Способ доставки биологически активных веществ в скаффолд

Изобретение относится к медицине, в частности к способу доставки биологически активных веществ в скаффолд. В качестве контейнеров используют тени эритроцитов, получаемых путем гипоосмотического шока нативных эритроцитов и инкубации их в растворе биологически активных веществ с последующим «замыканием» теней эритроцитов в изотонической среде. С целью максимального выхода гемоглобина и увеличения емкости теней эритроцитов для биологически активных веществ, в процессе их приготовления перед инкубацией с этими веществами, тени эритроцитов помещают в гипертонический раствор. С целью направленного влияния их содержимого на культивируемые клетки тени эритроцитов с инкапсулированными факторами помещают в структуру скаффолда в процессе ее формирования вместе с культивируемыми клетками. Осуществление изобретения позволяет пролонгированно поддержать жизнеспособность и пролиферативную активность фибробластов, мезенхимальных мультипотентных стволовых клеток как в культуральной среде, так и в скаффолдах. 3 пр.

 

Предлагаемое изобретение относится к медицине, биотехнологии, регенеративной медицине и может быть использовано в цитологии, гистологии, трансплантологии, биомедицинских исследованиях, клеточной биотехнологии и биоинженерии.

Важнейшей задачей тканевой инженерии является включение биоактивных веществ в структуру скаффолда для их постепенного высвобождения в процессе биорезорбции материала или регенерации ткани, восстанавливаемой с использованием скаффолда. Существует способ инкапсуляции ростовых факторов в системы лекарственной доставки, одной из которых являются липосомы. Аналогом предлагаемого изобретения может быть использование липосом в качестве контейнеров для переноса факторов роста (Monteiro N, Martins A, Reis RL, Neves NM. 2014 Liposomes in tissue engineering and regenerative medicine. J. R. Soc. Interface 11: 20140459. http://dx.doi.org/10.1098/rsif.2014.0459).

Однако этот способ достаточно сложен, требует соответствующего оборудования и, кроме того, существуют определенные ограничения инкапсулирования молекул в липосомы, такие как тип биоактивного агента, его конкретные физико-химические свойства и свойства самих липосом.

Системы доставки, как и сами скаффолды, должны иметь регулируемую скорость биодеградации, отсутствие токсичности и отрицательного влияния на структуру и биологические свойства клеток.

В качестве прототипа выбран способ, включающий использование в качестве контейнеров тени эритроцитов, получаемых путем гипоосмотического шока нативных эритроцитов и инкубации их в растворе биологически активных веществ с последующим «замыканием» теней эритроцитов в изотонической среде (SU 1718955 A1. Способ включения водорастворимого препарата в тени эритроцитов, Ж.Ш. Жумадилов, Т.П. Генинг, 15.03.92, Бюл. №10).

Однако способ имеет следующие недостатки. Заполненные тени эритроцитов вводятся внутривенно, поэтому направленного действия препаратов на культивированные клетки скаффолда не может происходить. Системное введение факторов роста обычно является малоэффективным, а иногда и опасным вследствие их короткого времени жизни, особенно в физиологических средах, неизбирательного биораспределения, потенциальной токсичности и риска канцерогенной активности.

Таким образом, включение биоактивных веществ в тени эритроцитов и размещение их в скаффолде решает несколько основных задач: локализованная доставка оптимальной концентрации ростовых факторов внутрь имплантата, сохранение биологической активности молекул, пролонгированное высвобождение веществ из теней эритроцитов. Кроме того, в прототипе в процессе создания теней эритроцитов высвобождается лишь часть гемоглобина, что снижает емкость теней для биологически активных веществ.

Задача предлагаемого изобретения - усовершенствование способа.

Технический результат - увеличение содержания в скаффолдах ростовых факторов, создание условий для их постепенного высвобождения из контейнеров и условий для их непосредственного влияния на культивируемые клетки. Использование теней эритроцитов в качестве контейнеров - носителей ростовых факторов.

Технический результат достигается за счет того, что в способе, включающем использование в качестве контейнеров тени эритроцитов, получаемых путем гипоосмотического шока нативных эритроцитов и инкубации их в растворе биологически активных веществ с последующим «замыканием» теней эритроцитов в изотонической среде, с целью максимального выхода гемоглобина и увеличения емкости теней эритроцитов для биологически активных веществ, в процессе их приготовления перед инкубацией с этими веществами, тени эритроцитов помещают в гипертонический раствор, а с целью направленного влияния их содержимого на культивируемые клетки тени эритроцитов с инкапсулированными факторами помещают в структуру скаффолда в процессе ее формирования вместе с культивируемыми клетками.

Способ доставки биологически активных веществ в скаффолд осуществляют следующим образом. Используют 1.5 мл донорских эритроцитов для приготовления теней эритроцитов. Отмывают их физиологическим раствором 2 раза путем центрифугирования при 3000 об./мин в течение 5 мин. Затем, добавляя в отмытые эритроциты по 10 мл ледяной дистиллированной воды, осуществляют гипоосмотический шок, центрифугируют 25 минут при 8000 об./мин, надосадочную жидкость сливают. Осадок суспензируют с 10 мл гипертонического раствора хлорида натрия (4%) для дальнейшего удаления оставшегося в тенях эритроцитов гемоглобина, центрифугируют 10 минут при 8000 об./мин, надосадочную жидкость удаляют. Полученные тени эритроцитов инкубируют с 4 мл раствора биологически активных веществ (например, смеси сыворотки крови и лизата тромбоцитов с добавлением фактора роста фибробластов) и разбавленной ледяной дистиллированной водой 1:1 в течение 20 минут при 4°C. Для «замыкания» мембраны эритроцитов восстанавливают изотоничность среды, добавляя физиологический раствор, и инкубируют в течение 30 мин при 37 С. После этого центрифугируют 10 минут при 4000 об./мин, надосадочную жидкость удаляют. Оставшиеся, заполненные биологически активными веществами, тени эритроцитов отмывают от находящейся вне теней биологически активных веществ, путем добавления 8 мл 0.6% хлористого натрия и центрифугируют 10 минут при 4000 об./мин, надосадочную жидкость удаляют. Для дальнейших исследований используют полученные тени эритроцитов с инкапсулированными биологически активными веществами.

Полученные тени эритроцитов с инкапсулированными в них биологически активными веществами использовали при оценке эффективности предложенного способа.

Пример 1

Проведены исследования, в которых изучали влияние теней эритроцитов с инкапсулированными ростовыми факторами на жизнеспособность и пролиферативную активность культуры дермальных фибробластов человека (ДФЧ). С этой целью к питательной ростовой среде (ДМЕМ с антибиотиками и глутамином) добавляли 10% от объема среды теней эритроцитов, включающих в себя смесь телячьей эмбриональной сыворотки и лизатом тромбоцитов с добавлением фактора роста фибробластов. В качестве положительного контроля использовали культуральную среду ДМЕМ с добавлением 10% ТЭС, отрицательный контроль - ДМЕМ без сыворотки. Культуру ДФЧ, 3-й пассаж засевали с концентрацией 10 тыс.клеток на см2 поверхности в чашки Петри площадью 7 см2 в объеме 3 мл питательной среды ДМЕМ с антибиотиками и глутамином с 10% ТЭС. Через сутки, после адгезии и распластывания клеток среду в чашках заменяли на контрольную и опытную. За ростом культуры наблюдали в течение 5 дней, после чего клетки были сняты с чашек Петри с подсчетом их концентрации на 1 см2 поверхности. Было установлено, что число клеток в положительном контроле (с культуральной средой DMEM содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки) через 5 суток составляло 49,233 тыс./см2, а в отрицательном контроле (DMEM без телячьей сыворотки) - 13,618 тыс./см2. В опыте, в котором вместо телячьей сыворотки использовались тени эритроцитов (0,3 мл) с инкапсулированной смесью сыворотки и лизатом тромбоцитов с добавлением фактора роста фибробластов, число клеток составляло 46,265 тыс./см2. Жизнеспособность клеток и в контрольных, и в опытных образцах составляла 97-99%.

В результате эксперимента показано, что включенные в тени эритроцитов факторы роста оказывают положительное влияние на пролиферативную активность ДФЧ. С помощью предлагаемого способа удается стимулировать жизнеспособность и пролиферативную активность фибробластов, мезенхимальных мультипотентных стволовых клеток как в культуральной среде, так и в скаффолдах.

Пример 2

Важнейшей задачей, решаемой с помощью предлагаемого способа, является постепенное высвобождение биологически активных веществ из контейнеров. В способе прототипа показано, что высвобождение антибиотиков из теней эритроцитов происходит постепенно при их внутривенном введении. Для проверки скорости высвобождения факторов роста из теней эритроцитов в условиях in vitro проведены следующие исследования. Тени эритроцитов, полученные описанным ранее способом, инкубировали с раствором 10% альбумина, разведенного 1: 1 дистиллированной водой. Заполненные ростовыми факторами тени эритроцитов, после их «замыкания» путем создания изотоничности среды, отмывали от находящейся вне теней альбумина, путем добавления физиологического раствора и центрифугирования 10 минут при 4000 об./мин, надосадочную жидкость удаляли. Добавляли 1 мл физиологического раствора, перемешивали и центрифугировали 10 минут при 4000 об./мин. Затем измеряли оптическую плотность супернатанта против физиологического раствора при длине волны 280 нм на спектрофотометре Spekol UV VIS (Zeiss, Германия). Установлено, что через сутки из теней эритроцитов высвобождается 54,5% инкапсулированного альбумина, через двое суток - 78%, через трое суток - 98%. Таким образом, данные исследования указывают на то, что в тени эритроцитов с помощью предполагаемого способа поступает белок - альбумин, который высвобождается из них постепенно.

Пример 3

Для проверки эффективности предлагаемого способа проведены следующие исследования. Описанным выше способом получали тени эритроцитов с инкапсуляцией в них биологически активных веществ - смеси сыворотки крови и лизата тромбоцитов с добавлением фактора роста фибробластов - опыт 1. Во втором опыте использовали те же тени эритроцитов, в которых инкапсулировали, вместо биологически активных веществ, физиологический раствор. В трех пробирках размещали фибробласты в физиологическом растворе с концентрацией клеток 400 тыс./100 мкл и тщательно перемешивали их с тенями эритроцитов из опыта 1 и опыта 2. В третью пробирку вместо теней эритроцитов помещали смесь фибробластов с физиологическим раствором (контроль). Во все три пробирки добавляли по 1,25 мл раствора фибриногена (25 мг/мл), тщательно перемешивали и добавляли раствор тромбина. Немедленно заливали эти смеси на силиконированные чашки Петри. Конечная концентрация клеток в скаффолде составляла 280 клеток/мм3. После полимеризации фибриногена поверх скаффолдов добавляли среду ДМЕМ + а + глутамин, а в контроле, без теней эритроцитов, еще и 10% раствор эмбриональной телячьей сыворотки. Помещали чашки Петри с полученным скаффолдом в клеточный инкубатор с 5% содержанием CO2 и температурой 37°C.

Количество клеток определяли через сутки с момента формирования скаффолда. Для этого от скаффолдов при помощи шаблона отделяли фрагменты площадью 0,64 см. В полученном фрагменте проводили анализ клеточной составляющей. Для визуализации ядер клеток в структуре скаффолда использовали метод флуоресцентной микроскопии, реализуемый на многофункциональном фотометре-имиджере Cytation 5 (BioTek, США). Проводили прижизненное окрашивание ядер клеток в скаффолде с применением флуорохрома Hoechst 3334 (США) обладающим высокой специфичностью к двухцепочечной молекуле ДНК (длина волны возбуждения 377 нм и длина волны эмиссии 447 нм). Окрашивание проводили в соответствии с протоколом производителя.

Как показали проведенные исследования, количество клеток (фибробластов) в скаффолде в контроле (без теней эритроцитов, но в присутствии в среде телячьей сыворотки), составляло 503 кл./мм3, а в опыте, в котором тени эритроцитов содержали биологически активные вещества - 600 кл./мм3. При этом телячья сыворотка в питательную среду не добавлялась. В опыте, в котором тени эритроцитов не содержали биологически активные вещества и в питательной среде не было телячьей сыворотки, число клеток составляло лишь 352 клетки мм3.

Таким образом, с помощью предполагаемого способа доставки биологически активных веществ в скаффолд возможно пролонгированное поддержание жизнеспособности и пролиферативной активности фибробластов, мезенхимальных мультипотентных стволовых клеток как в культуральной среде, так и в скаффолдах.

Способ доставки биологически активных веществ в скаффолд, включающий использование в качестве контейнеров тени эритроцитов, получаемых путем гипоосмотического шока нативных эритроцитов и инкубации их в растворе биологически активных веществ с последующим «замыканием» теней эритроцитов в изотонической среде, отличающийся тем, что с целью максимального выхода гемоглобина и увеличения емкости теней эритроцитов для биологически активных веществ, в процессе их приготовления перед инкубацией с этими веществами, тени эритроцитов помещают в гипертонический раствор, а с целью направленного влияния их содержимого на культивируемые клетки тени эритроцитов с инкапсулированными факторами помещают в структуру скаффолда в процессе ее формирования вместе с культивируемыми клетками.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области ветеринарии и представляет собой противопаразитарную композицию для защиты сельскохозяйственных животных, содержащую соединения из группы авермектинов, полимер и растворитель, отличающуюся тем, что дополнительно содержит ортосиликат полиола, выбранный из ортосиликата ксилита, или ортосиликата глицерина, или ортосиликата меглюмина, при этом композиция содержит соединения из группы авермектинов в инкапсулированном в полимерные микросферы виде и/или в свободном виде, причем компоненты в композиции находятся в определенном соотношении, масс.%.
Изобретение относится в области нанотехнологии и пищевой промышленности. Способ получения нанокапсул спирулины в каррагинане характеризуется тем, что в качестве оболочки нанокапсул используют каррагинан, а в качестве ядра - спирулину, при этом порошок спирулины медленно добавляют в суспензию каррагинана в бензоле в присутствии 0,01 г Е472с в качестве поверхностно-активного вещества, затем перемешивают при 1000 об/мин, после приливают хлороформ, после чего полученную суспензию отфильтровывают и сушат при комнатной температуре, при этом массовое соотношение ядро:оболочка составляет 1:1, или 1:3, или 1:5.

Изобретение относится к способу получения гидрогеля, включающему стадии: (а) обеспечения смеси, содержащей (a-i) реагент основной цепи, где реагент основной цепи имеет молекулярную массу в интервале от 1 до 100 кДа и представляет собой соединение такое, как определено в формуле изобретения, (a-ii) сшивающий реагент, где сшивающий реагент имеет молекулярную массу в интервале от 6 до 40 кДа и представляет собой соединение такое, как определено в формуле изобретения, и (a-iii) первый растворитель и по меньшей мере второй растворитель, где второй растворитель является несмешиваемым с первым растворителем, в массовом соотношении указанного по меньшей мере одного реагента основной цепи и указанного по меньшей мере одного сшивающего реагента в интервале от 1:99 до 99:1; и (b) полимеризации смеси со стадии (а) путем суспензионной полимеризации в гидрогель, причем полимеризацию на стадии (b) инициируют путем добавления основания.

Изобретение относится к медицине, в частности к композиции, состоящей из множества частиц, способу изготовления композиции и способу лечения желудочно-кишечного расстройства.
Изобретение относится в области нанотехнологии, медицины и пищевой промышленности. Способ получения нанокапсул лекарственных растений, обладающих иммуностимулирующим действием, где в качестве оболочки используют высоко- или низкоэтерифицированный яблочный или цитрусовый пектин, а в качестве ядра - настойку эхинацеи, характеризуется тем, что 5 мл настойки эхинацеи добавляют в суспензию высоко- или низкоэтерифицированного яблочного или цитрусового пектина в бензоле в присутствии 0,01 г препарата Е472с в качестве поверхностно-активного вещества при перемешивании 1300 об/мин, полученную суспензию отфильтровывают и сушат при комнатной температуре, при этом соотношение ядро : оболочка составляет 1:1 или 1:3.

Группа изобретений относится к молочной промышленности. Ферментированный молочный продукт содержит ферментированную молочную композицию и микрокапсулы окисляемого активного вещества, оболочка которых состоит из капсулирующей композиции, содержащей альгинат и аскорбил пальмитат.
Изобретение относится к области фармацевтики, а именно к способу получения нанокапсул лекарственных растений, обладающих кардиотоническим действием, характеризующемуся тем, что в качестве оболочки нанокапсул используют высоко или низкоэтерифицированный пектин, а в качестве ядра - настойку боярышника, при этом настойку боярышника добавляют в суспензию высоко- или низкоэтерифицированного яблочного или цитрусового пектина в гексане в присутствии 0,01 г препарата Е472с в качестве поверхностно-активного вещества при перемешивании 1300 об/мин, затем полученную суспензию отфильтровывают и сушат при комнатной температуре, при этом массовое соотношение ядро/оболочка составляет 1:3.

Группа изобретений относится к области фармацевтики и медицины и касается комбинации многофазного высвобождения по меньшей мере одного фактора роста на участке применения, содержащей средство доставки, содержащее по меньшей мере один первый фактор роста, и носитель, содержащий по меньшей мере один второй фактор роста, где средство доставки представляет собой жидкий или гелеобразный полимер, который представлен в жидкой форме для нанесения на носитель и выполнен для высвобождения по меньшей мере одного первого фактора роста в первоначальном профиле высвобождения за первый период времени, и носитель состоит из множества частиц, которые выполнены для высвобождения по меньшей мере одного второго фактора роста в профиле замедленного высвобождения за второй период времени.

Изобретение относится к фармацевтическим системам доставки гидрофобных лекарственных средств и композициям их содержащим. Заявлена фармацевтическая композиция, содержащая солюбилизированный эфир тестостерона, который выбран из тестостерона энантата, ундеканоата, ципионата и пальмитата.

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности. Быстро растворяющаяся пленка для лечения депрессивных расстройств, тревоги и расстройств адаптации содержит активный ингредиент пептидной природы, пленкообразователь, пластификатор, подсластитель и краситель, при этом в качестве активного ингредиента используют L-аргинил-L-тирозил-D-аланил-L-фенилаланил-L-глицин, в качестве пленкообразователя используют мультимодифицированный гороховый крахмал, в качестве пластификатора используют полисорбат-80, в качестве подсластителя используют комбинацию сорбита пищевого и сахарината натрия, в качестве красителя используют азорубин, при следующем соотношении компонентов, мас.

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к длительно действующим аналогам–агонистам рецепторов, подобных рецептору кальцитонина (CLR) и белков, модифицирующих активность рецептора (RAMPs).

Группа изобретений относится к химико-фармацевтической промышленности и представляет собой фармацевтическую композицию для перорального введения для лечения недостаточности надпочечников, содержащую носитель в виде микрочастиц; слой лекарственного средства, содержащий эффективное количество гидрокортизона и связывающий агент; изолирующий полимерный слой, содержащий по меньшей мере 14% масс./масс.

Изобретение относится к области фармацевтической промышленности и медицины, в частности к новым ПЭГилированным производным факторов эритропоэза, и касается создания новых молекул конъюгатов низкосиалированного дарбепоетина и полиэтиленгликоля, обладающих эритропоэз-стимулирующей активностью, не вызывающих резкого снижения глюкозы, с улучшенными фармакокинетическими и фармакодинамическими параметрами общей формулы (I) или (II).

Изобретение относится к комплексам типа сахаридная цепочка-полипептид, которые могут образовывать прозрачный и однородный гидрогель в широком диапазоне рН. Комплексы сахаридная цепочка-полипептид характеризуются тем, что данный полипептид представляет собой полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, состоящую из 8-34 аминокислотных остатков, в которой чередуются полярные и неполярные аминокислотные остатки, и с данным полипептидом связана одна или несколько сахаридных цепочек, и общее число сахаридных остатков, присутствующих в одной или нескольких сахаридных цепочках, связанных с указанным полипептидом, составляет 5 или больше.

Изобретение относится к области биохимии. Описана группа изобретений, включающая конъюгат антитело-лекарственное средство для лечения опухоли и/или рака, лекарственное средство, противоопухолевое лекарственное средство и/или противораковое лекарственное средство, содержащие вышеуказанный конъюгат антитело-лекарственное средство, фармацевтическую композицию, способ лечения опухоли и/или рака, промежуточное соединение лекарственное средство-линкер, линкер для получения вышеуказанного конъюгата антитело-лекарственное средство.

Настоящее изобретение относится к иммунологии. Предложено антитело, способное связывать рецептор пролактина (PRLR).

Группа изобретений относится к двухслойному комбинированному препарату для лечения диабета, содержащему слой гемиглиптина и слой метформина, и к способу его получения.

Группа изобретений относится к химико-фармацевтической промышленности и представляет собой способ лечения Ph+ лейкемии у субъекта, включающий пероральное введение фармацевтической композиции ежедневно один раз в сутки, и саму фармацевтическую композицию в виде капсул, характеризующуюся следующим составом и соотношением компонентов, масс.%: Группа изобретений позволяет получить новую эффективную при лечении Ph+ лейкемии фармацевтическую композицию, обладающую оптимальными характеристиками стабильности и совместимости компонентов.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к иммуногенным композициям гастрина-17, и может быть использовано в медицине для лечения заболеваний, связанных с патологией секреции гастрина.

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности и представляет собой биологически активную композицию на основе трийодида 1,3-диалкилбензимидазолия общей формулы I, ,где R1 и R3=(C1-С6) алкил, R2=(C1-С6) алкил, водород, характеризующуюся тем, что включает нуклеофильное хелатообразующее средство при соотношении компонентов трийодид 1,3-диалкилбензимидазолия и хелатообразующее средство соответственно 1:1-60 мас./об.

Группа изобретений относится к созданию лекарственного средства для повышения устойчивости млекопитающих к переохлаждению. Средство содержит фармацевтическую композицию препаратов, содержащую 0,78-1,18 мас.% пропранолола, 0,015-0,024 мас.% резерпина, 0,078-0,12 мас.% ивабрадина, 0,098-0,18 мас.% дифенгидрамина, 0,025-0,035 мас.% перициазина, 0,25-0,35 мас.% серотонина гидрохлорид, 0,07-0,12 мас.% пропицила, 0,07-0,16 мас.% сульфата магния, 98-98,61 мас.% фармацевтически приемлемого растворителя. Также предлагается способ повышения устойчивости организма млекопитающих к переохлаждению, заключающийся в введении терапевтически эффективного количества средства. Техническим результатом является повышение резистентности клеток жизненно важных органов и тканей к переохлаждению. 3 н.п. ф-лы, 2 ил., 2 пр.

Изобретение относится к медицине, в частности к способу доставки биологически активных веществ в скаффолд. В качестве контейнеров используют тени эритроцитов, получаемых путем гипоосмотического шока нативных эритроцитов и инкубации их в растворе биологически активных веществ с последующим «замыканием» теней эритроцитов в изотонической среде. С целью максимального выхода гемоглобина и увеличения емкости теней эритроцитов для биологически активных веществ, в процессе их приготовления перед инкубацией с этими веществами, тени эритроцитов помещают в гипертонический раствор. С целью направленного влияния их содержимого на культивируемые клетки тени эритроцитов с инкапсулированными факторами помещают в структуру скаффолда в процессе ее формирования вместе с культивируемыми клетками. Осуществление изобретения позволяет пролонгированно поддержать жизнеспособность и пролиферативную активность фибробластов, мезенхимальных мультипотентных стволовых клеток как в культуральной среде, так и в скаффолдах. 3 пр.

Наверх