Штамм вируса гриппа a/shanghai/hk/6:2/2013 (h7n9) для получения инактивированных и живых гриппозных вакцин



Штамм вируса гриппа a/shanghai/hk/6:2/2013 (h7n9) для получения инактивированных и живых гриппозных вакцин
Штамм вируса гриппа a/shanghai/hk/6:2/2013 (h7n9) для получения инактивированных и живых гриппозных вакцин
Штамм вируса гриппа a/shanghai/hk/6:2/2013 (h7n9) для получения инактивированных и живых гриппозных вакцин
Штамм вируса гриппа a/shanghai/hk/6:2/2013 (h7n9) для получения инактивированных и живых гриппозных вакцин
Штамм вируса гриппа a/shanghai/hk/6:2/2013 (h7n9) для получения инактивированных и живых гриппозных вакцин
Штамм вируса гриппа a/shanghai/hk/6:2/2013 (h7n9) для получения инактивированных и живых гриппозных вакцин
Штамм вируса гриппа a/shanghai/hk/6:2/2013 (h7n9) для получения инактивированных и живых гриппозных вакцин
Штамм вируса гриппа a/shanghai/hk/6:2/2013 (h7n9) для получения инактивированных и живых гриппозных вакцин
Штамм вируса гриппа a/shanghai/hk/6:2/2013 (h7n9) для получения инактивированных и живых гриппозных вакцин
Штамм вируса гриппа a/shanghai/hk/6:2/2013 (h7n9) для получения инактивированных и живых гриппозных вакцин
C12N2760/16121 - Микроорганизмы или ферменты; их композиции (биоциды, репелленты или аттрактанты или регуляторы роста растений, содержащие микроорганизмы, вирусы, микробные грибки, ферменты, агенты брожения или вещества, получаемые или экстрагируемые из микроорганизмов или из материала животного происхождения A01N 63/00; пищевые составы A21,A23; лекарственные препараты A61K; химические аспекты или использование материалов для бандажей, перевязочных средств, впитывающих подкладок или хирургических приспособлений A61L; удобрения C05); размножение, консервирование или сохранение микроорганизмов (консервирование живых тканей или органов людей или животных A01N 1/02); мутации или генная инженерия; питательные среды (среды для микробиологических испытаний C12Q)

Владельцы патента RU 2664460:

федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт гриппа имени А.А. Смородинцева" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "НИИ гриппа им. А.А. Смородинцева" Минздрава России) (RU)

Изобретение относится к области медицинской биотехнологии и касается штамма вируса гриппа. Представлен штамм вируса гриппа А/Shanghai/НК/6:2/2013 (H7N9), депонированный в Государственную коллекцию вирусов ФГБУ «ФНИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России под №2833. Штамм получен методом классической генетической реассортации на основе холодоадаптированного штамма А/Гонконг/1/68/162/35(H3N2) и рекомбинантного вируса A/Shanghai/2/2013(H7N9)-PR8-IDCDC. От донора штамм унаследовал гены, кодирующие внутренние негликозилированные белки РВ1, РВ2, PA, NP, MP и NS. Гены, кодирующие поверхностные белки вируса - НА и NA, штамм унаследовал от вируса дикого типа (A/Shanghai/2/2013(H7N9)-PR8-IDCDC). Штамм генетически стабилен при 5-кратном пассировании в 10-дневных развивающихся куриных эмбрионах и пригоден для производства моновалентной вакцины и вакцины трехкомпонентной (в качестве одного из составляющих). Может применяться в целях иммунизации населения против вирусов гриппа А подтипов Н7. 3 ил., 8 табл., 4 пр.

 

Изобретение относится к области медицинской биотехнологии и предназначено для получения инактивированных (ИГВ) и живых (ЖГВ) гриппозных вакцин, моновалентной или в составе 3-компонентной в целях иммунизации населения против потенциально пандемического вируса гриппа А подтипа Н7. Полученный вакцинный штамм относится к семейству Orthomyxoviridae, род Influenzavirus А.

Вирусы гриппа, циркулирующие среди животных, создают угрозу здоровью человека из-за способности непосредственного инфицирования его и еще большую - при реассортации с вирусами человека. Одним из наиболее опасных в настоящее время является вирус птичьего гриппа A/H7N9, способный при тесном контакте передаваться человеку и, подобно A/H5N1, вызывать тяжелую форму заболевания: 36% из зарегистрированных случаев заболевания людей гриппом A/H7N9 имели летальный исход [Lei Zhou et al., 2017].

Однако в отличие от A/H5N1 вирусы A/H7N9 не вызывают болезнь или смерть у птиц и такая бессимптомная инфекция снижает настороженность у человека. Наблюдения свидетельствуют о том, что вирус A/H7N9 не передается от человека человеку, хотя обладает большей, чем A/H5N1, трансмиссивностью от животного к человеку, то есть представляет большую угрозу трансформации в пандемический штамм. Результаты нескольких исследований указывают на способность вирусов A/H7N9 активно размножаться в органах мышей, хорьков и приматов, а также в клетках, выстилающих эпителий дыхательных путей человека [Bao L. 2014; Jurre Y. 2014]. Периодически регистрируются вспышки гриппа птиц подтипа Н7, сопровождающиеся инфицированием людей. Это обусловливает актуальность получения вакцинных штаммов против вируса A/H7N9.

Необходимость разработки противопандемических мер, в том числе и для борьбы с вирусами птичьего гриппа, отражена в приказе Роспотребнадзора РФ [Приказ №40 от 28.12.2004]. В «Глобальном плане ВОЗ по подготовке к борьбе с гриппом» до начала пандемии национальным органам рекомендуется испытывать и лицензировать пандемические вакцины, а также поддерживать развитие производства и обмена прототипами сезонных и пандемических вакцин для возможного целевого их применения. В связи с этим актуальными являются исследования по подготовке вакцинных препаратов против вирусов гриппа подтипов A/H7N9, а также испытания этих вакцинных препаратов на животных моделях.

В настоящее время работы по созданию вакцин против пандемических вирусов гриппа ведутся во всем мире, ряд вакцин прошли или проходят испытания на приматах и людях. В США в Национальном институте аллергии и инфекционных заболеваний (NIAID) разработана ЖГВ на основе реассортантов птичьих вирусов субтипа A/H7(H7N3, H7N9, H7N7) и донора аттенуации A/Ann Arbor/6/60 са). В России в НИИ экспериментальной медицины подготовлена ЖГВ из вакцинных штаммов, содержащих поверхностные белки вирусов A/H7N9, A/H7N3 и A/H2N2 и внутренние белки вируса-донора А/Ленинград/134/17/57. Патенты на вакцинные штаммы Н7: патент на изобретение РФ №2507256 (опубл. 20.02.2014), патент РФ №2563351 (опубл. 20.09.2015).

Все представленные штаммы получены методом обратной генетики.

Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, являлось получение реассортанта на основе вируса гриппа A/H7N9 и собственного донора генов внутренних белков А/Гонконг/1/68/162/35 методом классической генетической реассортации для производства инактивированных и живых гриппозных вакцин.

Для получения реассортанта на основе вируса A/H7N9 в качестве донора генов внутренних белков мы использовали разработанный в ФГБУ «НИИ гриппа» Минздрава России универсальный донор А/Гонконг/1/68/162/35 (H3N2) [патент №2511431 от 25.07.2011], который ориентирован на получение реассортантных штаммов как для живой (ЖГВ), так и для инактивированной (ИГВ) гриппозных вакцин. Соответственно, полученный реассортант может использоваться для производства обоих типов вакцин.

Получение штамма вируса гриппа RA-35 (А/Shanghai/HК/6:2(H7N9)

Штамм вируса гриппа RA-35 (A/Shanghai/ГК/6:2(H7N9) получен методом классической генетической реассортации на основе холодоадаптированного штамма А/Гонконг/1/68/162/35 (H3N2) и рекомбинантного вируса A/Shanghai/2/2013(H7N9)-PR8-IDCDC, полученного методом обратной генетики (Центр по контролю и профилактике инфекционных болезней (CDC), Атланта, США). При получении штамма было проведено 6 пассажей в 10-12-дневных развивающихся куриных эмбрионах.

Штамм представляет собой реассортант с формулой генома 6:2. Состав генома: 6 генов внутренних и неструктурных белков (РВ2, РВ1, PA, NP, М и NS) от вируса А/Гонконг/1/68/162/35 (H3N2) и 2 гена (НА и NA) от вируса дикого типа.

Анализ штамма для подтверждения состава генома был выполнен с использованием рестрикционного анализа ДНК-копий сегментов РНК, полученных с помощью обратно-транскриптазной полимеразно-цепной реакции (ОТ-ПЦР). Полученные с помощью ОТ-ПЦР ДНК-копии сегментов РВ2, РВ1, PA, NP, М и NS вирусов А/Гонконг/1/68/162/35 и A/Shanghai/2/2013(H7N9)-PR8-IDCDC (обозначены на фиг. 1 как НК и Shan) обрабатывали эндонуклеазами рестрикции EcoRI, HindIII, BamHI, PstI, Bsa29I и BslFI соответственно. Рестрикционный анализ ДНК-копий сегментов РНК на фиг. 1 показал, что реассортант RA-35 имеет состав генома 6:2.

Антигенное соответствие гемагглютинина реассортанта RA-35 родительскому штамму было подтверждено в реакции торможения гемагглютинации (РТГА).

При исследовании антигенной специфичности в РТГА было показано, что штамм RA-35 не реагировал с гетерологичными типоспецифическими сыворотками. Реассортант A/Shanghai/НК/6:2 (H7N9) реагировал со специфическими иммунными крысиными сыворотками типа A/H7N9 и A/H7N3 (табл. 2).

Показано, что вакцинный кандидат RA-35 антигенно идентичен родительскому штамму дикого типа.

Кроме того, было проведено полногеномное секвенирование полученного реассортанта. Результаты секвенирования подтвердили сохранность у реассортанта RA-35 всего комплекса мутаций генов, унаследованных от штамма-донора и кодирующих негликозилированные белки (табл. 3).

Выявленные нуклеотидные и аминокислотные замены в генах реассортанта RA-35, кодирующих поверхностные белки, представлены в таблицах 4, 5.

Примечание: Жирным шрифтом выделены мутации, приводящие к замене аминокислоты, * - замена встречается в других вариантах последовательностей дикого вируса, имеющихся в базе данных

Характеристика полученного штамма

Пример 1. Репродуктивные свойства штамма RA-35 (А/Shanghai/HK/6:2 (H7N9)

Штамм вируса гриппа RA-35 тестировали на инфекционную активность путем заражения развивающихся куриных эмбрионов 10-дневного возраста в соответствии с Методическими указаниями 3.3.2.1758-03 "Методы определения показателей качества иммунобиологических препаратов для профилактики и диагностики гриппа". Готовили десятикратные падающие разведения вируссодержащей аллантоисной жидкости. Каждым разведением начиная с 10-4 до 10-10 заражали по 4 куриных эмбриона. Инкубировали 48 часов при температуре 32°C. Наличие вируса определяли в РГА, инфекционную активность вируса рассчитывали по методу Рида и Менча. Аналогичным образом определяли инфекционную активность в культуре клеток MDCK.

Штамм вируса гриппа A/Shanghai/ГК/6:2(H7N9) показал высокую репродуктивную активность в РКЭ. Гемагглютинирующая активность реассортанта RA-35 - 1:1024, инфекционная активность в РКЭ составила 9,25 lgЭИД50/0,2 мл. Репродуктивные свойства штамма вируса гриппа RA-35 в куриных эмбрионах и в культуре клеток MDCK представлены в таблице 6.

Пример 2. Заявляемый вакцинный штамм RA-35 безвреден для мышей и морских свинок.

Тестирование штамма вируса гриппа RA-35 на безвредность (аномальную токсичность) для лабораторных животных проводили на двух видах животных: линейных белых мышах Balb/c, самках, массой 18-20 г (5 шт.), и морских свинках обоего пола массой 250-350 г (3 шт.). В исследованиях использовали здоровых животных, на которых ранее не проводили какие-либо испытания. Испытания проводили в соответствии с методическими указаниями МУК 4.1/4.2.588-96.

В течение периода наблюдения (7 суток) после заражения все животные остались живы, и ни у одного из них не были выявлены видимые признаки заболевания. Масса каждого животного в день окончания наблюдения не уменьшилась по сравнению с исходной. Ни у одной морской свинки не развился некроз или абсцесс в месте введения.

Пример 3. Вакцинный штамм RA-35 иммуногеннен для мышей.

На основе реассортантных штаммов были подготовлены вакцинные препараты живой и инактивированной гриппозных вакцин (ЖГВ и ИГВ соответственно). Для получения ЖГВ накопленный вирусный материал реассортантных вирусов разводили фосфатно-солевым буфером (ФСБ) до концентрации 6,5 lgЭИД50/мл. Препараты ИГВ получали методом изопикнического центрифугирования в градиенте плотности сахарозы. Инактивацию проводили 0,02% формалином. Содержание НА в вакцинных препаратах оценивали методом электрофореза в полиакриламидном геле с последующей денситометрией. Препараты ИГВ содержали 15 мкг НА на дозу (0,5 мл). В качестве адъюванта использовали гидроксид алюминия - 500 мкг на дозу.

Препараты ЖГВ и ИГВ использовали для иммунизации мышей и исследования иммуногенности. Данные по содержанию антигемагглютинирующих и нейтрализующих антител к вирусам гриппа в сыворотках крови мышей, иммунизированных препаратами ЖГВ и ИГВ реассортантных штаммов (фиг. 2, 3), демонстрируют достоверное (р<0,05) повышение уровня антигемагглютинирующих и вируснейтрализующих антител по сравнению с контрольными животными.

Иммуногенность штамма вируса гриппа RA-35 A/Shanghai/ГК/6:2(H7N9)

После иммунизации мышей ЖГВ и ИГВ на основе реассортантного вируса RA-35 (A/Shanghai/ГК/6:2(H7N9) в сыворотках крови были выявлены антигемагглютинирующие (фиг. 2) и вируснейтрализующие (фиг. 3) антитела в титрах, достаточных для формирования защитного иммунитета.

Пример 4. Вакцинный штамм RA-35 обладает свойствами температурочувствительности и холодоадаптированности.

Донор А/Гонконг/1/68/162/35 является универсальным, то есть обладает как высокой репродуктивностью, так и маркерами аттенуации к человеку - ts-, са-фенотип. Донор ориентирован на получение реассортантных штаммов как для живой, так и для инактивированной гриппозных вакцин.

Реассортанты на основе донора А/Гонконг/1/68/162/35 также наследуют ts-, са-фенотип и приобретают более высокую инфекционную, гемаггютинирующую и репродуктивную активность.

Полученный реассортант RA-35 наследовал от штамма-донора А/Гонконг/1/68/162/35 ts-, са-фенотип - способность хорошо репродуцироваться при пониженной температуре и почти полную потерю способности к репродукции при повышенной температуре (табл. 8).

При 5-кратном пассировании при температуре 32°C в системе РКЭ степень температурочувствительности и холодоадаптированности, а также уровень репродукции не изменялись. Таким образом, реассортантный штамм удовлетворяет требованиям температурочувствительности и холодовой адаптации, предъявляемым к вакцинным штаммам для ЖГВ, и требованиям высокой репродуктивности для ИГВ.

Штамм вируса гриппа A/Shanghai/HK/6:2/2013 RA-35 (H7N9), депонированный в Государственную коллекцию вирусов ФГБУ «ФНИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России под №2833, для получения инактивированных и живых гриппозных вакцин против потенциально пандемического штамма вируса гриппа А (H7N9).



 

Похожие патенты:

Представленные изобретения относятся, в частности, к миовирусному бактериофагу Clo-РЕР-1, выделенному из природы и имеющему геном, представленный нуклеотидной последовательностью SEQ.

Представленные изобретения относятся, в частности, к миовирусному бактериофагу Esc-СОР-1, выделенному из природы и имеющему геном, представленный нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 1 (регистрационный №: КСТС 12662 ВР).

Представленные изобретения относятся, в частности, к миовирусному бактериофагу Esc-СОР-4, выделенному из природы и имеющему геном, представленный нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 1 (регистрационный №: KСТС 12663 ВР).

Изобретения относятся к области биотехнологии и касаются поксвирусного вектора, композиции, включающей такой вектор, способу десенсибилизации, индукции переносимости или подавления аллергической реакции, способу вакцинации субъекта и набору.

Изобретения относятся к области биотехнологии и касаются живого аттенуированного рекомбинантного герпесвируса кои (KHV), вектора экспрессии, включающего геном такого вируса, выделенной клетки, вакцины, способа профилактики у рыбы заболевания, вызываемого KHV, и иммуногенной композиции.

Изобретения относятся к области биотехнологии и касаются вакцинной композиции, способа иммунизации при использовании указанной композиции и набора для осуществления такого способа.

Изобретение относится к биохимии и вирусологии и касается способов и системы для упаковки репортерных молекул нуклеиновых кислот в нерепликативные трансдукторные частицы для использования в качестве репортерных молекул.

Предложенное изобретение относится к области биотехнологии. Предложен способ индукции иммунного ответа у индивидуума на чужеродный белковый антиген.

Предложены вакцина для профилактики краснухи и способ ее получения. Охарактеризованная вакцина включает сферические частицы вируса табачной мозаики и антигены вируса краснухи, адсорбированные на поверхности сферических частиц, взятые в массовом соотношении 10:1.

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и касается штамма вируса инфекционной анемии цыплят. Представленный штамм «ИК-4» выделен из паренхиматозных органов больных анемией цыплят-бройлеров.

Изобретение относится к области генной инженерии, конкретно к рекомбинантному получению антиангиогенных белков, и может быть использовано в медицине. Сконструирована рекомбинантная плазмидная ДНК pERIG-PGS, обеспечивающая синтез в клетках Escherichia coli гибридного белка GyrA-PGS, содержащего модифицированный мини-интеин Мхе GyrA и антиангиогенный пептид Пигастин - производное фрагмента [44-77] фактора роста пигментного эпителия человека с присоединенной к С-концу последовательностью Pro-Gly-Pro.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к способу сохранения клеток млекопитающего в течение длительного периода времени с использованием раствора для трансплантации клеток, содержащего 2,0-6,0% (масс./об.) трегалозы, либо соли указанной трегалозы, и 4,0-7,0% (масс./об.) декстрана, либо соли декстрана.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению химерных антигенных рецепторов (CAR), называемых многоцепочечными CAR, и может быть применено в медицине для противоопухолевой терапии.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к модифицированным гемагглютининам (ГА) вируса гриппа, и может быть использовано в медицине при получении лекарственного средства для лечения или предотвращения инфекции, вызванной вирусом гриппа Н5.
Изобретение относится к области биохимии и биотехнологии, в частности к продуцирующему L-лизин микроорганизму рода Corynebacterium. Указанный микроорганизм отличается тем, что в нем инактивирован по меньшей мере один секреторный белок, выбранный из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей SEQ ID NOs: 1, 7 и 13.

Предложено применение ми-РНК, мишенью которой является последовательность SEQ ID NO:1, имеющей нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:2, для лечения сухих глаз и/или глазной боли, а также для получения лекарственного средства для лечения сухих глаз и/или глазной боли.

Настоящее изобретение относится к биотехнологии. Описан способ получения мутантного белка VP2 вируса ящура (FMDV), отличающийся тем, что мутантный белок VP2 получают путем замены по меньшей мере одной аминокислоты парентеральной αА-спирали белка VP2 на аминокислоту, выбранную из группы, включающей в себя: Q, N, V, I, F, Y, W и Н, с получением αА-спирали, отличной от αА-спирали дикого типа, где мутанты выбирают из группы, состоящей из: 1) мутантов H87V, V90N, Y91F, S93H, S93Y, S93F, S93W, S93Q, L94V, S97V, S97I, S97Q и Y98F серотипа O; 2) мутантов H93F и H93Q серотипа A; 3) мутантов S93H, S93Y, S93W, S93F и Y98F серотипа SAT-2, где все номера положений указаны в соответствии с нумерацией аминокислот, используемой в SEQ ID NO: 1.

Изобретение относится к биотехнологии. Описан способ лечения или предотвращения миотонической дистрофии типа 1 (DM1) у индивидуума.

Изобретение относится к области биохимии, генной инженерии и биотехнологии, в частности к штамму бактерии Escherichia coli BL21(DE3) BpsOmpA - продуценту поверхностного протеина OmpA/MotB с молекулярной массой 36,9 кДа.

Изобретение относится к области биохимии, генной инженерии и биотехнологии, в частности к штамму бактерии Escherichia coli BL21(DE3) BpsOmp39 - продуценту поверхностного протеина Оmр39 с молекулярной массой 40,6 кДа.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к модифицированным гемагглютининам (ГА) вируса гриппа, и может быть использовано в медицине при получении лекарственного средства для лечения или предотвращения инфекции, вызванной вирусом гриппа Н5.

Изобретение относится к области медицинской биотехнологии и касается штамма вируса гриппа. Представлен штамм вируса гриппа АShanghaiНК6:22013, депонированный в Государственную коллекцию вирусов ФГБУ «ФНИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России под №2833. Штамм получен методом классической генетической реассортации на основе холодоадаптированного штамма АГонконг16816235 и рекомбинантного вируса AShanghai22013-PR8-IDCDC. От донора штамм унаследовал гены, кодирующие внутренние негликозилированные белки РВ1, РВ2, PA, NP, MP и NS. Гены, кодирующие поверхностные белки вируса - НА и NA, штамм унаследовал от вируса дикого типа -PR8-IDCDC). Штамм генетически стабилен при 5-кратном пассировании в 10-дневных развивающихся куриных эмбрионах и пригоден для производства моновалентной вакцины и вакцины трехкомпонентной. Может применяться в целях иммунизации населения против вирусов гриппа А подтипов Н7. 3 ил., 8 табл., 4 пр.

Наверх