Способ оценки эффективности конъюгативного переноса в полимикробном сообществе

Изобретение относится к клинической микробиологии. Предложен способ оценки эффективности конъюгативного переноса в полимикробных сообществах. Способ включает оценку конъюгации плазмиды одновременно параллельно в планктоне и в формирующейся микробной биопленке в присутствии бактерий ассоциантов (опыт) и в отсутствии их (контроль). Затем рассчитывают частоту конъюгации и сравнивают. Если частота конъюгации в опыте увеличивается в 5 раз и более, то эффективность конъюгативной передачи в присутствии других бактерий считают высокой, если частота конъюгации в опыте уменьшается в 5 раз и более, то эффективность конъюгативной передачи в присутствии других бактерий оценивают как низкую, если частота конъюгации увеличивается/уменьшается менее чем в 5 раз, то эффективность конъюгативной передачи в присутствии других бактерий не изменяется. Способ обеспечивает объективность оценки эффективности конъюгативного переноса. 1 табл., 4 пр.

 

Изобретение относится к области медицины, клинической микробиологии и касается способа оценки конъюгативного переноса в полимикробных сообществах в планктонной и сессильной культуре (биопленках).

Многократно была подтверждена способность бактерий передавать гены резистентности к различным антибиотикам путем горизонтального переноса (Karami N. et al. Transfer of an ampicillin resistance gene between two Escherichia coli strains in the bowel microbiota of an infant treated with antibiotics. J. Antimicrob. Chemother. 2007. 5: 3; Phornphisutthimas S. et al. Conjugation in Escherichia coli. Biochem. Mol. Boil. Educ. 2007. 35(6): 440-445; Молчанова E.B., Агеева Н.П. Изучение возможности конъюгационной передачи плазмиды Rts1-Tn9 от Escherichia coli штаммам Burkholderia thailandensis и Burkholderia cepacia. Вестник ВолгГМУ. 2013. 4: 55-57). Передача плазмид резистентности представляет большую проблему для медицины, что требует создания эффективных способов, позволяющих контролировать этот процесс. Учитывая, что в прикрепленном сообществе клетки функционируют в отличных от планктона условиях, одновременная оценка конъюгативного переноса в двух моделях в присутствии и отсутствие бактерий ассоциантов может дать дополнительную информацию о процессе конъюгации.

Известен количественный метод определения конъюгативного переноса между бактериями в биопленке, сформированной на различных абиотических поверхностях (Guglielmetti Е. et al. Transfer of plasmid-mediated resistance to tetracycline in pathogenic bacteria from fish and aquaculture environments. FEMS Microbiol. Lett. 2009. 293:28-34; Krol J.E. et al. Invasion of E.coli biofilms by antibiotic resistance plasmids. Plasmid. 2013. 70: 110-119), при этом в конъюгационной смеси присутствуют только клетки штаммов донора и реципиента.

Недостатки прототипа: оценка конъюгативного переноса согласно прототипу осуществляется в отношении одного вида микроорганизмов или разных видов, но в бинарной культуре (клетки донора плазмиды и клетки реципиента), тогда как в окружающей среде и биотопах человека бактерии существуют в полимикробных ассоциациях.

Технический результат: повышение объективности оценки эффективности конъюгативного переноса.

Это достигается за счет использования двух моделей, отражающих формы существования бактерий - планктонную и сессильную, при которых учитывается влияние сопутствующей микробиоты (в полимикробных сообществах), то есть приближение условий эксперимента in vitro к ситуации in situ и in vivo.

Сущность метода заключается в том, что эффективность конъюгации оценивают одновременно в жидкой среде и формирующейся микробной биопленке в присутствии бактерий ассоциантов. Для этого бактериальные культуры донора конъюгативной плазмиды и реципиента культивируют в течение 24 часов в лунках полистиролового планшета in vitro в присутствии и в отсутствие клеток другого микроорганизма. После чего из планктона, а затем из отмытой и разрушенной ультразвуком биопленки делают высев на селективные агаризованные среды и оценивают следующие показатели: число клеток реципиента и трансконъюганта, затем рассчитывают и сравнивают с контролем (коньюгативный перенос между донором и реципиентом в отсутствие ассоцианта) частоту конъюгативного переноса, равную отношению числа клеток трансконъюганта к числу клеток реципиента. Если частота конъюгации в опыте увеличивается в 5 раз и более, то считается, что эффективность конъюгативной передачи в присутствии других бактерий высокая, смешанная культура стимулирует процесс конъюгативного переноса плазмиды. Если частота конъюгации в опыте уменьшается в 5 раз и более, то эффективность конъюгативной передачи в присутствии других бактерий низкая, смешанная культура ингибирует процесс конъюгативного переноса плазмиды. В случае если частота конъюгации увеличивается/уменьшается менее чем в 5 раз, то эффективность конъюгативной передачи в присутствии других бактерий не изменяется, смешанная культура не влияет на процесс конъюгативного переноса плазмиды.

Способ осуществляется следующим образом. Ночные культуры бактерий донора конъюгативной плазмиды, реципиента и ассоцианта, выращенные на среде Луриа-Бертани (LB-бульоне) с соответствующим селективным антибиотиком, стандартизуют до 2,0 по McFarland и разводят 1:100 в LB-бульоне. В пенициллиновых флакончиках формируют бактериальные суспензии: 1,0 мл донора + 2,0 мл реципиента + 2,0 мл средового компонента (LB-бульон) (контроль) и 1,0 мл донора + 2,0 мл реципиента + 2,0 мл ассоцианта (опыт). Смешанные культуры вносят в лунки плоскодонного полистиролового (без антиадгезивного покрытия) планшета (например, Медполимер, Россия). Закрытые планшеты выдерживают статически в термостате при 37°C в течение 24 часов. Для оценки количества клеток донора, реципиента и трансконъюганта в планктонной культуре после окончания срока экспозиции делают высев из последовательных децимальных разведений бактериальных суспензий на селективные среды. Для оценки количества клеток в биопленках из лунок удаляют планктонную культуру, 3-х кратно отмывают физиологическим раствором/фосфатным буфером, вносят в лунки 100 мкл фосфатно-буферной среды, 5-и кратно обрабатывают ультразвуком в течение 1 мин при 37 кГц, поместив планшеты в ультразвуковую ванну, например, Elma Ultrasonic 30S (Elma, Германия) и делают высевы на селективные агаризованные среды методом децимальных разведений. Количество клеток оценивают через 24 часа по числу колониеобразующих единиц. Затем рассчитывают и сравнивают с контролем (коньюгативный перенос между донором и реципиентом в отсутствие ассоцианта) частоту конъюгативного переноса, равную отношению числа клеток трансконъюганта к числу клеток реципиента согласно Guglielmetti Е. et al. (2009). Если частота конъюгации в опыте увеличивается в 5 раз и более, то считается, что эффективность конъюгативной передачи в присутствии других бактерий высокая, смешанная культура стимулирует процесс конъюгативного переноса плазмиды. Если частота конъюгации в опыте уменьшается в 5 раз и более, то эффективность конъюгативной передачи в присутствии других бактерий низкая, смешанная культура ингибирует процесс конъюгативного переноса плазмиды. В случае если частота конъюгации увеличивается/уменьшается менее чем в 5 раз, то эффективность конъюгативной передачи в присутствии других бактерий не изменяется, смешанная культура не влияет на процесс конъюгативного переноса плазмиды.

Примеры конкретного применения

Пример 1

Влияние клеток Klebsiella pneumonia АТСС 700603 (ассоциант) на конъюгативный перенос плазмиды рОХ38 в уропатогенный штамм Escherichia coli DL82 Ampr (реципиент). В качестве донора плазмидной ДНК был использован рекомбинантный штамм Escherichia coli N4i рОХ38 GmrCmr (содержит конъюгативную плазмиду рОХ38 - производную F-плазмиды Е. coli К12) (Guyer M.S. et al., 1980). Частота переноса плазмиды в планктоне и биопленке в присутствии клеток бактерий К. pneumonia составила 2,15Е-02±1,26Е-02 и 2,80Е-03±2,61Е-03 соответственно, без ассоцианта - 3,94Е-03±1,84Е-03 и 1,82Е-03±1,57Е-03. Конъюгативный перенос в присутствии клеток ассоцианта в планктоне увеличивается в 5,5 раз, в биопленке не изменяется (увеличение в 1,5 раза). Эффективность конъюгативной передачи в присутствии бактерий K. pneumoniae высокая.

Пример 2

Влияние клеток Enterococcus faecalis АТСС 23212 (ассоциант) на конъюгативный перенос плазмиды рОХ38 в уропатогенный штамм Е. coli DL82 Ampr (реципиент). Частота переноса плазмиды в планктоне и биопленке в присутствии клеток бактерий Е. faecalis составила 3,32Е-03±2,82Е-03 и 4,01Е-03±3,77Е-03 соответственно, без ассоцианта - 3,94Е-03±1,84Е-03 и 1,82Е-03±1,57Е-03. Конъюгативный перенос в присутствии клеток ассоцианта в планктоне (снижение в 1,2 раза) и в биопленке (увеличение в 2,2 раза) не изменяется. Эффективность конъюгативной передачи в присутствии бактерий Е. faecalis не изменяется. Смешанная культура не влияет на процесс конъюгативного переноса плазмиды.

Пример 3

Влияние клеток К. pneumonia АТСС 700603 (ассоциант) на конъюгативный перенос плазмиды рОХ38 в клинический штамм Е. coli Ampr (реципиент), выделенный от пациента с инфекцией области хирургического вмешательства. Частота конъюгативного переноса в планктонной культуре и биопленке в присутствии клеток бактерий К. pneumoniae составила 4,75Е-02±2,39Е-02 и 3,44Е-02±3,41Е-02 соответственно, без ассоцианта - 1,83Е-01±1,10Е-01 и 2,31Е-02±2,23Е-02. Конъюгативный перенос в присутствии клеток ассоцианта в планктоне (снижение в 3,9 раза) и в биопленке (увеличение в 1,5 раза) не изменяется. Эффективность конъюгативной передачи в присутствии бактерий Е. faecalis не изменяется.

Пример 4

Влияние клеток Е. faecalis АТСС 23212 (ассоциант) на конъюгативный перенос плазмиды рОХ38 в клинический штамм Е. coli (реципиент), выделенный от пациента с инфекцией области хирургического вмешательства. В планктоне и биопленке эффективность переноса плазмиды в присутствии клеток бактерий Е. faecalis составила 3,21Е-02±2,82Е-02 и 2,97Е-02±2,71Е-02 соответственно, без ассоцианта - 1,83Е-01±1,10Е-01 и 2,31Е-02±2,23Е-02. Конъюгативный перенос в присутствии клеток ассоцианта в планктоне снижается в 5,7 раз, в биопленке не изменяется (увеличение в 1,3 раза). Эффективность конъюгативной передачи в присутствии бактерий Е. faecalis низкая.

Способ отличается простотой и высокой производительностью за счет унификации обеих моделей эксперимента - в планктоне и в биопленке.

Способ оценки эффективности конъюгативного переноса путем проведения конъюгации между донором плазмиды и реципиентом в течение 24 часов в лунках полистиролового планшета, отличающийся тем, что конъюгацию осуществляют одновременно параллельно в планктоне и формирующейся биопленке в присутствии (опыт) и в отсутствие (контроль) клеток другого вида микроорганизмов, затем производят высевы бактериальных суспензий на селективные агаризованные среды из планктона и из отмытой разрушенной ультразвуком биопленки, рассчитывают частоту конъюгации и сравнивают с контролем, и если частота конъюгации в опыте увеличивается в 5 раз и более, то эффективность конъюгативной передачи в присутствии других бактерий считают высокой, если частота конъюгации в опыте уменьшается в 5 раз и более, то эффективность конъюгативной передачи в присутствии других бактерий оценивают как низкую, если частота конъюгации увеличивается/уменьшается менее чем в 5 раз, эффективность конъюгативной передачи в присутствии других бактерий не изменяется.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ оценки продуктивности рекомбинантных трансформантов дрожжей Pichia pastoris, секретирующих фитазы.

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ диагностики генетических нарушений, являющихся причиной бесплодия супружеских пар, включающий в себя комплексное определение мутаций в генах тромбофилии, фолатного цикла и аллелей HLA, где оценку генов в гомозиготном и гетерозиготном состояниях проводят в соответствии с разработанной балльной шкалой, присваивая генетическим факторам в образцах крови женщин следующие значения: F2 G/A - 4 балла, F2 А/А - 5 баллов, F5 G/A - 4 балла, F5 А/А - 5 баллов, F7 G/A - 0 баллов, F7 А/А - -1 балл, F13 G/T - 0 баллов, F13 Т/Т - -1 балл, FGB G/A - 1 балл, FGB А/А - 2 балла, ITGA2 С/Т - 2 балла, ITGA2 Т/Т - 1 балл, ITGB3 Т/С - 3 балла, ITGB3 С/С - 3 балла, PAI-1 5G/4G - 1 балл, PAI-1 4G/4G - 3 балла, MTHFR:677 С/Т - 2 балла, MTHFR:677 Т/Т - 3 балла, MTHFR: 1298 А/С - 1 балл, MTHFR: 1298 С/С - 2 балла, MTR A/G - 2 балла, MTR G/G - 1 балл, MTRR A/G - 1 балл, MTRR G/G - 2 балла; при наличии у супругов одной общей специфичности системы HLA - 0 баллов, двух - 1 балл, трех - 2 балла, четырех - 3 балла, пяти - 4 балла, шести или семи - 5 баллов, восьми - 6 баллов, девяти - 7 баллов, десяти - 8 баллов, общих специфичностей нет - -1 балл; заключение о том, что бесплодие с высокой вероятностью ассоциировано с генетическими причинами, делают при суммарном количестве баллов 18 и более, вероятность выше среднего - 14-17 баллов, бесплодие не детерминировано генетическими факторами -13 баллов и менее; заключение о благоприятном прогнозе при проведении вспомогательных репродуктивных технологий делают при суммарном количестве баллов 13 и менее.

Предложенная группа изобретений относится к области молекулярной биологии и медицины. Предложены способ и набор для специфической идентификации по меньшей мере одной последовательности ДНК в образце путем проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР), включающие одну пару праймеров, специфичных для этой последовательности ДНК, и пару зондов, в которой один представляет собой олигонуклеотидный мишень-специфичный зонд, имеющий 3'-сегмент, комплементарный идентифицируемому участку последовательности ДНК и содержащий метку, и 5'-сегмент, некомплементарный идентифицируемой последовательности ДНК и содержащий метку, а другой - олигонуклеотидный сигнальный зонд, комплементарный 5'-сегменту мишень-специфичного зонда и содержащий метку.

Изобретение относится к медицинской микробиологии. Изобретение может быть использовано при изучении нетоксигенных штаммов холерных вибрионов различного происхождения на молекулярно-биологическом уровне с целью установления их роли в этиологии спорадических случаев и вспышек диарейных заболеваний.

Изобретение относится к области ветеринарии и предназначено для диагностики мутантного аллеля, вызывающего короткий позвоночник или брахиспину у крупного рогатого скота.

Изобретение относится к области биологии и экспериментальной медицины. Предложен способ оценки фармакологических и токсических свойств веществ - потенциальных лигандов AHR человека - с использованием линии мух Drosophila melanogaster.
Предложенная группа изобретений относится к области медицины. Предложены способ и тестовый набор для определения предрасположенности пациента к тяжелому периодонтальному заболеванию и/или к высокому риску прогрессирования периодонтального заболевания.

Изобретение относится к области медицинской диагностики и предназначено для прогнозирования риска развития инсульта у мужчин русской национальности, уроженцев Центрального Черноземья.

Изобретение относится к области медицинской диагностики и предназначено для прогнозирования риска развития эссенциальной гипертензии у женщин. Проводят анализ полиморфизмов генов матриксных металлопротеиназ ММP-1 и ММP-3 и прогнозируют высокий риск развития эссенциальной гипертензии у женщин при выявлении сочетания генотипа 1G/1G по локусу rs1799750 ММP-1 и генотипа 6A/6А по локусу rs3025058 ММP-3.

Изобретение относится к биотехнологии. Описаны композиции и способы для определения находящихся в системе кровообращения биомолекул до, во время и/или после лечения пациента противораковым или противоопухолевым лекарственным препаратом (или предполагаемым лекарственным препаратом).

Предложена группа изобретений: мутантные штаммы Corynebacterium glutamicum КССМ11553Р, Corynebacterium glutamicum КССМ11554Р, продуцирующие L-глутамин и способ получения L-глутамина. Способ получения L-глутамина предусматривает культивирование мутантного штамма Corynebacterium glutamicum КССМ11553Р или Corynebacterium glutamicum КССМ11554Р на питательной среде с последующим выделением L-глутамина из мутантного штамма или среды.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в спиртовой промышленности. Штамм дрожжей Saccharomyces cerevisiae, обладающий способностью продуцировать этанол, депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов под регистрационным номером ВКПМ Y-4280.

Группа изобретений относится к биотехнологии. Предложены штаммы молочнокислых бактерий, обладающие антимикробной активностью (варианты); применение одного или более штаммов бактерий; композиция для лечения или предотвращения диареи у новорожденного млекопитающего, не являющегося человеком.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в спиртовой промышленности. Штамм дрожжей Saccharomyces cerevisiae, обладающий способностью продуцировать этанол, депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов под регистрационным номером ВКПМ Y-4281.

Изобретение относится к области медицинской и ветеринарной паразитологии и микробиологии. Способ подавления роста микроорганизмов предусматривает приготовление антигенов-экстрактов из гельминтов Anisakis simplex и Dirofilaria immitis и получение чистой культуры микроорганизмов, в качестве которых использовали Escherichia coli, Proteus vulgaris, Micrococcus sp., путем смыва суточной культуры с поверхности плотной агаризованной среды с последующей стандартизацией на основе коммерческих стандартов мутности №5 и №10, утвержденных ВОЗ как первичный эталон мутности для оптической стандартизации бактериальных взвесей.

Предложена группа изобретений: бесклеточная культуральная жидкость штамма бактерий Bacillus subtilis 3Н ВКПМ В-12758 и применение ее в качестве полифункционального средства для растений и консерванта для силоса.

Предложен штамм Pantoea agglomerans SGI-003-H11, депонированный как NRRL B-50483 и предназначенный для усиления роста и/или урожайности зернового культурного растения. Предложена также культура, предназначенная для получения растения с усиленным ростом и/или урожайностью и содержащая эффективное количество указанного штамма.

Предложены варианты применения очищенной популяции способных к прорастанию бактериальных спор для лечения или предотвращения или уменьшения тяжести по меньшей мере одного симптома дисбиоза ЖКТ, связанного с Clostridium difficile, включая рецидивирующую инфекцию С.
Изобретение относится к области биохимии. Предложен способ получения экзополисахарида (ЭПС) бактерий Xanthobacter xylophilus Z-0055.

Изобретение относится к получению химических элементов и их изотопов с помощью микроорганизмов. Способ получения химических элементов и их изотопов, в том числе сверхтяжелых заурановых элементов, предусматривает обработку водной суспензией бактерий рода Thiobacillus, адаптированных радиоактивным агентом, сырья, содержащего природные химические элементы и их природные изотопы, с получением целевого продукта.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к пептиду со способностью связываться со скурфином и ингибировать биологическую активность скурфина, который выбран из пептида, состоящего из аминокислотной последовательности Arg-Asp-Phe-Gln-Ser-Phe-Arg-Lys-Met-Trp-Pro-Phe-Phe-X, где Х отсутствует или Х присутствует и представляет собой X14 или X14-X15, где X14 и X15 независимо друг от друга обозначают аминокислоту, варианта указанного пептида и его фармацевтически приемлемой соли.

Изобретение относится к клинической микробиологии. Предложен способ оценки эффективности конъюгативного переноса в полимикробных сообществах. Способ включает оценку конъюгации плазмиды одновременно параллельно в планктоне и в формирующейся микробной биопленке в присутствии бактерий ассоциантов и в отсутствии их. Затем рассчитывают частоту конъюгации и сравнивают. Если частота конъюгации в опыте увеличивается в 5 раз и более, то эффективность конъюгативной передачи в присутствии других бактерий считают высокой, если частота конъюгации в опыте уменьшается в 5 раз и более, то эффективность конъюгативной передачи в присутствии других бактерий оценивают как низкую, если частота конъюгации увеличиваетсяуменьшается менее чем в 5 раз, то эффективность конъюгативной передачи в присутствии других бактерий не изменяется. Способ обеспечивает объективность оценки эффективности конъюгативного переноса. 1 табл., 4 пр.

Наверх