Стабилизирующая композиция для биологических материалов



Стабилизирующая композиция для биологических материалов
Стабилизирующая композиция для биологических материалов
Стабилизирующая композиция для биологических материалов
Стабилизирующая композиция для биологических материалов
Стабилизирующая композиция для биологических материалов
Стабилизирующая композиция для биологических материалов
Стабилизирующая композиция для биологических материалов
Стабилизирующая композиция для биологических материалов
Стабилизирующая композиция для биологических материалов
Стабилизирующая композиция для биологических материалов
Стабилизирующая композиция для биологических материалов
Стабилизирующая композиция для биологических материалов
Стабилизирующая композиция для биологических материалов
Стабилизирующая композиция для биологических материалов
Стабилизирующая композиция для биологических материалов
Стабилизирующая композиция для биологических материалов
Стабилизирующая композиция для биологических материалов
Стабилизирующая композиция для биологических материалов
Стабилизирующая композиция для биологических материалов
Стабилизирующая композиция для биологических материалов
Стабилизирующая композиция для биологических материалов
C12N1/00 - Микроорганизмы, например простейшие; их композиции (лекарственные препараты, содержащие материал из микроорганизмов A61K 35/66; приготовление лекарственных составов, содержащих бактериальные антигены или антитела, например бактериальных вакцин A61K 39/00); способы размножения, содержания или консервирования микроорганизмов или их композиций; способы приготовления или выделения композиций, содержащих микроорганизмы; питательные среды

Владельцы патента RU 2666601:

ЭДВАНСТ БИОНУТРИШН КОРП. (US)

Группа изобретений касается стабилизации биологически активного материала. Предложены: сухая композиция в аморфном стеклообразном состоянии для стабилизации биологически активного материала, содержащая указанный биологически активный материал, от 10% до 50% по меньшей мере одного дисахарида, от более чем 10% до 80% по меньшей мере одного олигосахарида, от 0,1% до 10% по меньшей мере одного полисахарида, от 0,5% до 40% по меньшей мере одного гидролизованного белка и по меньшей мере одну соль карбоновой кислоты в количестве 0,5-20%, при этом проценты указаны относительно общей массы композиции, при этом указанный биологически активный материал представляет собой: живую бактерию, гриб, фаг, фермент, белок или пестицид (варианты). Также предложены способ ее получения и продукты ее содержащие (варианты), обеспечивающие повышенную стабильность биологически активного материала. 6 н. и 19 з.п. ф-лы, 20 ил., 1 табл.

 

ПЕРЕКРЕСТНЫЕ ССЫЛКИ НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

[1] Настоящая заявка частично является продолжением заявки на патент США №13/378106, поданной 29 марта 2012 г, которая соответствует национальной фазе международной заявки PCT/US 11/22821, поданной 28 января 2011 г, испрашивающей приоритет согласно предварительной заявке на патент США №61/299 315, поданной 28 января 2010 г. Настоящая заявка также частично является продолжением заявки на патент США №13/208459, поданной 12 августа 2011 г, испрашивающей приоритет согласно предварительной заявке на патент США №61/373711, поданной 13 августа 2010 г. Настоящая заявка также испрашивает приоритет согласно предварительной заявке на патент США №61/614994, поданной 23 марта 2012 г, предварительной заявке на патент США №61/642094, поданной 3 мая 2012 г, и предварительной заявке на патент США №61/646337, поданной 13 мая 2012 г. Содержание всех перечисленных выше заявок, таким образом, включено в настоящий документ посредством ссылок для всех целей.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

[2] Сохранение структуры и функций биологических материалов во время длительного хранения при высоких температурах и влажности имеет фундаментальное значение для пищевой, нутрицевтической и фармацевтической промышленности. Сохранение свойств чувствительных биологических материалов, таких как белки, ферменты, клетки, бактерии и вирусы, часто необходимо при длительном хранении для последующего использования. Несмотря на то, что было опробовано множество способов стабилизации биологических материалов при хранении, многие из них не подходят для чувствительных биологически активных материалов, таких как живые или аттенуированные бактерии и вирусы. Например, традиционная сублимационная сушка сочетает нагрузки, связанные как с замораживанием, так и с высушиванием. Этап замораживания указанного процесса может оказывать нежелательные эффекты, такие как денатурация белков и ферментов и разрыв клеток.

[3] Существует потребность в стабилизирующей композиции, подходящей для широкого диапазона биологических материалов и обеспечивающей высокий уровень стабилизации и предохранения биологических материалов на протяжении длительных периодов времени при повышенных температурах и варьирующей влажности, которые могут возникать, например, при транспортировке и хранении материалов, с сохранением при этом значительного уровня активности при регидрировании. Также существует потребность в стабилизирующих композициях, которые могут применяться при таблетировании с целью избежать чрезмерной потери активности биологических материалов, многие из которых чувствительны к высокому давлению и температуре, возникающим во время таблетирования.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[4] Согласно одному аспекту в настоящем изобретении предложена сухая стабилизирующая композиция для биологически активного материала, содержащая углеводный компонент, содержащий приблизительно от 10% до 80% олигосахарида, приблизительно от 5% до 30% дисахарида и приблизительно от 1% до 10% полисахарида; и белковый компонент, содержащий приблизительно от 0,5% до 40% гидролизованных животных или растительных белков от общей массы указанной композиции. Указанная композиция может быть скомбинирована с биологически активным материалом.

[5] Согласно другому аспекту в настоящем изобретении предложен способ получения описанной выше композиции, скомбинированной с биологически активным материалом, включающий: (a) комбинирование биологически активного материала по меньшей мере с углеводным компонентом и белковым компонентом в водном растворителе с образованием вязкой суспензии; (b) быстрое замораживание указанной суспензии в жидком азоте с образованием твердых замороженных частиц, гранул, капель или нитей; (c) первичное высушивание путем удаления воды в вакууме из продукта этапа (b) при поддержании его при температуре выше температуры замораживания; и (d) вторичное высушивание продукта этапа (c) при максимальном вакууме и температуре 20°C или выше на протяжении времени, достаточного для снижения водной активности до уровня менее 0,3 Aw.

[6] Согласно другому аспекту в настоящем изобретении предложена таблетка, пилюля или пеллета, полученная путем компактирования чувствительного биологически активного материала, внедренного в сухую стеклообразную и аморфную композицию, содержащую один или большее число сахаров и один или большее число гидролизованных белков, причем указанные сахара включают приблизительно от 10% до 60%, а указанные гидролизованные белки включают приблизительно от 1% до 40% от общей сухой массы указанной композиции.

[7] Согласно еще одному аспекту в настоящем изобретении предложен способ получения вышеупомянутой таблетки, пилюли или пеллеты, включающий компактирование чувствительного биологически активного материала, внедренного в сухую стеклообразную и аморфную композицию, отличающийся тем, что указанная сухая стеклообразная и аморфная композиция получена при помощи способа, включающего: (а) комбинирование биологически активного материала по меньшей мере с одним или с большим числом сахаров, и с одним или с большим числом гидролизованных белков в водном растворителе с образованием вязкой суспензии; (b) быстрое замораживание указанной суспензии в жидком азоте с образованием твердых замороженных частиц, гранул, капель или нитей; (с) первичное высушивание путем удаления воды в вакууме из продукта этапа (b) при поддержании его при температуре выше температуры замораживания; и (d) вторичное высушивание продукта этапа (с) при максимальном вакууме и температуре 20°С или выше на протяжении времени, достаточного для снижения водной активности до уровня менее 0,3 Aw.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

[8] На фиг. 1 показано повышение стабильности коммерчески доступных пробиотических бактерий и пробиотических бактерий в сухой композиции согласно настоящему изобретению.

[9] На фиг. 2 показано влияние разных молярных отношений усилителей стеклообразования и смеси углеводов в указанной композиции на стабильность пробиотика (L. paracasei) в условиях ускоренного хранения (37°C и 33% отн. вл.).

[10] На фиг. 3 показано влияние композиции согласно настоящему изобретению на стабильность при хранении пробиотической бактерии L. acidophilus. Стабильность сухой пробиотической бактерии тестировали в условиях ускоренного хранения при 24°C и 33% отн. вл. на протяжении 537 дней.

[11] На фиг. 4 показано влияние различных усиливающих стеклообразование соединений на стабильность при хранении пробиотической бактерии L. acidophilus. Стабильность сухой пробиотической бактерии тестировали в условиях ускоренного хранения при 24°C и 43% отн. вл. на протяжении 180 дней.

[12] На фиг. 5 показано влияние различных пропорций белковых гидролизатов/сахаров на стабильность при хранении (35°C и 43% отн. вл.) пробиотической бактерии Bifidobacterium lactis.

[13] На фиг. 6 представлена оптимизация рН для максимальной стабильности пробиотика L. rhamnosus (в условиях ускоренного хранения при 40°C и 33% отн. вл. на протяжении 8 недель).

[14] На Фиг. 7 и 8 показан визуальный и микроскопический анализ различных высушенных композиций, содержащих разные матрицы и стеклообразующие агенты, в виде замороженных твердых гранул в соответствии со способом согласно настоящему изобретению.

[15] На Фиг. 9 показано влияние формы культуры L. rhamnosus: свежей, в виде замороженных гранул или сухого порошка, на исходные значения КОЕ в сухой композиции.

[16] На Фиг. 10 показано влияние температуры замораживания композиции, содержащей L. rhamnosus, в виде твердых гранул, замороженных в жидком азоте или в аппарате для глубокого замораживания при температуре -80°C, и в виде незамороженной вязкой суспензии при +4°C, на исходные значения КОЕ бактерий в сухой композиции. Результаты показывают исключительно эффект температуры замораживания суспензии без дополнительного этапа продувки перед высушиванием.

[17] На Фиг. 11 показано влияние температуры замораживания композиции, содержащей Bifidobacterium animalis в виде замороженных твердых гранул в жидком азоте, и в виде незамороженной вязкой суспензии при +4°C, на исходное значение КОЕ бактерии в сухой композиции. Результаты показывают исключительно эффект температуры замораживания суспензии без дополнительного этапа продувки перед высушиванием.

[18] На Фиг. 12 показано влияние продолжительности продувки замороженных твердых гранул в вакууме на исходное число КОЕ L. rhamnosus в сухой композиции.

[19] На Фиг. 13 показаны параметры высушивания композиции в сублимационной сушилке в соответствии со способом согласно настоящему изобретению.

[20] На Фиг. 14 показаны технологические потери и потери при высушивании L. rhamnosus в композициях и способах высушивания согласно настоящему изобретению.

[21] На Фиг. 15 показаны тренды стабильности для композиции с сухой пробиотической бактерией L. rhamnosus при хранении при 40°C и 33% относительной влажности.

[22] На Фиг. 16 показана стабильность при хранении при 40°C и 43% отн. вл. L. acidophilus sp, лиофилизированной обычным способом или включенной в состав предложенной композиции с помощью способов согласно настоящему изобретению.

[23] На Фиг. 17 показана стабильность при хранении при 40°C и 43% отн. вл, а также при 30°C и 60% отн. вл. L. rhamnosus sp, лиофилизированной обычным способом или включенной в состав предложенной композиции с помощью способов согласно настоящему изобретению.

[24] Фиг. 18 демонстрирует влияние прессования в таблеточном прессе на жизнеспособность и стабильность при хранении при 40°C и 43% отн. вл. пробиотика L. rhamnosus, стабилизированного и защищенного в композиции согласно настоящему изобретению.

[25] Фиг. 19 иллюстрирует влияние таблетирования со смесью мультивитаминов и минеральных веществ и хранения при воздействии температуры 40°C и 43% отн. вл. на жизнеспособность пробиотика L. rhamnosus, стабилизированного и защищенного в композиции согласно настоящему изобретению.

[26] Фиг. 20 иллюстрирует влияние прессования в таблеточном прессе на активность ферментов протеазы и липазы в свободной форме или защищенных в композиции согласно настоящему изобретению. Указанные ферменты либо индивидуально таблетировали, либо смешивали в равных пропорциях и затем таблетировали.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

ОПРЕДЕЛЕНИЯ

[27] Следует понимать, что терминология, используемая в настоящем документе, предназначена исключительно для описания конкретных вариантов реализации, а не для ограничения. В настоящем описании и прилагаемой формуле изобретения формы единственного числа, в том числе сопровождаемые определением «указанный(ая)», включают соответствующие формы множественного числа, если содержание явно не подразумевает иное. Соответственно, например, упоминание «белка» включает единственный белок или комбинацию двух или более белков; упоминание «фермента», «бактерии» и т.д. включает единственный тип или смеси нескольких типов, и т.д.

[28] В описании и в формуле настоящего изобретения используется, в соответствии с приведенными ниже определениями, следующая терминология.

[29] Термины «биологически активный ингредиент», «биологически активный материал» и «биологический материал» относятся к микроорганизмам или ингредиентам, обеспечивающим биологическую активность. Биологически активные материалы, подходящие для применения согласно настоящему изобретению, включают, не ограничиваясь перечисленными, пептиды, белки, ферменты, гормоны, нуклеиновые кислоты, антитела, лекарственные средства, вакцины, дрожжи, грибы, бактерии (пробиотические или другие), почвенные микробы, вирусы и/или суспензии клеток.

[30] Термин «биологическая композиция» относится к составам, находящимся в форме, однозначно эффективно обеспечивающей биологическую активность биологически активных ингредиентов или агентов.

[31] Термины «усилитель стеклообразования», «соединение, стимулирующее стеклообразование» и «стеклообразующий агент» используются в настоящем документе взаимозаменяемо, обозначая химическое соединение, обладающее способностью к формированию аморфной или стеклообразной структуры ниже критической температуры, температуры перехода в стеклообразное состояние (Tg). При образовании стеклообразной структуры биологические вещества могут быть внедрены в указанную стеклообразную структуру. Усилители стеклообразования, подходящие для применения согласно настоящему изобретению, включают, не ограничиваясь перечисленными, соли органических кислот, таких как молочная кислота, аскорбиновая кислота, малеиновая кислота, щавелевая кислота, малоновая кислота, яблочная кислота, янтарная кислота, лимонная кислота, глюконовая кислота, глутаминовая кислота и т.п. Соли могут включать катионы, такие как натрий, калий, кальций, магний, фосфат и т.п.Другие подходящие усилители стеклообразования включают белки, белковые гидролизаты, полипептиды и аминокислоты. Также включена комбинация стеклообразующих агентов в составе одной композиции. Способ, используемый для получения стеклообразной структуры для целей настоящего изобретения, обычно представлен техникой сублимации и/или испарения растворителя. В идеальном варианте соединения, являющиеся GRAS-соединениями, предпочтительнее соединений, не являющихся GRAS-соединениями.

[32] Термин «сахара» относится к сахаридам, состоящим в основном из атомов углерода, водорода и кислорода. Подходящие сахариды включают редуцирующие и нередуцирующие сахара, а также сахарные спирты и дисахариды. Два моносахарида, соединенные вместе, образуют дисахарид. Два моносахарида, используемые для получения дисахарида, могут быть одинаковыми или разными. Примеры дисахаридов, подходящих для применения в композиции согласно настоящему изобретению, включают сахарозу, трегалозу, лактозу, мальтозу, изомальтозу. Могут также применяться сульфатированные дисахариды.

[33] Термин «углеводы» или «полигидроксисоединения» относится к сахаридам, в основном состоящим из углерода, водорода и кислорода. Сахарид, как правило, состоит из сахарного остова из повторяющихся структурных единиц, связанных линейным или нелинейным образом, часть которых содержит положительно или отрицательно заряженные химические группы. Число повторяющихся единиц может варьировать от двух до нескольких миллионов. Подходящие сахариды включают редуцирующие и нередуцирующие сахара и сахарные спирты, дисахариды, олигосахариды, водорастворимые полисахариды и их производные. Два моносахарида, связанные друг с другом, образуют дисахарид. Два моносахарида, используемые для получения дисахарида, могут быть одинаковыми или разными. Примеры дисахаридов, подходящих для применения в смеси углеводов согласно настоящему изобретению, включают сахарозу, трегалозу, лактозу, мальтозу, изомальтозу. Могут также применяться сульфатированные дисахариды. Небольшое число связанных друг с другом моносахаридов (как правило, от трех до двадцати) образует олигосахарид. Моносахариды, используемые для получения олигосахарида, могут быть одинаковыми или разными сахарными компонентами. Примеры олигосахаридов, подходящих для применения, включают инулин, мальтодекстрины, декстраны, фруктоолигосахариды (ФОС), галактоолигосахариды (ГОС), маннан-олигосахариды (МОС) и их комбинации. Значительное число связанных друг с другом моносахаридов (как правило, более двадцати) образует полисахарид. Моносахариды, используемые для получения полисахарида, могут быть одинаковыми или разными сахарными компонентами. Примеры подходящих для применения полисахаридов включают, не ограничиваясь перечисленными, метилцеллюлозу, гидроксипропилцеллюлозу, гидроксиэтилцеллюлозу и гипромеллозу; растворимые крахмалы или фракции крахмалов, ксантановую камедь, гуаровую камедь, пектины, карраген, галактоманнан, геллановую камедь, включая любые их производные, ацетатфталат целлюлозы (АФЦ), карбоксиметилцеллюлозу, альгинат натрия, соли альгиновой кислоты, гидроксипропилметилцеллюлозу (ГПМЦ), аравийскую камедь, камедь бобов рожкового дерева, хитозан и производные хитозана, коллаген, полигликолевую кислоту, крахмалы, модифицированные крахмалы и цикл о декстрины.

[34] Термин «гидролизованный белок» относится к белку, подвергнутому частичному или полному кислотному или ферментативному гидролизу для получения гидролизованного белка с молекулярной массой от приблизительно 1 кДа до приблизительно 50 кДа. В некоторых вариантах реализации, включающих «глубоко гидролизованный белок» согласно настоящему описанию, по меньшей мере 20% указанного белкового субстрата преобразовано в пептиды с молекулярной массой от 200 до 2000 дальтон. Гидролизованный белок имеет приблизительно такой же аминокислотный состав, что и полноразмерный белок, и может быть получен из любого числа коммерческих источников. Так как гидролизованный белок является гипоаллергенным, может быть целесообразным его применение в определенных пищевых продуктах для гиперчувствительных потребителей, таких как дети младшего возраста и пожилые люди.

[35] «Стабильный» состав или композиция представляет собой такой(ую) состав или композицию, в котором(ой) биологически активный материал по существу сохраняет физическую стабильность, химическую стабильность и/или биологическую активность при хранении. Стабильность может быть измерена при заданных условиях температуры и влажности на протяжении выбранного периода времени. Для оценки ожидаемого срока годности при хранении до фактического истечения данного срока хранения материала может применяться анализ трендов. Для живых бактерий, например, стабильность определяют как период времени, в течение которого происходит снижение значения КОЕ/г сухого состава на 1 логарифмическую единицу в заранее определенных условиях температуры и влажности, и периода времени.

[36] Термин «жизнеспособность» в отношении бактерии относится к способности образовывать колонию (число КОЕ, или колониеобразующих единиц) на питательной среде, подходящей для роста указанной бактерии. Жизнеспособность в отношении вирусов относится к способности инфицировать подходящую клетку-хозяина и воспроизводиться в ней, что приводит к образованию пятна на газоне клеток-хозяев.

[37] «Обычная» комнатная температура или «обычные» условия представляют собой температуру или условия в любой момент времени в определенной среде. Как правило, обычная комнатная температура составляет 22-25°C, обычное атмосферное давление и обычная влажность легко могут быть измерены и варьируют в зависимости от времени года, погоды и климатических условий, высоты и т.д.

[38] Термин «водная активность» или «Aw» в контексте содержащих высушенные композиции составов относится к доступности воды и отражает энергетический статус воды в системе. «Aw» определяют как отношение давления пара воды над образцом к давлению пара чистой воды при той же температуре. Водная активность чистой дистиллированной воды равна единице, т.е. Aw = 1,0.

[39] Термин «относительная влажность» или «отн. вл.» в контексте стабильности при хранении относится к количеству водного пара в воздухе при определенной температуре. Относительная влажность обычно меньше необходимой для насыщения воздуха и выражается в процентах от влажности насыщения.

[40] Термин «сухой» и вариации указанного термина относятся к физическому обезвоженному или безводному состоянию, т.е. по существу отсутствию жидкости. Высушивание включает, например, высушивание распылением, сушку в псевдоожиженном слое, лиофилизацию и вакуумную сушку.

[41] Термин «лиофилизация» или сублимационная сушка относится к получению сухой формы композиции быстрым замораживанием и дегидрированием в замороженном состоянии (иногда называемом сублимацией). Лиофилизацию проводят при температуре, обеспечивающей кристаллизацию сахаров. Указанный процесс может проводиться в вакууме, достаточном для поддержания продукта в замороженном виде, согласно некоторым вариантам реализации - ниже приблизительно 2000 миллиторр.

[42] Этап «первичного удаления воды», «первичное высушивание» или «высушивание жидкости» в отношении процессов, описанных в настоящем документе, относится к дегидрированию, которое начинают после размораживания замороженных частиц и продолжают до момента начала вторичного высушивания. Как правило, основная часть первичного высушивания происходит за счет интенсивного испарения при поддержании температуры продукта на уровне значительно ниже температур источника нагрева. Этот процесс может проводиться в вакууме, достаточном для поддержания продукта в размороженном виде, согласно некоторым вариантам реализации более чем приблизительно >2000 миллиторр.

[43] Термин «вторичное высушивание» в отношении процессов, описанных в настоящем документе, относится к этапу высушивания, который проводят при температурах состава, близких к температуре источника нагрева. Указанный процесс может проводиться в вакууме, достаточном для снижения водной активности состава, согласно некоторым вариантам реализации менее чем приблизительно 1000 миллиторр. В ходе стандартного процесса высушивания на этапе вторичного высушивания водная активность состава снижается до Aw, равного 0,3 или менее.

[44] Настоящее изобретение включает композиции и способы высушивания для предохранения чувствительных биологически активных материалов, таких как пептиды, белки, гормоны, нуклеиновые кислоты, антитела, лекарственные средства вакцины, дрожжи, бактерии (пробиотические или другие), вирусы и/или суспензии клеток, при хранении.

[45] Композиции и способы высушивания согласно настоящему изобретению решают проблему получения малозатратных и подходящих для промышленных масштабов производства сухих составов, содержащих чувствительные биологически активные материалы, такие как пептиды, белки, гормоны, нуклеиновые кислоты, антитела, лекарственные средства, вакцины, дрожжи, бактерии, вирусы и/или суспензии клеток, с существенно увеличенным сроком годности в сухом состоянии. В настоящем изобретении предложена защитная композиция и способ высушивания, включающая(ий) биологический материал, окруженный аморфной стеклообразной структурой из высокорастворимых соединений. Процесс высушивания включает: смешивание биологического материала и композиции с получением жидкой суспензии, быстрое замораживание указанной содержащей композицию суспензии в жидком азоте с образованием капель, нитей или гранул с последующим высушиванием биологически активного материала в стеклообразной сахарной структуре путем испарения жидкости в режиме пониженного давления при нагревании композиции.

[46] Настоящее изобретение основано на примечательном открытии, заключающемся в том, что биологические материалы могут быть защищены стеклообразной структурой с сохранением активности по существу. При комбинировании биологического материала с содержащей композицию смесью и высушивании в соответствии с настоящим изобретением превосходная стабильность достигалась при длительном воздействии жестких условий температуры и влажности. Настоящее изобретение включает композиции, содержащие биологический материал, смесь растворимых углеводов и стимулирующие стеклообразование соли карбоновой кислоты. Композиции согласно настоящему изобретению заведомо отличаются по физической структуре и функции от невязких или концентрированных композиций с сахарами, высушиваемых просто с помощью стандартного способа сублимационной сушки. Например, в патенте США №6919172 описана аэрозольная порошковая композиция для легочного введения, содержащая смесь различных углеводов и цитрата натрия. Однако в описанной в указанном патенте композиции отсутствует дополнительное белковое соединение, критически важное для повышения стабильности и получения требуемой физической структуры при высушивании растворов, содержащих высокие концентрации Сахаров. Также описанная в указанном патенте композиция не обладает вязкой или гидрогелевой структурой, позволяющей осуществлять эффективное высушивание размороженного или незамороженного раствора для стимуляции стеклообразования. Напротив, композиция и процесс высушивания согласно настоящему изобретению позволяют решить все указанные проблемы при обеспечении наилучшей стабильности биологического материала. На существующем уровне техники также неизвестен дополнительный карбоксильный компонент, действующий синергически с гидролизованными белками, защищая и стабилизируя биологический материал.

[47] На существующем уровне техники стимуляция стеклообразной структуры обычно достигается при вспенивании или кипении раствора в вакууме, что способствует эффективному высушиванию. Этап вспенивания, как правило, приводит к интенсивному кипению и разбрызгиванию раствора, что является неизбежным последствием высушивания незамороженного раствора; в результате возможна только очень незначительная загрузка раствора во флакон или сосуд (см, например, патент США №6534087, где толщина готового вспененного продукта составляет менее чем 2 мм). Композиции и способы высушивания согласно настоящему изобретению позволяют избежать кипения и вспенивания указанного состава, позволяя, таким образом, загружать значительное больше материала в зону высушивания, в результате чего масштаб производства может быть легко увеличен для получения значительных количеств материала без применения специально разработанных сосудов, лотков или оборудования.

[48] В сочетании с предложенной с настоящем изобретении композицией для получения водной защитной среды в соответствии с настоящим изобретением может использоваться широкий спектр биологических материалов. Указанная защитная среда может затем подвергаться высушиванию с применением способов согласно настоящему изобретению для получения стабильного сухого порошка с указанным биологическим материалом. Указанные биологические материалы включают без ограничения: ферменты, такие как ферменты поджелудочной железы, липаза, амилаза, протеаза, фитаза, лактатдегидрогеназа; белки, такие как инсулин; вакцины; вирусы, такие как аденовирус; клетки, включая прокариотические клетки (включая бактерии и грибы) и эукариотические клетки, другие биологические материалы, включая лекарственные средства, нуклеиновые кислоты, пептиды, гормоны, витамины, каротеноиды, минеральные вещества, антибиотики, микробиоциды, фунгициды, гербициды, инсектициды, спермициды, антитела и липидные пузырьки.

[49] Как было показано, целесообразно использование композиций и способов высушивания согласно настоящему изобретению, в частности, для пробиотических бактерий. Стабильный сухой пробиотический порошок получают в соответствии с композициями и способами согласно настоящему изобретению, включая смешивание свежих, замороженных или сухих культур пробиотических бактерий со смесью углеводов и стимулирующих стеклообразование соединений, быстрое замораживание вязкого состава в жидком азоте для получения замороженных твердых капель, нитей или гранул, и высушивание с помощью предварительного применения вакуума, достаточного для увеличения температуры состава до значений, превышающих температуру замерзания, и использования источника нагревания с температурой 20°C и выше для облегчения первичного удаления воды. Поддержание температуры указанного состава выше точки замерзания может осуществляться путем регулировки вакуума и передачи тепла составу. Для завершения процесса высушивания и дополнительного уменьшения водной активности указанного состава до уровня менее Aw 0,3 или ниже проводят этап вторичного высушивания при максимальном вакууме и повышении температуры до 70°C включительно. Такая композиция способна сохранять стабильность в условиях хранения с температурой 40°C и 33% отн. вл. на протяжении 30 дней или более, как видно из фиг. 15.

[50] В частности, как было показано, целесообразно использование композиций и способов высушивания согласно настоящему изобретению для живых микроорганизмов, таких как пробиотическая бактерия, в прессованных таблетках. Стабильный сухой биологический порошок получают в соответствии с композициями и способами согласно настоящему изобретению, включая смешивание свежих, замороженных или сухих культур одноклеточных организмов со смесью Сахаров, гидролизованных белков и антиоксиданта, и, потенциально, включением дополнительных количеств полисахаридов и олигосахаридов и стимулирующих стеклообразование соединений, быстрое замораживание вязкого состава в жидком азоте для получения замороженных твердых капель, нитей или гранул, испарение воды путем предварительного применения вакуума, достаточного для увеличения температуры состава выше его температуры замораживания, и использования источника нагревания с температурой 20°C и выше, что облегчает первичное удаление воды. Поддержание температуры указанного состава на уровне выше точки замерзания может быть осуществлено путем доведения вакуума и передачи тепла или теплового облучения состава. Для завершения процесса высушивания и дополнительного уменьшения водной активности указанного состава до уровня менее Aw 0,3 или ниже, проводят этап вторичного высушивания при максимальном вакууме и повышении температуры до 70°C включительно.

КОМПОЗИЦИИ СОГЛАСНО НАСТОЯЩЕМУ ИЗОБРЕТЕНИЮ

[51] Согласно некоторым вариантам реализации состав содержит смесь углеводов дисахаридов, олигосахаридов и полисахаридов, куда внедрен биологически активный материал. Примеры подходящих полисахаридов включают, не ограничиваясь перечисленными, ацетатфталат целлюлозы (АФЦ), карбоксиметилцеллюлозу, пектин, альгинат натрия, соли альгиновой кислоты, гидроксипропилметилцеллюлозу (ГПМЦ), метилцеллюлозу, каррагинан, геллановую камедь, гуаровую камедь, аравийскую камедь, ксантановую камедь, камедь бобов рожкового дерева, хитозан и производные хитозана, коллаген, полигликолевую кислоту, крахмалы и модифицированные крахмалы. Примеры подходящих олигосахаридов включают, не ограничиваясь перечисленными, циклодекстрины, фруктаны, инулин, ФОС, мальтодекстрины, декстраны и т.д.; и их комбинации. Примеры подходящего дисахарида включают, не ограничиваясь перечисленными, лактозу, трегалозу, сахарозу и т.д. Согласно конкретному варианту реализации подходящий типовой полисахарид представляет собой альгинат натрия или геллановую камедь. Согласно другим вариантам реализации указанный состав содержит, в процентах по массе от общего содержания сухого вещества, 0,1-20% альгината натрия.

[52] Согласно некоторым вариантам реализации смесь углеводов содержит, в процентах по массе от общего содержания сухого вещества, 0, 1-10% полисахаридов, 1-10% олигосахаридов и 10-90% дисахаридов. Согласно дополнительному варианту реализации смесь углеводов содержит дисахариды, олигосахариды и полисахариды в массовых долях 10:0,1-4:0,1-2, или отличается тем, что массовые доли дисахаридов/олигосахаридов/полисахаридов составляют от приблизительно 10:0,2:0,1 до приблизительно 10:2:1.

[53] Согласно некоторым вариантам реализации фракция дисахаридов в смеси углеводов включает различные сахара и сахарные спирты. Подходящие дисахариды представляют собой дисахариды, не кристаллизующиеся и/или не повреждающие и не дестабилизирующие биологически активный материал в составе при температурах замораживания (например, ниже чем -20°C) и во время удаления воды. Например, биологически активный материал может быть высушен в присутствии стеклообразующих Сахаров, таких как сахароза, лактоза или трегалоза, что способствует сохранению молекулярной структуры на протяжении процесса высушивания и придает структурную жесткость аморфной матрице в сухом состоянии. Подходящий дисахарид будет эффективно замещать воду при снижении влагосодержания при высушивании, предотвращать повреждение клеточных мембран и денатурацию ферментов (см. обзор Crowe et al, 1998). Другие функции дисахарида в указанной композиции могут включать защиту биологически активного материала от повреждающего воздействия света, кислорода, окислительных агентов и влажности. Подходящий дисахарид должен легко растворяться в растворе. В частности, трегалоза представляет собой представляющее интерес защитное средство, поскольку является нередуцирующим дисахаридом, обнаруживаемым в растениях и живых организмах (например, бактериях, грибах и беспозвоночных, таких как насекомые и нематоды), остающихся в состоянии покоя (спячки) на протяжении периодов засухи. В некоторых случаях может быть целесообразным включение двух или большего числа разных дисахаридов, например, смеси трегалозы и сахарозы, для подавления образования кристаллов, увеличения стабильности высушенного состава с биологически активным материалов при хранении на протяжении длительных периодов времени и снижения расходов.

[54] Согласно некоторым вариантам реализации фракция олигосахаридов в смеси углеводов включает инулин, мальтодекстрины, декстраны, фруктоолигосахариды (ФОС), галактоолигосахариды (ГОС), маннан-олигосахариды (МОС) и их комбинации. Указанные олигосахариды разрешают несколько проблем, связанных с применением монокомпонентной трегалозы в качестве защитного средства для ряда биологических материалов, которые необходимо предохранить. При высокой эффективности в отношении защиты биологического материала при дегидрировании и регидрировании монокомпонентная трегалоза в качестве стабилизатора не обеспечивает требуемой стабильности при хранении на протяжении длительных периоды времени, в частности, при высоких температурах и/или во влажной среде. Указанная проблема в настоящем изобретении решена добавлением олигосахаридов, например, инулина, в смесь углеводов.

[55] Подходящие типовые массовые доли сахаридов в смеси углеводов: 10:0,1-10:0,1-2 дисахаридов/олигосахаридов/полисахаридов; согласно некоторым вариантам реализации массовые доли дисахаридов/олигосахаридов/полисахаридов составляют от приблизительно 10:0,2:0,1 до приблизительно 5:10:1. Согласно некоторым вариантам реализации смесь углеводов содержит, в процентах по массе от общего содержания сухого вещества, 10-90% дисахаридов, 1-10% олигосахаридов и 0,1-10% полисахаридов. Согласно другим вариантам реализации смесь углеводов содержит в процентах по массе от общего содержания сухого вещества 10-50% дисахаридов, 10-80% олигосахаридов и 0,1-10% полисахаридов.

[56] Согласно конкретному варианту реализации состав содержит смесь олигосахаридов. Указанная смесь олигосахаридов сокращает ряд проблем, связанных с применением единственного олигосахарида как монокомпонента в качестве стимулирующего стеклообразование материала в композиции. Высокоэффективно повышая температуру перехода в стеклообразное состояние, олигосахариды, однако, проявляют тенденцию к быстрой кристаллизации и осаждению, и, соответственно, фрагментации стеклообразной аморфной структуры, в частности, при высоких температурах и/или во влажной среде. Указанная проблема была решена в настоящем изобретении путем добавления смеси олигосахаридов вместо олигосахарида одного типа, согласно некоторым вариантам реализации - смеси фруктанов и декстринов с низким ДЭ. Согласно некоторым вариантам реализации смесь углеводов содержит, в процентах по массе от общего содержания сухого вещества, 5-40% фруктанов и 5-40% декстринов с низким ДЭ.

[57] Одна из подходящих композиций содержит от приблизительно 0,5% до приблизительно 90% углеводного компонента, включая по меньшей мере дисахарид, олигосахарид и полисахарид, и белковый компонент, содержащий от приблизительно 0,5% до приблизительно 40% гидролизованного белка. Согласно некоторым вариантам реализации композиция содержит от приблизительно 30% до приблизительно 70% углеводного компонента и приблизительно 1% до приблизительно 40% усиливающего стеклообразование компонента, такого как белок гидролизованный белок и карбоновая кислота, при этом указанный углеводный компонент содержит от приблизительно 10% до 90%, или от приблизительно 40% до 80% дисахарида; от приблизительно 1% до приблизительно 10%, или от приблизительно 5% до 10% олигосахарида; и от приблизительно 0,1 до приблизительно 10%, или от приблизительно 5% до приблизительно 10% полисахарида. Указанная композиция также содержит соль органической кислоты, которая считается еще одним усиливающим стеклообразование компонентом и содержит приблизительно от 0,5% до 20% карбоновой кислоты от общей массы указанной композиции.

[58] Согласно дополнительному варианту реализации композиция содержит смесь альгината натрия и олигосахаридов в массовых долях 1:1-10 или 1:1-5 альгината натрия/олигосахаридов.

[59] Согласно еще одному варианту реализации настоящего изобретения, композиция содержит поперечные связи с двухвалентными ионами металлов с образованием твердого гидрогеля. Согласно некоторым вариантам реализации указанный поперечно-сшитый гидрогелевый состав получают распылением или экструдированием суспензии в ванну, содержащую раствор двухвалентных ионов металлов, или путем добавления двухвалентных ионов металлов непосредственно в суспензию, позволяя составу затвердеть и образовать гидрогель. Затем гидрогелевый состав подвергают мгновенной заморозке и высушивают в соответствии со способами высушивания, предложенными в настоящем изобретении.

[60] Согласно другим вариантам реализации композиция содержит значимые количества стимулирующих стеклообразование соединений, в том числе соли органических кислот, таких как молочная кислота, аскорбиновая кислота, малеиновая кислота, щавелевая кислота, малоновая кислота, яблочная кислота, янтарная кислота, лимонная кислота, глюконовая кислота, глутаминовая кислота и т.п. Соли могут включать катионы, такие как натрий, калий, кальций, магний и т.п. Примеры включают цитрат натрия, лактат натрия, малеат натрия, глюконат магния, аскорбат натрия и т.п. Соли с высокой температурой перехода в стеклообразное состояние (Tg) и высокой растворимостью являются предпочтительными. Типовые органические кислоты включают лимонную кислоту и ее соли (например, цитрат натрия или калия, тринатрия цитрат дигидрат) и аскорбиновую кислоту и ее соли (например, аскорбат натрия, аскорбат калия, аскорбат магния). Например, согласно некоторым вариантам реализации композиция, предложенная в настоящем изобретении включает смесь углеводов дисахаридов, олигосахаридов и полисахаридов и ионы органической кислоты, такой как лимонная кислота и/или аскорбиновая кислота.

[61] Количество усилителей стеклообразования, применяемое в указанной композиции, варьирует в зависимости от итоговой композиции и предполагаемых условий хранения при высушивании. Обычно количество стимулирующего стеклообразование соединения в композиции выше, чем два (2) процента по массе от общего содержания сухого вещества, при этом поддерживают слабощелочные значения рН раствора или дисперсии (рН 7-7,5). Без связи с конкретной теорией предполагается, что функция стимулирующего стеклообразование соединения при относительно высоком содержании согласно описанию в настоящем документе состоит не только в участии в формировании требуемой аморфной и жесткой стеклообразной структуры готовой сухой композиции, но также в защите биологически активного материала от повреждающего воздействия света, кислорода, окислительных агентов и влажности. Подходящая типовая композиция содержит, в процентах по массе от общего содержания сухого вещества, 1-20% или приблизительно 2-10% по массе стимулирующего стеклообразование соединения от общего содержания сухого вещества.

[62] Другие подходящие усилители стеклообразования, включаемые в указанную композицию для дополнительного повышения ее стабильности, включают белки, белковые гидролизаты, полипептиды и аминокислоты. Указанные усилители включают желатин, альбумин, сывороточный белок, соевый белок, казеин, казеинат, иммуноглобулины, соевый белок, белок гороха, белок семян хлопчатника или другой пищевой продукт, и молочные или растительные белки и/или их гидролизаты, или любой другой гидролизованный белок. Примеры полиаминокислот включают полиаланин, полиаргинин, полиглицин, полиглутаминовую кислоту и т.п. Подходящие аминокислоты включают лизин, глицин, аланин, аргинин или гистидин, а также гидрофобные аминокислоты (триптофан, тирозин, лейцин, фенилаланин и т.д.) и метиламин, такой как бетаин.

[63] Согласно некоторым вариантам реализации используют казеин или белок гороха, либо гидролизованный казеин или гидролизованные гороховые белки. Согласно некоторым вариантам реализации фракция гидролизованных белков в содержащей композицию смеси включает частично гидролизованные или глубоко гидролизованные белки, полипептиды и аминокислоты. В настоящем документе под глубоко гидролизованными белками понимают белки, полученные путем экстенсивного ферментативного гидролиза с применением протеаз для модификации (разложения) белков. Согласно некоторым вариантам реализации гидролизуют животные или растительные белки, такие как казеин, белки сыворотки, сои или гороха, или глубоко гидролизованные казеин или белок гороха. Некоторые варианты реализации задействуют глубоко гидролизованные белки, содержащие более чем 80% короткоцепочечных пептидов с молекулярной массой, составляющей от приблизительно 1 кДа до приблизительно 50 кДа, и по меньшей мере 20% белкового субстрата преобразовано в пептиды с молекулярной массой от 200 до 2000 дальтон. Без связи с конкретной теорией считается, что смесь, полученная из сахара и глубоко гидролизованного белка согласно описанию в настоящем документе обеспечивает более быстрое высушивание и вносит вклад в образование требуемой аморфной и жесткой стеклообразной структуры готовой сухой композиции. Гидролизованный ферментом белок может быть получен с помощью способов, известных специалистам в данной области техники, или может быть получен из коммерческого источника. Подходящая типовая композиция содержит, в процентах по массе от общего содержания сухого вещества, 5-40% глубоко гидролизованных белков.

[64] Подходящее типовое общее количество белков, гидролизованного белка или глубоко гидролизованных белков и аминокислот в сухой композиции составляет от приблизительно 1% до приблизительно 40%, или от приблизительно 5% до приблизительно 40%, или от приблизительно 10% до приблизительно 30% от общей массы сухой смеси.

[65] Следует отметить, что подходящее количество усилителей стеклообразования в указанной композиции может зависеть от требуемых характеристик сухой композиции. Например, композиция, содержащая смесь углеводов и белка или белковых гидролизатов, может применяться для повышения химической стабильности биологического материала при хранении при умеренных температуре и относительной влажности, например, при 25°C и 25% отн. вл. Определение нужного количество усилителей стеклообразования, и, в частности, отношение дисахаридов и олигосахаридов, должно проводиться в соответствии с требуемыми условиями хранения. Например, композиция с высоким значением отношения дисахаридов/олигосахаридов может применяться для повышения химической стабильности биологического материала при хранении при умеренных температуре и относительной влажности, например, при 25°C и 25% отн. вл. Композиция с малым значением отношения дисахаридов/олигосахаридов может применяться для повышения химической стабильности биологического материала при хранении при высоких температуре и относительной влажности, например, при 30°C и 40% отн. вл. или выше.

[66] Ионы аскорбиновой кислоты могут быть предпочтительными усилителями стеклообразования согласно некоторым вариантам реализации, для получения дополнительного преимущества, заключающегося в стабилизации при воздействии более высоких температуры и влажности. Как вариант, согласно некоторым вариантам реализации более предпочтительной является комбинация ионов цитрата и/или аскорбата с другим усилителем стеклообразования, таким как белок или белковые гидролизаты.

[67] Согласно некоторым вариантам реализации состав содержит смесь Сахаров и гидролизованных белков, в которую внедрен биологически активный материал. Примеры подходящих Сахаров включают, не ограничиваясь перечисленными, дисахариды, такие как лактоза, трегалоза, сахароза и их смесь. Примеры подходящих гидролизованных белков включают, не ограничиваясь перечисленными, глубоко гидролизованный желатин, альбумин, сывороточный белок, соевый белок, казеин, казеинат, иммуноглобулины, соевый белок, белок гороха, белок семян хлопчатника или любые другие глубоко гидролизованные белки молочных продуктов, животного или растительного происхождения, и их смесь. Подходящее типовое общее количество сахаров в сухой композиции составляет от приблизительно 10% до приблизительно 80%» от общей массы сухой смеси, или от приблизительно 10% до приблизительно 60% сухой массы.

[68] Согласно одному примеру варианта реализации стеклообразующий агент содержит смесь дисахарида и гидролизованного белка. Согласно конкретному варианту реализации подходящий типовой стеклообразующий агент представляет собой смесь трегалозы и гидролизованного белка. Согласно некоторым вариантам реализации указанный состав содержит, в процентах по массе от общего содержания сухого вещества, 10-90% трегалозы и 0,1-30% гидролизованного белка, или 20-80% трегалозы и 0,1-20% гидролизованного белка, или 40-80% трегалозы и 0,1-20% гидролизованного белка.

[69] В идеальном варианте соединения, признанные полностью безвредными («Generally Recognized As Safe», GRAS) предпочтительнее соединений, не являющихся GRAS-соединениями. Другие включают вспомогательные вещества - соли, такие как сульфат магния; полиол, например, трехатомные или высшие сахарные спирты (например глицерин, эритрит, глицерол, арабит, ксилит, сорбит и маннит); пропиленгликоль; полиэтиленгликоль; плюроники; поверхностно-активные вещества; и их комбинации.

[70] Согласно некоторым вариантам реализации биологический материал содержит живую бактерию (например, пробиотическую бактерию). Примеры подходящих микроорганизмов включают, не ограничиваясь перечисленными, дрожжи, такие как Saccharomyces, Debaromyces, Candida, Pichia и Torulopsis, плесневые грибы, такие как Aspergillus, Rhizopus, Mucor, Penicillium и Torulopsis, и бактерии, такие как бактерии родов Bifidobacterium, Clostridium, Fusobacterium, Melissococcus, Propionibacterium, Streptococcus, Enterococcus, Lactococcus, Kocuria, Staphylococcus, Peptostrepococcus, Bacillus, Pediococcus, Micrococcus, Leuconostoc, Weissella, Aerococcus, Oenococcus и Lactobacillus. Конкретные примеры подходящих пробиотических микроорганизмов представлены следующими видами и включают все культивируемые биотипы в рамках указанных видов: Aspergillus niger, A. oryzae, Bacillus coagulans, В. lentus, В. licheniformis, В. mesentericus, В. pumilus, В. subtilis, В. natto, Bacteroides amylophilus, Вас. capillosus, Вас. ruminocola, Вас. suis, Bifidobacterium adolescentis, B. animalis, B. breve, B. bifidum, B. infantis, B. lactis, B. longum, B. pseudolongum, B. thermophilum, Candida pintolepesii, Clostridium butyricum, Enterococcus cremoris, E. diacetylactis, E faecium, E. intermedius, E. lactis, E. muntdi, E. thermophilus, Escherichia coli, Kluyveromyces fragilis, Lactobacillus acidophilus, L. alimentarius, L. amylovorus, L. crispatus, L. brevis, L. case 4 L. curvatus, L. cellobiosus, L. delbrueckii ss. bulgaricus, L farciminis, L. fermentum, L. gasseri, L. helveticus, L. lactis, L. plantarum, L. johnsonii, L. reuteri, L. rhamnosus, L. sakei, L. salivarius, Leuconostoc mesenleroides, P. cerevisiae (damnosus), Pediococcus acidilactici, P. pentosaceus, Propionibacterium freudenreichii, Prop, shermanii, Saccharomyces cerevisiae, Staphylococcus carnosus, Staph, xylosus, Streptococcus infantarius, Strep, salivarius ss. thermophilus, Strep. Thermophilus и Strep, lactis.

СПОСОБЫ ПОЛУЧЕНИЯ КОМПОЗИЦИЙ

[71] Подходящим способом смешивания биологического материала и композиции является добавление полностью сухой содержащей композицию смеси в концентрированную культуру или раствор среды, содержащий биологический материал. Массовое содержание биологического материала в культуральной среде составляет, как правило, от приблизительно 5% до 30% (масса/объем), или приблизительно от 10% до 20% (масса/объем). Массовое содержание добавляемой содержащей композицию смеси в культуральной среде составляет, как правило, приблизительно от 10% до приблизительно 60%, или приблизительно от 20% до 40%. Конечное содержание твердого вещества в смешанной суспензии составляет от приблизительно 20% до приблизительно 60% и, в частности, от приблизительно 30% до приблизительно 50%. Согласно некоторым вариантам реализации раствор перемешивают при комнатной температуре или немного нагревают для облегчения растворения материалов в вязком растворе (например, от 20°C до 40°C). Согласно варианту настоящего изобретения общее количество смеси углеводов в составе корректировали до достижения требуемой вязкости и плотности состава, обеспечивающих эффективное высушивание наряду с предотвращением образования каучукоподобного материала или избыточного вспенивания, которое может происходить на этапе высушивания. Подходящая типовая вязкость суспензии составляет от приблизительно 1000 сП до приблизительно 500000 сП, или от приблизительно 5000 сП до приблизительно 300000 сП. Желательные вязкость и плотность готовой суспензии могут быть достигнуты с помощью любых способов, известных в данной области техники, например, небольшой коррекцией количества полисахаридов в смеси углеводов, либо дегазацией или впрыскиванием газа, такого как воздух, азот, диоксид углерода, аргон и т.д.

[72] Суспензию биологического материала согласно настоящему изобретению, как правило, быстро замораживают до температур от -30°C до -180°C, или указанный состав быстро замораживают в жидком азоте путем распыления, капельного стекания или впрыскивания в ванну с жидким азотом. Извлекают частицы, гранулы, нити или капли из ванны с жидким азотом и высушивают в сублимационной сушилке или вакуумной сушилке, или, как вариант, хранят в аппарате для глубокой заморозки (от -30°C до -80°C) для последующего использования в замороженном виде или для последующего высушивания, например, высушивания распылением.

[73] В целом, подходящие техники высушивания включают высушивание распылением; или высушивание выпариванием незамороженного раствора в вакуумной печи или центробежном испарителе при температурах выше температуры замерзания суспензии (от -20 до 50°C), с последующим перемалыванием для получения требуемого размера частиц. Полученные частицы порошка имеют стеклообразную структуру, при этом большая часть указанного стеклообразного материала покрывает биологический материал. Преимущество покрытия биологического материала стеклообразными материалами состоит в увеличении физической стабильности продукта и сокращении разрушительных межмолекулярных реакций внутри частиц. Согласно соответствующему примеру варианта реализации замороженные частицы загружают на лотки и немедленно переносят в камеру для вакуумной сушки, где продолжают процесс высушивания, состоящий из трех основных этапов, включающих: (1) необязательную непродолжительную продувку и этап стабилизации структуры замороженных частиц в вакууме менее чем <2000 миллиторр, (2) этап первичного высушивания в вакууме более чем >2000 миллиторр при температуре выше точки замерзания суспензии, и (3) вторичный и последний этап высушивания стеклообразного аморфного материала при полном вакууме и повышенной температуре на протяжении времени, достаточного для снижения водной активности высушенного состава до 0,3 Aw или менее.

[74] Согласно конкретному варианту реализации настоящего изобретения высушенный состав гранулируют со смесью расплавленных жиров для повышения защиты в случае непродолжительных периодов воздействия экстремальных температуры и влажности.

[75] Высушенная стабильная биологическая композиция может применяться непосредственно в виде хлопьев, или может быть перемолота в порошок и просеяна для получения среднего размера частиц от приблизительно 10 мкм до приблизительно 1000 мкм. Указанный состав может прямо вводиться животному, включая человека, в виде концентрированного порошка, в виде восстановленной жидкости (например, напитка), или может быть включен в виде хлопьев или порошка в существующий пищевой продукт, корм или сельскохозяйственный продукт.

[76] Согласно некоторым вариантам реализации композиции для получения стабильных замороженных или сухих порошков биологических материалов в соответствии с настоящим изобретением включают смесь углеводов и усилитель стеклообразования. Такие материалы при смешивании с биологически активным материалом образуют гранулы, нити или капли в жидком азоте и могут быть успешно высушены в аморфную стеклообразную структуру в соответствии со способами согласно настоящему изобретению, для получения значительных количеств стабильных сухих композиций для хранения и введения указанного биологически активного материала. (См. фиг. 7 и 8, где представлены данные визуальных и микроскопических наблюдений и приведены значения водной активности (Aw) для разных составов после высушивания). Смесь углеводов обеспечивает структурную стабильность состава при высоких температурах и влажности, например, выше 30°C и 40% отн. вл, и/или полезные защитные физические и химические свойства биологически активным материалам, предотвращает или уменьшает нежелательные эффекты при восстановлении или регидрировании.

[77] Фракция полисахаридов в смеси углеводов может обеспечивать загущение состава, лучший контроль плотности состава в вакууме и повышение структурной прочности композициям с высушенным составом согласно настоящему изобретению. (См. фиг. 8 - рисунки 4, 4b, 4c, где показана стеклообразная структура и степень высушивания указанного конкретного состава). Подходящими полисахаридами, в частности, для живых организмов, являются водорастворимые камеди за счет их отличительного свойства - способности образовывать вязкий гель при умеренных температурах. Также камеди в определенной концентрации, как было обнаружено, эффективно стабилизируют структуру состава в вакууме за счет обеспечения подходящей вязкости и плотности состава и эффективного высушивания указанного состава во время этапа первичного удаления воды при конкретной вязкости. Некоторые камеди способны также образовывать гидрогели за счет поперечного сшивания с двухвалентными или многовалентными катионами (например, альгинаты, пектины, хитозан) или при изменении температуры или рН (например, желатины, КМЦ, АФЦ, геллановая камедь). Гидрогелевые растворы предотвращают проблемы, связанные с вакуумной сушкой незамороженных растворов. Камеди в определенной концентрации также, как было обнаружено, эффективно стабилизируют состав, облегчают получение аморфной стеклообразной структуры и улучшают параметры высушивания в вакууме (см. фиг. 7 - рис. 3а, 3b, 3с, 4; фиг. 8-4с; и фиг. 13).

[78] Примечательно то, что, как видно из рисунков на фиг. 7 в сочетании с результатами, представленными ниже в табл. 1, все образцы 3b, 3c, 4, 5 и 6, очевидным образом, были высушены в достаточной степени для обеспечения определенного уровня пористости аморфных стеклообразных структур.

[79] Таблица 1

Например, биологически активный материал в сухой форме может быть включен в раствор или суспензию, содержащий(ую) композицию в виде порошковой смеси. Композиция в виде смеси может быть растворена в теплом водном растворе при перемешивании с небольшим усилием сдвига перед охлаждением и смешиванием с указанным биологически активным материалом. Биологически активный материал, такой как культура вируса или бактерии, может быть сконцентрирован и отделен от культуральной среды путем центрифугирования или фильтрации до ресуспендирования с получением состава. Как вариант, всю воду или часть воды в составе представляет жидкость указанного концентрированного биологического материала. Температуру суспензии поддерживают на уровне немного выше комнатной температуры, и композицию в виде сухой порошковой смеси медленно добавляют к теплой (25°C-40°C) суспензии, содержащей биологический материал. Суспензию осторожно перемешивают в планетарном смесителе до тех пор, до полного диспергирования или растворения компонентов с получением однородной суспензии.

[80] Затем может быть проведено поперечное сшивание вязкой суспензии с образованием гидрогеля (в зависимости от свойств полисахаридов) путем добавления ионов металлов или изменения температуры или рН массы, а затем - высушивание в соответствии со способами высушивания согласно настоящему изобретению. Как вариант, суспензия может быть быстро заморожена посредством мелкодисперсного распыления через насадку, капельного стекания или впрыскивания в ванну с сухим льдом или жидким азотом для получения небольших частиц или твердых капель, нитей или гранул. Замороженные твердые частицы можно хранить в морозильном аппарате для глубокого замораживания при температуре от -30°C до -80°C для будущего использования в виде стабильного замороженного продукта, либо до высушивания. Подходящим типовым способом высушивания является вакуумная сушка, при которой температуру продукта поддерживают на уровне немного выше его температуры замораживания. Замороженные капли или гранулы помещают на лотки в количестве от приблизительно 0,1 кг/кв.фут до приблизительно 1,5 кг/кв.фут и высушивают в соответствии со способом согласно настоящему изобретению. Согласно некоторым вариантам реализации процесс высушивания начинают с этапа непродолжительной продувки, который обеспечивает адаптацию продукта к исходной температуре, релаксацию и стабилизацию структуры замороженных частиц и дегазацию с удалением избыточного воздуха. Как правило, этап продувки занимает от 1 до 60 минут в зависимости от вязкости продукта и загрузки лотка. Гранулы или частицы должны оставаться в твердой замороженной форме в течение всего этапа продувки. Затем температуру продукта доводят до уровня выше его температуры замораживания, и проводят этап первичного удаления воды до тех пор, пока вся свободная вода не испарится из продукта. После достижения требуемой температуры состава нагревание корректируют таким образом, чтобы поддерживать заданную температуру, и этап первичного высушивания жидкости продолжается за счет испарения. На указанном этапе состав уже разморожен, и ускоренное испарение воды происходит без какого-либо кипения или вспенивания. Процесс высушивания завершают фазой дополнительного вторичного высушивания при максимальном вакууме и повышенной температуре.

[81] Типичные способы на существующем уровне техники включают интенсивное вспенивание и/или разбрызгивание, и интенсивное кипение, что может повреждать чувствительные биологические материалы и приводить к проблемам при масштабировании производства до промышленного уровня при загрузке значительных количеств (см, например патент США №6534087, где используемый вакуум приводит к интенсивному кипению и вспениванию). При этом предложенные в настоящем документе композиции и способы позволяют избежать кипения или вспенивания указанного состава наряду с обеспечением значительно большей скорости высушивания, и позволяют проводить обработку значительных количеств состава. Кроме того, полная и эффективная дегазация вязких жидких суспензий представляет трудность и может занимать длительное время. Все перечисленные трудности были устранены с помощью настоящего изобретения за счет применения подходящей композиции, позволяющей проводить эффективное первичное удаление воды наряду с получением стеклообразной структуры без кипения и избыточного вспенивания. Загрузка твердых замороженных частиц на лоток, по сравнению с загрузкой жидкой суспензии или вязкого сиропа, обеспечивает значительно более высокую вместимость зоны высушивания на лотках по сравнению с возможной на существующем уровне техники.

[82] Согласно одному подходящему примеру настоящего изобретения биологический материал представляет собой концентрат культуры живой пробиотической бактерии. Согласно некоторым вариантам реализации композиция в виде порошковой смеси содержит альгината натрия или геллановой камеди, 50-75% трегалозы, 1-10% инулина или ФОС, 10-20% белковых гидролизатов, таких как гидролизаты казеина, сыворотки, гороха, сои или семян хлопчатника, и 1-10% цитрата натрия или аскорбата натрия. Пробиотическая культура может быть свежей, замороженной или предварительно высушенной, в форме сухого порошка.

[83] Согласно другому подходящему примеру настоящего изобретения биологический материал представляет собой концентрат культуры живого микроорганизма. Композицию в виде порошковой смеси получают смешиванием 1-4% альгината натрия или геллановой камеди, 5-30% трегалозы, 5-40% инулина, 5-40% мальтодекстрина с низким ДЭ, 10-30% глубоко гидролизованного белка, такого как казеин, сыворотка, горох, соя или белок семян хлопчатника. Необязательно в композицию также могут быть дополнительно включены 0,1-10% усилителей стеклообразования, таких как цитрат натрия, глутамат натрия или аскорбат натрия. Культура микроорганизма или спор может быть свежей, замороженной или предварительно высушенной, в форме сухого порошка.

[84] Смесь с композицией добавляют в среду с концентрированной пробиотической культурой до достижения содержания твердого вещества в растворе смеси, составляющего 40-60% (по массе), и рН доводят до 6,5-7,5 добавлением фосфатных или цитратных ионов. Раствор перемешивают при температуре, незначительно превышающей комнатную температуру (как правило, от 25°C до 37°C) до полного растворения всех компонентов. Вязкая суспензия по каплям стекает в жидкий азот, образуя небольшие капли или гранулы, которые затем извлекают из жидкого азота, упаковывают в пакеты и хранят в морозильном аппарате для глубокого замораживания при -80°C до высушивания.

[85] Типичный способ высушивания живой пробиотической бактерии включает распределение твердых замороженных гранул на лотках равномерным слоем в количестве 100-1500 г/кв. фут; лотки немедленно помещали в сублимационную сушилку. Затем применяли вакуум приблизительно 1000 миллиторр или ниже, и в зависимости от размера сублимационной сушилки и типа источника нагревания доводили температуру до приблизительно -20 - приблизительно -30°C. Твердые замороженные гранулы оставляют для продувки приблизительно на 1-60 минут, доводят вакуум до 2000-10000 миллиторр и увеличивают нагрев для повышения температуры состава до -20°C-0°C, или до -10°C-0°C, как правило, приблизительно -10°C. Указанные температуру и вакуум поддерживают на протяжении этапа первичного удаления воды, который может продолжаться от нескольких часов и до 24 часов в зависимости от загруженности лотка. В определенный момент времени в процессе первичного высушивания скорость испарения растворителя снижается, и температура состава начинает повышаться благодаря большему поступлению тепла в сушильную камеру. Указанный момент времени соответствует окончанию этапа первичного высушивания согласно настоящему изобретению. После испарения растворителя из состава стеклообразующие соединения в растворе становятся более концентрированными и загустевают до тех пор, пока раствор не утрачивает характерную для жидкости текучесть и не переходит в аморфную и/или стабильную стеклообразную структуру.

[86] Затем следует этап вторичного высушивания при максимальном вакууме и температуре состава от 30°C до 50°C. Целью этапа вторичного высушивания является удаление оставшейся захваченной или связанной жидкости и получение композиции, стабильной при хранении на протяжении длительного периода времени при обычных температурах окружающей среды. Этап вторичного высушивания может продолжаться несколько часов, и его конечная точка соответствует моменту, когда состав полностью высушен и его водная активность составляет менее чем 0,3 Aw.

[87] Способы высушивания согласно настоящему изобретению обеспечивают получение биологически активного материала, заключенного внутрь аморфной стеклообразной структуры, с предотвращением за счет этого разворачивания или денатурации белков и значительным уменьшением молекулярных взаимодействий или перекрестной реактивности благодаря значительному уменьшению подвижности указанного соединения и других молекул в составе аморфной стеклообразной композиции. Относительная стабильность пробиотической бактерии может сохраняться при условии поддержания аморфной твердой структуры при температуре ниже температуры ее перехода в стеклообразное состояние, и сохранении достаточно низкой остаточной влажности, см. фиг. 15. Следует отметить, что получение стеклообразной структуры не является обязательным условием для обеспечения стабильности в течение длительного времени, так как для некоторых биологических материалов более благоприятным может быть более кристаллическое состояние.

[88] Высушенная стеклообразная структура может использоваться в виде цельной массы, может быть нарезана на фрагменты требуемой формы и размеров либо измельчена и перемолота в свободно текучий порошок, что позволяет с легкостью осуществлять последующую обработку, например, влажную или сухую агломерацию, гранулирование, таблетирование, компактирование, пеллетирование или любой другой способ получения продукции. Способы измельчения, перемалывания, перетирания или распыления хорошо известны в данной области техники. Например, может применяться молотковая мельница, воздушная мельница, ударная мельница, вихревая мельница, штифтовая мельница, мельница Вили или аналогичное устройство для перемалывания. Подходящий типовой размер частиц составляет менее чем приблизительно 1000 мкм, и согласно некоторым вариантам реализации менее чем 500 мкм.

[89] В другом примере настоящего изобретения сухой стабильный порошок, содержащий биологически активный материал, агломерируют с расплавленными жирами. Сухой порошок помещали в планетарный смеситель при 40°C, и расплавленные жиры, такие как масло какао, натуральные воски или гидрогенизированное масло или их смесь медленно добавляли к теплому порошку при перемешивании; смесь охлаждали до температуры ниже температуры плавления жиров, продолжая перемешивание до получения агломерированного порошка с визуально однородным размером частиц. Массовая доля смеси расплавленных жиров в указанной композиции составляет от приблизительно от 20% до приблизительно 70%, согласно некоторым вариантам реализации приблизительно 30-50%. Готовый продукт может употребляться в агломерированной форме, или может подвергаться прессованию в таблеточной машине и употребляться в форме таблеток.

[90] Согласно одному из конкретных примеров сухой порошок прессуют в таблеточной машине с получением таблетки требуемой формы и размера. Стабильную сухую биологическую композицию необязательно смешивают с наполнителем для достижения активности таблетки, соответствующей требуемой дозировке. Наполнитель может включать, не ограничиваясь перечисленными, мальтодекстрин, карбоксиметилцеллюлозу натрия, карбоксиметилцеллюлозу кальция, коллоидную двуокись кремния и их комбинации. Необязательно в смесь для таблетирования также включают агент, улучшающий распадаемость. Примеры улучшающих распадаемость агентов могут включать, не ограничиваясь перечисленными, кроскармеллозу натрия, кросповидон (нерастворимый поливинилпирролидон), крахмалгликолят натрия, крахмалгликонат натрия, прежелатинизированный крахмал и т.п. Согласно настоящему документу смесь для таблетирования может необязательно включать обеспечивающие текучесть агенты. Указанные обеспечивающие текучесть агенты могут включать, не ограничиваясь перечисленными, стеарат магния, стеарат кальция, стеарат цинка, стеариновую кислоту и кремнеземный порошок, такой как гидрофильный или гидрофобный кремнеземный порошок.

[91] Подходящие способы получения таблеток из стабильной биологической композиции и других ингредиентов таблеток включают стандартные способы таблетирования прессованием, включая обычно используемые для получения многослойных таблеток. Давление сжатия при таблетировании до 50 кН/см2, соответствующее пределу прочности на разрыв менее 100 Н (оборудование Erweka) является предпочтительным, при этом температура воздействия должна быть ограничена значениями ниже 60°C в тех случаях, когда биологический материал представляет собой живой микроорганизм.

[92] Таблетки могут быть предназначены для проглатывания целиком, разжевывания или приготовления шипучего напитка. При распаде таблеток после употребления во рту, в напитке или в желудке, биологический материал подвергается воздействию других активных материалов, от которых они были отделены в структуре таблетки. Потенциально это может приводить к повреждению биологического материала, если местная концентрация повреждающих материалов слишком высока. Таким образом, согласно некоторым вариантам реализации предпочтительна задержка распада биологического активного материала, чтобы обеспечить разбавление и диспергирование содержимого других активных компонентов таблетки. Указанная проблема была решена в настоящем изобретении за счет получения композиции с упрочненной или поперечно-сшитой структурой согласно описанию в настоящем документе. Согласно некоторым вариантам реализации биологический материал остается в неизмененном состоянии в матрице композиции при смешивании с водой. Согласно некоторым вариантам реализации неповрежденный биологический материал высвобождается из матрицы композиции на требуемом участке приложения действия пищеварительного тракта животного.

[93] Таблетки в соответствии с настоящим изобретением могут быть упакованы таким образом, чтобы сохранить исходную степень сухости в приемлемом диапазоне. Для этого может использоваться упаковка таблеток во влагонепроницаемую емкость, такую как туба или блистерная упаковка, или в контейнер, содержащий обезвоживающий агент, такой как силикагель, для поглощения воды, что снижает водную активность внутри контейнера. Для защиты от кислорода такая упаковка может также содержать поглощающий кислород материал, такой как FreshPax®, Ageless™, аскорбилпальмитат или другие аскорбаты, пропилгаллаты или другие галлаты, альфа-токоферол, сульфит магния или натрия, бутилированный гидроксианизол или бутилированный гидрокситолуол и т.п.

[94] Композиции и способы, описанные в настоящем документе, стабилизируют биологический материал и сохраняют его активность в течение длительного периода хранения при температурах и относительной влажности выше обычных значений. Так, композиции тестируют на стабильность, подвергая воздействию повышенной температуры (например, 40°C) и высокой влажности (например, 33% отн. вл, или 43% отн. вл.) и измеряя биологическую активность составов. В примере с живой пробиотической бактерией результаты указанных исследований показывают, что бактерия, включенная в состав указанных композиций, сохраняет стабильность на протяжении по меньшей мере 60 дней. Стабильность определена как период времени, в течение которого происходит снижение активности, выраженной через логарифм КОЕ/г. Такие составы стабильны даже при использовании высоких концентраций биологически активного материала. Таким образом, указанные составы обладают преимуществом, состоящим в возможности транспортировки и хранения при комнатной температуре или выше на протяжении длительных периодов времени.

ПРИМЕРЫ

[95] ПРИМЕР 1

[96] Получение сухой и стабильной композиции

[97] Основная смесь углеводов

[98] Приблизительно 70 г трегалозы (Cargill, Миннеаполис, Миннесота, США), приблизительно 5 г растворимого инулина (Cargill, Миннеаполис, Миннесота, США) и приблизительно 3 г альгината натрия (ISP Corp, Уэйн, Нью-Джерси, США) перемешивали до однородности в сухом виде.

[99] Основная смесь усилителей стеклообразования

[100] Приблизительно 17 г гидролизатов казеина или гидролизатов гороха (ультрафильтрованные гидролизаты, Marcoc, Карлштадт, Нью-Джерси, США) и 5 г цитрата натрия или аскорбата натрия (Sigma, Сент-Луис, Миссури, США) перемешивали до однородности в сухом виде.

[101] Стабилизация пробиотической бактерии

[102] Свежий концентрат Lactobacillus rhamnosus (100 мл, 10% твердых веществ, получен непосредственно в результате ферментирования) добавляли в измельчитель при поддержании температуры 35°C. Приблизительно 78 г основной смеси углеводов и приблизительно 22 г основной смеси усилителя стеклообразования медленно добавляли в культуру пробиотика и смешивали при 35°C на протяжении 10 минут. Затем вязкую суспензию переносили в сосуд с перфорированным дном и позволяли по каплям стекать в ванну с жидким азотом. Затем извлекали гранулы из жидкого азота и немедленно приступали к высушиванию.

[103] Высушивание замороженных гранул, содержащих пробиотическую бактерию

[104] Замороженные гранулы распределяли на лотке в количестве 200 г/кв. фут и немедленно помещали на полку в сублимационной сушилке (модель 25 SRC, Virtis, Гардинер, Нью-Йорк, США). Затем доводили вакуум до 2000-2700 миллиторр, температура повышалась до +30°C. Указанные настройки температуры и вакуума поддерживали на протяжении 5 часов. Необязательно температуру замороженных гранул стабилизировали на уровне приблизительно -20°C перед началом первичного высушивания жидкости, используя вакуум приблизительно 1000 миллиторр и оставляя твердые замороженные гранулы для продувки приблизительно на 10 минут. За этапом первичного высушивания следовало доведение вакуума до 2000-2700 миллиторр, температура повышалась до +30°C. Указанные настройки температуры и вакуума поддерживали в течение 5 часов. Затем проводили этап вторичного высушивания при полном вакууме (150-200 миллиторр) при поддержании температуры 30°C-50°C на протяжении дополнительных 3 часов. Состав полностью высыхал, и измеренная водная активность с помощью инструмента Hygropalm AWI (Rotonic Instrument Corp, Хантингтон, Нью-Йорк, США) при Aw = 0,23.

[105] ПРИМЕР 2

[106] Стабильность при хранении сухой пробиотической бактерии

[107] Фиг. 1 отражает стабильность при двух разных вариантах условий ускоренного хранения: 40°C и 33% отн. вл, и 30°C и 43% отн. вл, сухой стабильной пробиотической бактерии из примера 1 и коммерчески доступной сухой пробиотической бактерии (Culturelle, Amerifit, Inc, Кромвель, Коннектикут, США). Коммерческая пробиотическая бактерия полностью теряла жизнеспособность в течение первых нескольких недель в условиях ускоренного хранения, тогда как в сухой композиции с пробиотической бактерией согласно настоящему изобретению жизнеспособность снижалась всего на 1,18 логарифмических единиц через 60 дней при 30°C и 43% отн. вл, и всего на 1,09 логарифмических единиц при 40°C и 33% отн. вл..

[108] ПРИМЕР 3

[109] Получение стабильной сухой композиции, содержащей пробиотическую бактерию Lactobacillus rhamnosus, в увеличенном масштабе

[110] Lactobacillus rhamnosus (400 г замороженного концентрата из коммерческого источника) размораживали при 37°C в двойном планетарном смесителе с рубашкой (DPM, 1 кв, Ross Engineering, Inc, Саванна, Джорджия, США), содержание твердого вещества доводили до 10% по массе дистиллированной водой). Приблизительно 212 г трегалозы (Cargill, Миннеаполис, Миннесота, США), приблизительно 20 г растворимого инулина (Cargill, Миннеаполис, Миннесота, США), приблизительно 12 г альгината натрия (ISP Corp, Уэйн, Нью-Джерси, США), приблизительно 136 г гидролизатов казеина (ультрафильтрованные гидролизаты, Marcor, Карлштадт, Нью-Джерси, США) и приблизительно 20 г аскорбата натрия (Sigma, Сент-Луис, Миссури, США) перемешивали до однородности в сухом виде. Порошковую смесь медленно добавляли в пробиотическую культуру и перемешивали при 40 об./мин и 37°C на протяжении 10 минут. Затем суспензию переносили в сосуд с перфорированным дном и позволяли по каплям стечь в ванну с жидким азотом. Затем гранулы извлекали из жидкого азота, помещали в герметичный фольгированный алюминием пакет и хранили в морозильном аппарате для глубокого замораживания при -80°C в течение нескольких недель.

[111] Для высушивания замороженные гранулы равномерно распределяли на лотках в количестве от 500 до 1500 г/кв. фут и лотки помещали на полки в сублимационной сушилке (модель 25 SRC, Virtis, Гардинер, Нью-Йорк, США). Этап первичного высушивания жидкости начинали с доведения вакуума до 2000-2700 миллиторр, и повышения и стабилизации температуры продукта до -10 - -5°C. С течением времени (приблизительно через 10-16 ч) температура продукта повышалась приблизительно до 20-25°C, в этот момент начинали этап вторичного высушивания при максимальном вакууме (150-200 миллиторр) и поддержании температуры продукта на уровне от 30 до 40°C на протяжении еще 14 часов. Состав полностью высыхал, и измеренная водная активность составляла 0,23 Aw.

[112] ПРИМЕР 4

[113] Получение в увеличенном масштабе стабильной сухой композиции, содержащей пробиотическую бактерию Bifidobacterium lactis

[114] Bifidobacterium lactis (400 г замороженного концентрата из коммерческого источника) размораживали при 37°C в двойном планетарном смесителе с рубашкой (DPM, 1 кв, Ross Engineering, Inc. Саванна, Джорджия, США). Приблизительно 212 г трегалозы (Cargill, Миннеаполис, Миннесота, США), приблизительно 20 г растворимого инулина (Cargill, Миннеаполис, Миннесота, США), приблизительно 12 г альгината натрия (ISP Corp, Уэйн, Нью-Джерси, США) и приблизительно 20 г аскорбата натрия (Sigma, Сент-Луис, Миссури, США) перемешивали до однородности в сухом виде. Порошковую смесь медленно добавляли в пробиотическую культуру. Приблизительно 136 г гидролизатов гороха (ультрафильтрованные гидролизаты, Marcor, Карлштадт, Нью-Джерси, США) растворяли в 80 г дистиллированной воды и указанную смесь в течение непродолжительного времени нагревали в микроволновой печи или на водяной бане до 60°C до полного растворения, а затем охлаждали приблизительно до 35°C. Сухую порошковую смесь и раствор, содержащий гидролизаты белков гороха, добавляли в концентрат пробиотика и перемешивали при 40 об./мин и 37°C в течение 20 минут. Указанную суспензию затем переносили в сосуд с перфорированным дном и позволяли по каплям стекать в ванну с жидким азотом. Затем гранулы извлекали из жидкого азота, помещали в герметичный фольгированный алюминием пакет и хранили в морозильном аппарате для глубокого замораживания при -80°C в течение нескольких недель.

[115] Для высушивания замороженные гранулы равномерно распределяли на лотках в количестве 800 г/кв. фут; лотки помещали на полки в сублимационной сушилке (модель 25 SRC, Virtis, Гардинер, Нью-Йорк, США). Этап первичного высушивания жидкости начинали с доведения вакуума до 2000-2700 миллиторр, температуру продукта повышали и стабилизировали на уровне от -10 до -5°C. Со временем (приблизительно через 10-16 ч) температура продукта повышалась до приблизительно 20-25°C, после чего начинали этап вторичного высушивания при максимальном вакууме (150-200 миллиторр) и поддержании температуры продукта на уровне от 30 до 40°C на протяжении еще 14 часов. Состав полностью высыхал, и измеренная водная активность составляла 0,23 Aw.

[116] ПРИМЕР 5

[117] Получение гидрогелевого состава, содержащего пробиотическую бактерию Bifidobacterium lactis

[118] Концентрированную суспензию пробиотика Bifidobacterium lactis получали в соответствии с примером 1. К основному составу добавляли 0,5 г двухосновного фосфата кальция, а затем 0,5 г глюконолактона. Суспензию оставляли для затвердевания при комнатной температуре в течение следующих 2 часов для получения твердого гидрогеля. Твердый гель разрезали на тонкие длинные полосы с применением коммерчески доступного ножа/измельчителя. Указанные тонкие полосы загружали непосредственно на лотки во влажном состоянии или подвергали быстрому замораживанию в жидком азоте, загружали на лоток в количестве 500 г/кв. фут и помещали в сублимационную сушилку для высушивания согласно описанию в примере 3. Водная активность (Aw) указанного состава составляет 0,05 (измерения проводились с помощью HygroPalm Awl, Rotonic, Хантингтон, Нью-Йорк, США). Затем сухой состав перемалывали в тонкий порошок с применением обычной молотковой мельницы и просеивали через сита с диаметром ячеек 50-250 мкм.

[119] ПРИМЕР 6

[120] Оптимизация молярного отношения усилителей стеклообразования и смеси углеводов

[121] В соответствии с примером 1 получали несколько композиций, содержащих различные молярные доли усилителей стеклообразования и смеси углеводов. Концентрированную культуру пробиотической бактерии L. paracasei получали из коммерческого источника и включали в состав сухой композиции согласно описанию в примере 1, за исключением того, что массу немедленно загружали на лотки во влажном виде, минуя этапы быстрого замораживания и продувки. Суспензию высушивали в ходе первичного и вторичного этапов согласно описанию в примерах 1 и 3, за исключением того, что температуру повышали до 40°C во время этапов первичного и вторичного высушивания. Стабильный порошок помещали в условия ускоренного хранения при 37°C и 33% отн. вл. на 84 дня. На фиг. 2 показан эффект различных молярных отношений на стабильность высушенных бактерий. Результаты указывали на то, что оптимальное молярное отношение усилителей стеклообразования и смеси углеводов составляет приблизительно 0,12-0,15.

[122] ПРИМЕР 7

[123] Эффект композиции согласно настоящему изобретению на стабильность при хранении пробиотической бактерии L. acidophilus

[124] Получали композицию, содержащую смесь углеводов и смесь усилителей стеклообразования согласно описанию в примере 1. Концентрированную культуру пробиотической бактерии L. acidophilus получали из коммерческого источника и включали в состав сухой композиции согласно описанию в примерах 1 и 3; стабильный порошок помещали в условия ускоренного хранения при 24°C и 33% отн. вл. на 537 дней. На фиг. 3 представлена наилучшая стабильность пробиотика, включенного в состав композиции согласно настоящему изобретению. Результаты показывали, что жизнеспособность пробиотика снижалась всего на 0,18 логарифмических единиц за 537 дней хранения в заданных условиях.

[125] ПРИМЕР 8

[126] Эффект различных соединений - усилителей стеклообразования на стабильность при хранении пробиотической бактерии L. acidophilus

[127] Получали несколько композиций, содержащих смесь углеводов согласно описанию в примере 1 и смесь усилителей стеклообразования, содержащую гидролизаты казеина и цитрат натрия или аскорбат натрия, или их комбинацию. Концентрированную культуру пробиотической бактерии L. acidophilus получали из коммерческого источника и включали в состав сухой композиции согласно описанию в примере 1, за исключением того, что указанную суспензию немедленно загружали на лотки во влажном состоянии, минуя этапы быстрого замораживания и продувки. Суспензию высушивали в ходе первичного и вторичного этапов согласно описанию в примерах 1 и 3, и стабильный порошок помещали в условия ускоренного хранения при 24°C и 43% отн. вл. на 180 дней. На фиг. 4 показан эффект различных стимулирующих стеклообразование соединений на стабильность высушенных бактерий. Результаты указывали на значительно более высокую стабильность при включении в белковые гидролизаты дополнительных усилителей стеклообразования. В частности, включение равных количеств ацетата натрия и аскорбата натрия обеспечивало получение наиболее стабильной композиции. Результаты из примеров 5 и 6 также предполагали, что различные усилители стеклообразования могут быть более эффективными или могут даже функционировать в качестве дестабилизаторов в зависимости от штамма бактерии.

[128] ПРИМЕР 9

[129] Эффект различных соотношений белковых гидролизатов/сахаров на стабильность при хранении пробиотической бактерии Bifidobacterium lactis

[130] Получали несколько композиций, содержащих смесь углеводов и усилителей стеклообразования согласно описанию в примере 1, и композиций, содержащих равные количества, но разные пропорции гидролизатов гороха/трегалозы с аскорбатом натрия или без аскорбата натрия. Концентрированную культуру пробиотической бактерии Bifidobacterium lactis получали из коммерческого источника, включали в состав сухой композиции согласно описанию в примерах 1 и 3, и стабильный порошок помещали в условия ускоренного хранения при 35°C и 43% отн. вл. на 7 недель. На фиг. 5 показан эффект пропорций 1:4,1:2,5 и 1:1,5 гидролизатов гороха/трегалозы с аскорбатом натрия или без аскорбата натрия на стабильность высушенных бактерий. Результаты указывали на значимо более высокую стабильность при более высоких значениях отношения гидролизатов гороха к трегалозе. В частности, пропорция 1:1,5 гидролизатов гороха к трегалозе обеспечивала получение более стабильной композиции. Включение аскорбата натрия при более высоком значении отношения гидролизатов гороха к трегалозе приводило к наилучшей стабильности по сравнению с составами без аскорбата натрия.

[131] ПРИМЕР 10

[132] Оптимизация значений рН для максимальной стабильности пробиотика L. rhamnosus

[133] Получали несколько композиций, содержащих смесь углеводов и усилители стеклообразования согласно описанию в примере 1, при разных значениях рН. Концентрированную культуру пробиотической бактерии L. rhamnosus получали из коммерческого источника и включали в состав сухой композиции согласно описанию в примерах 1 и 3. Стабильный порошок помещали в условия ускоренного хранения при 40°C и 33% отн. вл. на протяжении 8 недель. На фиг. 6 представлено влияние рН суспензии на стабильность высушенных бактерий. Результаты указывали на то, что оптимальная стабильность достигалась при нейтральном значении рН (~7).

[134] ПРИМЕР 11

[135] Стабильный сухой порошок, содержащий фермент

[136] Гидрогелевый состав, содержащий 40 масс.% фитазы (BASF, GmBH), получали путем смешивания 400 г смеси углеводов и 200 г смеси усилителей стеклообразования согласно описанию в примерах 1 и 4 и 400 г фитазы в 1000 мл воды. Измельченный гидрогелевый состав подвергали быстрому замораживанию в жидком азоте и высушивали в вакуумной печи при температуре первичного и вторичного высушивания 50°C. Для определения содержания (белка) и стабильности при хранении высушенного состава сухой образец аккуратно взвешивали (<100 мг) в микроцентрифужной пробирке. Добавляли часть диметилсульфоксида объемом 200 мкл (ДМСО). Состав растворяли в ДМСО-буфере перемешиванием на вортексе. К указанному образцу добавляли 0,8 мл раствора, содержащего 0,05 Н NaOH, 0,5% ДСН и 0,075 М лимонную кислоту (тринатриевую соль). Пробирки обрабатывали ультразвуком в течение 10 минут при 45°C, с последующим непродолжительным центрифугированием при 5000 об/мин в течение 10 минут. Аликвоты прозрачного раствора ДМСО/NаOH/ДСН/цитрата переносят в лунки микропланшета и анализируют на содержание белка с применением метода Бредфорда. Стабильность сухой стабильной композиции с ферментом после воздействия температурой 95°C в течение 20 минут значительно выше, чем стабильность сухого фермента без композиции согласно настоящему изобретению.

[137] ПРИМЕР 12

[138] Стабильный сухой порошок, содержащий вакцину против вируса инфекционной анемии лосося (ISAV)

[139] Концентрированную суспензию вакцины ISAV (Novozyme, Дания) получали в соответствии с примером 4, за исключением того, что в суспензию, содержащую концентрат вакцины ISAV, смесь углеводов и усилители стеклообразования, добавляли 20 мл 4% раствора хитозана в 0,5% уксусной кислоты. Добавляли 0,5 г двухосновного фосфата кальция, а затем 0,5 г глюконолактона. Суспензию оставляли для затвердевания при комнатной температуре на протяжении следующих 2 часов для получения твердого гидрогеля. Твердый гель разрезали на тонкие длинные полосы с применением коммерчески доступного ножа/измельчителя. Тонкие полосы загружали непосредственно на лотки во влажном состоянии или быстро замораживали в жидком азоте, загружали на лоток в количестве 1500 г/кв. фут и помещали в сублимационную сушилку для высушивания согласно описанию в примере 3. Водная активность (Aw) указанного состава составляет 0,25. Указанный сухой состав затем перемалывали в тонкий порошок с применением обычной молотковой мельницы и просеивали через сита с диаметром ячеек 50-150 мкм. Стабильную сухую композицию ISAV применяли для пероральной вакцинации, путем нанесения на коммерческий корм внешнего покрытия из сухой композиции и кормления атлантического лосося.

[140] ПРИМЕР 13

[141] Получение приманки для инвазивных видов

[142] В соответствии с настоящим изобретением получали содержащую пестицид пеллетированную приманку для направленного воздействия на инвазивные виды. 200 г состава получали согласно описанию в примере 9 и добавляли в 200 г воды. К указанному раствору добавляли 90 г ротенона и 0,5 г двузамещенного фосфата кальция, а затем 0,5 г глюконолактона. Суспензию немедленно высушивали распылением в стандартной промышленной распылительной сушилке, и сухой состав применяли для направленного воздействия на инвазивные виды без разрушительного эффекта токсина на окружающую среду или соседние экосистемы.

[143] ПРИМЕР 14

[144] Получение защищенного пробиотического состава для растений

[145] Агент биологического контроля, такой как Rhizobacteria, получали в виде сухой композиции в соответствии с примером 4. Эффективность сухой композиции с Rhizobacteria оценивали по росту салата в гнотобиологических условиях. Сухую композицию с Rhizobacteria в дозе 100 мг на растение вносят в банки с песком и высаживали предварительно пророщенные (24 ч) проростки салата. На растения в банке наносят простерилизованный раствор Хогланда с питательными веществами в дозировке 5 мл. Банки распределяли в случайном порядке в ростовой камере с поддерживаемой температурой 28°C и фотопериодом 12 ч. В течение каждого 7-дневного интервала времени после посева растения и приставший песок аккуратно извлекали из банок. Корни промывали в стерильном фосфатном буфере (рН 7,0) и регистрирули измеренную длину корней.

[146] ПРИМЕР 15

[147] Получение сухого стабильного пробиотического материала [148] Основной состав

[149] Часть (75 г) трегалозы (Cargill, Миннеаполис, Миннесота, США) и 22 г глубоко гидролизованного казеина (Marcor, Карлштадт, Нью-Джерси, США) перемешивали до однородности с 3 г альгината натрия (ISP Corp, Уэйн, Нью-Джерси, США) в сухом виде. Свежий концентрат Lactobacillus acidophilus (100 мл, по меньшей мере 10% твердого вещества, получен непосредственно в результате ферментирования) добавляли в измельчитель при поддержании температуры 35°C. Сухую смесь камеди, сахара и гидролизованного белка медленно добавляли в пробиотическую культуру и перемешивали при 35°C на протяжении 10 минут. Вязкую суспензию затем переносили в сосуд с перфорированным дном и позволяли по каплям стекать в ванну с азотом. Затем гранулы извлекали из жидкого азота и немедленно приступали к высушиванию.

[150] Высушивание замороженных гранул основного состава

[151] Замороженные гранулы равномерно распределяли на лотке в количестве 100 г/кв. фут и немедленно помещали на полку в сублимационной сушилке (модель 25 SRC, Virtis, Гардинер, Нью-Йорк, США). Затем применяли вакуум 1000 миллиторр, и твердые замороженные гранулы оставляли для продувки на 10 минут. Затем вакуум доводили до 2700 миллиторр и температуру повышали до +30°C. Указанные температуру и вакуум поддерживали на протяжении 3 часов. Затем проводили этап вторичного высушивания при полном вакууме (150-200 миллиторр) и температуру повышали до 30°C еще на 2 часа. Состав полностью высыхал, и измеренная с помощью инструмента Hygropalm Awl (Rotonic Instrument Corp, Хантингтон, Нью-Йорк, США) водная активность составляла Aw = 0,23.

[152] ПРИМЕР 16

[153] Стабильная сухая композиция, содержащая пробиотическую бактерию Lactobacillus rhamnosus LGG

[154] Lactobacillus rhamnosus LGG (500 г замороженного концентрата из коммерческого источника) размораживали при 37°C в двойном планетарном смесителе с рубашкой (DPM, 1 кв, Ross Engineering, Inc. Саванна, Джорджия,, США). Два стеклообразующих агента; трегалоза (387 г, Cargill, Миннеаполис, Миннесота, США) и глубоко гидролизованный казеин (83 г, Marcor, Карлштадт, Нью-Джерси, США) перемешивали до гомогенности в сухом виде с двумя матрицеобразующими агентами; альгинатом натрия (15 г, ISP Corp, Уэйн, Нью-Джерси, США) и растворимым инулином (25 г, Cargill, Миннеаполис, Миннесота, США). Сухую смесь медленно добавляли к размороженным пробиотическим бактериям и смешивали при 40 об./мин и 37°C на протяжении 10 минут. Вязкость суспензии доводили до 12000 сП добавлением 50-200 мл воды. Затем суспензию переносили в сосуд с перфорированным дном и позволяли по каплям стекать в сосуд, содержащий жидкий азот. Затем гранулы извлекали из жидкого азота, помещали в герметичный фольгированный алюминием пакет и хранили в морозильном аппарате для глубокого замораживания при -80°C в течение нескольких недель.

[155] Для высушивания замороженные гранулы равномерно распределяли на лотках в количестве от 100 до 500 г/кв. фут и лотки помещали на полки сублимационной сушилки (модель 25 SRC, Virtis, Гардинер, Нью-Йорк, США). Применяли вакуум 1000 миллиторр и температуру доводили до +20°C. Твердые замороженные гранулы оставляли для продувки на период времени от 1 до 30 минут. За этапом продувки следовал этап первичного высушивания после доведения вакуума до 2700 миллиторр и повышения температуры до +30°C. Указанные температуру и вакуум поддерживали в течение 12 часов. Затем проводили этап вторичного высушивания при полном вакууме (150-200 миллиторр) и поддержании температуры 30°C на протяжении еще 4 часов. Состав полностью высыхал, и измеренная водная активность составляла 0,23 Aw. На фиг. 13 представлены параметры высушивания пробиотического состава.

[156] Снижение жизнеспособности после замораживания суспензии при различных температурах (+4°C, -80°C и -180°C), процесса высушивания, включающего получение замороженных гранул, и высушивания в сублимационной сушилке показано на фиг. 10, 11 и 14. Снижение жизнеспособности в течение всего процесса в целом составляло менее чем 1 логарифмическую единицу в зависимости от типа бактериальной культуры (замороженные или сухие культуры) и температуры замораживания вязкой суспензии. Результаты показывали, что процесс быстрого замораживания пробиотической бактерии в жидком азоте (-180°C) оказывал менее повреждающее воздействие, чем замораживание при -80°C.

[157] На фиг. 12 и 15 показан эффект разных по продолжительности периодов продувки в диапазоне от 0 мин (без продувки) до 30 мин на исходное количество пробиотической бактерии в сухой композиции и на стабильность в условиях ускоренного хранения, температуре 40°C и 33% относительной влажности. Результаты предполагали, что более длительный период продувки в целом увеличивает исходное количество бактерий в сухом составе, но не оказывает влияния на стабильность пробиотического состава при хранении.

[158] ПРИМЕР 17

[159] Трегалозу (752 г, Cargill, Миннеаполис, Миннесота, США), глубоко гидролизованный белок гороха (167 г, Marcor, Карлштадт, Нью-Джерси, США), альгинат натрия (30 г, ISP Corp, Уэйн, Нью-Джерси, США) и растворимый инулин, 50 г, Cargill, Миннеаполис, Миннесота, США) перемешивали до гомогенности в сухом виде. Сухую смесь медленно добавляли к 1000 мл горячей деионизированной воды при 80°C в двойном планетарном смесителе с рубашкой (DPM, 1 кв, Ross Engineering, Inc. Саванна, Джорджия, США) и перемешивали при 40 об./мин на протяжении 10 минут. Температуру смеси снижали до 37°С°С, медленно добавляли 100 г сухого порошка Lactobacillus rhamnosus LGG, полученного из коммерческого источника, и продолжали смешивание в течение 20 минут. Затем суспензию экструдировали через иглу с отверстием 2 мм в ванну с жидким азотом. Указанные /нити/гранулы затем извлекали из жидкого азота, помещали в герметичный фольгированный алюминием пакет и хранили в морозильном аппарате для глубокого замораживания при -80°C в течение нескольких недель. Для высушивания замороженные нити/гранулы равномерно распределяли на лотках в количестве от 100 до 500 г/кв. фут, лотки помещали на полки в сублимационной сушилке (модель 25 SRC, Virtis, Гардинер, Нью-Йорк, США) и высушивали согласно описанию в примере 16. Все составы оставались полностью внутри лотков; при любых уровнях загрузки не наблюдалось разбрызгивания или вспенивания. Состав полностью высыхал даже при больших уровнях загрузки, до водной активности 0,26 Aw и ниже для всех образцов.

[160] ПРИМЕР 18

[161] Получение гидрогелевого состава, содержащего пробиотическую бактерию Bifidobacterium sp.

[162] Концентрированную суспензию пробиотика Bifidobacterium sp.получали в соответствии с примером 15. К основному составу добавляли 0,5 г двухосновного фосфата кальция, затем - 0,5 г глюконолактона. Суспензию оставляли для затвердевания при комнатной температуре еще на 2 часа для получения твердого гидрогеля. Твердый гель разрезали на тонкие длинные полосы с применением коммерчески доступного ножа/измельчителя. Тонкие полосы быстро замораживали в жидком азоте, загружали на лоток в количестве 700 г/кв. фут и помещали в сублимационную сушилку для высушивания согласно описанию в примере 16. Водная активность (Aw) указанного состава составляла 0,05 (измерения проводили с помощью HygroPalm Awl, Rotonic, Хантингтон, Нью-Йорк, США). Затем сухой состав перемалывали в тонкий порошок с применением обычной молотковой мельницы и просеивали через сита с диаметром ячеек 50-250 мкм.

[163] ПРИМЕР 19

[164] Не содержащая аллергенов композиция, содержащая пробиотическую бактерию Lactobacillus acidophilus

[165] Трегалозу (752 г, Cargill, Миннеаполис, Миннесота, США), глубоко гидролизованный белок гороха (167 г, Marcor, Карлштадт, Нью-Джерси, США), альгинат натрия (30 г, ISP Corp, Уэйн, Нью-Джерси, США) и растворимый инулин, 50 г, Cargill, Миннеаполис, Миннесота, США) перемешивали до гомогенности в сухом виде. Сухую смесь стерилизовали путем медленного добавления в 1000 мл горячей деионизированной воды с температурой 80°C в двойном планетарном смесителе с рубашкой (DPM, 1 кв, Ross Engineering, Inc, Саванна, Джорджия, США) и перемешивали при 40 об./мин на протяжении 10 минут до получения однородной прозрачной суспензии. Температуру смеси снижали до 37°C, медленно добавляли 1000 г замороженных гранул, содержащих Lactobacillus acidophilus из коммерческого источника, и продолжали перемешивание на протяжении 10 минут. Затем суспензию экструдировали через иглу с отверстием 2 мм в ванну с жидким азотом. Затем /нити/гранулы извлекали из жидкого азота, помещали в герметичный фольгированный алюминием пакет и хранили в морозильном аппарате для глубокого замораживания при -80°C в течение нескольких недель. Для высушивания замороженные нити/гранулы равномерно распределяли на лотках в количестве 1000 г/кв. фут, лотки помещали на полки сублимационной сушилки (модель 25 SRC, Virtis, Гардинер, Нью-Йорк, США) и высушивали согласно описанию в примере 16. Исходное значение КОЕ пробиотической бактерии в сухой композиции составляло 10,53 логарифмических единиц/г, и снижение жизнеспособности через 42 дня в условиях ускоренного хранения, при температуре 40°C и 33% отн. вл. составляло 0,69 логарифмических единиц КОЕ/г.

[166] ПРИМЕР 20

[167] Детское питание, содержащее сухой состав согласно настоящему изобретению

[168] Стабильный сухой состав, содержащий Lactobacillus rhamnosus, получали в соответствии с примером 16 с последующим просеиванием для разделения частиц на две группы по размеру (более 50 мкм и менее 150 мкм). Детское питание получали путем смешивания 99,9 г смеси Nutramigen (Mead Johnson; Эвансвилл, Иллинойс, США) с 0,1 г частиц сухого состава размером от 50 мкм и 150 мкм). Готовый продукт содержит приблизительно 108 КОЕ Lactobacillus rhamnosus на 100 г детского питания.

[169] ПРИМЕР 21

[170] Пробиотическая добавка, содержащая стабильный сухой состав согласно настоящему изобретению

[171] Стабильную сухую композицию, содержащую Lactobacillus acidophilus, включали в состав дозированных форм для перорального применения, таких как таблетки, капсуловидные таблетки или капсулы. Таблетки с ароматом апельсина, содержащие 99,9 г агента для прессования (декстрозы) и 0,1 г частиц сухого состава размером от 50 мкм до 150 мкм, получали прямым прессованием на роторной машине с применением стандартного инструмента для формовки ½ дюймовых круглых двояковыпуклых таблеток. Готовый продукт содержит приблизительно 108 КОЕ на единицу дозы. Твердость таблеток составляет 8-10 ед. твердости по Кнупу, время распадения составляет приблизительно 20 секунд. Прессованные таблетки упаковывали во флаконы из ПНД объемом 180 см3 по 100 таблеток на флакон и подвергали воздействию контролируемой температуры/влажности: 40°C/33% отн. влажности. Продукт ежемесячно тестировали на микробиологическую стабильность на протяжении 12 месяцев или до наблюдаемого при анализе снижения количества до уровня ниже 1×106 на единицу дозы.

[172] ПРИМЕР 22

[173] Функциональный напиток, содержащий стабильный сухой состав согласно настоящему изобретению

[174] Получали сухую смесь, содержащую (в % по массе) 71% сахарозы, 14% мальтодекстрина, 10% инулина, 2% декстрозы, 1% безводной лимонной кислоты, 0,3% аравийской камеди, 0,3% вкусоароматических веществ, 0,3% трикальцийфосфата и 0,1% частиц сухого пробиотического состава (L. acidophilus) размером от 50 мкм до 250 мкм. Готовый продукт содержит приблизительно 109 КОЕ на единицу дозы (30 г сухой смеси). Продукт упаковывали в небольшие пакеты из алюминиевой фольги (единица дозы 30 г на пакет) для приготовления напитка для употребления после разведения в 340 мл воды. Стабильность пробиотической бактерии в сухой смеси для приготовления напитка тестировали на микробиологическую стабильность ежемесячно на протяжении 12 месяцев либо до наблюдаемого в анализе снижения количества до уровня ниже 1×107 на единицу дозы.

[175] ПРИМЕР 23

[176] Получение пробиотического корма для домашних животных

[177] Коммерчески доступный пеллетированный корм для собак высушивали в конвекционном сушильном шкафу до достижения водной активности, составляющей 0,1, и затем покрывали стабильным пробиотическим сухим составом, полученным согласно описанию в примере 17. Сухие пеллеты опрыскивали приблизительно 5% состава на жировой основе для создания влагоудерживающего барьера (смесь 40% куриного жира, 40% масла какао и 20% пчелиного воска), смешивали в галтовочном барабане с сухим порошковым составом (обычно всего 0,1-0,5% от общего количества корма для домашних животных, что обеспечивает дозу 108 КОЕ/г), после чего опрыскивали составом на жировой основе для создания еще одного влагоудерживающего слоя. Общая доля покрытия составляет приблизительно 15% (корма для домашних животных). Продолжительность покрытия составляет приблизительно 30 минут.

[178] ПРИМЕР 24

[179] Получение корма для рыб с несколькими пробиотическими микроорганизмами

[180] Получали пеллетированный корм для рыб в соответствии с настоящим изобретением, содержащий смесь нескольких пробиотиков. Стабильный сухой пробиотический состав, содержащий смесь L. rhamnosus, L. acidophilus и Bifidobacterium lactis, получали согласно описанию в примере 15. Сначала коммерчески доступный стартерный корм для лососевых рыб (Zeigler Bros, Гарднере, Пенсильвания, США) высушивали в конвекционном сушильном шкафу до значения водной активности, составляющего 0,1, а затем покрывали пробиотическим составом в галтовочном барабане. Сначала пеллеты (1000 г) опрыскивали приблизительно 5% по массе состава на жировой основе для создания влагоудерживающего барьера (смесь 40% рыбьего жира, 40% масла какао и 20% пчелиного воска), затем смешивали с 1 г стабильного сухого пробиотического состава (для получения дозы 107 КОЕ/г корма), после чего опрыскивали составом на жировой основе для создания еще одного влагоудерживающего слоя. Общее количество покрытия составляет приблизительно 10% (корма для рыб).

[181] ПРИМЕР 25

[182] Стабильный сухой порошок, содержащий фермент

[183] Гидрогелевый состав, содержащий 40% по массе савиназы (Savinase, от Novozymes, Дания) получали путем смешивания 600 г состава, описанного в примере 18, и 400 г савиназы в 1000 г воды. Измельченный гидрогелевый состав быстро замораживали в жидком азоте и высушивали в вакуумной печи при температуре сушки 50°C. Для определения содержания (белка) и стабильности при хранении высушенного состава сухой образец аккуратно взвешивали (<100 мг) в микроцентрифужной пробирке. Добавляли 200 мкл диметилсульфоксида (ДМСО). Состав растворяли в ДМСО-буфере путем перемешивания на вортексе. В указанный образец добавляли 0,8 мл раствора, содержащего 0,05 Н NaOH, 0,5% ДСН и 0,075 М лимонную кислоту (тринатриевую соль). Пробирки обрабатывали ультразвуком в течение 10 минут при 45°C, с последующим непродолжительным центрифугированием при 5000 об/мин в течение 10 минут. Аликвоты прозрачного раствора ДМСО/NaOH/ДСН/цитрата переносят в лунки микропланшета и анализирули содержание белка с применением метода Бредфорда. Стабильность при хранении указанного стабильного ферментного состава значительно выше, чем у сухого фермента без состава согласно настоящему изобретению.

[184] ПРИМЕР 26

[185] Стабильный сухой порошок, содержащий витамин А

[186] Состав, содержащий 30 массовых % витамина А, получали путем смешивания 320 г растворимого инулина, 320 г мальтодекстрина DE-1 (Tate&Lyle, Лондон, Великобритания), 50 г карбоксиметилцеллюлозы натрия (Ashland Aqualon Functional Ingredients, Уилмингтон, Делавэр, США), 10 г аскорбата натрия и 300 г кристаллического витамина A (BASF Corp, Флорам Парк, Нью-Джерси, США) в 1000 г воды. Влажный состав сушат распылением в распылительной сушилке Mobile-Minor (GEA Process Engineering Inc, Колумбия, Мэриленд, США) при температурах на входе и выходе, составляющих 180°C и 80°C, соответственно, или быстрым замораживанием в жидком азоте, затем распределяли на лотках в количестве 1000 г/кв. фут и высушивали согласно описанию в примере 16. Композиция с витамином А стабильна (>80%) при 40°C и 75% отн. вл. на протяжении 3 месяцев.

[187] ПРИМЕР 27

[188] Получение содержащего каротины защитного состава с повышенной биодоступностью

[189] Состав, сохраняющий и повышающий биодоступность каротинов, в противном случае подверженных окислению за счет других ингредиентов корма при хранении или в организме после употребления, получали в соответствии с рецептурой и способом согласно настоящему изобретению. Состав, содержащий 6 г водорастворимого хитозана (LSK BioPartners, Inc. Солт Лейк Сити, Юта, США) растворяли в 200 г воды. К указанному раствору добавляли 90 г природного астаксантина (NaturoseTM, Cyanotech Corp, Кайлуа-Кона, Гавайи, США), суспензию распыляли или экструдировали в ванну с 5% триполифосфата натрия. Микрочастицы или нити гидрогеля оставляли для затвердевания при комнатной температуре в течение 4 часов. Частицы извлекали из ванны для поперечного сшивания, промывали водой и смешивали с сухой смесью 90 г сахарозы и 10 г глубоко гидролизованного казеина. Нагруженные сахарами/белком частицы подвергали быстрому замораживанию, немедленно помещали на лотки в количестве 500 г/кв. фут и лиофилизирули в сублимационной сушилке до достижения уровня водной активности, составляющего менее чем 0,3. Затем сухой состав перемалывали для получения требуемого распределения по размерам частиц, и упаковывали.

[190] ПРИМЕР 28

[191] Получение приманки для инвазивных видов

[192] В соответствии с настоящим изобретением получали содержащую пестицид пеллетированную приманку для направленного воздействия на инвазивные виды. Согласно описанию в примере 1 получали 200 г состава, содержащего пестицид, и добавляли к 200 г воды. К указанному раствору добавляли 90 г ротенона и 0,5 г двузамещенного фосфата кальция, а затем 0,5 г глюконолактона. Суспензию оставляли для затвердевания при комнатной температуре на 2 часа. Твердый гель разрезали на тонкие длинные полосы с помощью ножа/измельчителя. Тонкие полосы загружали на лоток и помещали в сублимационную сушилку. Выставляли температуру -30°C, и состав оставляли для замораживания с последующим использованием полного вакуума и повышением температуры до +60°C для высушивания в течение ночи. Сухой состав перемалывали для получения требуемого распределения по размерам частиц для получения конкретных характеристик приманки для направленного воздействия на определенные виды.

[193] ПРИМЕР 29

[194] Получение защищенного пестицида в водонерастворимом составе

[195] Защищенный гранулированный состав с пестицидом, в противном случае подверженным разложению за счет других ингредиентов состава при хранении или в окружающей среде после применения, получали с применением рецептуры и способа согласно настоящему изобретению. Состав, содержащий 6 г пектина и 102 г сахарозы, добавляли в 200 г воды. К указанному раствору добавляли 90 г сухого состава чувствительного пестицида и смеси, содержащей 1,5 г двузамещенного фосфата кальция и 0,5 г хлорида кальция, а затем 0,85 г глюконолактона. Суспензию оставляли для затвердевания при комнатной температуре в течение 4 часов, и затем разрезали на тонкие длинные полоски с помощью ножа/измельчителя. Указанные тонкие полосы загружали на лотки и высушивали в сублимационной сушилке до достижения уровня водной активности, составляющего 0,1. Затем сухой состав перемалывали для получения требуемого распределения по размерам частиц и упаковывали.

[196] ПРИМЕР 30

[197] Получение защищенного пробиотического состава для растений

[198] Получали сухую композицию с агентом биологического контроля, таким как Rhizobacteria, в соответствии с примером 18. Эффективность сухой композиции, содержащей Rhizobacteria оценивали по росту салата в гнотобиологических условиях. Сухую композицию с Rhizobacteria в дозе 100 мг на растение вносят в банки с песком и высаживали предварительно пророщенные (24 ч) проростки салата. На растения в банке наносят простерилизованный раствор Хогланда с питательными веществами в дозировке 5 мл. Банки располагали случайным образом в ростовой камере с поддерживаемой температурой 28°C и фотопериодом 12 ч. В течение каждого 7-дневного интервала времени после посева растения с приставшим песком аккуратно извлекали из банок. Корни промывали в стерильном фосфатном буфере (рН 7,0), и регистрирули измеренную длину корней.

[199] ПРИМЕР 31

[200] Получение стабильной сухой композиции, содержащей пробиотическую бактерию Lactobacillus acidophilus (DSM-20356)

[201] Замороженный бактериальный концентрат (10 г, продукт ферментации из местного источника) размораживали при 37°C на водяной бане, и содержание твердого вещества доводили до 10% сырой массы твердых веществ дистиллированной водой). Приблизительно 5 г гидролизованного белка гороха (ультрафильтрованные гидролизаты, Marcor, Карлштадт, Нью-Джерси, США) полностью растворяли в 50 г теплой воды и добавляли к размороженной бактериальной культуре. Приблизительно 2,5 г трегалозы (Cargill, Миннеаполис, Миннесота, США), приблизительно 5 г растворимого инулина, приблизительно 5 г мальтодекстрина DE-1 (Cargill, Миннеаполис, Миннесота, США) и приблизительно 1,5 г альгината натрия (ISP Corp, Уэйн, Нью-Джерси, США) перемешивали до однородности в сухом виде. Порошковую смесь медленно добавляли к бактериальной культуре и смешивали с применением небольшой лопатки при 37°C в течение 20 минут. Затем суспензии позволяли по каплям стечь в ванну с жидким азотом. Затем гранулы извлекали из жидкого азота, помещали в герметичный фольгированный алюминием пакет и хранили в морозильном аппарате для глубокого замораживания при -80°C до высыхания.

[202] Для высушивания замороженные гранулы равномерно распределяли на лотках в количестве от 500 до 1500 г/кв. фут, и лотки помещали на полки в сублимационной сушилке (модель 25 SRC, Virtis, Гардинер, Нью-Йорк, США). Этап первичного высушивания жидкости начинали с доведения вакуума до 2000-2700 миллиторр, а температуру продукта повышали и удерживали на уровне от -10 до -5°C. Со временем (приблизительно через 10-16 ч) температуру продукта повышали до приблизительно 20-25°C, после чего начинали этап вторичного высушивания при максимальном вакууме (150-200 миллиторр) и поддержании температуры продукта 30-40°C на протяжении еще 14 часов. Состав полностью высыхал, и измеренная водная активность составляла менее 0,3 Aw. Состав измельчали с применением коммерчески доступной молотковой мельницы и просеивали для получения размера частиц менее 100 мкм.

[203] Жизнеспособность стабильной пробиотической бактерии, а также обычным способом лиофилизированного содержащего бактерию порошка, отслеживали еженедельно в соответствии со стандартными процедурами разведения и засеивания чашек с агаром для культивирования лактобактерий (LMRS). На фиг. 16 видно, что через 14 дней при 40° отн. вл. стабильность пробиотической бактерии, включенной в состав композиции согласно настоящему изобретению, была на две (2) логарифмических единицы выше, чем стабильность лиофилизированной обычным способом бактерии. Указанные результаты показывали, что стабильность пробиотической бактерии резко повышается в условиях хранения при высокой влажности и без охлаждения при применении композиций и способов согласно настоящему изобретению.

[204] ПРИМЕР 32

[205] Получение стабильной сухой композиции с агломерированными расплавленными жирами, содержащей пробиотическую бактерию Lactobacillus acidophilus (DSM-20356)

[206] Десять (10) г сухой порошковой композиции получали согласно описанию в примере 31. Сухой порошок помещали в мензурке на водяную баню с температурой 40°C. 10 г смеси расплавленных жиров, содержащей восемь (8) частей масла какао и две (2) части стеарата (27-стеарин, Loders Croklaan, Чаннахон, Иллинойс, США) медленно добавляли к теплому порошку при перемешивании. Указанную смесь охлаждали до 10°C, продолжая перемешивание до достижения визуально однородного размера агломерированных частиц порошка.

[207] ПРИМЕР 33

[208] Стабильность при хранении при 40°C и 43% отн. вл. или 30°C и 60% отн. вл. сухой композиции, содержащей пробиотическую бактерию Lactobacillus rhamnosus sp.

[209] Десять (10) г сухой порошковой композиции, содержащей пробиотическую бактерию Lactobacillus rhamnosus sp. (продукт ферментации из местного источника), получали согласно описанию в примере 31. Сухую стабильную композицию помещали в десикатор и подвергали воздействию температуры 40°С при 43% отн. вл, или 30°C при 60% отн. вл. Жизнеспособность стабильного пробиотика, а также обычным способом лиофилизированного порошка с бактерией отслеживали еженедельно в соответствии со стандартными процедурами разведения и засеивания чашек с агаром для культивирования лактобактерий (LMRS). Фиг. 17 демонстрирует, что через 14 дней при 40°C и 43% отн. влажности стабильность пробиотической бактерии в составе композиции согласно настоящему изобретению была на три (3) логарифмических единицы выше стабильности лиофилизированной общепринятым способом бактерии. Через 7 дней при 30°C и 60% отн. вл. стабильность пробиотической бактерии в составе композиции согласно настоящему изобретению также была на три (3) логарифмических единицы выше стабильности лиофилизированной общепринятым способом бактерии. Указанные результаты показывали, что стабильность пробиотической бактерии значительно повышается в условиях хранения с высокой влажностью без охлаждения при применении композиций и способов согласно настоящему изобретению.

[210] ПРИМЕР 34

[211] Получение корма для животных, содержащего стабильную сухую композицию с пробиотической бактерией против патогенных микроорганизмов

[212] Приблизительно на 10 кг коммерчески доступного корма для бычков или корма для цыплят наносили в галтовочном барабане внешний слой из 3% смеси масел, содержащей одну часть измельченного биологического материала согласно описанию в примере 31 или 32 и две (2) части растительного масла, такого как кукурузное масло. Значение КОЕ пробиотической бактерии составляет 1Е9/г корма. Корм с покрытием помещали в камеру при 43% относительной влажности при температуре 40°C, и через 14 дней хранения в указанных экстремальных условиях снижение жизнеспособности пробиотической бактерии составляет менее чем одну (1) логарифмическую единицу относительно первоначального значения КОЕ. Другой корм с покрытием помещали в камеру с 33% относительной влажности при температуре 30°C и спустя шесть (6) месяцев хранения в указанных условиях; снижение жизнеспособности пробиотической бактерии составляет менее чем одну (1) логарифмическую единицу относительно первоначального значения КОЕ. Указанный пример демонстрирует, что микроорганизмы, такие как Lactobacillus sp, применяемые для лечения различных животных, в том числе животных-компаньонов, могут быть защищены в композиции и с помощью способов высушивания согласно настоящему изобретению, и затем нанесены на корма для длительного хранения или хранения по меньшей мере в течение двух (2) недель в автоматической кормушке в типичных для хранения кормов без покрытий условиях влажности и температуры.

[213] ПРИМЕР 35

[214] Получение стабильной сухой композиции, содержащей одноклеточный гриб S. cerevisiae

[215] Свежие пекарские дрожжи в форме пасты (100 г, от местного поставщика) помещали на водяную баню при 10°C. Приблизительно 50 г гидролизованного белка гороха (ультрафильтрованные гидролизаты, Marcor, Карлштадт, Нью-Джерси, США) полностью растворяли в 500 г теплой воды. Раствор охлаждали до 10°C и добавляли к дрожжевой пасте при перемешивании. Приблизительно 25 г сахарозы (полученной из местного продуктового магазина), приблизительно 50 г растворимого инулина, приблизительно 50 г мальтодекстрина DE-1 (Cargill, Миннеаполис, Миннесота, США), приблизительно 12 г аскорбата натрия (Sigma) и приблизительно 15 г альгината натрия (ISP Corp, Уэйн, Нью-Джерси, США) перемешивали до однородности в сухом виде. Порошковую смесь медленно добавляли в дрожжевую культуру и проводят смешивание при 40 об./мин и 10°C в течение 20 минут. Затем суспензию переносят в сосуд с перфорированным дном и позволяли по каплям стечь в ванну с жидким азотом. Затем гранулы извлекали из жидкого азота, помещали в герметичный фольгированный алюминием пакет и хранят в морозильном аппарате для глубокого замораживания при -80°C в течение нескольких недель. Высушивание и перемалывание осуществляли согласно описанию в примере 31.

[216] ПРИМЕР 36

[217] Высушивание распылением стабильной сухой композиции, содержащей одноклеточный гриб S. cerevisiae

[218] Дрожжевую суспензию получали согласно описанию в примере 34. Указанную суспензию затем разбавляли холодной (10°C) дистиллированной водой до вязкости, составляющей приблизительно 1000-2000 сП. Разбавленную суспензию высушивали распылением (распылительная сушилка Mobile Minor, GEA Niro Inc, Колумбия, Мэриленд, США), используя настройки со значениями температуры на входе/выходе, составляющими 180°C/60°C.

[219] ПРИМЕР 37

[220] Покрытие семян кукурузы стабильной сухой композицией, содержащей одноклеточные грибы

[221] Приблизительно на 10 кг коммерчески доступных семян кукурузы наносят в галтовочном барабане при 40°C внешний слой из 3% смеси расплавленных масел, содержащей одну часть измельченного биологического материала согласно описанию в примере 34 или примере 35 и две (2) части растительного масла, такого как пальмовое или кокосовое масло. Число КОЕ дрожжей составляет 1Е8/г семян. Семена с нанесенным покрытием помещали в камеру с 60% относительной влажности при температуре 30°C, и через три (3) месяца хранения в указанных экстремальных условиях снижение жизнеспособности дрожжей составляет менее чем одну (1) логарифмическую единицу относительно первоначального значения КОЕ. Указанный пример демонстрирует, что микроорганизмы, применяемые в сельском хозяйстве в качестве затравочных, такие как различные штаммы Penicillium sp, могут быть защищены в композициях и с помощью способов высушивания согласно настоящему изобретению, и затем нанесены на зерна для длительного хранения в типичных для хранения семян без покрытий уровнях влажности и температуры.

[222] ПРИМЕР 38

[223] Получение гидрогелевой композиции, содержащей пробиотическую бактерию Bifidobacterium sp.

[224] Концентрированную суспензию пробиотика Bifidobacterium sp.получали в соответствии с примером 31. К порошковой смеси добавляли 5 г двухосновного фосфата кальция. Порошковую смесь добавляли в культуру пробиотика при перемешивании с последующим добавлением 5 г глюконолактона. Суспензию оставляли для затвердевания при комнатной температуре на протяжении следующих двух (2) часов для получения твердого гидрогеля. Твердый гель разрезали на тонкие и длинные полосы с применением коммерчески доступного ножа/измельчителя. Указанные тонкие полосы загружали непосредственно на лотки во влажном состоянии или подвергали быстрому замораживанию в жидком азоте, загружали на лоток в количестве 500 г/кв. фут и помещали в сублимационную сушилку для высушивания согласно описанию в примере 31. Сухой состав измельчали с получением тонкого порошка с применением стандартной молотковой мельницы и просеивали через 50-микронное сито.

[225] ПРИМЕР 39

[226] Получение стабильного кисломолочного продукта, содержащего пробиотическую бактерию

[227] К ста (100) граммам пастеризованного кисломолочного продукта без добавок (Dannon, получен из местного продуктового магазина) добавляли пять десятых (0,5) грамма поперечно-сшитого порошка, содержащего стабильный пробиотик согласно описанию в примере 37. Исходное количество КОЕ в кисломолочном продукте составляет 1Е9/г кисломолочного продукта. Кисломолочный продукт хранят в холодильнике при 4°C в течение шести (6) недель. Снижение жизнеспособности пробиотической бактерии в охлажденном кисломолочном продукте составляет менее чем одну (1) логарифмическую единицу относительно первоначального значения КОЕ. Указанный пример демонстрирует, что пробиотическая бактерия, например, различные штаммы Lactobacillus и Bifidobacterium, может быть защищена в композициях и с помощью способов высушивания согласно настоящему изобретению. Затем пробиотическая бактерия в составе указанных композиций может быть полностью гидрирована и может сохранять активность в молочных продуктах в течение продолжительного времени в типичных условиях, при которых незащищенная пробиотическая бактерия погибает.

[228] ПРИМЕР 40

[229] Стабильная сухая композиция, содержащая фермент

[230] Гидрогелевый состав, содержащий 40% фитазы (Marcor, Карлштадт, Нью-Джерси, США) по массе, получали путем смешивания 250 г порошковой смеси согласно описанию в примере 34 и раствора 200 г фитазы в 500 мл воды, содержащего приблизительно 50 г гидролизованного белка гороха. Измельченный гидрогелевый состав подвергали быстрому замораживанию в жидком азоте и высушивали в вакуумной печи при температуре первичного и вторичного высушивания 50°С.Для определения содержания (белка) и стабильности при хранении высушенной композиции: сухой образец аккуратно взвешивали (<100 мг) в микроцентрифужной пробирке. Добавляли 200 мкл диметилсульфоксида (ДМСО). Состав растворяли в ДМСО-буфере путем перемешивания на вортексе. К указанному образцу добавляли 0,8 мл раствора, содержащего 0,05 Н NaOH, 0,5% ДСН и 0,075 М лимонную кислоту (тринатриевую соль). Пробирки обрабатывали ультразвуком в течение 10 мин при 45°C с последующим непродолжительным центрифугированием при 5000 об/мин в течение 10 минут. Аликвоты прозрачного раствора ДМСО/NaOH/ДСН/цитрата переносят в лунки микропланшета и анализирули на содержание белка с применением метода Бредфорда. Стабильность стабильной сухой композиции с ферментом после воздействия температурой 95°C в течение 20 минут значительно выше, чем у сухого фермента без композиции согласно настоящему изобретению.

[231] ПРИМЕР 41

[232] Стабильная сухая композиция, содержащая агент биологического контроля для растений

[233] Агент биологического контроля, такой как Rhizobacteria, включали в сухую композицию в соответствии с примером 34. Эффективность сухой композиции с Rhizobacteria оценивали по росту салата в гнотобиологических условиях. Сухую композицию с Rhizobacteria в дозе 100 мг на растение вносят в банки с песком и высаживали предварительно пророщенные (24 ч) проростки салата. На растения в банке наносят простерилизованный раствор Хогланда с питательными веществами в дозировке 5 мл. Банки располагали случайным образом в ростовой камере с температурой, поддерживаемой на уровне 28°C, и фотопериодом 12 ч. В течение каждого 7-дневного интервала времени после посева растения и приставший песок осторожно извлекали из банок. Корни промывали в стерильном фосфатном буфере (рН 7,0), и регистрировали измеренную длину корней. Наблюдается более интенсивный рост проростков салата, обработанных композицией с Rhizobacteria, относительно необработанных проростков.

[234] ПРИМЕР 42

[235] Получение таблеток, содержащих стабильную сухую композицию с пробиотической бактерией Lactobacillus rhamnosus sp.

[236] Замороженный бактериальный концентрат (10 г, продукт ферментации из местного источника) размораживали при 37°C на водяной бане, и содержание твердого вещества доводили дистиллированной водой до 10% влажной массы. Приблизительно 5 г гидролизованного белка гороха (ультрафильтрованные гидролизаты, Marcor, Карлштадт, Нью-Джерси, США) полностью растворяли в 50 г теплой воды и добавляли к размороженной бактериальной культуре. Приблизительно 5 г трегалозы (Cargill, Миннеаполис, Миннесота, США) и приблизительно 2,5 г аскорбата натрия перемешивали до однородности в сухом виде. Необязательно добавляли также приблизительно 5 г растворимого инулина, приблизительно 5 г мальтодекстрина DE-1 (Cargill, Миннеаполис, Миннесота, США) и приблизительно 1,5 г альгината натрия (ISP Corp, Уэйн, Нью-Джерси, США) для получения вязкой суспензии требуемой вязкости, составляющей приблизительно 50000 сП и дополнительной стимуляции образования стеклообразной структуры сухого материала. Порошковую смесь медленно добавляли к бактериальной культуре и смешивали при 37°C в течение 20 минут. Затем вязкая бактериальная суспензия по каплям медленно стекала в ванну с жидким азотом. Замороженные гранулы затем извлекали из жидкого азота, помещали в герметичный фольгированный алюминием пакет и хранили в морозильном аппарате для глубокого замораживания при -80°C до высушивания.

[237] Для высушивания замороженные гранулы равномерно распределяли на лотках в количестве 500 до 1500 г/кв. фут, и лотки помещали на полки в сублимационной сушилке (модель 25 SRC, Virtis, Гардинер, Нью-Йорк, США). Этап первичного удаления жидкости начинали с доведения вакуума до 2000-2700 миллиторр, позволяя температуре продукта подняться и стабилизироваться при значениях от -10 до -5°C. Со временем (приблизительно через 10-16 ч) температура продукта повышалась до приблизительно 20-25°C, в этот момент начинали этап вторичного высушивания при максимальном вакууме (50-200 миллиторр) и поддержании температуры продукта 30-45°C на протяжении дополнительных 14 часов. Указанный состав высыхал полностью и измеренная водной активности составляла менее 0,3 Aw. Состав перемалывали с применением кофемолки и частицы просеивали для получения размера менее 250 мкм.

[238] Для таблетирования сухую стабильную пробиотическую композицию (100 мг) смешивали с 400 мг мальтодекстрина DE-1, содержащего 2% стеарата магния по массе и 2% гидрофильного кремнеземного порошка (AEROSIL® 200, Evonik Industries) по массе, и прессовали в ручном таблеточном прессе (с применением формы для таблеток диаметром ½ дюймов). Также получали аналогичные таблетки, содержащие обычным способом лиофилизированный порошок пробиотической бактерии (свободный пробиотик), и использовали для сравнения с таблетками, содержащими защищенную пробиотическую бактерию.

[239] Жизнеспособность до и после таблетирования и при хранении при 40°C и 43% отн. вл. стабильной пробиотической бактерии, а также свободного пробиотика отслеживали еженедельно после осуществления стандартных процедур разведения и засеивания чашек с агаром для культивирования лактобактерий (LMRS). На фиг.18 видно, что жизнеспособность свободной пробиотической бактерии снижалась более чем на одну логарифмическую единицу в процессе таблетирования, тогда как жизнеспособность защищенной бактерии оставалась по существу неизменной после процесса таблетирования. Через 14 дней хранения при 40°C и 43% отн. вл. жизнеспособность пробиотической бактерии, включенной в состав композиции согласно настоящему изобретению, незначительно снижалась, приблизительно на 0,3 логарифмических единицы, тогда как жизнеспособность лиофилизированной обычным способом бактерии снижалась еще приблизительно на 0,6 логарифмических единиц. Указанные результаты показывали, что композиция и способы согласно настоящему изобретению обеспечивали значимую защиту пробиотической бактерии от давления при прессовании и связанного с таблетированием нагревания, а также при хранении в условиях высокой влажности без охлаждения.

[240] ПРИМЕР 43

[241] Получение мультивитаминных/пробиотических таблеток, содержащих стабильную сухую композицию с пробиотической бактерией Lactobacillus rhamnosus sp.

[242] Также исследовали защиту композиций и способы согласно описанию в настоящем документе в таблетках, содержащих мультивитаминные ингредиенты. Десять (10) г сухой порошковой композиции получали согласно описанию в примере 42. Для таблетирования сухую и стабильную, пробиотическую композицию (100 мг) смешивали с 400 мг коммерчески доступного порошка мультивитаминов (Centrum®, Pfizer), содержащим 2% стеарата магния по массе и 2% по массе гидрофильного порошка кремнезема (AEROSIL® 200, Evonik Industries), и прессовали в ручном таблеточном прессе (с применением формы для таблеток диаметром ½ дюйма). Также получали аналогичные таблетки, содержащие обычным способом лиофилизированный порошок с пробиотической бактерией (свободный пробиотик), и использовали для сравнения с таблетками, содержащими защищенную пробиотическую бактерию. Затем готовые таблетки тестировали на содержание пробиотика. Результаты представлены на фиг. 19.

[243] Как видно из фиг. 19, жизнеспособность свободной пробиотической бактерии снижалась более чем на две (2) логарифмических единицы в процессе таблетирования с мультивитаминными ингредиентами, тогда как жизнеспособность защищенной бактерию снижалась менее чем на одну логарифмированную единицу. Через 14 дней хранения при 40°C и 43% отн. вл. жизнеспособность пробиотической бактерии, включенной в состав композиции согласно настоящему изобретению, оставалась по существу неизменной, тогда как жизнеспособность лиофилизированной обычным способом бактерии снижалась еще на три (3) логарифмических единицы. Указанные результаты показывали, что композиция и способы согласно настоящему изобретению также обеспечивали значимую защиту чувствительных биологических материалов от повреждений другими соединениями в таблеточной смеси, позволяя, таким образом, смешивать в одной таблетке разнообразные биологические материалы без вреда для их итоговой активности.

[244] ПРИМЕР 44

[245] Таблетирование стабильной сухой композиции, содержащей защищенные ферменты

[246] Сухие стабильные композиции, содержащие протеазу или липазу (оба фермента от Sigma) получали согласно описанию в примере 42. Готовые сухие композиции содержали 10% протеазы или липазы, 40% трегалозы, 20% глубоко гидролизованного белка гороха, 10% аскорбата натрия. Кроме того, в указанную композицию включали также 6% альгината натрия и 14% инулина.

[247] Для таблетирования сухих композиций с ферментом (по 50 мг) смешивали с 450 мг мальтодекстрина DE-1, содержащего 2% по массе стеарата магния и 2% по массе гидрофильного кремнеземного порошка, и прессули в ручном таблеточном прессе (с применением формы для таблеток диаметром ½ дюйма). Таблетки, содержащие равные количества обоих защищенных ферментов также получали смешиванием 25 мг протеазы и 25 мг липазы с 450 мг смеси с мальто декстрином DE1. Также получали аналогичные таблетки, содержащие сухой порошок фермента в свободной форме (свободный фермент или смесь обоих ферментов), и использовали их для сравнения с таблетками, содержащими защищенные ферменты.

[248] Сохранение активности протеазы и липазы после таблетирования относительно их активности в порошковой смеси до таблетирования определяли в соответствии с способами известными в данной области техники с применением азоказеина и п-нитрофенилпальмитата в качестве субстрата, соответственно.

[249] Как видно из фиг. 20, таблетирование свободной протеазы по отдельности или в комбинации со свободной липазой приводило к снижению активности приблизительно на 40%, в то время как активность защищенной протеазы не снижалась при таблетировании отдельно и снижалась всего приблизительно на 17% при таблетировании в смеси с защищенной липазой. Таблетирование свободной или защищенной липазы не приводило к какому-либо значимому снижению активности, при этом таблетирование свободной липазы в присутствии свободной протеазы приводило к снижению активности на 64%, в то время как таблетирование защищенной липазы в присутствии защищенной протеазы приводило к снижению активности всего на 33%. Указанные результаты показывали, что композиция и способы согласно настоящему изобретению обеспечивали значимую защиту от давления при прессовании и сопутствующего нагревания при таблетировании ферментов. Результаты также показывали, что композиция и способы согласно настоящему изобретению обеспечивали защиту от других пищеварительных ферментов в таблеточной смеси, позволяя, таким образом, смешивание в одной таблетке различных нужных ферментов без вреда для их итоговой активности.

[250] ПРИМЕР 45

[251] Таблетирование корма для животных, содержащего стабильную сухую композицию, содержащую пробиотическую бактерию против патогенных микроорганизмов

[252] Защиту композиций и способы согласно описанию в настоящем документе также исследовали на таблетках, содержащих ингредиенты корма для животных. Получали приблизительно 100 г сухих и стабильных композиций, содержащих пробиотическую бактерию L. acidophilus sp.и высушивали согласно описанию в примере 42. Готовые сухие композиции содержали 10% сухой биомассы бактериальных клеток, 54% трегалозы, 20% глубоко гидролизованного белка гороха, 10% аскорбата натрия. Кроме того, в композицию также включали 6% альгината натрия.

[253] Приблизительно 10 кг коммерчески доступного корма для собак или готового пеллетированного корма для цыплят высушивали на воздухе в течение ночи при 40°C и затем тонко перемалывали в свободно текучий порошок. Стабильную сухую пробиотическую композицию смешивали с порошком из корма и прессули в ручном таблеточном прессе (с применением форм для пилюль диаметром 1/8-7/8 дюйма) для получения пилюль размером приблизительно 200-2000 мг, содержащих приблизительно десять (10) миллионов живых клеток на грамм корма. Для лечения цыплят кормовые пробиотические пилюли медленно высыпали в 100 кг стандартного коммерческого корма при перемешивании. Обработанный готовый корм готов к употреблению для кормления птиц и повышения устойчивости к патогенам, таким как сальмонелла. Для тестирования на стабильность пробиотические пилюли помещали во влажную камеру с 43% относительной влажности при 40°C, и через 14 дней хранения в указанных экстремальных условиях снижение жизнеспособности пробиотической бактерии составляет менее чем одну (1) логарифмическую единицу относительно первоначального значения КОЕ. Указанный пример демонстрирует, что микроорганизмы, применяемые для лечения различных животных, включая животных-компаньонов, например, различные представители Lactobacillus sp, могут быть защищены в указанной композиции и с помощью способов высушивания согласно настоящему изобретению, а затем могут прессоваться в таблеточном прессе и подаваться вместе с обычными кормами в обычную автоматическую кормушку в типичных условиях влажности и температуры.

[254] ПРИМЕР 46

[255] Получение таблеток для приготовления газированного шипучего напитка, содержащих стабильную сухую композицию с пробиотической бактерией

[256] Приблизительно 10 г порошка сухих и стабильных композиций, содержащих пробиотическую бактерию L. acidophilus sp. или Bifidobacterium sp, получали и высушивали согласно описанию в примерах 42 и 45.

[257] Шипучие таблетки, такие как Alka Seltzer®, Fizzies® или спортивные напитки, тонко перемалывали для получения свободно текучего порошка. Стабильную сухую пробиотическую композицию смешивали с шипучим порошком и прессули в ручном таблеточном прессе (с использованием формы для таблеток диаметром 7/8 дюйма) для получения таблеток размером приблизительно 2000 мг, содержащих приблизительно десять (10) миллионов живых клеток на таблетку. Для тестирования стабильности шипучие таблетки с пробиотиком помещали в камеру с 43% относительной влажности при 33°C; через 90 дней хранения в указанных экстремальных условиях снижение жизнеспособности пробиотической бактерии составляет менее чем одну (1) логарифмическую единицу относительно первоначального значения КОЕ. Указанный пример демонстрирует, что чувствительные биологические материалы, такие как живые пробиотические бактерии, могут быть защищены и стабилизированы в указанной композиции с помощью способов высушивания согласно настоящему изобретению, а затем могут прессоваться в таблеточном прессе и храниться в жестких влажностных и температурных условиях потребления.

[258] ПРИМЕР 47

[259] Получение таблеток, содержащих стабильную сухую композицию с пробиотической бактерией для лечения вагинальных инфекций, например, дрожжевого или бактериального вагиноза.

[260] Приблизительно 15 г порошка сухих и стабильных композиций, содержащих пробиотическую бактерию L. acidophilus sp, получали и высушивали согласно описанию в примерах 1 и 4.

[00261] Сухую пробиотическую композицию смешивали с 74 г лактозы, 10 г кукурузного крахмала, 0,5 г стеарата магния, 0,01 г карбоксиметилцеллюлозы натрия, 0,01 г поливинилпирролидина и 0,01 г гидрофобного кремнеземного порошка, и перемешивали в течение 15 минут. Порошковую смесь прессули в ручном таблеточном прессе. Масса полученной таблетки составляет приблизительно 1,5 г. Максимальная твердость таблеток составляет от 6 до 8 кг. Таблетка распадается в воде приблизительно через 30 секунд.

[262] ПРИМЕР 48

[263] Получение масляной суспензии, содержащей стабильную сухую композицию с пробиотической бактерией Lactobacillus acidophilus (DSM-20356)

[264] Замороженный концентрат L. acidophilus (200 г, продукт ферментации из местного источника) размораживали при 37°C на водяной бане и добавляли 200 г 3% раствора гидролизованного белка гороха (ультрафильтрованные гидролизаты, Marcor, Карлштадт, Нью-Джерси, США). Суспензию бактерий центрифугировали при 4000 г в течение 15 мин (Sorvall RC-5B, Du-Pont Company, Уилмингтон, Делавэр, США) и декантировали супернатант. Бактериальный осадок доводили до исходной массы (200 г) 3% раствором гидролизованного белка гороха. Дополнительно 50 г гидролизованного белка гороха полностью растворяли в 80 г теплой воды, доводили рН до 9 20% раствором NaOH и добавляли к бактериальной культуре. 85,6 г сахарозы (полученной с местного рынка), 30 г циклодекстрина-7 (Cargill, Миннеаполис, Миннесота, США), 20 г аскорбата натрия (Sigma) и 15 г альгината натрия (ISP Corp, Уэйн, Нью-Джерси, США) перемешивали до однородности в сухом виде. Порошковую смесь медленно добавляли к бактериальной культуре и смешивали в 1 кв. планетарном смесителе (Charles Ross & Son Company, Хопаг, Нью-Йорк, США) при 37°C в течение 20 минут. Затем суспензия медленно стекала по каплям в ванну с жидким азотом. Замороженные гранулы затем извлекали из жидкого азота, помещали в герметичный фольгированный алюминием пакет и хранили в морозильном аппарате для глубокого замораживания при -80°C до высушивания.

[265] Для высушивания замороженные гранулы равномерно распределяли на лотках в количестве от 500 до 1500 г/кв. фут и лотки помещали на полки сублимационной сушилки (модель 25 SRC, Virtis, Гардинер, Нью-Йорк, США). Этап первичного высушивания начинали с доведения вакуума до 2000-2700 миллиторр; температуру продукта повышали и стабилизировали на уровне от -12°C до -5°C. Со временем (приблизительно через 10-16 ч) температура продукта повышалась до приблизительно 20-25°C, после чего начинали этап вторичного высушивания при максимальном вакууме (100-150 миллиторр) и поддержании температуры продукта на уровне 30-40°C на протяжении еще 14 часов. Состав полностью высыхал, измеренная водная активность составляла менее 0,3 Aw. Состав перемалывали с применением коммерчески доступной молотковой мельницы и просеивали частицы для получения размера менее 250 мкм.

[266] Жизнеспособность стабильной композиции с пробиотической бактерией тестировали при 40°C и 43% отн. вл. в течение 14 дней в форме сухого порошка или в виде суспензии с кукурузным маслом (1 г сухого порошка, смешанного со 100 г масла) или после нанесения 10 г масляной суспензии на 45 г пеллетированного корма для цыплят (пеллетированный корм предварительно стабилизировали во влажной камере с 33% отн. вл. на протяжении двух недель). Через 14 дней инкубирования при 40°C и 43% отн. вл. количество КОЕ/г пробиотической бактерии уменьшалась всего на 0,5 логарифмических единиц при хранении в сухом виде, на 0,34 логарифмических единицы при смешивании с масляной суспензией и на 0,65 логарифмических единицы в корме для цыплят с нанесенным покрытием. Указанные результаты показывали, что при применении композиций и способов согласно настоящему изобретению жизнеспособность пробиотической бактерии сохраняется в различных кормах через 14 дней при воздействии высокой влажности и хранении без охлаждения.

[267] ПРИМЕР 49

[268] Получение стабильной сухой композиции, содержащей живые фаги против Vibrio anguillarum

[269] Концентрированную культуру живых фагов (100 г полученной от производителя культуры) помещали в планетарный смеситель с рубашкой при 10°C. Приблизительно 50 г гидролизованного белка гороха (ультрафильтрованные гидролизаты, Marcor, Карлштадт, Нью-Джерси, США) полностью растворяли в 300 г теплой воды. Раствор охлаждали до 10°C и добавляли к культуре фагов при перемешивании. Сто семьдесят четыре (174) г сахарозы (полученной с местного рынка), 60 г циклодекстрина-7 (Cargill, Миннеаполис, Миннесота, США), 40 г аскорбата натрия (Sigma) и 30 г альгината натрия (ISP Corp, Уэйн, Нью-Джерси, США) перемешивали до однородности в сухом виде. Порошковую смесь медленно добавляли к культуре фагов и смешивали в 1 кв. планетарном смесителе при 10°C в течение 20 минут. Затем суспензия медленно по каплям стекает в ванну с жидким азотом. Замороженные гранулы затем извлекали из жидкого азота, помещали в герметичный фольгированный алюминием пакет и хранят в морозильном аппарате для глубокого замораживания при -80°C до высушивания. Высушивание и перемалывание осуществляли согласно описанию в примере 48. Десять (10) граммов сухого порошка с композицией смешивали со 100 г рыбьего жира, и указанную суспензию наносят на 10 кг пеллетированного корма для атлантического лосося. Корм с нанесенным покрытием затем хранят в обычных складских условиях. Жизнеспособность фагов в корме для рыб сохраняется через 14 дней в условиях хранения с воздействием высокой влажности и без охлаждения при применении композиций и способов согласно настоящему изобретению.

[270] Несмотря на то, что настоящее изобретение проиллюстрировано и описано в настоящем документе с помощью конкретных вариантов реализации, предполагается, что настоящее изобретение не ограничено приведенными конкретными характеристиками. Напротив, в указанные конкретные характеристики могут быть внесены различные модификации, входящие в объем и серию эквивалентов формулы изобретения без отступления от настоящего изобретения.

1. Сухая композиция в аморфном стеклообразном состоянии для стабилизации биологически активного материала, содержащая указанный биологически активный материал, от 10% до 50% по меньшей мере одного дисахарида, от более чем 10% до 80% по меньшей мере одного олигосахарида, от 0,1% до 10% по меньшей мере одного полисахарида, от 0,5% до 40% по меньшей мере одного гидролизованного белка и по меньшей мере одну соль карбоновой кислоты в количестве 0,5-20%, при этом проценты указаны относительно общей массы композиции, при этом указанный биологически активный материал представляет собой: живую бактерию, гриб, фаг, фермент, белок или пестицид.

2. Композиция по п. 1, отличающаяся тем, что указанная бактерия представляет собой пробиотическую бактерию.

3. Композиция по п. 1, отличающаяся тем, что указанный по меньшей мере один дисахарид выбран из группы, состоящей из трегалозы, сахарозы, лактозы или их смеси.

4. Композиция по п. 1, отличающаяся тем, что указанный по меньшей мере один олигосахарид выбран из группы, состоящей из циклодекстринов, инулинов, мальтодекстринов, декстранов, фруктоолигосахаридов (ФОС), галактоолигосахаридов (ГОС), маннан-олигосахаридов (МОС) и их смеси.

5. Композиция по п. 1, отличающаяся тем, что указанный по меньшей мере один олигосахарид состоит из циклодекстрина.

6. Композиция по п. 1, отличающаяся тем, что указанный по меньшей мере один полисахарид выбран из группы, состоящей из ацетатфталата целлюлозы (АФЦ), карбоксиметилцеллюлозы, пектина, альгината натрия, соли альгиновой кислоты, гидроксипропилметилцеллюлозы (ГПМЦ), метилцеллюлозы, каррагинана, геллановой камеди, гуаровой камеди, аравийской камеди, ксантановой камеди, камеди бобов рожкового дерева, хитозана и производных хитозана, коллагена, полигликолевой кислоты, крахмалов, модифицированных крахмалов и их смеси.

7. Композиция по п. 1, отличающаяся тем, что указанный по меньшей мере один гидролизованный белок выбран из группы, состоящей из гидролизованного казеина, гидролизованного сывороточного белка, гидролизованного белка гороха, гидролизованного соевого белка и их смеси.

8. Композиция по п. 1, отличающаяся тем, что указанная карбоновая кислота выбрана из группы, состоящей из молочной кислоты, аскорбиновой кислоты, малеиновой кислоты, щавелевой кислоты, малоновой кислоты, яблочной кислоты, янтарной кислоты, лимонной кислоты, глюконовой кислоты и глутаминовой кислоты.

9. Композиция по п. 1, отличающаяся тем, что указанный гидролизованный белок представляет собой белок растений.

10. Способ получения композиции по п. 1, включающий:

(a) комбинирование указанного биологически активного материала с указанным по меньшей мере одним дисахаридом, указанным по меньшей мере одним олигосахаридом, указанным по меньшей мере одним полисахаридом, указанным по меньшей мере одним гидролизованным белком и по меньшей мере одной солью карбоновой кислоты в водном растворителе с образованием вязкой суспензии;

(b) быстрое замораживание указанной суспензии в жидком азоте для получения твердых замороженных частиц в форме гранул, капель или нитей;

(c) первичное высушивание указанных замороженных частиц путем удаления воды в вакууме при температуре выше температуры замораживания указанных частиц с получением первично высушенного состава; и

(d) вторичное высушивание указанного первично высушенного состава при максимальном вакууме и температуре 20°С или выше на протяжении времени, достаточного для снижения водной активности указанного первично высушенного состава до уровня менее 0,3 Aw, что обеспечивает получение указанной композиции.

11. Способ по п. 10, отличающийся тем, что указанный по меньшей мере один олигосахарид в указанной композиции представляет собой циклодекстрин.

12. Сухая композиция в аморфном стеклообразном состоянии для стабилизации биологически активного материала, содержащая указанный биологически активный материал, от более чем 10% до 80% по меньшей мере одного олигосахарида, от 10% до 50% по меньшей мере одного дисахарида, от 0,1% до 10% по меньшей мере одного полисахарида, от 0,5% до 40% по меньшей мере одного гидролизованного белка и по меньшей мере одну соль карбоновой кислоты в количестве 0,5-20%, при этом проценты указаны относительно общей массы композиции, при этом указанный по меньшей мере один олигосахарид состоит из циклодекстрина, при этом указанный биологически активный материал представляет собой: живую бактерию, гриб, фаг, фермент, белок или пестицид.

13. Композиция по п. 12, отличающаяся тем, что указанный по меньшей мере один гидролизованный белок выбран из группы, состоящей из гидролизованного казеина, гидролизованного сывороточного белка, гидролизованного белка гороха, гидролизованного соевого белка и их смеси.

14. Композиция по п. 12, отличающаяся тем, что указанный по меньшей мере один полисахарид выбран из группы, состоящей из ацетатфталата целлюлозы (АФЦ), карбоксиметилцеллюлозы, пектина, соли альгиновой кислоты, гидроксипропилметилцеллюлозы (ГПМЦ), метилцеллюлозы, каррагинана, геллановой камеди, гуаровой камеди, аравийской камеди, ксантановой камеди, камеди бобов рожкового дерева, хитозана и производных хитозана, коллагена, полигликолевой кислоты, крахмалов, модифицированных крахмалов или их смеси.

15. Композиция по п. 12, отличающаяся тем, что указанный по меньшей мере один дисахарид выбран из группы, состоящей из трегалозы, сахарозы, лактозы или их смеси.

16. Композиция по п. 12, отличающаяся тем, что указанная карбоновая кислота выбрана из группы, состоящей из молочной кислоты, аскорбиновой кислоты, малеиновой кислоты, щавелевой кислоты, малоновой кислоты, яблочной кислоты, янтарной кислоты, лимонной кислоты, глюконовой кислоты и глутаминовой кислоты.

17. Композиция по п. 12, отличающаяся тем, что указанная бактерия представляет собой пробиотическую бактерию.

18. Композиция по п. 12, отличающаяся тем, что указанную композицию высушивают посредством одного или нескольких способов, выбранных из группы, состоящей из воздушного высушивания, вакуумной сушки, сушки в псевдоожиженном слое и распылительной сушки.

19. Композиция по п. 12, отличающаяся тем, что указанный гидролизованный белок представляет собой белок растения.

20. Продукт, полученный с применением композиции по п. 1 или п. 12 и содержащий указанный стабилизированный биологически активный материал, активность которого сохранена.

21. Продукт по п. 20, отличающийся тем, что указанный продукт представляет собой восстановленную жидкость, измельченный порошок, таблетку, пеллет, капсулу, пищевой продукт, корм или семенной продукт с покрытием.

22. Продукт, который содержит композицию по п. 1 или п. 12, содержащую указанный стабилизированный биологически активный материал, активность которого сохранена.

23. Продукт по п. 22, который выбран из: нутрицевтического продукта, фармацевтического продукта, сельскохозяйственного продукта или вакцинного продукта.

24. Продукт, полученный с применением композиции по п. 1 или п. 12 и содержащий указанный стабилизированный биологически активный материал, активность которого сохранена.

25. Продукт по п. 24, отличающийся тем, что указанный продукт представляет собой пищевой продукт, пищевую добавку, корм для животных, кормовую добавку для животных, нутрицевтический, фармацевтический, сельскохозяйственный или вакцинный продукт в форме блока, жидкого состава, коллоидной суспензии, порошка, таблетки, капсулы или семян с нанесенным покрытием.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой вакцину инактивированную эмульсионную против ящура типа А.

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой вакцину инактивированную эмульсионную против ящура типа О.

Изобретение относится к области медицинской биотехнологии и касается штамма вируса гриппа. Представлен штамм вируса гриппа А/Shanghai/НК/6:2/2013 (H7N9), депонированный в Государственную коллекцию вирусов ФГБУ «ФНИЦЭМ им.

Представленные изобретения относятся, в частности, к миовирусному бактериофагу Clo-РЕР-1, выделенному из природы и имеющему геном, представленный нуклеотидной последовательностью SEQ.

Представленные изобретения относятся, в частности, к миовирусному бактериофагу Esc-СОР-1, выделенному из природы и имеющему геном, представленный нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 1 (регистрационный №: КСТС 12662 ВР).

Представленные изобретения относятся, в частности, к миовирусному бактериофагу Esc-СОР-4, выделенному из природы и имеющему геном, представленный нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 1 (регистрационный №: KСТС 12663 ВР).

Изобретения относятся к области биотехнологии и касаются поксвирусного вектора, композиции, включающей такой вектор, способу десенсибилизации, индукции переносимости или подавления аллергической реакции, способу вакцинации субъекта и набору.

Изобретения относятся к области биотехнологии и касаются живого аттенуированного рекомбинантного герпесвируса кои (KHV), вектора экспрессии, включающего геном такого вируса, выделенной клетки, вакцины, способа профилактики у рыбы заболевания, вызываемого KHV, и иммуногенной композиции.

Изобретения относятся к области биотехнологии и касаются вакцинной композиции, способа иммунизации при использовании указанной композиции и набора для осуществления такого способа.

Изобретение относится к биохимии и вирусологии и касается способов и системы для упаковки репортерных молекул нуклеиновых кислот в нерепликативные трансдукторные частицы для использования в качестве репортерных молекул.

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой композицию для культивирования плюрипотентных стволовых клеток, содержащую культуральную среду для плюрипотентных стволовых клеток, деацилированную геллановую камедь или ее соль, и адгезивные клетки, где указанные адгезивные клетки представляют собой плюрипотентные стволовые клетки в форме сфер, где указанная деацилированная геллановая камедь или ее соль присутствуют в концентрации, которая позволяет культивировать сферы в статической суспензионной культуре, и где указанная композиция имеет вязкость не более 8 мПа∙с в условиях 37°C.

Изобретение относится к биотехнологии. Изобретение представляет собой штамм вируса ядерного полиэдроза непарного шелкопряда Lymantria dispar L.

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии, и может быть использовано для получения специфического белоксодержащего антигенного препарата из клинически значимых дрожжевых грибов.

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой штамм культуры корня растения шлемник байкальский (Scutellaria baicalensis Georgi), депонированный в Коллекции генетически трансформированных корней растений при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте физиологии растений им.

Изобретение относится к биотехнологии и сельскому хозяйству. Изобретение представляет собой штамм клубеньковых бактерий Rhizobium leguminosarum ССМ 32 ВКПМ В-12661, применяемый в качестве активного компонента для получения биоудобрений под горох.

Изобретение относится к биотехнологии. Изобретение представляет собой штамм бактерий Bacillus megaterium V3, депонированный в ФГБНУ ВНИИСХМ под номером RCAM 04324 в качестве средства для ускорения роста и увеличения продуктивности зерновых, овощных и древесных культур.

Изобретение относится к микробиологии. Способ подготовки шахтных вод для выделения ДНК предусматривает фильтрацию проб кислой шахтной воды через нитрозоцеллюлозный фильтр, трехкратную промывку осадка оксалатом аммония и осаждение отмытых клеток центрифугированием в течение 20 мин.

Изобретение относится к биотехнологии. Изобретение представляет собой штамм суспензионной культуры клеток растения диоскорея дельтовидная (Dioscorea deltoidea Wall) под обозначением ИФР-ДМ-05-pro №89, депонированный в Российскую коллекцию высших растений при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте физиологии растений им.

Изобретение относится к медицине и биологии, в частности к диагностике, а именно: к ДНК-анализу, и может быть использовано для выявления мутаций резистентности к макролидным антибиотикам у Mycoplasma genitalium и Mycoplasma pneumonia, а именно в позициях 2058/2059 и 2611 23S рРНК.

Изобретение относится к области биохимии. Описана группа объектов, включающая способ определения бактерии вида Dickeya solani методом петлевой изотермической амплификации (LAMP) и набор праймеров для определения бактерии вида Dickeya solani методом петлевой изотермической амплификации (LAMP).

Изобретение относится к фармацевтической промышленности и касается пероральной лекарственной формы 3,3'-дииндолилметана для использования в терапии опухолевых процессов органов репродуктивной системы.

Группа изобретений касается стабилизации биологически активного материала. Предложены: сухая композиция в аморфном стеклообразном состоянии для стабилизации биологически активного материала, содержащая указанный биологически активный материал, от 10 до 50 по меньшей мере одного дисахарида, от более чем 10 до 80 по меньшей мере одного олигосахарида, от 0,1 до 10 по меньшей мере одного полисахарида, от 0,5 до 40 по меньшей мере одного гидролизованного белка и по меньшей мере одну соль карбоновой кислоты в количестве 0,5-20, при этом проценты указаны относительно общей массы композиции, при этом указанный биологически активный материал представляет собой: живую бактерию, гриб, фаг, фермент, белок или пестицид. Также предложены способ ее получения и продукты ее содержащие, обеспечивающие повышенную стабильность биологически активного материала. 6 н. и 19 з.п. ф-лы, 20 ил., 1 табл.

Наверх