Способ оценки продуктивности рекомбинантных трансформантов дрожжей pichia pastoris, секретирующих фитазы, относящиеся к кислым гистидиновым фосфатазам



Способ оценки продуктивности рекомбинантных трансформантов дрожжей pichia pastoris, секретирующих фитазы, относящиеся к кислым гистидиновым фосфатазам
Способ оценки продуктивности рекомбинантных трансформантов дрожжей pichia pastoris, секретирующих фитазы, относящиеся к кислым гистидиновым фосфатазам

Владельцы патента RU 2665836:

Федеральное государственное бюджетное учреждение "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов Национального исследовательского центра "Курчатовский институт" (НИЦ "Курчатовский институт" - ГосНИИгенетика) (RU)
Акционерное общество "Биоамид" (RU)

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ оценки продуктивности рекомбинантных трансформантов дрожжей Pichia pastoris, секретирующих фитазы. Способ включает точечное высевание колоний оцениваемых трансформантов на модифицированную диагностическую среду, представляющую собой минимальную питательную среду с добавлением витаминов, микроэлементов и фитата натрия в концентрации 0,5-1.0 (мас.%), с добавлением последовательно молочной кислоты до конечной концентрации 0,17-0,18 (мас.%), CaCl2 до концентрации 0,5-0,8 (мас.%) и метанола до концентрации 1,0-1,5 (мас.%), инкубацию на ней при 28-32°С в течение 24-48 ч и оценку продуктивности по соотношению диаметров зоны просветления и зоны нанесенной колонии, чем больше величина соотношения указанных диаметров, тем выше продуктивность. Способ обеспечивает отбор высокопродуктивных рекомбинантных трансформантов дрожжей Pichia pastoris, секретирующих фитазы, относящиеся к кислым гистидиновым фосфатазам. 1 табл., 2 пр., 2 ил.

 

Изобретение относится к биотехнологии и предназначено для отбора высокопродуктивных рекомбинантных трансформантов дрожжей Pichia pastoris при конструировании штаммов-продуцентов, секретирующих фитазы, относящиеся к классу кислых гистидиновых фосфатаз.

Для улучшения питательных свойств растительных кормов в сельском хозяйстве широкое распространение получили ферменты - фитазы, относящиеся к классу кислых гистидиновых фосфатаз, катализирующие гидролиз фитатов (миоинозитол гексакисфосфатов) с отщеплением неорганического фосфата при кислых значениях рН среды. В настоящее время фитазы для сельскохозяйственных нужд производятся микробиологическим способом, в основном с использованием рекомбинантных дрожжевых продуцентов. Потребность промышленности в эффективных продуцентах постоянно возрастает [Hosseinkhani В., Emtiazi G., Nahvi I. Analysis of phytase producing bacteria (Pseudomonas sp.) from poultry faeces and optimization of this enzyme production. Afr. J. Biotechnol, 2009, 8(17), 4229-4232.]. Наиболее часто для высокоэффективной продукции гетерологичных белков используют метилотрофные дрожжи Pichia pastoris [Daly R., Hearn M.T. Expression of heterologous proteins in Pichia pastoris: a useful experimental tool in protein engineering and production. J. Mol Recognit., 2005, 18(2), 119-138. doi: 10.1002/jmr.687].

Известен способ отбора природных бактериальных штаммов, продуцирующих внеклеточную фитазу [S. Sreedevi, B.N. Reddy Screening for efficient phytase producing bacterial strains from different soils. International Journal of Biosciences Vol. 3, No. 1, p.76-85, 2013.] Способ заключается в том, что колонии исследуемых бактериальных штаммов высевают на чашки с диагностической средой, в качестве которой используют полную питательную среда (рН 7,0), содержащую в своем составе нерастворимый фитат кальция, и инкубируют при 37°С в течение 72 часов. Образование зоны просветления вокруг колонии свидетельствует о наличии фитазной активности, так как происходит гидролиз фитата кальция. Оценку продуктивности осуществляют по соотношению диаметров зоны просветления и зоны нанесенной колонии.

Однако, данный способ не подходит для дрожжей P. pastoris, так как для их роста полную питательную среду необходимо дополнить источником углерода, а фитазы класса кислых гистидиновых фосфатаз практически не диагностируются при нейтральном рН (оптимум рН для работы таких ферментов лежит в кислой области).

Известен способ отбора наиболее продуктивных трансформантов дрожжей Р. pastoris [Cheng Li, Ying Lin, Xueyun Zheng, Nuo Pang, Xihao Liao, Xiaoxiao Liu, Yuanyuan Huang Shuli Liang Combined strategies for improving expression of Citrobacter amalonaticus phytase in Pichia pastoris, BMC Biotechnology 2015, 15:88], основанный на двустадийном культивировании трансформантов в жидких полных питательных средах: сначала BMGY, где в качестве единственного источника углерода содержится глицерин, а затем в среде BMMY с индуктором экспрессии метанолом. Процесс культивирования занимает 5 суток, и затем измеряют фитазную активность в культуральной жидкости по модифицированной методике Зиля [Zyla К, Koreleski J, Swiatkiewicz S, Wikiera A, Kujawski M, Piironen J, et al. Effects of phosphorolytic and cell wall-degrading enzymes on the performance of growing broilers fed wheat-based diets containing different calcium levels. Poult Sci. 2000;79(l):66-76].

Методика заключается в приготовлении реакционной смеси, содержащей в своем составе 5 мМ фитат натрия, 100 мМ натрий ацетатный буфер (рН 5,5) и исследуемый образец супернатанта, с последующей инкубацией при температуре 37°С в течение 30 мин, окрашиванием колорирующим раствором в течение 10 мин и измерением оптической плотности на спектрофотометре при длине волны 415 нм. Такой способ отбора является длительным и трудоемким.

Задачей изобретения является расширение арсенала способов оценки продуктивности рекомбинантных трансформантов дрожжей Pichia pastoris, секретирующих фитазы, относящиеся к кислым гистидиновым фосфатазам.

Поставленная задача решена путем разработки способа оценки продуктивности рекомбинантных трансформантов дрожжей Pichia pastoris, секретирующих фитазы, относящиеся к кислым гистидиновым фосфатазам, включающего точечное высевание колоний оцениваемых трансформантов на модифицированную диагностическую среду, представляющую собой минимальную питательную среду след состава (мас.%): Na2HPO4 - 0,6; КН2РО4 - 0,3; NaCl - 0,05; NH4CL - 0,1; MgSO42O - 0,065; агар - 2 с добавлением витаминов, микроэлементов и фитата натрия в концентрации (мас. %), фитат натрия 0,5 - 1.0, в которую последовательно добавляют молочную кислоту до конечной концентрации 0,17 - 0,18, CaCl2 до концентрации 0,5 - 0,8 и метанол до концентрации 1,0 - 1,5, инкубацию на ней при 28 - 32°С в течение 24-48 ч. и оценку продуктивности по соотношению диаметров зоны просветления и зоны нанесенной колонии, чем больше величина соотношения указанных диаметров, тем выше продуктивность трансформанта.

Существенными признаками данного изобретения являются использование молочной кислоты как подкисляющего агента, использование метанола в качестве единственного источника углерода, а также последовательность добавления компонентов среды (молочная кислота, затем CaCl2, затем метанол). Только совокупность указанных признаков обеспечивает решение поставленной задачи.

Витамины и микроэлементы добавляют в питательную среду с целью улучшить рост дрожжей. Для этого может быть использован любой витаминно-минеральный комплекс, подходящий для выращивания дрожжей на минимальной питательной среде [например, Бабьева И.П., Голубев В.И. методы выделения и идентификации дрожжей. М.: Пищевая промышленность, 1979, стр.48.].

Изобретение осуществляют следующим образом.

Готовят плотную минимальную питательную среду, содержащую фосфаты натрия и калия, хлорид натрия и аммония, сульфат магния и агар. Среду стерилизуют при нагревании, немного остужают, вносят стерилизованный раствор витаминов и микроэлементов, подходящих для дрожжей [например, Бабьева И.П., Голубев В.И. Методы выделения и идентификации дрожжей. М.: Пищевая промышленность, 1979, 2-254.] разливают по стерильным пробиркам, в которые добавляют стерилизованный раствор фитата натрия в концентрации (мас. %) 0,5 -1.0 и перемешивают. Фитат натрия можно добавить в среду и ранее, но предпочтительно добавлять его уже в пробирки, так как в этом случае легче осуществить тщательное перемешивание. Затем еще в горячий раствор последовательно добавляют молочную кислоту до конечной концентрации (мас. %), 0,17 - 0,18, CaCl2 до концентрации (мас. %.) 0,5 - 0,8 и метанол до концентрации (мас %.) 1,0 - 1,5. После добавления каждого компонента раствор тщательно перемешивают. Затем раствор переливают в чашки Петри и дают застыть. На чашку с диагностической средой точечно высевают тестируемые трансформанты дрожжей P. Pastoris и осуществляют инкубацию при 28 - 32°С в течение 24-48 ч. По окончании инкубации измеряют диаметры зон просветления (D) и колоний (Z) и по соотношению диаметров зоны просветления и зоны нанесенной колонии осуществляют оценку продуктивности тестируемых трансформантов.

Изобретение проиллюстрировано следующими фигурами графического изображения.

Фиг. 1 Экспрессионная плазмида pPIC9α-Phy, содержащая в своем составе ген, кодирующий бактериальную фитазу С. freundii

Фиг. 2. Зоны просветления вокруг колоний трансформантов P. pastoris на чашке с модифицированной диагностической средой после 24 часов культивирования.

Изобретение проиллюстрировано следующими примерами.

Пример 1. Получение трансформантов дрожжей P. pastoris, содержащих в составе хромосомы ген фитазы С.freundii

Клонирование гена, кодирующего бактериальную фитазу из Citrobacter freundii, относящуюся к классу кислых гистидиновых фосфатаз, осуществляют в составе коммерческого интеграционного экспрессионного вектора pPIC9α (Invitrogen) под сильным промотором АОХ1, индуцируемым метанолом.

Данная экспрессионная система наиболее востребована для получения ферментов в промышленности [Macauley-Patrick S., Fazenda M.L., McNeil В., et al. Heterologous protein production using the Pichia pastoris expression system. Yeast, 2005; 22, 249-270].

Фрагмент ДНК, содержащий кодирующую область гена бактериальной фитазы из С.freundii синтезируют методом ПЦР с использованием праймеров PhyC-F aagaattcgaagagcagaacggtatga и PhyC-R agcggccgcttacttattccgtaactg. В качестве матрицы используют общую ДНК бактерии С, freundii. Для получения экспрессионной плазмиды амплифицированные фрагменты ДНК обрабатывают эндонуклеазами рестрикции EcoRl, Notl и лигируют с ДНК аналогично расщепленного экспрессионного вектора pPIC9α. Полученной плазмидой трансформируют клетки Е. coli. Трансформанты отбирают по устойчивости к ампициллину. Плазмидную ДНК, выделенную из отобранных клонов, идентифицируют с помощью рестрикционного анализа.

Схематическое изображение плазмиды, содержащей в своем составе ген фитазы, представлено на фиг. 1.

Экспрессионную плазмиду обрабатывают эндонуклеазой рестрикции Bgfll, получаот экспрессионные кассеты, содержащие в своем составе плечи для интеграции, ген фитазы под индуцибельным промотором АOX1 и сигнальным пептидом, представляющим пре-про-последовательность α-фактора дрожжей S. cervisiae, селективный маркер HIS4.

Экспрессионными кассетами трансформируют клетки дрожжей P. pastoris. Трансформанты получают на минимальной среде следующего состава (мас. %): Na2HPO4 - 0,6; КН2РО4 - 0,3; NaCl - 0,05; NH4CL - 0,1; MgSO42O - 0,065; агар - 2; глюкоза - 2; CaCl2 - 0,07; биотин, мг - 0,0002; кальций пантотенат - 0,04; фолиевая кислота - 0,0002; ниацин - 0,04; р-аминобензойная к-та - 0,02; пиридоксин гидрохлорид - 0,04; рибофлавин - 0,02; тиамин гидрохлорид - 0,04; борная кислота -0,05; CuSO4 - 0,004; KJ - 0,01; FeCl3 - 0,02; натрий молибдат - 0,02; ZnSO4- 0,04. Полученные трансформанты проверяют на наличие целевого гена в составе хромосомной ДНК методом ПЦР с использованием праймеров PhyC-F aagaattcgaagagcagaacggtatga и PhyC-R agcggccgcttacttattccgtaactg. Наличие ПЦР-фрагментов размера 1236 п.н. подтверждает присутствие гена фитазы С.freundii в составе хромосом полученных трансформантов.

Пример 2. Оценка продуктивности полученных трансформантов дрожжей P. pastoris в чашечном тесте с модифицированной диагностической средой

Диагностическую среду готовят следующим образом: раствор, содержащий (мас. %): Na2HPO4 - 0,6; КН2РO4 - 0,3; NaCl - 0,05; NH4Cl - 0,1; MgSO42O - 0,065; агар - 2; стерилизуют при 121°С и 0,8 атм, остужают до 60°, вносят в него стерильный раствор витаминов и микроэлементов следующего состава (мас. %): биотин, мг - 0,0002; кальций пантотенат - 0,04; фолиевая кислота - 0,0002; ниацин - 0,04; р-аминобензойная к-та - 0,02; пиридоксин гидрохлорид - 0,04; рибофлавин - 0,02; тиамин гидрохлорид - 0,04; борная кислота - 0,05; меди сульфат - 0,004; калий йодид - 0,01; железа хлорид - 0,02; натрий молибдат - 0,02; цинк сульфат - 0,04 и разливают по стерильным пробиркам, в которые добавляют раствор фитата натрия (предварительно стерилизованный фильтрованием) до концентрации 0,75, перемешивают на вортексе.

Затем добавляют молочную кислоту (89%) до концентрации (мас. %) 0,18, перемешивают, добавляют стерильный раствор 1М CaCl2 до концентрации (мас. %) 0,56, перемешивают до однородного состояния образовавшийся белый осадок нерастворимого фитата кальция и добавляют метанол до концентрации (мас. %) 1,19%. Затем перемешивают и разливают по чашкам.

На чашку с диагностической средой точечно высевают полученные рекомбинантные трансформанты дрожжей P. pastoris. После 24 ч культивирования при 30°С измеряют диаметры зон просветления (D) и колоний (Z) (фиг. 2).

Наличие фитазной активности определяют по появлению зоны просветления вокруг колонии. О величине продуктивности трансформантов судят по соотношению значений диаметров зоны просветления и колонии.

Чем выше продуктивность трансформанта, тем больше величина соотношения указанных диаметров, т.е. значение D/Z. Результаты для трансформантов 1-4 приведены в таблице.

Для проверки выводов, сделанных на основе результатов чашечного теста, проведено количественное измерение активности тестируемой бактериальной фитазы.

Для этого штаммы выращивают на жидкой среде YPD [Бабьева И.П., Голубев В.И. Методы выделения и идентификации дрожжей. М.: Пищевая промышленность, 1979, 2-254.] с добавлением 1% глюкозы в течение 24 ч, затем индуцируют экспрессию гена фитазы путем добавления 2% метанола каждые 24 ч в течение 5 суток. Количественно продуктивность трансформантов оценивают по активности фитазы, образовавшейся в культуральной жидкости, для чего клетки осаждают центрифугированием и в отобранном супернатанте анализируют фитазную активность модифицированным методом Фиске-Субарроу [Bae L.J., Yanke K.J., Cheng H.D., et al. A novel staining method for detecting phytase activity. J Microbiol Methods, 1999, 39(1), 17-22.]. Результаты измерения продуктивности трансформантов представлены в таблице.

Как видно из данных, представленных в таблице 1, количественные измерения продуктивности трансформантов проведенные модифицированным методом Фиске-Субарроу, подтверждают результаты, полученные заявляемым способом.

Таким образом, заявляемый способ достаточно просто и быстро позволяет оценить продуктивность и отобрать наиболее продуктивные рекомбинантные трансформанты дрожжей P. pastoris, секретирующих фитазы, относящиеся к кислым гистидиновым фосфатазам.

Способ оценки продуктивности рекомбинантных трансформантов дрожжей Pichia pastoris, секретирующих фитазы, относящиеся к кислым гистидиновым фосфатазам, включающий точечное высевание колоний оцениваемых трансформантов на модифицированную диагностическую среду, представляющую собой минимальную питательную среду (мас.%): Na2HPO4 - 0,6; КН2РО4 - 0,3; NaCl - 0,05; NH4CL - 0,1; MgSO42O - 0,065; агар - 2 с добавлением витаминов и микроэлементов, необходимых для роста указанных дрожжей, а также фитата натрия в концентрации (мас.%): фитат натрия 0,5-1.0, в которую последовательно добавляют молочную кислоту до конечной концентрации (мас.%) 0,17-0,18, СаСl2 до концентрации (мас.%) 0,5-0,8 и метанол до концентрации (мас.%) 1,0-1,5, инкубацию на ней при 28-32°С в течение 24-48 ч и оценку продуктивности по соотношению диаметров зоны просветления и зоны нанесенной колонии, чем больше величина соотношения указанных диаметров, тем выше продуктивность.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ диагностики генетических нарушений, являющихся причиной бесплодия супружеских пар, включающий в себя комплексное определение мутаций в генах тромбофилии, фолатного цикла и аллелей HLA, где оценку генов в гомозиготном и гетерозиготном состояниях проводят в соответствии с разработанной балльной шкалой, присваивая генетическим факторам в образцах крови женщин следующие значения: F2 G/A - 4 балла, F2 А/А - 5 баллов, F5 G/A - 4 балла, F5 А/А - 5 баллов, F7 G/A - 0 баллов, F7 А/А - -1 балл, F13 G/T - 0 баллов, F13 Т/Т - -1 балл, FGB G/A - 1 балл, FGB А/А - 2 балла, ITGA2 С/Т - 2 балла, ITGA2 Т/Т - 1 балл, ITGB3 Т/С - 3 балла, ITGB3 С/С - 3 балла, PAI-1 5G/4G - 1 балл, PAI-1 4G/4G - 3 балла, MTHFR:677 С/Т - 2 балла, MTHFR:677 Т/Т - 3 балла, MTHFR: 1298 А/С - 1 балл, MTHFR: 1298 С/С - 2 балла, MTR A/G - 2 балла, MTR G/G - 1 балл, MTRR A/G - 1 балл, MTRR G/G - 2 балла; при наличии у супругов одной общей специфичности системы HLA - 0 баллов, двух - 1 балл, трех - 2 балла, четырех - 3 балла, пяти - 4 балла, шести или семи - 5 баллов, восьми - 6 баллов, девяти - 7 баллов, десяти - 8 баллов, общих специфичностей нет - -1 балл; заключение о том, что бесплодие с высокой вероятностью ассоциировано с генетическими причинами, делают при суммарном количестве баллов 18 и более, вероятность выше среднего - 14-17 баллов, бесплодие не детерминировано генетическими факторами -13 баллов и менее; заключение о благоприятном прогнозе при проведении вспомогательных репродуктивных технологий делают при суммарном количестве баллов 13 и менее.

Предложенная группа изобретений относится к области молекулярной биологии и медицины. Предложены способ и набор для специфической идентификации по меньшей мере одной последовательности ДНК в образце путем проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР), включающие одну пару праймеров, специфичных для этой последовательности ДНК, и пару зондов, в которой один представляет собой олигонуклеотидный мишень-специфичный зонд, имеющий 3'-сегмент, комплементарный идентифицируемому участку последовательности ДНК и содержащий метку, и 5'-сегмент, некомплементарный идентифицируемой последовательности ДНК и содержащий метку, а другой - олигонуклеотидный сигнальный зонд, комплементарный 5'-сегменту мишень-специфичного зонда и содержащий метку.

Изобретение относится к медицинской микробиологии. Изобретение может быть использовано при изучении нетоксигенных штаммов холерных вибрионов различного происхождения на молекулярно-биологическом уровне с целью установления их роли в этиологии спорадических случаев и вспышек диарейных заболеваний.

Изобретение относится к области ветеринарии и предназначено для диагностики мутантного аллеля, вызывающего короткий позвоночник или брахиспину у крупного рогатого скота.

Изобретение относится к области биологии и экспериментальной медицины. Предложен способ оценки фармакологических и токсических свойств веществ - потенциальных лигандов AHR человека - с использованием линии мух Drosophila melanogaster.
Предложенная группа изобретений относится к области медицины. Предложены способ и тестовый набор для определения предрасположенности пациента к тяжелому периодонтальному заболеванию и/или к высокому риску прогрессирования периодонтального заболевания.

Изобретение относится к области медицинской диагностики и предназначено для прогнозирования риска развития инсульта у мужчин русской национальности, уроженцев Центрального Черноземья.

Изобретение относится к области медицинской диагностики и предназначено для прогнозирования риска развития эссенциальной гипертензии у женщин. Проводят анализ полиморфизмов генов матриксных металлопротеиназ ММP-1 и ММP-3 и прогнозируют высокий риск развития эссенциальной гипертензии у женщин при выявлении сочетания генотипа 1G/1G по локусу rs1799750 ММP-1 и генотипа 6A/6А по локусу rs3025058 ММP-3.

Изобретение относится к биотехнологии. Описаны композиции и способы для определения находящихся в системе кровообращения биомолекул до, во время и/или после лечения пациента противораковым или противоопухолевым лекарственным препаратом (или предполагаемым лекарственным препаратом).

Изобретение относится к области медицины и предназначено для идентификации генетических маркеров поздней формы болезни Паркинсона. Осуществляют подготовку образцов ДНК из взятого у пациентов с болезнью Паркинсона биологического материала.

Изобретение относится к прикладной микробиологии, биотехнологии и микробиологической промышленности. Способ биосинтеза нуклеазы бактерий Serratia marcescens предусматривает добавление митомицина С в количестве 0,01-1,0 мг/л культуральной жидкости в период экспоненциального роста бактерий Serratia marcescens на среде LB.
Изобретение относится к биотехнологии. Способ получения карбоксипептидазы В из поджелудочной железы свиней предусматривает гомогенизацию животного сырья, автолиз, экстракцию двойным объемом буферного раствора, содержащим 0,01М КH2PO4 0.001 М ZnCl2 при температуре 65°С с получением экстракта.

Изобретение относится к биотехнологии. Штамм бактерий Serratia species К-57, обладающий РНКазной и ДНКазной активностью, депонирован в Коллекции бактерий, бактериофагов и грибов Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора» под регистрационным номером В-1289.

Изобретение относится к области биологического обезвреживания микотоксинов. Способ основан на применении гексагистидинсодержащей органофосфатгидролазы, проявляющей высокую лактоназную активность с широким спектром действия, которую вводят в виде высокоочищенного растворимого или регидратированного лиофилизованного препарата, или ферментного полиэлектролитического комплекса, или препарата иммобилизованного фермента, или супернатанта клеточного гомогената в реакционную среду, содержащую микотоксины в концентрации до 0,5 г/кг или 0,5 г/л с последующим проведением процесса гидролиза лактона до 95-100%.

Группа изобретений относится к биотехнологии. Предложена плазмида pET40CmAP/OmpF размером 8767 пар оснований (п.о.), определяющая синтез рекомбинантного гибридного бифункционального полипептида CmAP/OmpF.

Изобретения относятся к медицине, в частности к фармацевтической промышленности. Предложены субстанция протеолитического фермента на основе Протосубтилина ГЗХ и композиция для лечения гнойно-некротических ран.
Изобретение относится к биотехнологии. Способ получения комбинированного ферментного препарата бета-галактозидаз предусматривает подготовку лактозосодержащего сырья с массовой долей лактозы 3-15%.

Изобретение относится к области биотехнологии. Штамм Micrococcus luteus, депонированный под регистрационным номером В-12410 во Всеросиийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов ФГУП ГосНИИГенетика, является продуцентом сайт-специфической метилзависимой эндонуклеазы MluVI.

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к способу получения рекомбинантного штамма бактерий Escherichia coli N106 (pM.AgsI) . Рекомбинантный штамм бактерий Escherichia coli N106 (pM.AgsI) получают трансформацией клеток штамма Escherichia coli RR1 плазмидой pM.AgsI-106, продуцирующий ДНК-метилтрансферазу M.AgsI, узнающую нуклеотидную последовательность ДНК 5′-TTSAA-3′ и метилирующую внешний остаток аденина этой последовательности с образованием 5′-TTSA(m6A)-3′.
Изобретение относится к области биотехнологии и касается способа восстановления чувствительного слоя чипов биосенсоров. Способ предусматривает обработку чувствительного слоя чипа биосенсора смесью трипсина и общей фракцией протеаз гепатопанкреаса камчатского краба (при соотношении 1,5:1) в буфере, содержащем 3 мМ хлорида кальция, 100 мМ хлорида натрия, 50 мМ трис-HCl, рН 8,0, при температуре в диапазоне 35-40°С с последующей экспозицией в течение 4 ч.

Группа изобретений относится к биоинженерии и биотехнологии. Предложены трансформант дрожжей Pichia sp.

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ оценки продуктивности рекомбинантных трансформантов дрожжей Pichia pastoris, секретирующих фитазы. Способ включает точечное высевание колоний оцениваемых трансформантов на модифицированную диагностическую среду, представляющую собой минимальную питательную среду с добавлением витаминов, микроэлементов и фитата натрия в концентрации 0,5-1.0, с добавлением последовательно молочной кислоты до конечной концентрации 0,17-0,18, CaCl2 до концентрации 0,5-0,8 и метанола до концентрации 1,0-1,5, инкубацию на ней при 28-32°С в течение 24-48 ч и оценку продуктивности по соотношению диаметров зоны просветления и зоны нанесенной колонии, чем больше величина соотношения указанных диаметров, тем выше продуктивность. Способ обеспечивает отбор высокопродуктивных рекомбинантных трансформантов дрожжей Pichia pastoris, секретирующих фитазы, относящиеся к кислым гистидиновым фосфатазам. 1 табл., 2 пр., 2 ил.

Наверх