Способ идентификации генетических маркеров поздней формы болезни паркинсона



Способ идентификации генетических маркеров поздней формы болезни паркинсона
Способ идентификации генетических маркеров поздней формы болезни паркинсона
Способ идентификации генетических маркеров поздней формы болезни паркинсона
G01N33/50 - химический анализ биологических материалов, например крови, мочи; испытания, основанные на способах связывания биоспецифических лигандов; иммунологические испытания (способы измерения или испытания с использованием ферментов или микроорганизмов иные, чем иммунологические, составы или индикаторная бумага для них, способы образования подобных составов, управление режимами микробиологических и ферментативных процессов C12Q)
G01N2800/56 - Исследование или анализ материалов путем определения их химических или физических свойств (разделение материалов вообще B01D,B01J,B03,B07; аппараты, полностью охватываемые каким-либо подклассом, см. в соответствующем подклассе, например B01L; измерение или испытание с помощью ферментов или микроорганизмов C12M,C12Q; исследование грунта основания на стройплощадке E02D 1/00;мониторинговые или диагностические устройства для оборудования для обработки выхлопных газов F01N 11/00; определение изменений влажности при компенсационных измерениях других переменных величин или для коррекции показаний приборов при изменении влажности, см. G01D или соответствующий подкласс, относящийся к измеряемой величине; испытание

Владельцы патента RU 2663908:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной генетики РАН (RU)

Изобретение относится к области медицины и предназначено для идентификации генетических маркеров поздней формы болезни Паркинсона. Осуществляют подготовку образцов ДНК из взятого у пациентов с болезнью Паркинсона биологического материала. Проводят реакцию множественной лигазной полимеразной реакции (МЛПР) и типирование основных известных маркерных мутаций и полиморфизмов, ассоциированных с болезнью Паркинсона. Отбирают пациентов для проведения экзомного секвенирования с исключением тех пациентов, в ДНК которых выявлены известные маркеры. Выявляют основные ассоциированные с развитием поздней формы болезни Паркинсона маркеры. Изобретение обеспечивает ускорение и удешевление анализа мутаций у пациентов с болезнью Паркинсона за счет введения перед этапом полноэкзомного секвенирования ДНК предварительной стадии типирования частых мутаций с использованием метода МЛПР. 5 ил., 4 табл., 1 пр.

 

Область техники, к которой относится настоящее изобретение

Настоящее изобретение относится к области медицины и может использоваться для предварительной идентификации генетических маркеров, имеющих прогностическую ценность в диагностике болезни Паркинсона для повышения эффективности и информативности экзомного секвенирования. Способ в соответствии с настоящим изобретением может быть востребован в клинической неврологической практике для проведения генетического консультирования, диагностики и оценки генетической предрасположенности к болезни Паркинсона в первую очередь в семьях с документированными случаями болезни Паркинсона.

Предшествующий уровень техники настоящего изобретения

Работы по выявлению новых генов и ДНК маркеров болезни Паркинсона проводятся с использованием методов экзомного секвенирования - определения последовательности ДНК только кодирующих белок участков генома. Экзомное секвенирование используется при диагностике генетических заболеваний. Экзомный анализ проводится с использованием методов NGS-секвенирования («Next Generation Sequencing», секвенирование нового поколения).

Наиболее часто семейные случаи болезни Паркинсона связаны с мутациями в генах паркина (PARK2) и дардарина (LRRK2). Анализ мутаций и полиморфных вариантов этих генов в настоящее время находит применение в клинической практике для изучения семей с аутосомно-рецессивной и аутосомно-доминантной формами семейной болезни Паркинсона, в том числе в России. Однако изучение известных генетических систем, связанных с развитием болезни Паркинсона, не позволяет провести исчерпывающую оценку генетического риска в связи с тем, что неидентифицированы все патогенетически значимые мутации и полиморфизмы и не определены все связанные с развитием болезни Паркинсона локусы.

В связи с этим предполагается идентификация новых генетических маркеров, связанных с развитием болезни Паркинсона. При этом основное внимание уделяется анализу семейной формы заболевания и пациентов со спорадической формой болезни Паркинсона с ранним возрастом клинического дебюта, так как у этих больных наиболее высока вероятность выявления новых генетических маркеров заболевания.

Из предшествующего уровня техники известны способы выявления различных генетических заболеваний с использованием различных методов секвенирования. Например, в международной патентной публикации WO 98/59050 (дата публикации 30.12.1998 г.) раскрыт способ выявления субъектов с повышенным риском болезни Паркинсона, предусматривающий получение образца, содержащего нуклеиновую кислоту, белки или ткани, и выявление в них мутаций, связанных с болезнью Паркинсона. Однако предварительное типирование мутаций и полиморфизмов, связанных с этим заболеванием, не используется.

Наиболее близким техническим решением к настоящему изобретению, изложенным в международной патентной публикации WO 2010/056337 (дата публикации 20.05.2010 г.), является способ выявления биомаркеров различных заболеваний, в том числе и болезни Паркинсона, у субъекта с применением технологии NGS-секвенирования, при реализации которой применяются различные методики ПЦР и электрофореза. Однако предварительное типирование основных ассоциированных с развитием заболевания для исключения уже известных маркерных мутаций и полиморфизмов до выполнения секвенирования не проводится, что отрицательно сказывается на информативности и эффективности способа.

Таким образом, несмотря на широкое применение метода экзомного секвенирования остается не решенной проблема повышения его информативности и эффективности.

Описание чертежей

На фиг.1 представлена схема проведения МЛПР (множественной лигазной полимеразной реакции).

На фиг.2 показан пример фрагментного анализа контрольного образца ДНК с нормальным соотношением величины пиков от геномной ДНК (начиная с пика 128 п.н.) с контрольными пиками (размером от 64 до 105 п.н.).

На фиг.3 представлены результаты сравнительного анализа МЛПР контрольного образца ДНК с отсутствием мутаций в изучаемых генах и образца ДНК пациента с болезнью Паркинсона с невыявленными мутациями.

На фиг.4 представлены результаты сравнительного анализа МЛПР контрольного образца ДНК с отсутствием мутаций в изучаемых генах и образца ДНК пациента с болезнью Паркинсона с гетерозиготной дупликацией трех экзонов (2, 3 и 4) в гене PARK2.

На фиг.5 представлены результаты сравнительного анализа МЛПР контрольного образца ДНК с отсутствием мутаций в изучаемых генах и образцах ДНК пациента с болезнью Паркинсона с ТМ G2019S (rs34637584) в гене LRRK2.

Раскрытие настоящего изобретения

Целью настоящего изобретения является повышение эффективности и информативности выявления новых патогенетически значимых мутаций для болезни Паркинсона методом экзомного секвенирования (NGS-секвенирования) и выявление основных ассоциированных с развитием болезни Паркинсона мутаций и полиморфизмов, являющихся маркерами указанного заболевания.

В соответствии с настоящим изобретением перед проведением экзомного анализа с использованием методов NGS-секвенирования осуществляется типирование основных ассоциированных с развитием заболевания известных мутаций и полиморфизмов, что повышает информативность экзомного анализа.

Вновь выявленные ДНК-маркеры дополняют панель используемых для оценки генетического риска мутаций и полиморфных вариантов генов семейной формы заболевания и позволяют выявлять значительное число лиц с высоким генетическим риском развития болезни Паркинсона до проявления первых клинических признаков заболевания.

Выявление генов и ДНК-маркеров, вовлеченных в патогенез спорадической и семейной форм болезни Паркинсона, обеспечивает раннюю (доклиническую) ДНК-диагностику этого заболевания с целью проведения его профилактического лечения в тот момент, когда дегенерация дофаминергических нейронов находится на ранней стадии и затрагивает ограниченное число нейронов этого типа. Это позволяет замедлить (если не остановить) развитие патологических процессов в нервной ткани, тем самым, сдвигая возраст клинического дебюта заболевания и снижая его клиническую тяжесть. Таким образом, способ в соответствии с настоящим изобретением позволяет перевести лечение болезни Паркинсона на качественно новый уровень - индивидуализированной профилактической медицины.

Указанная цель достигается тем, что осуществляется предварительный подбор пациентов с болезнью Паркинсона перед проведением экзомного секвенирования для анализа биологического материала - геномной ДНК, полученной от пациентов с болезнью Паркинсона с их информированного согласия, на предмет выявления маркерных мутаций и полиморфизмов, ассоциированных с болезнью Паркинсона. Для этого предусматривается использование метода множественной лигазной полимеразной реакции (МЛПР). МЛПР основана на использовании термостабильной лигазы для лигирования только полностью комплементарных последовательности геномной ДНК олигонуклеотидных зондов. Если последний 3'-нуклеотид зонда оказывается не комплементарен в результате мутации в геномной ДНК, лигирования не происходит. После лигирования продукты лигазной реакции амплифицируют с помощью праймеров, комплементарных последовательности, общей для всех зондов. Полученные продукты амплификации анализируют с использованием капиллярного гель-электрофореза, оценивая длину полученных ампликонов и величину пиков. На фиг. 1 схематично представлен принцип способа в соответствии с настоящим изобретением. Таким образом, способ в соответствии с настоящим изобретением предусматривает следующие стадии:

а) подготовка образцов ДНК из взятого у пациентов с болезнью Паркинсона биологического материала;

б) проведение реакции множественной лигазной полимеразной реакции (МЛПР);

в) проведение типирования основных известных маркерных мутаций и полиморфизмов, ассоциированных с болезнью Паркинсона;

г) оценка качества анализа;

д) анализ полученных при проведении МЛПР данных;

е) отбор пациентов для проведения экзомного секвенирования с исключением тех пациентов, в ДНК которых выявлены известные маркеры;

ж) осуществление экзомного секвенирования ДНК отобранных пациентов; и

з) выявление основных ассоциированных с развитием поздней формы болезни Паркинсона мутаций и полиморфизмов, являющихся маркерами указанного заболевания.

Соответственно, технический результат, обеспечиваемый изобретением, состоит в ускорении и удешевлении анализа мутаций у пациентов с болезнью Паркинсона за счет введения перед этапом полноэкзомного секвенирования ДНК предварительной стадии типирования частых мутаций с использованием метода МЛПР.

Все работы осуществляются в стерильном лабораторном блоке, специализированном для проведения ПЦР. Сборка ПЦР-смесей производится в ПЦР-боксе, например в UV-cleaner box 1200 (Biosan, Латвия), оборудованном проточным бактерицидным УФ-рециркулятором воздуха, например бактерицидным рециркулятором воздуха UVR-M (Biosan, Латвия), который обеспечивает постоянное обеззараживание внутри бокса во время работы во избежание загрязнения компонентов смесей и биологического материала.

Биологический материал (геномная ДНК из лейкоцитов периферической крови) выделяется из крови, предпочтительно венозной, пациентов с болезнью Паркинсона, полученной с их информированного согласия. Венозная кровь отбирается предпочтительно под 0,5 М раствора EDTA (этилендиаминтетрауксусной кислоты) (pH 8,0) (в соотношении на 1 объем крови 0,1 объема раствора EDTA). Выделение геномной ДНК проводится традиционными методами, предпочтительно фенол-хлороформным методом (Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Д. Молекулярное клонирование. Москва, "Мир", 1984). Для анализа образцов ДНК методом множественной лигазной полимеразной реакции используются традиционные наборы, например, набор SALSA MLPA (MRC-Holland b.v., Нидерланды), для которого требуется от 50 до 250 нг ДНК.

Для осуществления способа подбора пациентов с болезнью Паркинсона для проведения экзомного секвенирования используется следующее оборудование: амплификатор в реальном времени, например, StepOnePlus с ноутбуком (Life technologies, США); амплификатор для проведения рутинной ПЦР, например, Biometra Т3 Thermocycler (Biometra, Германия); прибор для капиллярного электрофореза, например, ABI-Prism 3100 (Applied Biosystems, США); гель-документирующая система, например, GelDoc XR (Bio-Rad Laboratories, США); вакуумный концентратор, например, Concentrator plus Complete System (Eppendorf, Германия); морозильник низкотемпературный, например, DW-86L388 (Haier, Германия) или SFR 167 (Indesit, Италия); холодильник с морозильной камерой, например, ХМ-6025 (Атлант, Беларусь); система для горизонтального электрофореза, например система для горизонтального электрофореза от Bio-Rad Laboratories (США); система очистки воды, например система Simplysity (Millipore, США) или система Milli-DI (Millipore; США); центрифуга, например микроцентрифуга 5424 (Eppendorf, Германия), микроцентрифуга-вортекс Микроспин FV-2400 (Biosan, Латвия) или персональный вортекс V-1 plus (Biosan, Латвия); флюориметр, например флюориметр Qubit 1.0 (Live Technologies, США); набор пипеток, например набор автоматических пипеток Biohit от 0,5 мкл до 10 мкл, от 10 мкл до 100 мкл, от 20 мкл до 200 мкл, от 100 мкл до 1000 мкл, от 1000 мкл до 5000 мкл (Sartorius, США); весы аналитические, например весы EP214C до 210 г (Ohaus, США); источник питания, например, источник питания PowerPac НС Power Supply (Bio-Rad Laboratories, США); pH-метр, например pH-метр PB-11 (Sartorius, США); насос мембранный, например насос мембранный Millivac (Millipore, США); магнитная мешалка, например магнитная мешалка MSH-300 с подогревом (Biosan, Латвия).

Таблица 1
Набор для проведения МЛПР SALSA MLPA (MRC-Holland b.v., Нидерланды)
Компонент набора SALSA MLPA Состав
Буфер SALSA MLPA KCl, Tris-HCl, EDTA, PEG-6000, pH 8,5
SALSA Лигаза-65 Глицерин, BRIJ (0,05%), EDTA, Beta-Mercaptoethanol (0,1%), KCl, Tris-HCl. pH 7,5, фермент Ligase-65 (бактериального происхождения)
Лигазный буфер A NAD (бактериального происхождения), pH 3,5
Лигазный буфер B Tris-HCl, неионные детергенты, MgCl2, pH 8,5
Смесь SALSA ПЦР-праймеров Синтетические олигунуклеотиды, один из которых флуоресцентно меченый, (FAM, Су5.0 или другой краситель в зависимости от используемого инструмента капиллярного электрофореза), dNTP, Tris-HCl, KCl, EDTA, BRIJ (0,04%), pH 8,0
SALSA полимераза Глицерин, BRIJ (0,5%), EDTA, DTT (0,1%), KCl, Tris-HCl, фермент полимеразы (бактериального происхождения), pH 7,5
Смесь зондов Синтетические олигонуклеотиды, олигонуклеотиды, очищенные от бактерий, Tris-HCl, EDTA, pH=8,0

Согласно одному из вариантов осуществления настоящего изобретения способ предусматривает стадии, на которых

1. Готовят образцы ДНК:

а) 100 нг геномной ДНК человека переносят в пробирку для ПЦР на 200 мкл и переосаждают двумя объемами холодного (-20°C) этанола (96%) в присутствии 100 мМ NaCl;

б) осадок дважды промывают 70% и 96% холодным спиртом, сушат (на воздухе или в вакуумной сушке);

в) осадок растворяют в 5 мкл TE, pH 8,2.

2. Осуществляют реакцию МЛПР:

а) панель анализируемых образцов должна содержать не менее 10 образцов ДНК (3 образца ДНК здоровых доноров и 7 образцов ДНК исследуемых пациентов), при анализе большего количества образцов ДНК на каждые 7 образцов ДНК от пациентов добавляют дополнительный контрольный образец ДНК; в каждую панель включают один образец отрицательного контроля, в котором ДНК заменена на 5 мкл TE (10 мМ Tris-HCl, 0,1 мМ EDTA, pH 8,2);

б) геномную ДНК из панели образцов денатурируют в ПЦР-термоциклере с нагреваемой крышкой в течение 15 минут при 98°C, затем пробирки охлаждают до 25°C;

в) готовят смесь, содержащую для каждой реакции 1,5 мкл зондов для МЛПР и 1,5 мкл буфера SALSA MLPA (см. таблицу 1), и добавляют к каждому образцу ДНК для гибридизации зондов с ДНК;

г) продолжают выполнение программы термоциклера: инкубируют 1 минуту при 95°C, а затем 16-20 часов при 60°C;

д) вносят 32 мкл лигазной смеси, содержащей для каждой реакции 25 мкл бидистилированной воды, 3 мкл лигазного буфера A, 3 мкл лигазного буфера B и 1 мкл лигазы, в предварительно нагретую до 54°C пробирку с анализируемой ДНК;

е) реакционную смесь инкубируют 15 минут при температуре 54°C;

ж) затем реакционную смесь инкубируют 5 минут при 98°C;

з) реакционную смесь охлаждают до 20°C;

и) для проведения ПЦР готовят смесь, содержащую для каждой реакции 7,5 мкл H2O, 2 мкл смеси праймеров SALSA PCR и 0,5 мкл SALSA-полимеразы;

к) при комнатной температуре добавляют по 10 мкл смеси в каждую пробирку и продолжают выполнение программы: 35 циклов: 30 секунд при 95°C, 30 секунд при 60°C, 60 секунд при 72°C;

л) 20 минут инкубируют образцы при 72°C с паузой 15°C;

м) ПЦР-продукты запаковывают в алюминиевую фольгу и хранят при - 20°C.

3. Проводят фрагментный анализ:

а) анализируют размер и количество полученных ампликонов с использованием капиллярного электрофореза с использованием капилляра длиной 36 см;

б) готовят инъекционную смесь из 0,7 мкл ПЦР-продукта, 0,2 мкл маркера LIZ, 9 мкл формамида;

в) проводят электрофорез при следующих условиях: напряжение при введении составляет 1,6 кВ, время инъекции составляет 15 секунд, напряжение при проведении электрофореза составляет 15 кВ;

г) инкубируют при 80°C и быстро охлаждают, время проведения электрофореза составляет 30 минут;

д) оценивают первичные данные и сопоставляют полученные пики с информацией о них в наборе праймеров и зондов на мутации и полиморфизмы (см. таблицу 2) с использованием программного обеспечения Coffalyser. Net (MRC-Holland, Нидерланды).

4. Оценивают качество анализа:

а) оценку качества всех реакций МЛПР проводят с использованием входящих в состав реакционной смеси контрольных фрагментов размером:

- 92 п.н. (эталонный стандарт);

- 64, 70, 76, 82 п.н. (фрагменты для оценки количества введенной в реакцию геномной ДНК), при этом при высоте пиков от геномной ДНК менее 30% от величины стандартных пиков результаты анализа считают недостоверными;

- 86 и 96 п.н. (контроль денатурации), при этом при высоте пиков от геномной ДНК менее 40% от величины стандартных пиков результаты анализа считают недостоверными;

- 100 и 105 п.н. (специфичны для X и Y хромосомы соответственно, и используются для контроля за полом пациента и предупреждения ошибок типирования образцов ДНК);

б) в реакции отрицательного контроля при МЛПР детектируют только фрагменты размером 64, 70, 76 и 82 п.н., при этом наличие дополнительных фрагментов ДНК, достигающих по величине 50% любого из этих пиков, указывает на ошибку при проведении анализа, в этом случае всю панель образцов ДНК исключают из данного конкретного эксперимента;

в) допускают детекцию множественных малых по размеру фоновых пиков с фрагментами длиной менее 64 п.н., которые не препятствуют проведению дальнейшей обработки первичных электрофоретических данных; вариант осуществления настоящего изобретения фрагментного анализа образца ДНК с нормальным соотношением пиков приведен на фиг.2.

5. Проводят анализ данных, полученных при проведении МЛПР:

а) для нормализации используют данные, прошедшие оценку первичных результатов и паттернов пиков;

б) нормализацию проводят в два этапа, поскольку абсолютные флуоресцентные интенсивности сигналов, детектируемые капиллярным электрофорезом, зависят от многих факторов;

в) нормализуют величину всех пиков в каждом образце ДНК по величине стандартного пика для фрагментов размером 92, 64, 70, 76, 82 п.н., при этом полученные нормализованные значения пиков от различных стандартных фрагментов должны отличаться между собой не более чем на 0,1 относительной единицы;

г) на основании усредненной по разным стандартным фрагментам величины пика для конкретного фрагмента ДНК проводят нормализацию величины этого пика у анализируемого пациента по величине пика, полученной для контрольного образца ДНК здорового человека;

д) если эта относительная величина блика к единице, считают, что контрольный образец ДНК и образец ДНК пациента не отличаются по копийности данного фрагмента, как показано на фиг.3;

е) при отклонении этого соотношения от 1 данные интерпретируют в соответствии с фиг.4.

6. Отбирают пациентов для проведения экзомного секвенирования, исключая тех пациентов, в ДНК которых выявляют известные маркеры:

панель геномной ДНК (ДНК из периферической крови пациентов с болезнью Паркинсона), сформированную для проведения экзомного секвенирования, анализируют с использованием анализа МЛПР согласно этапу 2; при этом из сформированной панели исключают образцы ДНК, в которых выявляют основные известные мутации и полиморфизмы, ассоциированные с болезнью Паркинсона и приведенные в таблице 1.

7. Осуществляют экзомное секвенирование.

Экзомное секвенирование на стадии 7 осуществляют с использованием традиционных технологий, известных специалистам в данной области техники и не являющихся предметом настоящего изобретения.

Согласно варианту осуществления настоящего изобретения в ходе проведения работ с использованием способа подбора пациентов с болезнью Паркинсона для проведения экзомного секвенирования типировали 54 мутации и полиморфизма в 11 генах. В таблице 2 представлен перечень маркерных мутаций и полиморфизмов, которые должны быть типированы.

Таблица 2
Перечень маркерных мутаций и полиморфизмов, исследуемых при подборе пациентов с болезнью Паркинсона для проведения экзомного секвенирования
Ген Мутации и полиморфизмы
PINK1 Делеция/дупликация экзонов 1, 2, 3, 4, 6, 7, 8
SNCA Делеция/дупликация экзонов 2, 2а, 3, 4, 5, 6, 7b, TM A53T (rs104893877)
ATP13A2 Делеция/дупликация экзонов 9, 14, 28
LRRK2 Делеция/дупликация экзонов 1, 2, 10, 15, 27, 41, 49; TM G2019S (rs34637584)
PARK2 Делеция/дупликация экзонов 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12
TNFRSF9 Делеция/дупликация экзона 3
PARK7 Делеция/дупликация экзонов 1b, 3, 5, 7
PACRG Делеция/дупликация экзона 1
CAV2 Делеция/дупликация экзона 3
UCHL1 Делеция/дупликация экзонов 1, 4, 5, 9
GCH1 Делеция/дупликация экзонов 1, 2, 3, 5, 6

В таблице 3 представлены следующие пороговые значения соотношения в величине нормализованного сигнала у пациента с болезнью Паркинсона и здоровых лиц:

Таблица 3
Оценка копийности фрагментов при анализе МЛПР по величине нормализованных пиков в ДНК пациента и в контрольной ДНК
Количество копий анализируемой последовательности Соотношение с нормой
Норма 0,85<X<1,15
Гетерозиготная дупликация 1,35<X<1,55
Гомозиготная дупликация 1,70<X<2,20
Гетерозиготная делеция 0,35<X<0,65
Гомозиготная делеция 0
Сомнительный результат Все остальные значения

Для анализа точковых мутаций предусматриваются следующие условия:

- для каждой точковой мутации в панель праймеров и зондов должно входить два типа зондов - на аллель дикого типа и мутантный аллель;

- этим аллелям должны соответствовать два отличающихся по размеру фрагмента;

- появление соответствующего мутантному аллелю фрагмента говорит о наличии у пациента той или иной мутации в соответствии с фиг.5.

Пример осуществления настоящего изобретения

Способ подбора пациентов с болезнью Паркинсона для проведения экзомного секвенирования использовали для анализа ранее сформированной на основании клинико-генеалогического анализа выборки пациентов со спорадической с ранним началом развития и аутосомно-доминантной формой болезней Паркинсона (70 пациентов). Список проанализированных пациентов и результаты МЛПР анализа приведены в таблице 4.

Таблица 4
Список проанализированных с использованием МЛПР пациентов с болезнью Паркинсона, отобранных для NGS-секвенирования на основании клинико-генеалогических данных
Номер пациента по базе данных Выявленные при МЛПР анализе мутации
PDA1 Нет
PDA2 Нет
PDA25 Нет
PDA26 Нет
PDA35 Нет
PDA37 Нет
PDM20 Нет
PDM24 Нет
PDM25 Нет
PDM26 Нет
PDM32 Нет
PDM39 Нет
PD87 Нет
PD94 Нет
PD98 Нет
PD100 Нет
PD105 Нет
PD122 Нет
PD129 Нет
PD144 Нет
PD37 (P146) Нет
PD86 Нет
PD87 Нет
PD94 Нет
PD105 Нет
PD107 Нет
PD129 Нет
PD132 Нет
PDM9 Нет
PDM14 Нет
PDM36 Нет
PDM39 Нет
PDM40 Нет
PDA32 Нет
PDA33 Нет
PDA35 Нет
PDX2 Нет
PDX82 Нет
101 Нет
129 Нет
165 Нет
347 Нет
351 Нет
427 Нет
74 Нет
83 PARK2-2,3,4 exon-het.dupl.
84 Нет
87 Нет
89 Нет
112 Нет
126 PARK7-3 ex-het.dupl.
157 G2019S-het.
158 Нет
175 Нет
319 Нет
330 Нет
338 Нет
339 Нет
342 Нет
346 Нет
348 G2019S-het.
391 Нет
396 Нет
400 Нет
401 Нет
407 Нет
417 Нет
429 PARK2-3 exon-het.del.
439 PARK2-3,4 exon-het.del.
538 G2019S-het.

У семи пациентов (10%) выявляли различные мутации и исключали их из дальнейшего анализа. В трех случаях обнаруживали миссенс-мутацию G2019S в гене дардарина LRRK2 (что подтверждает ранее полученные данные о высокой частоте этой мутации у пациентов с аутосомно-доминантной болезнью Паркинсона в различных этнических группах, в том числе в России). У трех больных выявляли различные перестройки экзонов гена паркина PARK2, при этом обнаруживали как гетерозиготные делеции этого гена (у двух пациентов), так и гетерозиготную дупликацию (у одного пациента). Интересно, что во всех трех случаях перестройки захватывали экзоны 3 и 4, которые авторами настоящего изобретения ранее определялись как «горячие точки» при перестройках гена PARK2 при болезни Паркинсона. Необходимо отметить, что эти мутации в гене PARK2 выявляли как у пациентов со спорадической формой болезни Паркинсона, так и у пациентов с семейной аутосомно-доминантной формой развития заболевания. Это говорит о том, что не исключено, что в некоторых случаях гетерозиготные делеции в гене PARK2 могут манифестировать как доминантные мутации и приводить к поздней форме заболевания. В то же время, гомозиготность по мутациям в этом гене вызывает раннюю аутосомно-рецессивную форму болезни Паркинсона с медленным прогрессированием патологического процесса.

Таким образом, способ в соответствии с настоящим изобретением обеспечил проведение типирования основных известных маркерных мутаций и полиморфизмов, ассоциированных с болезнью Паркинсона, что позволило исключить из дальнейшего анализа семь пациентов, т.е. значительно сократить (на 10%) выборку, сформированную для экзомного секвенирования. В результате была сформирована выборка пациентов с недиагностированными патогенетически значимыми вариантами.

Это значительно повысит информативность и эффективность дальнейшего анализа, проводимого с использованием экзомного секвенирования.

Способ идентификации генетических маркеров поздней формы болезни Паркинсона, отличающийся тем, что перед проведением экзомного секвенирования осуществляют предварительный подбор пациентов с болезнью Паркинсона, предусматривающий следующие стадии:

а) подготовка образцов ДНК из взятого у пациентов с болезнью Паркинсона биологического материала;

б) проведение реакции множественной лигазной полимеразной реакции (МЛПР);

в) проведение типирования основных известных маркерных мутаций и полиморфизмов, ассоциированных с болезнью Паркинсона;

г) оценка качества анализа;

д) анализ полученных при проведении МЛПР данных;

е) отбор пациентов для проведения экзомного секвенирования с исключением тех пациентов, в ДНК которых выявлены известные маркеры;

ж) осуществление экзомного секвенирования ДНК отобранных пациентов; и

з) выявление основных ассоциированных с развитием поздней формы болезни Паркинсона мутаций и полиморфизмов, являющихся маркерами указанного заболевания.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к медицине, а именно к генерированию конфигурационных выходных данных, которые могут быть использованы в связи с конфигурацией устройства по уходу за больным, и может быть использовано для генерирования конфигурационных выходных данных.

Изобретение относится к экспресс-способу прогнозирования пожароопасных свойств, таких как температура вспышки, предельных кетонов. Способ характеризуется тем, что используют молекулярные дескрипторы и искусственные нейронные сети и осуществляется путем применения двух алгоритмов обучения «обратное распространение ошибки» и «deep learning», обеспечивая анализ пожароопасных свойств веществ.

Группа изобретений относится к области медицины. Предложена система для инсулинотерапии и устройство управления для дистанционного управления инсулиновой помпой.

Группа изобретений относится к медицине, а именно к средствам анализа объемных электронных медицинских карт или электронной истории болезни, и может быть использована для оптимизации плана лечения пациента и выбора курса лечения.

Группа изобретений относится к медицине, а именно к системе поддержки принятия клинических решений. Рабочая станция содержит систему, которая обеспечивает выполнение способа, содержащего: привязку набора клинических входных условий и клинических рекомендаций к узлу клинического руководства, включающего в себя множество узлов, привязку пары, представляющей клинический вопрос и соответствующий клинический ответ, к узлу.

Изобретение относится к области автоматики, управления и организации оперативно-командной связи и передачи данных в объектах и между объектами автоматизированных систем управления.

Изобретение относится к области медицины, а именно к эндокринологии. Для доставки инсулина в организм пациента принимают информацию о количестве инсулина, подлежащем доставке в организм пациента, и начинают доставку инсулина в организм пациента.

Группа изобретений относится к медицине и может быть использована для оценки вероятности развития онкологических заболеваний. Группа изобретений представлена способом и системой.

Изобретение относится к области добычи природного газа, а именно к способу контроля за разработкой многопластовых месторождений газа, при расчете пластового давления, как по отдельным пластам, так и по месторождению в целом.

Изобретение относится к области геолого-гидродинамического моделирования и может быть использовано при решении задач поиска, разведки и проектирования разработки нефтяных месторождений в условиях сложного строения коллекторов.

Группа изобретений относится к онкологии. Предложены: способ классификации злокачественного опухолевого заболевания, включающий количественную оценку экспрессии карбоангидразы IX (CAIX) в опухолевом образце путем окрашивания опухолевых клеток и определения балла CAIX по формуле, сравнение этого балла CAIX с предварительно определенным баллом CAIX ≥ 2,0 и классификацию/определение злокачественного опухолевого заболевания как подлежащее лечению соединением, нацеленным на CAIX, если балл CAIX превышает предопределенное пороговое значение; и способ его лечения, включающий указанный способ классификации злокачественного опухолевого заболевания как подлежащий лечению соединением, нацеленным на CAIX (например, антителом гирентуксимабом).

Изобретение относится к способам анализа биологических материалов, а именно сыворотки крови. Способ оценки эффективности ингаляционной антибиотикотерапии нозокомиальной пневмонии заключается в том, что определяют содержание белка клеток Клара в сыворотке венозной крови за 1 час до первой ингаляции антибиотика и через 1 час после ингаляции с помощью иммуноферментного анализа, увеличение содержания белка клеток Клара по крайней мере в 1,5 раза свидетельствует об эффективности ингаляционной антибактериальной терапии.

Изобретение относится к медицине, а именно к рентгенохирургическим методам лечения ишемической болезни сердца, и касается способа прогнозирования риска тромбоза в коронарном стенте при плановом чрезкожном коронарном вмешательстве у больных ишемической болезнью сердца.

Изобретение касается способа определения эффективности композиции в отношении ингибирования инициации трансляции, уровень ингибиторной активности которой в отношении инициации трансляции неизвестен, где способ включает: приведение клетки линии, которая имеет номер доступа РТА-13010 в Американской коллекции типовых культур (АТСС), в контакт с указанной композицией в течение периода времени и при температуре, достаточных для ингибирования пролиферации указанной клетки, приведение клетки линии, которая имеет номер доступа РТА-13011 в АТСС, в контакт с указанной композицией в течение периода времени и при температуре, достаточных для ингибирования пролиферации указанной клетки, измерение индуцированного указанной композицией уровня ингибирования пролиферации указанной клетки линии, которая имеет номер доступа РТА-13010 в АТСС, и уровня ингибирования пролиферации указанной клетки линии, которая имеет номер доступа РТА-13011 в АТСС, причем величина указанной ингибиторной активности указанной композиции в отношении процесса инициации трансляции пропорциональна уровню ингибирования пролиферации в клетке линии, которая имеет номер доступа РТА-13010 в АТСС, и сравнение уровня ингибирования пролиферации, индуцированного указанной композицией, с уровнем ингибирования пролиферации, индуцированного стандартом, имеющим известную величину указанной активности, и определение композиции как не имеющей ингибиторной активности в отношении инициации трансляции, если указанная композиция ингибирует пролиферацию указанной клетки линии, которая имеет номер доступа РТА-13011 в АТСС; при этом указанная композиция представляет собой пищевой, нутрицевтический или лекарственный продукт, при этом указанная клетка линии, которая имеет номер доступа РТА-13010 и/или РТА-13011 в АТСС, характеризуется тем, что содержит лентивирусный экспрессионный вектор, который содержит: (а) гетерологичный ген eIF2α, у которого полностью отсутствуют 3' и 5' НТО; (б) направленную на нуклеотид №1098, тимидиновый нуклеотид в 3'-НТО области эндогенного гена eIF2, миРНК №1098, которая ингибирует более 85% эндогенной экспрессии eIF2; и (в) оптимальную консенсусную последовательность Козака (GCCACCATGG).

Изобретение относится к области медицины, а именно к клинической биохимии и хирургии, и может быть использовано для прогнозирования развития макроангиопатий нижних конечностей у больных сахарным диабетом 2 типа.
Изобретение относится к области медицины, конкретно к кардиологии, реабилитологии, ультразвуковой диагностике и терапии, и касается способа прогнозирования риска развития неблагоприятного ремоделирования левого желудочка сердца у больных острым передним инфарктом миокарда с подъемом сегмента ST в течение 6 месяцев от начала заболевания.

Изобретение относится к области биологии и может быть использовано для оценки экологического состояния окружающей среды. Для этого проводят отбор живых проб организмов, обитающих в водной среде с последующей идентификацией видового состава организмов с применением маркерных белков методом иммуноферментного анализа.

Изобретение относится к области медицины - стоматология/детская стоматология и микробиология/бактериология, и может быть использовано для определения титра кариесогенных бактерий S.

Изобретение относится к области медицины и предназначено для прогнозирования риска развития эссенциальной гипертензии. У индивидуумов русской национальности, являющихся жителями Центрального Черноземья, осуществляют выделение ДНК из периферической венозной крови и анализ генетических маркеров матриксных металлопротеиназ.

Изобретение относится к медицине, ветеринарии, зоотехнии и биотехнологии. Способ оценки перекисного гомеостаза организма кроликов включает введение самцам и самкам кроликов антиоксидантного препарата «Окси-Нил драй» на ранних стадиях постнатального онтогенеза в одинаковых дозах по 300 мг/кг корма, подготовку биологического материала, исследования общеклинических и биохимических показателей крови, определение физиологических параметров организма в динамике пола и возраста; в качестве маркеров определены активность основных антиоксидантных ферментов и концентрации малонового диальдегида и диеновых конъюгатов в плазме крови, совокупно позволяющие судить о глубине активации перекисного окисления липидов, при этом если суммарное накопление продуктов перикисного окисления липидов превышает общую активность ферментативного звена, то организм находится в состоянии окислительного стресса, если наоборот - то в состоянии активированной компенсации.
Изобретение относится к способу и устройству для изготовления таблетки, которая предпочтительно предусмотрена для последующего анализа с целью химического определения вещества предпочтительно в промышленности основных материалов.

Изобретение относится к области медицины и предназначено для идентификации генетических маркеров поздней формы болезни Паркинсона. Осуществляют подготовку образцов ДНК из взятого у пациентов с болезнью Паркинсона биологического материала. Проводят реакцию множественной лигазной полимеразной реакции и типирование основных известных маркерных мутаций и полиморфизмов, ассоциированных с болезнью Паркинсона. Отбирают пациентов для проведения экзомного секвенирования с исключением тех пациентов, в ДНК которых выявлены известные маркеры. Выявляют основные ассоциированные с развитием поздней формы болезни Паркинсона маркеры. Изобретение обеспечивает ускорение и удешевление анализа мутаций у пациентов с болезнью Паркинсона за счет введения перед этапом полноэкзомного секвенирования ДНК предварительной стадии типирования частых мутаций с использованием метода МЛПР. 5 ил., 4 табл., 1 пр.

Наверх