а также способ (способы) лечения множества заболеваний (включая рак (виды рака), инфекционное заболевание (инфекционные заболевания) и воспалительное заболевание (воспалительные заболевания)), с использованием антитела (антител) или его функционального фрагмента (их функциональных фрагментов) в соответствии с настоящим изобретением.

[0003] Описание предшествующего уровня техники

[0004] Белок программируемой смерти клеток 1, PD-1, является членом семейства CD28 и иммунодепрессивных рецепторов, которые экспрессируются на поверхностях активированных Т- и В-клеток (Yao, Zhu et al. Advances in targeting cell surface signalling molecules for immune modulation. Nat Rev Drug Discov, 2013,12(2): 130-146). Этот рецептор может связываться со своими лигандами, PD-L1 и PD-L2, чтобы эффективно уменьшать иммунную реакцию привлеченных иммунных Т-клеток. Опухолевые клетки избегают иммунного надзора внутри тела из-за высокого экспрессирования PD-L1 (Okazaki and Honjo, PD-1 and PD-1 ligands: from discovery to clinical application. International Immunology, 2007, 19(7): 813-824 2007). Взаимодействие между PD1 и PD-L1 может быть заблокировано, чтобы очевидно улучшить активность CD8+ цитотоксических Т-клеток в отношении уничтожения опухолевые клетки.

[0005] В основном PD-1 экспрессируются на поверхности CD4+ Т-клеток, CD8+ Т-клеток, клеток NKT, В-клеток и активированных моноцитов. В основном его экспрессирование индуцируется сигналами Т-клеточного рецептора (TCR) или B-клеточного рецептора (BCR). Фактор некроза опухолей (TNF) может повысить экспрессирование PD-1 на поверхности таких клеток (Francisco, Sage et al., The PD-1 pathway in tolerance and autoimmunity. Immunol Rev, 2010, 236: 219-242). Человеческий PD-1, кодируемый геном Pdcd1, расположен на участке хромосомы 2q37.3 общей длиной 9,6 т.п.о. Он включает в себя пять экзонов и четыре интрона, а часть, расположенная против хода транскрипции, содержит промотор размером 663 п. о. Молекулярная структура PD-1 включает внеклеточный, трансмембранный и внутриклеточный участки. Аминокислотная последовательность (аминокислотные последовательности) во внеклеточной области имеет 24% гомологию с CTLA-4 и 28% гомологию с CD28. Ее ген имеет в основном семь сайтов однонуклеотидного полиморфизма. Внеклеточная область включает в себя один структурный домен вариабельной цепи иммуноглобулина IgV. Внутриклеточная область включает в себя два мотива сигнальной трансдукции на основе тирозина - ITIM (иммунорецепторного тирозинового ингибирующего мотива) и ITSM (иммунорецепторного тирозинового переключающего мотива). После активации Т-клеток, PD-1 собирает тирозин фосфатазы SHP2, главным образом, через мотив ITSM, что приводит к дефосфорилированию эффекторных молекул, включая CD3ζ, PKCθ и ZAP70 и т.д.

[0006] Существует два лиганда для PD-1: PD-L1 и PD-L2. PD-L1 также называется B7H1 или CD274, а PD-L2 называется B7DC или CD273. Ген PD-L расположен в локусе 9p24.2 хромосомы человека размером 42 т.п.о. Эти лиганды имеют 21~27%-ную гомологию аминокислотной последовательности и структурное сходство с В7-1, В7-2 и ICOSL: все они содержат по одному структурному домену иммуноглобулин-подобного вариабельного участка, по одному структурному домену константного участка, по одному трансмембранному участку и по одному короткому цитоплазматическому хвосту. Цитоплазматический хвост PD-L1 более консервативен, чем PD-L2. PD-L1 и PD-L2 экспрессируются в разных клеточных популяциях (Shimauchi, Kabashima et al., Augmented expression of programmed death-1 in both neoplastic and non-neoplastic CD4+ T cells in adult T cell leukemia/lymphoma. Int J Cancer, 2007, 121(12): 2585-2590). И эти клетки включают негемопоэтическую ткань и различные типы опухолей. В основном PD-L1 экспрессируется на Т-клетках, В-клетках, дендритных клетках, макрофагах, мезенхимальных стволовых клетках и тучных клетках, происходящих из костного мозга. PD-L1 также экспрессируется на клетках, не происходящих из костного мозга, таких как эндотелиальные клетки сосудов, клетки эпителия, клетки скелетных мышц, гепатоциты, эпителиальные клетки почечных канальцев, инсулоциты, астроциты головного мозга и разные типы нелимфоидных опухолей, такие как меланома, рак печени, рак желудка, почечно-клеточная карцинома. Он также экспрессируется на клетках иммунологически привилегированных сайтов, таких как плацента, глаза. Это дает основания полагать, что PD-L1 может до определенной степени существенно регулировать аутореактивные Т-клетки, В-клетки и иммунологическую толерантность, а также может играть определенную роль в реакции периферических тканей Т-клеток и В-клеток. Тем не менее, PD-L2 имеет очень ограниченный участок экспрессии и существует только в макрофагах и дендритных клетках. Считается, что он играет важную роль в основном в иммунном презентировании.

[0007] PD-1 и PD-L1 взаимодействуют друг с другом, чтобы регулировать и контролировать активацию Т-клеток, что было подтверждено у множества опухолей и вирусных инфекций. PD-L1 экспрессируется на поверхностях различных опухолевых клеток, которые включают рак легкого, рак печени, рак яичника, рак шейки матки, рак кожи, рак мочевого пузыря, рак толстого кишечника, рак молочной железы, глиому, рак почки, рак желудка, рак пищевода, плоскоклеточный рак полости рта, рак головы/шеи. Кроме того, существует большое количество CD8+ Т-клеток, экспрессирующих PD-L1, выявленных при этих видах рака. Клиническая статистика показала, что высокий уровень экспрессии PD-L1 на раковых клетках связан с неблагоприятным прогнозом для пациентов со злокачественными новообразованиями (Okazaki and Honjo 2007. Там же).

[0008] Многие вирусы, вызывающие хронические и острые инфекции, также избегают иммунного надзора организма посредством сигналов PD-1 и PD-L1. Например, уровень экспрессирования PD-1 у ВИЧ-инфицированных пациентов тесно связан со степенью истощения Т-клеток и может быть использован в качестве одного из маркеров прогрессирования СПИДа (Trabattoni, Saresella et al., B7-H1 is up-regulated in HIV infection and is a novel surrogate marker of disease progression. Blood, 2003, 101(7): 2514-2520). То же самое происходит у пациентов с хроническим гепатитом В (Evans, Riva et al., Programmed death 1 expression during antiviral treatment of chronic hepatitis B: Impact of hepatitis B e-antigen seroconversion., Hepatology, 2008, 48(3): 759-769). Исследования на животных показали, что мыши, чей ген PD-1 нокаутирован, могут контролировать вирусную инфекцию лучше, чем обычные мыши; и гепатит может быть вызван путем переноса HBV-специфических Т-клеток трансгенным животным с вирусом гепатита В.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0009] Настоящее изобретение относится к антителу (антителам) к PD-1 и их функциональному фрагмента (функциональным фрагментам), которые могут связываться с белком программируемой смерти клеток (PD 1).

[0010] С одной стороны, в соответствии с настоящим изобретением антитело (антитела) или их функциональный фрагмент (функциональные фрагменты) содержат CDR тяжелой цепи, выбранный из аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: 1, 2, 3, 7, 8, 9, 13, 14, 15 или любого варианта указанной последовательности, и/или CDR легкой цепи, выбранный из аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: 4, 5, 6, 10, 11, 12,16, 17, 18 или любого варианта указанной последовательности.

[0011] В некоторых предпочтительных вариантах осуществления аминокислотные последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи указанного антитела (указанных антител) или их функционального фрагмента (функциональных фрагментов) выбраны из каких-либо следующих групп разных аминокислотных последовательностей или их вариантов:

HCDR1 HCDR2 HCDR3
A SEQ ID NO:1 SEQ ID NO:2 SEQ ID NO:3
B SEQ ID NO:7 SEQ ID NO:8 SEQ ID NO:9
C SEQ ID NO:13 SEQ ID NO:14 SEQ ID NO:15

,

и/или аминокислотные последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи, выбраны из какой-либо из следующих групп разных аминокислотных последовательностей или их вариантов:

LCDR1 LCDR2 LCDR3
A SEQ ID NO:4 SEQ ID NO:5 SEQ ID NO:6
B SEQ ID NO:10 SEQ ID NO:11 SEQ ID NO:12
C SEQ ID NO:16 SEQ ID NO:17 SEQ ID NO:18

.

В некоторых предпочтительных вариантах осуществления в соответствии с настоящим изобретением аминокислотные последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи, а также CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи антитела (антител) или их функционального фрагмента (функциональных фрагментов) выбраны из следующих групп разных аминокислотных последовательностей или их вариантов:

HCDR1 HCDR2 HCDR3 LCDR1 LCDR2 LCDR3
A SEQ ID NO:1 SEQ ID NO:2 SEQ ID NO:3 SEQ ID NO:4 SEQ ID NO:5 SEQ ID NO:6
B SEQ ID NO:7 SEQ ID NO:8 SEQ ID NO:9 SEQ ID NO:10 SEQ ID NO:11 SEQ ID NO:12
C SEQ ID NO:13 SEQ ID NO:14 SEQ ID NO:15 SEQ ID NO:16 SEQ ID NO:17 SEQ ID NO:18

.

[0012] В некоторых вариантах осуществления в соответствии с настоящим изобретением антитело (антитела) или его функциональный фрагмент (функциональные фрагменты) содержат вариабельный участок (вариабельные участки) тяжелой цепи, выбранные из аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: 19, 21, 23 или любого варианта указанной последовательности, и/или вариабельный участок (вариабельные участки) легкой цепи, выбранные из аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: 20, 22, 24 или любого варианта указанной последовательности.

[0013] В одном предпочтительном варианте осуществления указанный вариабельный участок (указанные вариабельные участки) тяжелой цепи представляет собой SEQ ID NO: 19 или ее вариант, а указанный вариабельный участок (указанные вариабельные участки) легкой цепи представляет собой SEQ ID NO: 20 или ее вариант.

[0014] В другом более предпочтительном варианте осуществления указанный вариабельный участок (указанные вариабельные участки) тяжелой цепи представляет собой SEQ ID NO: 21 или ее вариант, а указанный вариабельный участок (указанные вариабельные участки) легкой цепи представляет собой SEQ ID NO: 22 или ее вариант.

[0015] В другом более предпочтительном варианте осуществления указанный вариабельный участок (указанные вариабельные участки) тяжелой цепи представляет собой SEQ ID NO: 23 или ее вариант, а вариабельный участок (вариабельные участки) легкой цепи представляет собой SEQ ID NO: 24 или ее вариант.

[0016] В соответствии с настоящим изобретением антитело (антитела) или его функциональный фрагмент (их функциональные фрагменты) может являться химерным антителом, гуманизированным антителом или полностью человеческим антителом.

[0017] В соответствии с настоящим изобретением антитело (антитела) или его функциональный фрагмент (функциональные фрагменты) могут являться гуманизированными. Способ (способы) получения гуманизированного антитела обычно известны специалистам в данной области. Например, последовательность CDR в соответствии с настоящим изобретением может быть перенесена в вариабельный участок человеческого антитела для получения гуманизированного антитела к PD-1 по настоящему изобретению. Указанное гуманизированное антитело не будет вызывать реакцию антиантитела (AAR) и реакцию человеческого антитела к мышиному антигену (HAMA), и не будет быстро удаляться из-за нейтрализации антиантителом, а будет играть роль в иммунологическогом эффекте, таком как ADCC и CDC.

[0018] В некоторых предпочтительных вариантах осуществления в соответствии с настоящим изобретением гуманизированное антитело (антитела) к PD-1 или его функциональный фрагмент (их функциональные фрагменты) содержат вариабельный участок (вариабельные участки) тяжелой цепи, выбранные из аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: 33, 35, 36 или какого-либо варианта указанной последовательности, и/или вариабельный участок (вариабельные участки) легкой цепи, выбранные из аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: 34, 37 или любого варианта вышеуказанной последовательности.

[0019] В одном предпочтительном варианте осуществления гуманизированного антитела (гуманизированных антител) или его функционального фрагмента (их функциональных фрагментов) в соответствии с настоящим изобретением вышеуказанный вариабельный участок (вариабельные участки) тяжелой цепи представляет собой SEQ ID NO: 33 или ее вариант, а указанный вариабельный участок (вариабельные участки) легкой цепи представляет собой SEQ ID NO: 34 или ее вариант.

[0020] В другом предпочтительном варианте осуществления гуманизированного антитела (гуманизированных антител) или его функционального фрагмента (их функциональных фрагментов) в соответствии с настоящим изобретением указанный вариабельный участок (вариабельные участки) тяжелой цепи представляет собой SEQ ID NO: 35 или ее вариант, а указанный вариабельный участок (вариабельные участки) легкой цепи представляет собой SEQ ID NO: 34 или ее вариант.

[0021] В другом предпочтительном варианте осуществления гуманизированного антитела (гуманизированных антител) или его функционального фрагмента (их функциональных фрагментов) в соответствии с настоящим изобретением указанный вариабельный участок (вариабельные участки) тяжелой цепи представляет собой SEQ ID NO: 36 или ее вариант, а указанный вариабельный участок (вариабельные участки) легкой цепи представляет собой SEQ ID NO: 34 или ее вариант.

[0022] В другом более предпочтительном варианте осуществления гуманизированного антитела (гуманизированных антител) или его функционального фрагмента (их функциональных фрагментов) в соответствии с настоящим изобретением указанный вариабельный участок (вариабельные участки) тяжелой цепи представляет собой SEQ ID NO: 35 или ее вариант, а указанный вариабельный участок (вариабельные участки) легкой цепи представляет собой SEQ ID NO: 37 или ее вариант.

[0023] Настоящее изобретение также обеспечивает отдельную молекулу нуклеиновой кислоты (отдельные молекулы нуклеиновой кислоты), кодирующую антитело (антитела) или его функциональный фрагмент (их функциональные фрагменты) в соответствии с настоящим изобретением. В одном из предпочтительных вариантов осуществления указанная молекула нуклеиновой (молекулы нуклеиновой кислоты) содержит нуклеотидные последовательности, изложенные в SEQ ID NO: 25-30, 38-42, или их комбинацию.

[0024] Настоящее изобретение также обеспечивает экспрессионный вектор (экспрессионные векторы), содержащий указанную молекулу нуклеиновой кислоты (молекулы нуклеиновой кислоты), а также клетку-хозяина (клетки-хозяева), содержащую указанный экспрессионный вектор (экспрессионные векторы).

[0025] Настоящее изобретение обеспечивает способ (способы) получения антитела (антител) к PD-1 или его функционального фрагмента (их функциональных фрагментов), который включает культивирование указанной клетки-хозяина (клеток-хозяев) в соответствии с настоящим изобретением в условиях, которые обеспечивают продуцирование указанного антитела (указанных антител) или его функционального фрагмента (функциональных фрагментов), а также выделение указанного антитела (антител) или его функционального фрагмента (их функциональных фрагментов), полученного таким образом.

[0026] С другой стороны, настоящее изобретение относится к иммуноконъюгату (иммуноконъюгатам), содержащему антитело (антитела) или его функциональный фрагмент (их функциональные фрагменты) в соответствии с настоящим изобретением, которые связанны с терапевтическим средством (терапевтическими средствами). Указанное терапевтическое средство (терапевтические средства) предпочтительно является токсином, радиизотопом, лекарственным средством или цитотоксическим средством.

[0027] Настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции, содержащей (антитело) антитела или его функциональный фрагмент (их функциональные фрагменты) в соответствии с настоящим изобретением, а также фармацевтический носитель (фармацевтические носители).

[0028] С другой стороны, настоящее изобретение обеспечивает способ (способы), применяемый для профилактики или лечения заболеваний или состояний путем устранения, подавления или снижения активности PD-1, который включает введение нуждающемуся пациенту эффективной лечебной дозы антитела (антител) или его функционального фрагмента (их функциональных фрагментов) в соответствии с настоящим изобретением, нуклеиновой кислоты, экспрессионного вектора, клетки-хозяина, иммуноконъюгата или фармацевтической композиции, где указанные заболевания или состояния выбраны из видов рака, инфекционных заболеваний или воспалительных заболеваний, при этом указанные виды рака предпочтительно выбраны из меланомы, рака почки, рака предстательной железы, рака молочной железы, рака толстого кишечника, рака легкого, рака кости, рака поджелудочной железы, рака кожи, рака головы или шеи, кожной или внутриглазной злокачественной меланомы, рака матки, рака яичника, рака прямой кишки, рака анального канала, рака желудка, рака яичка, рака матки, рака фаллопиевых труб, рака эндометрия, рака шейки матки, рака влагалища, рака вульвы, болезни Ходжкина, неходжкинской лимфомы, рака пищевода, рака тонкого кишечника, рака эндокринной системы, рака щитовидной железы, рака паращитовидной железы, рака надпочечника, саркомы мягких тканей, рака уретры, рака полового члена, хронического или острого лейкоза, который включает в себя острый миелоидный лейкоз, хронический миелоидный лейкоз, острый лимфобластный лейкоз, хронический лимфоцитарный лейкоз, солидных опухолей у детей, лимфоцитарной лимфомы, рака мочевого пузыря, рака почки или уретры, рака почечной лоханки, патологического разрастания ткани центральной нервной системы, первичной лимфомы центральной нервной системы, ассоциированного с опухолью ангиогенеза, опухолей оси позвоночника, глиомы ствола мозга, аденомы гипофиза, саркомы Капоши, эпидермоидной карциномы, плоскоклеточного рака, Т-клеточной лимфомы, вызванных влиянием окружающей среды видов рака, в том числе вызванных асбестом, и сочетания указанных видов рака, при этом указанные инфекционные заболевания предпочтительно выбраны из ВИЧ, гриппа, герпеса, лямблиоза, малярии, лейшманиоза, из патогенных инфекций, вызванных следующими вирусами: вирусы гепатита (гепатита А, В и С), вирусы герпеса (например, VZV, HSV-1, HAV-6, HSV-II и CMV, вирус Эпштейна-Барр), аденовирус, вирус гриппа, флавивирусы, эховирус, риновирус, вирус Коксаки, коронавирус, респираторно-синцитиальный вирус, вирус эпидемического паротита, ротавирус, вирус кори, вирус краснухи, парвовирус, вирус коровьей оспы, вирус HTLV, вирус денге, вирус папилломы, вирус моллюска, вирус полиомиелита, вирус бешенства, вирус JC и вирус арбовирусного энцефалита, из патогенных инфекций, вызванных следующими бактериями: хламидии, риккетсии, микобактерии, стафилококки, стрептококки, пневмококки, менингококки и гонококки, клебсиелла, протей, серратия, псевдомонады, легионеллы, из возбудителей дифтерии, сальмонеллеза, туберкулеза, холеры, столбняка, ботулизма, сибирской язвы, чумы, лептоспироза и бактерий болезни Лайма, из патогенных инфекций, вызванных следующими грибами: кандида (Candida albicans, Candida krusei, Candida glabrata, Candida tropicalis и т.д.), Cryptococcus neoformans, аспергиллы (Fumigatus, Aspergillus niger и т.д.), род Mucor (Mucor, Absidia, Rhizopus), Sporothrix schenckii, вызывающие дерматит почкующиеся дрожжи, Paracoccidiodes brasiliensis, Coccidioides immitis и Histoplasma capsulatum, из патогенных инфекций, вызванных следующими паразитами: дизентерийная амеба, балантидия толстого кишечника, черви Фернандо, амеба, поражающая головной мозг, лямблия, криптоспоридия, Pneumocystis carinii, P. vivax, бабезии полевых мышей, Trypanosoma brucei, Trypanosoma cruzi, Leishmania donovani, Toxoplasma gondii и Nippostrongylus brasiliensis, при этом указанные воспалительные заболевания предпочтительно выбраны из следующих: острый рассеянный энцефаломиелит, болезнь Аддисона, анкилозирующий спондилит, синдром антифосфолипидных антител, аутоиммунная гемолитическая анемия, аутоиммунный гепатит, артрит, болезнь Бехчета, буллезный дерматит, целиакия, болезнь Шагаса, болезнь Крона, дерматомиозит, сахарный диабет 1 типа, легочное кровотечение - аутоиммунная гемолитическая анемия, реакция трансплантат против хозяина, болезнь Грейвса, синдром Гийена-Барре, тиреоидит Хашимото, синдром гипериммуноглобулинемии Е, идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура, системная красная волчанка, рассеянный склероз, миастения гравис, пемфигус, злокачественная анемия, полимиозит, первичный билиарный цирроз, псориаз, ревматоидный артрит, синдром Шегрена, височный артериит, васкулит и гранулематоз Вегенера.

[0029] Настоящее изобретение также предлагает применение антитела (антител) или его функционального фрагмента (их функциональных фрагментов) в соответствии с настоящим изобретением, нуклеиновой кислоты, экспрессионного вектора, клетки-хозяина, иммуноконъюгата или фармацевтической композиции в получении лекарственных средств для лечения заболеваний или состояний.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ РЯДА ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

[0030] На фигуре 1 изображено разделение по массе белка внеклеточного структурного участка PD-1, полученного от человека (hu) и Macaca fascicularis (макака-крабоеда) (cyno), проведенное с помощью SDS-PAGE (электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии натрия додецилсульфата).

[0031] На фигуре 2 изображено связывание меченного биотином rh-PD-L1 и Т-клеток человека, измеренное с помощью проточной цитометрии.

[0032] На фигуре 3 показано, что контрольный PD-L1, клоны 1, 10, 11, 55 и 64 блокируют связывание между PD-1 с лигандом PD-L1 на поверхности клеток, что измерено с помощью проточной цитометрии.

[0033] На фигуре 4 показано связывание контрольного антитела, клонов 1, 10, 11, 55 и 64 с PD-1, а также других членов семейства CD28 (ICOS, CTLA-4 и CD28).

[0034] На фигуре 5 изображен эксперимент со стимуляцией столбнячным токсином для измерения стимуляции химерными антителами Т-клеток in vitro.

[0035] На фигуре 6 изображен уровень секреции IL2 клонами 38, 39, 41 и 48 (контроль (conIgG4)) гуманизированного антитела, измеренного с помощью набора реактивов для анализа секреции цитокинов клетками CD8+.

[0036] На фигуре 7 изображено значение флуоресценции GFP, полученное после совместного культивирования дендритных клеток и модифицированных клеток MD-МАВ-453 в течение 3 дней и последующего добавления извлеченных Т-клеток и клонов 38, 39, 41 и 48 (контроль (conIgG4)) гуманизированного антитела к PD-1 в соответствии с настоящим изобретением для совместного культивирования в течение 3 дней.

[0037] На фигуре 8 изображено связывание гуманизированного антитела согласно настоящему изобретению с белками PD-1, полученными от человека, Macaca fascicularis и мыши.

[0038] На фигуре 9 изображено сравнение между последовательностями PD-1 человека, Macaca fascicularis (сyno) и мыши, где основные отличающиеся участки мышиного белка PD-1 и белка человека/PD-1 Macaca fascicularis обведены прямоугольной рамкой.

[0039] На фигуре 10 изображен результат эксперимента пролиферации Т-клеток, стимулированных in vitro гуманизированным антителом - эксперимента с анамнестической реакцией на антиген столбняка.

[0040] На фигуре 11 изображен результат эксперимента пролиферации Т-клеток, стимулированных in vitro гуманизированным антителом - эксперимента с анамнестической реакцией на антиген в виде вирусных полипептидов.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0041] Если не указано иное, все технические термины, используемые в этом патенте, имеют те же значения, понятные обычному специалисту в данной области. Что касается определений и терминов из уровня техники, в частности, специалисты могут обратиться к литературному источнику Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel). При сокращении названий аминокислотных остатков используется форма стандартного кода, состоящего из 3 букв и/или 1 буквы, применяемого в данной области для каждой из 20 обще используемых L-аминокислот.

[0042] Настоящее изобретение обеспечивает антитело (антитела) к PD-1 и его функциональный фрагмент (их функциональные фрагменты), которые могут связываться с белком программируемой смерти клеток (PD -1). Антитело (антитела) и его функциональный фрагмент (их функциональные фрагменты) в соответствии с настоящим изобретением характеризуются по меньшей мере одним из следующих признаков: способны блокировать взаимодействие между PD-1 и PD-L1 с высокой аффинностью или способны связываться с PD-1 с высокой специфичностью, но не с другими членами семейства CD28 (например, ICOS, CTLA-4 и CD28), или активировать опухолеспецифические Т-клетки для уничтожения опухолевых клеток, и активируют CD8+ для проникновения в ткань солидной опухоли в такой степени, чтобы в значительной мере увеличить уровни иммунных эффекторов, таких как IFNγ.

[0043] Настоящее изобретение также обеспечивает гуманизированное антитело (антитела) к PD-1 и его функциональный фрагмент (их функциональные фрагменты). Указанное гуманизированное антитело (гуманизированные антитела) получают путем использования методики компьютерного моделирования мышиного антитела, полученного от иммунизированной мыши, в сочетании с технологией бактериофагового дисплея. Его эпитопы связывания также определены на основе его характеристик связывания с белками PD-1 различных видов. Кроме благоприятных характеристик антитела (антител) к PD-1 и его функционального фрагмента (их функциональных фрагментов), описанных выше, указанное гуманизированное антитело (гуманизированные антитела) к PD-1 и его функциональный фрагмент (их функциональные фрагменты) в соответствии с настоящим изобретением также связывается с белками PD-1 человека или Macaca fascicularis с высокой аффинностью, но не взаимодействует с полученным от мыши белком PD-1.

[0044] Исходя из незначительного влияния на активность антитела, специалисты в данной области могут заменить, добавить и/или удалить одну или более (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10 или более) аминокислот в последовательности в соответствии с настоящим изобретением таким образом, чтобы получить вариант (варианты) последовательности указанного антитела (антител) или его функционального фрагмента (их функциональных фрагментов). Все они считаются включенными в объем охраны, предоставляемой настоящим изобретением. Например, аминокислота (аминокислоты) в вариабельном участке может быть заменена аминокислотами с аналогичными характеристиками. Последовательность указанного варианта в соответствии с настоящим изобретением может характеризоваться идентичностью с ее исходной последовательностью, составляющей по меньшей 95%, 96%, 97%, 98% или 99%. Идентичность указанной последовательности, описанная в настоящем изобретении, может быть измерена с помощью программного обеспечения для анализа последовательностей, например, компьютерной программы BLAST с использованием параметра по умолчанию, в особенности BLASTP или TBLASTN.

[0045] Антитело в соответствии с настоящим изобретением может быть антителом полной длины (например, антитела IgG1 или IgG4) или содержать часть, которая связывается с антигеном (например, фрагменты Fab, F(ab')2 или scFv), или может быть модифицировано для влияния на его функцию. Настоящее изобретение предусматривает антитело (антитела) к PD-1, содержащее модифицированный паттерн гликозилирования. В ряде применений может быть целесообразным проведение модификации для удаления нежелательного сайта (сайтов) гликозилирования или избежать присоединения части фукозы на олигосахаридную цепь, например, чтобы повысить функцию антитела в антителозависимой клеточноопосредованной цитотоксичности (ADCC). В некоторых других применениях модификация путем галактозилирования может быть проведена, чтобы изменить комплементзависимую цитотоксичность (CDC).

[0046] Используемый в данном патенте термин ”функциональный фрагмент” относится, в частности, к фрагменту (фрагментам) антитела, таким как Fv, scFv (”sc” означает однонитевой), фрагменты Fab, F(ab')2, Fab', scFv-Fc или диатело, или какой-либо фрагмент, время полужизни которого должно быть по возможности увеличено путем химической модификации или введения в липосомы, при этом указанная химическая модификация представляет собой, например, добавление полиалкиленгликоля, такого как полиэтиленгликоль (“пегилирование, ПЭГилированный”) (далее именуемый как пегилированный фрагмент, такой как Fv-PEG, scFv-PEG, Fab-PEG, F(ab')2-PEG или Fab'-PEG) (“ПЭГ” представляет собой полиалкиленгликоль), и указанный фрагмент обладает EGFR-связывающей активностью. Предпочтительно указанные функциональные фрагменты cодержат неполную последовательность тяжелой или легкой цепи их исходного антитела (исходных антител). Указанная неполная последовательность является достаточной для поддержания специфичности связывания и достаточной аффинности, аналогичных ее исходному антителу. Что касается PD-1, то предпочтительной является аффинность, составляющая по меньшей мере 1/100 его исходного антитела, и более предпочтительно по меньшей мере 1/10. Такой тип функционального фрагмента (функциональных фрагментов) включает по меньшей мере 5 аминокислот, а предпочтительно 10, 15, 25, 50 и 100 последовательных аминокислот из последовательности его исходного антитела.

[0047] Специалисты в данной области могут клонировать молекулу (молекулы) ДНК, кодирующую указанное антитело к PD-1 в соответствии с настоящим изобретением, в вектор, а затем трансформировать вектором клетку-хозяин. Таким образом, настоящее изобретение может также обеспечивать тип вектора на основе рекомбинантной ДНК, который содержит молекулу (молекулы) ДНК, кодирующую указанное антитело (указанные антитела) к PD-1 в соответствии с настоящим изобретением.

[0048] Предпочтительно указанный вектор на основе рекомбинантной ДНК является типом экспрессионного вектора. Специалисты в данной области могут клонировать молекулу (молекулы) ДНК указанного антитела в экспрессионный вектор и трансформировать вектором клетку-хозяина для получения антитела посредством индуцирования экспрессии. Экспрессионный вектор согласно настоящему изобретению содержит последовательность (последовательности) ДНК, кодирующую вариабельный участок тяжелой цепи, вариабельный участок легкой цепи и/или константный участок антитела (антител) к PD-1. Тем не менее, два типа экспрессионных векторов могут быть созданы отдельно. Один содержит вариабельный участок тяжелой цепи и константный участок, а другой вариабельный участок легкой цепи и константный участок. Они вместе трансфицируют клетки млекопитающих. В одном предпочтительном варианте осуществления указанный экспрессионный вектор дополнительно содержит промотор и последовательность (последовательности) ДНК, кодирующую секретируемые сигнальные пептиды, а также по меньшей мере один тип устойчивого к лекарственным средствам гена, используемого для скрининга.

[0049] Указанная клетка-хозяин (клетки-хозяева) в соответствии с настоящим изобретением может быть прокариотической клеткой-хозяином, эукариотической клеткой-хозяином или бактериофагом. Указанная прокариотическая клетка-хозяин может представлять собой кишечную палочку, сенную палочку, стрептомицеты или протей мирабилис и т.д. Указанная эукариотическая клетка-хозяин может представлять собой грибы, такие как Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae, делящиеся дрожжи и Trichoderma, клетки насекомых, таких как Spodoptera frugiperda, клетки растений, таких как табак, клетки млекопитающих, такие как клетки ВНК, СНО, COS и миеломные клетки. В некоторых вариантах осуществления указанные клетки-хозяева в соответствии с настоящим изобретением представляют собой предпочтительно клетки млекопитающих, и более предпочтительно клетки ВНК, СНО, NSO или COS.

[0050] Термин “фармацевтическая композиция”, который используется в данном патенте, относится к комбинации по меньшей мере одного вида лекарственного средства и случайно выбранных фармацевтических носителей или вспомогательных веществ для специальных целей. В некоторых вариантах осуществления указанная фармацевтическая композиция (фармацевтические композиции) включает в себя комбинации, которые разделены во времени и/или пространстве, при условии, что они могут функционировать синергетически, чтобы выполнить цели настоящего изобретения. Например, ингредиенты, содержащиеся в указанной фармацевтической композиции (например, антитело, молекула нуклеиновой кислоты, комбинация и/или конъюгат молекулы нуклеиновой кислоты), могут быть введены пациенту вместе или по отдельности. В случае если ингредиенты, содержащиеся в указанной фармацевтической композиции, вводят пациенту отдельно, они могут быть использованы одновременно или поочередно. Предпочтительно указанный фармацевтически носитель (фармацевтические носители) представляют собой воду, буферный водный раствор, изотонические солевые растворы, такие как PBS (фосфатный буфер), глюкозу, маннит, декстрозу, лактозу, крахмал, стеарат магния, целлюлозу, карбонат магния, 0,3% глицерин, гиалуроновую кислоту, этанол или полиалкиленгликоли, такие как полипропиленгликоль, триглицериды и т.д. Тип используемого фармацевтического носителя зависит от того, составляется ли композиция в соответствии с настоящим изобретением для перорального, интраназального, внутрикожного, подкожного, внутримышечного или внутривенного введения. Композиция согласно настоящему изобретению может содержать увлажняющее средство (увлажняющие средства), эмульгатор (эмульгаторы) или буферный раствор (буферные растворы) в качестве добавки.

[0051] Фармацевтическая композиция в соответствии с настоящим изобретением может быть введена посредством любого соответствующего пути введения, например, перорально, интраназально, внутрикожно, подкожно, внутримышечно или внутривенно.

[0052] В одном соответствующем аспекте настоящее изобретение обеспечивает фармацевтическую композицию в сочетании с антителом к PD-1 и вторым терапевтическим средством. В одном варианте осуществления указанное второе терапевтическое средство представляет собой любое средство, являющееся предпочтительным для сочетания с антителом к PD-1. Пример такого средства, предпочтительного для сочетания с антителом к PD-1, включает без ограничения другие средства для ингибирования активности PD-1, в том числе фрагмент (фрагменты), пептидный ингибитор, низкомолекулярные антагонисты и т.д., которые связываются с другим антителом (другими антителами) или антигеном (антигенами), и/или средства, препятствующие трансдукции восходящих или нисходящих сигналов PD-1.

[0053] Термины “профилактика или лечение заболеваний или состояний путем устранения, подавления или снижения активности PD-1” указывают на заболевания или состояний, вызванные экспрессированием PD-1, или заболевания или состояния с симптомами/признаками экспрессирования PD-1. В некоторых вариантах осуществления указанные заболевания или состояния выбраны из видов рака или инфекционных заболеваний. Указанные виды рака включают без ограничения рак легкого, рак печени, рак яичника, рак шейки матки, рак кожи, рак мочевого пузыря, рак толстого кишечника, рак молочной железы, глиому, рак почки, рак желудка, рак пищевода, плоскоклеточную карциному полости рта, рак головы/шеи. Указанные инфекционные заболевания включают без ограничения ВИЧ-инфекцию и инфекцию, вызванную вирусом гепатита В.

[0054] Термин “эффективная лечебная доза”, который используется в данном патенте, относится к дозе, достаточной для того, чтобы показать эффективность при целевом применении. Фактически введенная доза, скорость и продолжительность введения могут зависеть от условий и степени воздействия лечения на мишень. Назначение лечения (например, определение дозы) является обязанностью врача-терапевта и других врачей в соответствии с их решениями. Обычно учитываются такие факторы, как заболевание, которое подлежит лечению, состояние каждого пациента, участок введения, способ введения и другие факторы, известные врачу.

[0055] Термин ”cубъект”, который используется в данном патенте, относится к млекопитающим, таким как человек или другие животные, например, дикие животные (цапля, аист, журавль и т.д.), сельскохозяйственные животные (утка, гусь и т.д.) или лабораторные животные (орангутанг, обезьяны, крыса, мышь, кролик, морская свинка и т.д.).

[0056] Следующие варианты осуществления приведены для демонстрации и дополнительного пояснения некоторых предпочтительных форм осуществления и факторов в соответствии с настоящим изобретением. Тем не менее, они не должны истолковываться как ограничивающие объем настоящего изобретения.

Варианты осуществления

Вариант осуществления 1: клонирование внеклеточного структурного участка PD1 человека в экспрессионную эукариотическую плазмиду.

[0057] Экстрагировали общую РНК из человеческих клеток периферической крови (Центр крови Красного креста в Пекине) с помощью набора для экстрагирования РНК Trizol RNA extraction kit (Invitrogen) и получали кДНК с помощью набора для обратной транскрипции от компании Invitrogen. Используя данную кДНК в качестве матрицы, прямой праймер, представляющий собой 5'-GTACGCTAGCCACCATGCAGATCCCACAGGC-'3 (SEQ ID NО. 31), и обратный праймер, представляющий собой 5’-GATCCTCGAGCCACCAGGGTTTGGAACTG-'3 (SEQ ID NО. 32), с помощью ПЦР амплифицировали внеклеточный фрагмент PD1. После того, как амплифицированный продукт расщепляли с помощью Nhe I и Xho I, их клонировали в систему на основе экспрессионной эукариотической плазмиды pCDNA3.1. Трансфицировали клетки 293Т (АТСС) с помощью этой плазмиды в течение 3 дней, а затем отбирали культуральный супернатант для очистки h-PD1. Аналогичным образом также экстрагировали общую РНК из клеток периферической крови Macaca fascicularis и клонировали полученную кДНК в систему эукариотической экспрессии.

[0058] Как показано на фигуре 1, по причине модификации, такой как гликозилирование, разделение по массе белка внеклеточных структурных участков PD-1, полученных от человека (hu), и Macaca fascicularis (cyno) PD-1 составляют приблизительно 50 тыс. дальтон после окрашивания Кумасси синим.

Вариант осуществления 2: анализ связывания PD-1 на клетках с лигандом PD-L1

1. Отделение Т-клеток от клеток периферической крови человека

[0059] Когда суспензия клеток периферической крови (Пекинский институт крови) проходит через колонку с нейлоновым волокном (Beijing Hede Biotechnology Company), то В-клетки, плазматические клетки, мононуклеары и некоторые вспомогательные клетки будут избирательно адгезироваться на нейлоновых волокнах, однако, большинство Т-клеток проходят через колонку с нейлоновым волокном и, таким образом, получают обогащенную популяцию Т-клеток. Эту процедуру проводят следующим образом: возьмите стеклянный шприц объемом 50 мл, вытащите поршень и прикрепите резиновую трубку к наконечнику шприца. Свяжите несколько нейлоновых волокон и вставьте их в шприц. Закрепите шприц на подставке и залейте cреду RPMI для культивирования клеток при температуре 37°C для предварительной обработки нейлоновых волокон. Закройте клапан, а затем откройте клапан через 0,5 часа, чтобы спустить культуральную жидкость. Разведите клеточную суспензию, которая подлежит разделению, с помощью предварительно нагретой среды для культивирования RPMI до соответствующей концентрации примерно 5,00×107 клеток/мл. Налейте клеточную суспензию в шприц и погрузите в воду колонку с нейлоновым волокном. Накройте шприц и инкубируйте в термостате при температуре 37°C в течение 1 часа. Откройте нижнее отверстие, медленно выпустите жидкость (1 капля/мин.) и соберите ее в центрифужную пробирку. Центрифугируйте при 1000 × g в течение 10 минут, чтобы получить желаемые Т-лимфоциты.

2. Мечение рекомбинантного белка RH-PD-L1 биотином

[0060] Смешайте 100 мкг рекомбинантного белка rh-PD-L1, приобретенного у компании Beijing Sino Biological Inc., с биотином - аминокапроновой кислотой - NHS (Thermo), растворенным в ДМСО при молярном соотношении 1:4, и оставьте его при комнатной температуре на 1 час. Затем пропустите реакционную смесь через колонку с гелем G25 (Thermo), чтобы отделить меченный биотином rh-PD-L1 и свободный биотин.

3. Связывание меченого биотином rh-PD-L1 с Т-клетками человека

[0061] Смешайте рекомбинантный белок rh-PD-L1, меченый биотином в разных концентрациях, и выделенные Т-клетки в количестве 105, а затем инкубируйте их при температуре 4°C в течение 15 минут. Промойте их три раза PBS, а затем добавьте стрептавидин - аллофикоцианин (Thermo) (SA-APC) до 0,2 мкг/мл и инкубируйте их при температуре 4°C в течение 20 минут. Промойте их три раза c использованием PBS и поместите в систему для проточной цитометрии Beckman Dickson Calibur и проведите измерения при 660 нм. Как показано на фигуре 2, результаты демонстрируют, что белок PD-L1, меченый биотином, может связываться с Т-клетками.

Вариант осуществления 3: получение антитела к rh-PD-1

1. Иммунизация животных

[0062] Смешайте 10 мкг рекомбинантного белка rh-PD-1 в количестве 1 мг/мл в качестве антигена и аналогичные иммуностимуляторы (адъюванта Фрейнда (Sigma-Aldrich)) и выберите трех мышей-самок FVB в возрасте 6 недель, чтобы провести подкожную иммунизацию. После первой иммунизации аналогичную дозу вводят один раз в неделю для усиления иммунизации.

2. Слияние клеток

[0063] После последнего введения с целью усиления иммунизации, у мышей отберите лимфатические узлы у основания бедра и измельчите их в изотоническом солевом растворе. Затем возьмите суспензию, обогащенную В-клетками, и смешайте с клетками SP2/0 посредством стандартной методики электрофоретического переноса (см. руководство к BTX). Поместите слитые клетки в цельную культуральную среду RPMI-1640, содержащую HAT (Sigma) для культивирования при условиях 5% CO2 и температуре 37°С.

Вариант осуществления 4: эксперимент с блокированием лиганда и рецептора

[0064] Используя реакцию ферментного мечения (Elisa), из 20000 типов моноклональных клеток гибридомы отобрали клоны 1220 типов секретируемых антител, которые могут связываться с белками PD-1. Среди этих 1220 типов антител существует пять типов, которые могут в разной степени ингибировать связывание меченого биотином PD-L1 и рецептора PD-1 на Т-клетках.

[0065] Инкубируйте смесь из пяти антител (1 мкг/мл), как указано выше, и 312 нг/мл меченых биотином rh-PD-L1 (концентрация) при комнатной температуре в течение 20 минут. Затем инкубируйте смесь и отделенные Т-клетки при температуре 4°C в течение 15 минут. Затем три раза промойте изотоническим солевым раствором и добавьте 0,2 мкг/мл SA-APC для инкубирования при температуре 4°C в течение 15 минут. После трехкратной промывки изотоническим солевым раствором проведите измерение образца с помощью проточного цитометра BD, чтобы убедиться в том, что он способен ингибировать связывание rh-PD-L1 с рецептором PD-1 на поверхности Т-клеток.

[0066] Как показано на фигуре 3, клоны 1, 10 и 11 могут блокировать связывание PD-1 с лигандом PD-L1 на поверхности клетки. Однако клоны 55 и 64 способны только к слабому ингибированию.

Вариант осуществления 5: связывание с другими членами семейства CD28

[0067] В целях дальнейшего тестирования специфичности связывания клонов 1, 10, 11, 55 и 64 с антителами-кандидатами поместите 1 мкг/мл rh-PD-1 или белка ICOS , CTLA-4 и CD28 (R&D System) других членов семейства CD28 в буферном растворе в 96-луночный планшет для ферментного мечения, покрытый 0,05 М карбоната PH9, и храните при температуре 4°C в течение ночи. На следующий день удалите из лунок раствор и промойте продукт три раза отмывочным буфером (PBS + 0,5% твин). Затем добавьте раствор PBS, содержащий 3% бычьего сывороточного альбумина, и блокируйте в течение 20 минут. Промойте три раза отмывочным буфером, а затем добавьте 100 мкл 1 мкг/мл антитела-кандидата, инкубируйте при комнатной температуре в течение 1 часа, а затем промойте три раза отмывочным буфером. Затем разбавьте козье антитело к иммуноглобулину мыши, конъюгированное с пероксидазой хрена (Jackson ImmunoResearch), в соотношении 1:10000 с отмывочным буфером и инкубируйте при комнатной температуре в течение 1 часа. После трехкратной промывки отмывочным буфером добавьте 50 мкл раствора субстрата TMB (тетраметилбензидина), для окрашивания. После реакции при комнатной температуре в течение 10 минут завершите реакцию, добавив 25 мкл 0,5 М раствора серной кислоты, и проведите считывание поглощения при 450 нм.

[0068] Как показано на фигуре 4, все тестированные антитела-кандидаты способны распознавать rh-PD-1 и связываться с ним, однако не распознают других членов семейства CD28.

Вариант осуществления 6: последовательность вариабельного участка антитела-кандидата

[0069] Культивируйте клетки гибридомы кандидата до общей численности 107, центрифугируйте их при 1000 об/мин в течение 10 минут, чтобы собрать клетки и экстрагировать общую РНК с помощью набора Trizol reagent kit (Invitrogen). Используйте указанную РНК в качестве матрицы для синтеза первой цепи кДНК (Qiagen), а затем используйте первую цепь кДНК в качестве последующей матрицы для амплификации последовательности ДНК вариабельного участка, соответствующего клеткам гибридомы. Последовательность праймера, который используется в реакции амплификации, является комплементарной первому каркасному участку и константному участку или вариабельному участку антитела (Larrick, J.W., et al., (1990) Scand. J. Immunol., 32, 121-128 and Coloma, J. J. et al., (1991) BioTechniques, 11,152-156 et al.). В реакционную систему 50 мкл добавьте отдельно 1 мкл кДНК, 5 мкл 10 × буфера для ПЦР, по 1 мкл (25 пмолей) каждого из прямого и обратного праймеров, 1 мкл дНТФ, 1 мкл 25 ммолей/л MgCl2, 39 мкл Н2О, проводите начальную денатурацию при температуре 95°C в течение 10 минут. Добавьте 1 мкл фермента Taq (Invitrogen) и запустите температурные циклы, чтобы провести ПЦР-амплификацию. Условия реакции следующие: денатурация при температуре 94°C в течение 1 минуты, отжиг при температуре 58°C в течение 1 минуты, и удлинение при температуре 72°C в течение 115 минут. Повторяйте такой цикл 30 раз, а затем оставьте при температуре 72°C на 10 минут.

[0065] После секвенирования амплифицированного продукта последовательности вариабельных участков тяжелой и легкой цепей клона 1, 10 и 11 гибридомы получают следующим образом:

Клон 1:

тяжелая цепь

,

последовательность нуклеиновой кислоты

,

легкая цепь

,

последовательность нуклеиновой кислоты

.

Клон 10:

тяжелая цепь

,

последовательность нуклеиновой кислоты

,

легкая цепь

,

последовательность нуклеиновой кислоты

.

Клон 11:

тяжелая цепь

,

последовательность нуклеиновой кислоты

,

легкая цепь

,

последовательность нуклеиновой кислоты

.

Вариант осуществления 7: конструирование экспрессионного вектора для химерного антитела

[0071] Клонируйте фрагмент Fc константного участка тяжелой цепи и константного участка k/J легкой цепи из клеток крови человека (Пекинский институт крови) и объедините их в плазмиде pCDNA3.1 (см. Walls MA, Hsiao H and Harris LJ (1993), Nucleic Acids Research, Vol. 21, No. 12 2921-2929) с целью модификации. Указанные фрагменты последовательности тяжелой и легкой цепей в варианте осуществления 6 синтезированы компанией GenScript. После расщепления тяжелой цепи ферментами Xho I и Age I и расщепления легкой цепи ферментами Sma I и Dra III, их связывают в плазмидe pCDNA3.1, модифицированную соответствующим образом, и секвенируют для подтверждения последовательности клонированной ДНК. Последующие экспериментальные материалы получены посредством трансфицирования клеток этой группой плазмид с последующей очисткой.

Вариант осуществления 8: функциональный эксперимент in vitro со стимулированием Т-клеток химерным антителом - тест со стимуляцией столбнячным токсином

[0072] Высейте свежеполученные PBMC в 96-луночный планшет с плоским дном у лунок. После инкубации в течение ночи добавляйте различные концентрации антител и 100 нг/мл столбнячного токсина (ТТ) (List Biological Laboratories). Три дня спустя соберите супернатант. Используйте набор INFNγ от компании R&D System для измерения содержания IFNγ в супернатанте посредством ELISA (твердофазного иммуноферментного анализа). Как показано на фигуре 5, после блокировки сигнала PD-1 количество цитокина, секретируемого иммунными клетками, активированными посредством стимуляции c использованием TT, значительно возрастает. Кроме того, титр антитела-кандидата превышает титра антитела из клона EH12.2H7, приобретенного у компании Biolegend, в заявке на патент 200980147059.0.

Вариант осуществления 9: взаимодействие различных антител с PD-1 после обмена тяжелыми и легкими цепями

[0073] Проведите рекомбинацию легких и тяжелых цепей антител 1 и 10, соответственно, чтобы получить H1L10 (тяжелую цепь 1, легкую цепь 10) и H10L1 (тяжелую цепь 10, легкую цепь 1). Аналогично тому, как описано в варианте осуществления 7, мы получаем рекомбинантные антитела. Эти антитела, исходное антитело 1 (тяжелая цепь 1, легкая цепь 1) и исходное антитело 10 (тяжелая цепь 10, легкая цепь 10), тестировали с результатами при помощи методики Elisa c получением результатом EC50 следующим образом:

Образец H1L1 H10L10 H1L10 H10L1
EC50 (пкM) 338,1 426,3 270,1 528,1

[0074] Согласно результатам антитела, продуцируемые после рекомбинации, могут по-прежнему эффективно связываться с белком PD-1.

Вариант осуществления 10: модификация антитела посредством гуманизации

[0075] Модификацию посредством гуманизации проводят в соответствии с последовательностью вариабельного участка антитела, секретируемого клеткой гибридомы, полученной, как описано выше. Вкратце, процесс модификации посредством гуманизации включает следующие этапы: A - сравнение последовательности генов антител, секретируемых разными клетками гибридомы, с последовательностью гена антитела зародышевой линии, для выявления последовательности с высокой гомологией; В - анализ и испытание сродства HLA-DR, чтобы выбрать последовательность каркасного участка зародышевой линии с низкой аффинностью; С - использование компьютерной аналоговой технологии для применения молекулярного докинга с тем, чтобы проанализировать последовательности каркасных участков в вариабельном участке и окружающей среде, и изучить их стереорежим связывания в пространстве. Рассчитывают электростатическую силу, силы Ван-дер-Ваальса, гидрофобность, гидрофильность и величину энтропии для анализа основной отдельной аминокислоты (отдельных аминокислот) в последовательностях генов антител, секретируемых различными клетками гибридомы, которые могут воздействовать с PD-1 и поддерживать пространственную конфигурацию, обратный перенос к выбранному гену каркасного участка зародышевой линии, а затем на основе этого мечение аминокислотных сайтов в каркасном участке, которые должны быть зарезервированы, синтезирование случайных праймеров, создание собственной фаговой библиотеки, скринирование библиотеки гуманизированных антител (Pini, A. et al., (1998 г.) Design and Use of a Phage Display Library: HUMAN ANTIBODIES WITH SUBNANOMOLAR AFFINITY AGAINST A MARKER OF ANGIOGENESIS ELUTED FROM A TWO-DIMENSIONAL GEL., Journal of Biological Chemistry, 273(34): 21769-21776). Исходя из этого, мы получаем следующие различные гуманизированные антитела. Они включают в себя следующие клоны, в которых идентичны последовательности легкой цепи клонов 38, 39 и 41 и последовательности тяжелой цепи клонов 39 и 48.

Тяжелая цепь клона 38

.

Легкая цепь клона 38

.

Тяжелая цепь клона 39

.

Легкая цепь клона 39

.

Тяжелая цепь клона 41

.

Легкая цепь клона 41

.

Тяжелая цепь клона 48

.

Легкая цепь клона 48

.

Вариант осуществления 11: стимуляция гуманизированным антителом функции Т-клеток in vitro

[0076] Высейте свежеполученные PBMC (Beijing Blood Institute) в 96-луночный планшет с плоским дном у лунок. После инкубации в течение ночи добавьте 10 мкг/мл антитела и 100 нг/мл столбнячного токсина (ТТ). После культивирования в течение 3 дней соберите супернатант и измерьте уровень секреции IL2 клона 38, 39, 41 и 48 (контроль (conIgG4)) гуманизированных антител с помощью системы Luminex от компании Life Technology и набора для анализа секреции цитокинов клетками CD8+ от компании EMD. Согласно результату (см. фигуру 6) все гуманизированные антитела могут стимулировать функцию Т-клеток.

Вариант осуществления 12: гуманизированное антитело может стимулировать Т-клетки in vitro для уничтожения опухолевых клеток

[0077] Используйте лентивирусы (Qiagen), экспрессирующее белок PD-L1, для инфицирования клеток MD-МАВ-453, чтобы получить линию клеток MD-MAB-453, стабильно экспрессирующих PD-L1. Затем индуцируйте гены GFP, чтобы позволить им стабильно экспрессировать белок GFP. Извлеките дендритные клетки (DC) из свежих клеток периферической крови человека. Культивируйте их в количестве 300 клеток/лунка и указанные модифицированные клетки MD-МАВ-453 (300 клеток/лунка) в 96-луночном планшете вместе в течение трех дней. Затем добавьте извлеченные Т-клетки (1000 клеток/лунка) и 10 мкг/мл клона 38, 39, 41 и 48 (контроль (conIgG4)) гуманизированного антитела к PD-1 до их последующего культивирования вместе в течение 3 дней и считывания значения флуоресценции GFP. Результат (см. фигуру 7) показывает, что все гуманизированные антитела могут стимулировать уничтожение опухолевых клеток Т-клетками.

Вариант осуществления 13: связывание гуманизированных антител с белками PD-1 различных видов

[0078] Разведите, соответственно, 1 мкг/мл указанного PD-1, полученного от человека, PD-1 от Macaca fascicularis и PD-1, полученного от мыши (приобретено у компании Sinobiological) в буферном растворе в планшете, лунки которого покрыты 0,05 М карбоната с PH9, и оставьте на ночь при температуре 4°C. На следующий день удалите раствор из лунок и промойте продукт три раза отмывочным буфером. Затем добавьте раствор PBS, содержащий 3% бычьего сывороточного альбумина, и блокируйте его в течение 20 минут. Затем промойте три раза отмывочным буфером, прежде чем добавить 100 мкл различных концентраций антител-кандидатов после разбавления. Инкубируйте при комнатной температуре в течение 1 часа, а затем промойте три раза отмывочным буфером. Затем разведите козье антитело к иммуноглобулину человека, конъюгированное с пероксидазой хрена (Jackson ImmunoResearch), в соотношении 1:10000 с отмывочным буфером и инкубируйте при комнатной температуре в течение 1 часа. После трехкратной промывки отмывочным буфером добавьте 50 мкл раствора субстрата TMB, чтобы придать окраску. После реакции при комнатной температуре в течение 10 минут становите реакцию, добавив 25 мкл 0,5 М раствора серной кислоты, и проведите считывание поглощения при 450 нм. Результаты (фигура 8А, В и С) показывают, что все клоны связываются с PD-1 человека или Macaca fascicularis с аналогичной аффинностью, несмотря на то, что все они не взаимодействуют с PD-1, полученным от мыши.

[0079] Сравнение последовательностей PD-1 человека, Macaca fascicularis и мыши (см. фигуру 9, на которой основные отличающиеся участки PD-1 мыши, человека/Macaca fascicularis обведены прямоугольной рамкой). Доказано экспериментально, что эпитоп антитела-кандидата к белку PD-1 существует в этих участках.

Вариант осуществления 14: эксперимент со стимуляцией in vitro гуманизированным антителом пролиферации Т-клеток - эксперимент с анамнестической реакцией на столбнячный антиген

[0080] Высейте свежеполученные РВМС (Beijing Blood Institute) в 96-луночный планшет с плоским дном у лунок. После инкубации в течение ночи маркируйте их с использованием (CFSE) и добавьте 10 мкг/мл гуманизированного антитела (38, 39, 41 и 48) и 100 нг/мл столбнячного токсина (ТТ) (List Biological Laboratories). Проведите количественный анализ пролиферации Т-клеток на 6-й, 8-й и 10-й день с помощью проточной цитометрии (сортировки клеток с активированной флуоресценцией - FACS) через коэффициент разбавления CSFE. Как показано в результате на фигуре 10, по сравнению с контрольным IgG, иммуноциты, активированные стимуляцией TT, индуцированной посредством блокирования сигнала PD-1, находятся на этапе дальнейшего деления и пролиферации.

Вариант осуществления 15: эксперимент со стимуляцией in vitro гуманизированным антителом пролиферации Т-клеток - эксперимент с анамнестической реакцией на вирусные полипептиды

[0081] Высейте свежеполученные РВМС (Пекинский институт крови) в 96-луночный планшет с плоским дном у лунок. После инкубации в течение ночи маркируйте их с помощью CFSE. Добавьте 10 мг/мл гуманизированного антитела (38, 39, 41 и 48) и 1 мкг/мл смеси пептидов CEF (СMV, EBV и грипп). Проведите количественный анализ пролиферации Т-клеток на 6-й, 8-й и 10-й день с помощью проточной цитометрии (FACS) через коэффициент разбавления CSFE. Как показано в результате на фигуре 11, по сравнению с контрольным IgG, иммуноциты, активированные путем стимуляции смесью пептидов CEF, индуцированной посредством блокирования сигнала PD-1, находятся на этапе дальнейшего деления и пролиферации.

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> ШАНХАЙ ЦЗЮНЬШИ БИОСАЙЕНСИЗ ИНК., ЦЗЮНЬМЭН БИОСАЙЕНСИЗ КО., ЛТД

<120> АНТИТЕЛО К PD-1 И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ

<130> 2013-06-26

<160> 42

<170> PatentIn версии 3.3

<210> 1

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> CDR1 тяжелой цепи клона 1

<400> 1

Asp Tyr Glu Met His

1 5

<210> 2

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> CDR2 тяжелой цепи клона 1

<400> 2

Val Ile Glu Ser Glu Thr Gly Gly Thr Ala Tyr Asn Gln Lys Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 3

<211> 16

<212> БЕЛОК

<213> CDR3 тяжелой цепи клона 1

<400> 3

Glu Gly Ile Thr Thr Val Ala Thr Thr Tyr Tyr Trp Tyr Phe Asp Val

1 5 10 15

<210> 4

<211> 16

<212> БЕЛОК

<213> CDR1 легкой цепи клона 1

<400> 4

Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu

1 5 10 15

<210> 5

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> CDR2 легкой цепи клона 1

<400> 5

Lys Val Tyr Asn Arg Phe Ser

1 5

<210> 6

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> CDR3 легкой цепи клона 1

<400> 6

Phe Gln Gly Ser His Val Pro Phe Thr

1 5

<210> 7

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> CDR1 тяжелой цепи клона 10

<400> 7

Asp Tyr Glu Met His

1 5

<210> 8

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> CDR2 тяжелой цепи клона 10

<400> 8

Ala Ile Asp Pro Glu Thr Gly Gly Ala Ala Tyr Asn Gln Lys Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 9

<211> 16

<212> БЕЛОК

<213> CDR3 тяжелой цепи клона 10

<400> 9

Glu Gly Ile Thr Thr Ser Val Val Thr Tyr Tyr Trp Tyr Phe Asp Val

1 5 10 15

<210> 10

<211> 16

<212> БЕЛОК

<213> CDR1 легкой цепи клона 10

<400> 10

Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu

1 5 10 15

<210> 11

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> CDR2 легкой цепи клона 10

<400> 11

Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser

1 5

<210> 12

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> CDR3 легкой цепи клона 10

<400> 12

Phe Gln Gly Ser His Val Pro Leu Thr

1 5

<210> 13

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> CDR1 тяжелой цепи клона 11

<400> 13

Thr Phe Gly Met Gly Val Gly

1 5

<210> 14

<211> 16

<212> БЕЛОК

<213> CDR2 тяжелой цепи клона 11

<400> 14

His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro Ala Leu Lys Ser

1 5 10 15

<210> 15

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> CDR3 тяжелой цепи клона 11

<400> 15

Ile Glu Glu Arg Phe Arg Trp Tyr Phe Asp Val

1 5 10

<210> 16

<211> 14

<212> БЕЛОК

<213> CDR1 легкой цепи клона 11

<400> 16

Arg Ser Ser Thr Gly Ala Ile Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn

1 5 10

<210> 17

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> CDR2 легкой цепи клона 11

<400> 17

Gly Thr Asn Asn Arg Ala Pro

1 5

<210> 18

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> CDR3 легкой цепи клона 11

<400> 18

Ala Leu Trp Tyr Ser Asn His Trp Val

1 5

<210> 19

<211> 125

<212> БЕЛОК

<213> Вариабельный участок тяжелой цепи клона 1

<400> 19

Gln Gly Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Thr Leu Thr Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Glu Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Ile His Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Val Ile Glu Ser Glu Thr Gly Gly Thr Ala Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Lys Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Glu Gly Ile Thr Thr Val Ala Thr Thr Tyr Tyr Trp Tyr Phe

100 105 110

Asp Val Trp Gly Thr Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 20

<211> 112

<212> БЕЛОК

<213> Вариабельный участок легкой цепи клона 1

<400> 20

Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Glu Leu Leu Ile Tyr Lys Val Tyr Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly

85 90 95

Ser His Val Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 21

<211> 125

<212> БЕЛОК

<213> Вариабельный участок тяжелой цепи клона 10

<400> 21

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Glu Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Val His Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Ala Ile Asp Pro Glu Thr Gly Gly Ala Ala Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Ile Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Glu Gly Ile Thr Thr Ser Val Val Thr Tyr Tyr Trp Tyr Phe

100 105 110

Asp Val Trp Gly Thr Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 22

<211> 112

<212> БЕЛОК

<213> Вариабельный участок легкой цепи клона 10

<400> 22

Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Pro Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly

85 90 95

Ser His Val Pro Leu Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 23

<211> 121

<212> БЕЛОК

<213> Вариабельный участок тяжелой цепи клона 11

<400> 23

Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Phe

20 25 30

Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro Ala

50 55 60

Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asn Thr Ser Lys Asn Gln Val

65 70 75 80

Phe Leu Lys Ile Ala Asn Val Asp Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr

85 90 95

Cys Ala Arg Ile Glu Glu Arg Phe Arg Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly

100 105 110

Thr Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 24

<211> 109

<212> БЕЛОК

<213> Вариабельный участок легкой цепи клона 11

<400> 24

Arg Ala Gly Trp Thr Gln Glu Ser Ala Leu Thr Thr Ser Pro Gly Glu

1 5 10 15

Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Ile Thr Thr Ser

20 25 30

Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Asp His Leu Phe Thr Gly

35 40 45

Leu Ile Gly Gly Thr Asn Asn Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Leu Ile Gly Asp Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala

65 70 75 80

Gln Thr Glu Asp Glu Ala Ile Tyr Phe Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn

85 90 95

His Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105

<210> 25

<211> 375

<212> ДНК

<213> Вариабельный участок тяжелой цепи клона 1

<400> 25

cagggtcaac tgcagcagtc tggggctgag ctggtgaggc ctggggcttc agtgacgctg 60

acctgcaagg cttcgggcta cacatttact gactatgaaa tgcactgggt gaagcagaca 120

cctatacatg gcctggaatg gattggagtt attgaatctg aaactggtgg tactgcctac 180

aatcagaagt tcaagggcaa ggccaaactg actgcagaca aatcctccag cacagcctac 240

atggagctcc gcagcctgac atctgaggac tctgccgtct attactgtac aagagagggt 300

attactacgg tagcaactac gtactactgg tacttcgatg tctggggcac agggaccacg 360

gtcaccgtct cctca 375

<210> 26

<211> 336

<212> ДНК

<213> Вариабельный участок легкой цепи клона 1

<400> 26

gatgttttga tgacccagac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc 60

atctcttgca gatctagtca gagcattgta catagtaatg gaaacaccta tttagaatgg 120

tacctgcaga aaccaggcca gtctccagag ctcctgatct acaaagttta caaccgattt 180

tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc 240

agcagagtgg aggctgagga tctgggagtt tattactgct ttcaaggttc acatgttcca 300

ttcacgttcg gctcggggac aaagttggaa ataaaa 336

<210> 27

<211> 375

<212> ДНК

<213> Вариабельный участок тяжелой цепи клона 10

<400> 27

caggttcaac tgcagcagtc tggggctgag ctggtgaggc ctggggcttc agtgacgctg 60

tcctgcaagg cttcgggcta cacatttact gactatgaaa tgcactgggt gaagcagaca 120

cctgtgcatg gcctggaatg gattggagct attgatcctg aaactggtgg tgctgcctac 180

aatcagaagt tcaagggcaa ggccatactg actgcagaca aatcctccag cacagcctac 240

atggagctcc gcagcctgac atctgaggac tctgccgtct attactgtac aagagagggt 300

attactacgt cagtggttac gtactactgg tacttcgatg tctggggcac agggaccacg 360

gtcaccgtct cctca 375

<210> 28

<211> 336

<212> ДНК

<213> Вариабельный участок легкой цепи клона 10

<400> 28

gatgttttga tgacccaaac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc 60

atctcttgca gatctagtca gagcattgta catagtaatg gaaacaccta tttagaatgg 120

tacctgcaga aaccaggcca gtctccaaag ctcctgatct acaaagtttc caaccgattt 180

tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaggatc 240

agcagagtgg agcctgagga tctgggagtt tattactgct ttcaaggttc acatgttcca 300

ctcacgttcg gctcggggac aaagttggaa ataaaa 336

<210> 29

<211> 363

<212> ДНК

<213> Вариабельный участок тяжелой цепи клона 11

<400> 29

caggttactc tgaaagagtc tggccctggg atattgcagc cctcccagac cctcagtctg 60

acttgttctt tctctgggtt ttcactgagc acttttggta tgggtgtcgg ctggattcgt 120

cagccttcag ggaagggtct ggagtggctg gcacacattt ggtgggatga tgataagtac 180

tataatcccg ccctgaagag tcggctcaca atctccaaga atacctccaa aaaccaggta 240

ttcctcaaga tcgccaatgt ggacactgaa gatactgcca catactactg tgctcgaata 300

gaggagaggt tccgctggta cttcgatgtc tggggcacag ggaccacggt caccgtctcc 360

tca 363

<210> 30

<211> 327

<212> ДНК

<213> Вариабельный участок легкой цепи клона 11

<400> 30

agggctggtt ggactcagga atctgcactc accacatcac ctggtgaaac agtcacactc 60

acttgtcgct caagtactgg ggctattaca actagtaact atgccaactg ggtccaagaa 120

aaaccagatc atttattcac tggtctaata ggtggtacca acaaccgagc tccaggtgtt 180

cctgccagat tctcaggctc cctgattgga gacaaggctg ccctcaccat cacaggggca 240

cagactgagg atgaggcaat atatttctgt gctctatggt acagcaacca ctgggtgttc 300

ggtggaggaa ccaaactgac tgtccta 327

<210> 31

<211> 31

<212> ДНК

<213> Прямой праймер

<400> 31

gtacgctagc caccatgcag atcccacagg c 31

<210> 32

<211> 29

<212> ДНК

<213> Обратный праймер

<400> 32

gatcctcgag ccaccagggt ttggaactg 29

<210> 33

<211> 125

<212> БЕЛОК

<213> Вариабельный участок тяжелой цепи клона 38

<400> 33

Gln Gly Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Glu Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Ile His Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Val Ile Glu Ser Glu Thr Gly Gly Thr Ala Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Gly Ile Thr Thr Val Ala Thr Thr Tyr Tyr Trp Tyr Phe

100 105 110

Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 34

<211> 112

<212> БЕЛОК

<213> Вариабельный участок легкой цепи клона 38,39 и 41

<400> 34

Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly

85 90 95

Ser His Val Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 35

<211> 125

<212> БЕЛОК

<213> Вариабельный участок тяжелой цепи клона 39 и 48

<400> 35

Gln Gly Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Glu Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Val Ile Glu Ser Glu Thr Gly Gly Thr Ala Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Ala Lys Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Glu Gly Ile Thr Thr Val Ala Thr Thr Tyr Tyr Trp Tyr Phe

100 105 110

Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 36

<211> 125

<212> БЕЛОК

<213> Вариабельный участок тяжелой цепи клона 41

<400> 36

Gln Gly Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Glu Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Val Ile Glu Ser Glu Thr Gly Gly Thr Ala Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Glu Gly Ile Thr Thr Val Ala Thr Thr Tyr Tyr Trp Tyr Phe

100 105 110

Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 37

<211> 112

<212> БЕЛОК

<213> Вариабельный участок легкой цепи клона 48

<400> 37

Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly

85 90 95

Ser His Val Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 38

<211> 375

<212> ДНК

<213> Последовательность нуклеиновых кислот вариабельного участка тяжелой цепи клона 38

<400> 38

cagggccagc tggtgcagag cggcgccgag gtgaagaagc ccggcgccag cgtgaaggtg 60

agctgcaagg ccagcggcta caccttcacc gactacgaga tgcactgggt gagacaggcc 120

cccatccacg gcctggagtg gatcggcgtg atcgagagcg agaccggcgg caccgcctac 180

aaccagaagt tcaagggcag agtgaccatc accgccgaca agagcaccag caccgcctac 240

atggagctga gcagcctgag aagcgaggac accgccgtgt actactgcgc cagagagggc 300

atcaccaccg tggccaccac ctactactgg tacttcgacg tgtggggcca gggcaccacc 360

gtgaccgtga gcagc 375

<210> 39

<211> 336

<212> ДНК

<213> Последовательность нуклеиновых кислот вариабельного участка легкой цепи клона 38,39 и 41

<400> 39

gatgtggtga tgacccagag cccgctgagc ctgccggtga ccctgggcca gccggcgagc 60

attagctgcc gcagcagcca gagcattgtg catagcaacg gcaacaccta tctggaatgg 120

tatctgcaga aaccgggcca gagcccgcag ctgctgattt ataaagtgag caaccgcttt 180

agcggcgtgc cggatcgctt tagcggcagc ggcagcggca ccgattttac cctgaaaatt 240

agccgcgtgg aagcggaaga tgtgggcgtg tattattgct ttcagggcag ccatgtgccg 300

ctgacctttg gccagggcac caaactggaa attaaa 336

<210> 40

<211> 375

<212> ДНК

<213> Последовательность нуклеиновых кислот вариабельного участка тяжелой цепи клона 39 и 48

<400> 40

cagggccagc tggtgcagag cggcgccgag gtgaagaagc ccggcgccag cgtgaaggtg 60

agctgcaagg ccagcggcta caccttcacc gactacgaga tgcactgggt gagacaggcc 120

cccggccagg gcctggagtg gatgggcgtg atcgagagcg agaccggcgg caccgcctac 180

aaccagaagt tcaagggcag agccaagatc accgccgaca agagcaccag caccgcctac 240

atggagctga gcagcctgag aagcgaggac accgccgtgt actactgcac cagagagggc 300

atcaccaccg tggccaccac ctactactgg tacttcgacg tgtggggcca gggcaccacc 360

gtgaccgtga gcagc 375

<210> 41

<211> 375

<212> ДНК

<213> Последовательность нуклеиновых кислот вариабельного участка тяжелой цепи клона 41

<400> 41

cagggccagc tggtgcagag cggcgcggaa gtgaaaaaac cgggcgcgag cgtgaaagtg 60

agctgcaaag cgagcggcta tacctttacc gattatgaaa tgcattgggt gcgccaggcg 120

ccgggccagg gcctggaatg gatgggcgtg attgaaagcg aaaccggcgg caccgcgtat 180

aaccagaaat ttcagggccg cgtgaccctg accgcggata aaagcagcag caccgcgtat 240

atggaactga gcagcctgcg cagcgaagat accgcggtgt attattgcac ccgcgaaggc 300

attaccaccg tggcgaccac ctattattgg tattttgatg tgtggggcca gggcaccctg 360

gtgaccgtga gcagc 375

<210> 42

<211> 336

<212> ДНК

<213> Последовательность нуклеиновых кислот вариабельного участка легкой цепи клона 48

<400> 42

gatgtggtga tgacccagag cccgctgagc ctgccggtga ccctgggcca gccggcgagc 60

attagctgcc gcagcagcca gagcattgtg catagcaacg gcaacaccta tctggaatgg 120

tatctgcaga aaccgggcca gagcccgcgc ctgctgattt ataaagtgag caaccgcttt 180

agcggcgtgc cggatcgctt tagcggcagc ggcagcggca ccgattttac cctgaaaatt 240

agccgcgtgg aagcggaaga tgtgggcgtg tattattgct ttcagggcag ccatgtgccg 300

ctgacctttg gccagggcac caaactggaa attaaa 336

1. Антитело или его функциональный фрагмент, которые могут связываться с белком программируемой клеточной смерти 1 (PD-1) и содержат CDR тяжелой цепи, выбранный из аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: 1, 2, 3, 7, 8, 9, 13, 14 и 15, и CDR легкой цепи, выбранный из аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: 4, 5, 6, 10, 11, 12, 16, 17 и 18;

где аминокислотные последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 из указанного CDR тяжелой цепи выбраны из какой-либо из следующих групп разных аминокислотных последовательностей:

HCDR1 HCDR2 HCDR3
A SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 2 SEQ ID NO: 3
B SEQ ID NO: 7 SEQ ID NO: 8 SEQ ID NO: 9
C SEQ ID NO: 13 SEQ ID NO: 14 SEQ ID NO: 15

и аминокислотные последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 указанного CDR легкой цепи выбраны из какой-либо из следующих групп разных аминокислотных последовательностей:

LCDR1 LCDR2 LCDR3
A SEQ ID NO: 4 SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 6
B SEQ ID NO: 10 SEQ ID NO: 11 SEQ ID NO: 12
C SEQ ID NO: 16 SEQ ID NO: 17 SEQ ID NO: 18

2. Антитело или его функциональный фрагмент по п. 1, в которых аминокислотные последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи, а также CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи выбраны из какой-либо из следующих групп различных аминокислотных последовательностей:

HCDR1 HCDR2 HCDR3 LCDR1 LCDR2 LCDR3
A SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 2 SEQ ID NO: 3 SEQ ID NO: 4 SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 6
B SEQ ID NO: 7 SEQ ID NO: 8 SEQ ID NO: 9 SEQ ID NO: 10 SEQ ID NO: 11 SEQ ID NO: 12
C SEQ ID NO: 13 SEQ ID NO: 14 SEQ ID NO: 15 SEQ ID NO: 16 SEQ ID NO: 17 SEQ ID NO: 18
D SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 2 SEQ ID NO: 3 SEQ ID NO: 10 SEQ ID NO: 11 SEQ ID NO: 12

3. Антитело или его функциональный фрагмент по п. 1, которые содержат вариабельные участки тяжелой цепи, выбранные из аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: 19, 21 и 23, и вариабельные участки легкой цепи, выбранные из аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: 20, 22 и 24.

4. Антитело или его функциональный фрагмент по п. 1, где указанный вариабельный участок тяжелой цепи представляет собой SEQ ID NO: 19, и указанный вариабельный участок легкой цепи представляет собой SEQ ID NO: 20, или указанный вариабельный участок тяжелой цепи представляет собой SEQ ID NO: 21, и указанный вариабельный участок легкой цепи представляет собой SEQ ID NO: 22, или указанный вариабельный участок тяжелой цепи представляет собой SEQ ID NO: 23, и указанный вариабельный участок легкой цепи представляет собой SEQ ID NO: 24.

5. Антитело или его функциональный фрагмент по одному из пп. 1-4, которые представляют собой химерное антитело.

6. Антитело или его функциональный фрагмент по одному из пп. 1-5, которые содержат вариабельный участок тяжелой цепи, выбранный из аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: 33, 35, 36, и вариабельный участок легкой цепи, выбранный из аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: 34, 37.

7. Антитело или его функциональный фрагмент по п. 1, где указанный вариабельный участок тяжелой цепи представляет собой SEQ ID NO: 33, а указанный вариабельный участок легкой цепи представляет собой SEQ ID NO: 34, или указанный вариабельный участок тяжелой цепи представляет собой SEQ ID NO: 35, и указанный вариабельный участок легкой цепи представляет собой SEQ ID NO: 34, или указанный вариабельный участок тяжелой цепи представляет собой SEQ ID NO: 36, а указанный вариабельный участок легкой цепи представляет собой SEQ ID NO: 34, или указанный вариабельный участок тяжелой цепи представляет собой SEQ ID NO: 35, и указанный вариабельный участок легкой цепи представляет собой SEQ ID NO: 37.

8. Отдельная молекула нуклеиновой кислоты, которая кодирует указанное антитело или его функциональный фрагмент по любому из пп. 1-7.

9. Экспрессионный вектор, который содержит указанную молекулу нуклеиновой кислоты по п. 8.

10. Клетка-хозяин для продуцирования антитела или его функционального фрагмента по любому из пп. 1-7, которая содержит указанный экспрессионный вектор по п. 9.

11. Способ получения антител к PD-1 или их функциональных фрагментов, который включает культивирование указанных клеток-хозяев по п. 10 в условиях, которые обеспечивают продуцирование указанных антител или их функциональных фрагментов, а также выделение указанных антител или их функциональных фрагментов, полученных таким образом.

12. Иммуноконъюгат для лечения заболеваний, ассоциированных с повышенной экспрессией и/или активностью PD-1, который содержит указанное антитело или его функциональный фрагмент по любому из пп. 1-7, связанный с терапевтическим средством, при этом указанное терапевтическое средство предпочтительно является токсином, радиозотопом, лекарственным средством или цитотоксическим средством.

13. Фармацевтическая композиция для лечения заболеваний, ассоциированных с повышенной экспрессией и/или активностью PD-1, которая содержит указанное антитело или его функциональный фрагмент по любому из пп. 1-7 в количестве, эффективном для устранения, подавления или снижения активности PD-1, а также фармацевтический носитель.

14. Способ, применяемый для профилактики или лечения заболеваний или состояний, ассоциированных с повышенной экспрессией и/или активностью PD-1, путем устранения, подавления или снижения активности PD-1, который включает введение нуждающемуся пациенту эффективной лечебной дозы антитела или его функционального фрагмента по любому из пп. 1-7, иммуноконъюгата по п. 12 или фармацевтической композиции по п. 13.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению полипептидных комплексов, обладающих цитотоксичностью в отношении раковых клеток, что может быть использовано в медицине.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к шаттлам для гематоэнцефалического барьера, что может быть использовано в медицине. Получают шаттл для гематоэнцефалического барьера, который связывается с рецептором трансферрина, содержит специфичный к нему scFab, линкер и эффекторный элемент для головного мозга, что используют в фармацевтических композициях для транспорта эффекторного элемента для головного мозга через гематоэнцефалический барьер.

Настоящее изобретение относится к иммунологии. Предложено антитело, специфически связывающееся с CD26 человека, а также кодирующие такое антитело нуклеиновые кислоты, экспрессирующий вектор, клетка-хозяин и способ производства антитела.

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к композиции даклизумаба, и может быть использовано в медицине. Полученная композиция препарата даклизумаба подходит для подкожного введения и может быть применена при лечении индивидов, страдающих от рассеянного склероза.

Настоящее изобретение относится к области иммунологии. Предложены антитело и его антигенсвязывающий участок, способные к связыванию с фосфорилированным эпитопом на тау-белке человека с высокой специфичностью и/или аффинностью.

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии и биомедицины, а именно к способу получения эритроцитов, а также способу получения препарата крови. К настоящему изобретению также относятся препараты клеток для получения эритроцитов, замороженные препараты популяций клеток для получения эритроцитов и набор для получения вышеуказанных препаратов клеток.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к антигенсвязывающему фрагменту (Fab) для сывороточного альбумина (СА), что может быть использовано в медицине.
Изобретения касаются модифицированной клетки СНО и способа размножения ортопоксвируса при ее использовании. Представленная клетка модифицирована таким образом, чтобы включать последовательность, кодирующую CP77 под контролем конститутивного промотора, и последовательность, кодирующую D13L и/или K1L также под контролем конститутивного промотора.

Настоящее изобретение относится к области иммунологии. Предложена молекула антитела, связывающегося с CD37 человека и имеющего константные области человеческого происхождения.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению анти-HER2 антитела и конъюгата анти-HER2 антитела и низкомолекулярного медицинского средства, и может быть использовано в медицине.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению полипептидных комплексов, обладающих цитотоксичностью в отношении раковых клеток, что может быть использовано в медицине.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к двухцепочечной РНК (дцРНК) для подавления экспрессии гена-мишени у Leptinotarsa или Lygus. Также раскрыты ДНК-конструкция, кодирующая указанную дцРНК, прокариотическая клетка-хозяин, дрожжевая или растительная клетка-хозяин, содержащие указанную ДНК-конструкцию, композиция, содержащая дцРНК, трансгенное растение, модифицированное указанной дцРНК, и семя, полученное из указанного трансгенного растения.

Настоящее изобретение относится к иммунологии. Предложено антитело, специфически связывающееся с CD26 человека, а также кодирующие такое антитело нуклеиновые кислоты, экспрессирующий вектор, клетка-хозяин и способ производства антитела.

Группа изобретений относится к области биотехнологии. Предложен экспрессионный вектор, включающий промоторную последовательность и последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую белок, содержащий сигнальный пептид с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 2, 4 или 6 и дополнительную аминокислотную последовательность фермента протеазы, причем N-конец сигнального пептида расположен в белке, кодируемом указанной последовательностью нуклеиновой кислоты.

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к композиции даклизумаба, и может быть использовано в медицине. Полученная композиция препарата даклизумаба подходит для подкожного введения и может быть применена при лечении индивидов, страдающих от рассеянного склероза.

Изобретение относится к биохимии и представляет собой антитело, включающее тяжелую цепь и легкую цепь, способное специфически связываться с белком запрограммированной смерти клетки 1 (PD-1).

Настоящее изобретение относится к области иммунологии. Предложены антитело и его антигенсвязывающий участок, способные к связыванию с фосфорилированным эпитопом на тау-белке человека с высокой специфичностью и/или аффинностью.

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ репликации человеческого митохондриального генома в клетках дрожжей Yarrowia lipolytica.

Предложенное изобретение относится к области биотехнологии. Предложен способ индукции иммунного ответа у индивидуума на чужеродный белковый антиген.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к корму для животных, содержащему трансгенное растение или его часть для получения усвояемых сахаров с помощью фермента, деградирующего клеточную стенку, присутствующего в нем.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению полипептидных комплексов, обладающих цитотоксичностью в отношении раковых клеток, что может быть использовано в медицине.

Настоящее изобретение относится к области иммунологии. Предложены антитело и его функциональный фрагмент, способные к связыванию с PD-1. Также рассмотрена молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая антитело или его фрагмент, экспрессионный вектор, клетка-хозяин и способ получения антитела или его функционального фрагмента. Кроме того, описан иммуноконъюгат и фармацевтическая композиция, а также способ лечения заболеваний, ассоциированных с PD-1. Данное изобретение может найти дальнейшее применение в терапии различных состояний, в частности различных видов рака, инфекционных и воспалительных заболеваний. 8 н. и 6 з.п. ф-лы, 13 ил., 14 пр.

Наверх