Способ определения посттрансплантационного химеризма при анализе точечных мутаций замены оснований в генах f2, f5, f7, f13, fgb, itga2, itgb3, pai-1



Способ определения посттрансплантационного химеризма при анализе точечных мутаций замены оснований в генах f2, f5, f7, f13, fgb, itga2, itgb3, pai-1
Способ определения посттрансплантационного химеризма при анализе точечных мутаций замены оснований в генах f2, f5, f7, f13, fgb, itga2, itgb3, pai-1
Способ определения посттрансплантационного химеризма при анализе точечных мутаций замены оснований в генах f2, f5, f7, f13, fgb, itga2, itgb3, pai-1
G01N33/50 - химический анализ биологических материалов, например крови, мочи; испытания, основанные на способах связывания биоспецифических лигандов; иммунологические испытания (способы измерения или испытания с использованием ферментов или микроорганизмов иные, чем иммунологические, составы или индикаторная бумага для них, способы образования подобных составов, управление режимами микробиологических и ферментативных процессов C12Q)
G01N2800/50 - Исследование или анализ материалов путем определения их химических или физических свойств (разделение материалов вообще B01D,B01J,B03,B07; аппараты, полностью охватываемые каким-либо подклассом, см. в соответствующем подклассе, например B01L; измерение или испытание с помощью ферментов или микроорганизмов C12M,C12Q; исследование грунта основания на стройплощадке E02D 1/00;мониторинговые или диагностические устройства для оборудования для обработки выхлопных газов F01N 11/00; определение изменений влажности при компенсационных измерениях других переменных величин или для коррекции показаний приборов при изменении влажности, см. G01D или соответствующий подкласс, относящийся к измеряемой величине; испытание

Владельцы патента RU 2667006:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки "Кировский научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови Федерального медико-биологического агентства" (RU)

Изобретение относится к области медицины, в частности к гематологии, и предназначено для определения посттрансплантационного донорского химеризма при анализе точечных мутаций замены оснований в генах тромбофилии. Для оценки химеризма анализируют однонуклеотидные полиморфизмы генов F2, F5, F7, F13, FGB, ITGA2, ITGB3, PAI-1 методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени. В случае обнаружения у реципиента аллельных специфичностей, отсутствующих у донора, определяют наличие химеризма, а в случае определения у донора алелля, отсутствующего у реципиента, - отсутствие химеризма после трансплантации аллогенных гемопоэтических стволовых клеток (ГСК). Изобретение обеспечивает создание способа оценки гемопоэтического химеризма на основании анализа информативных аллелей в генах F2, F5, F7, F13, FGB, ITGA2, ITGB3, PAI-1. Предлагаемый способ позволяет определить маркерные локусы, необходимые для оценки состояния больного после трансплантации ГСК. 3 табл., 2 пр.

 

Изобретение относится к области медицины, в частности к гематологии и может быть использовано для оценки донорского химеризма после трансплантации костного мозга и гемопоэтических стволовых клеток путем определения точечных мутаций замены оснований в генах F2, F5, F7, F13, FGB, ITGA2, ITGB3, PAI-1 методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени.

Цель изобретения - разработка способа определения посттрансплантационного химеризма при анализе полиморфизма генов F2, F5, F7, F13, FGB, ITGA2, ITGB3, PAI-1.

Аллогенная трансплантация гемопоэтических стволовых клеток (аллоТГСК) является эффективным методом лечения тяжелых заболеваний системы крови и иммунной системы. Несмотря на достигнутые успехи в области трансплантологии, аллоТГСК сопряжена с развитием острой и хронической реакции «трансплантат против хозяина», возможностью отторжения трансплантата, возникновением рецидивов основного заболевания. Мониторинг приживления гемопоэтических стволовых клеток путем оценки посттрансплантационного химеризма необходим для оценки состояния кроветворной системы и планирования цитостатической и иммунносупрессивной терапии [1]. Генетический химеризм - это одновременное присутствие в организме двух и более маркеров генетически различных клеточных линий. Выделяют полный донорский химеризм, смешанный химеризм и отсутствие химеризма (отторжение трансплантата) [7].

Известен способ диагностики химеризма цитогенетическим методом. Данный метод не обладает достаточной чувствительностью и используется при различиях донора и реципиента по полу или при наличии у пациента хромосомных особенностей. Недостатком является сложность получения метафазных пластинок хромосом при малой клеточности костного мозга. Метод флюоресцентной гибридизации in situ (FISH) обладает рядом преимуществ перед стандартной цитогенетикой, т.к. не предусматривает культивирования клеток, но, также как и метод количественного определения Y-хромосомы [5], данный способ может быть использован только при различиях донора и реципиента по полу [4].

Известен способ мониторинга химеризма по результатам исследования антигенов эритроцитов. Необходимым условием для проведения данного метода являются различия между донором и реципиентом по каким-либо антигенам систем АВО, Резус, Келл, MNS Даффи, Левис, Кидд. Преимуществами способа являются простота и высокая скорость выполнения. Недостатками данного способа являются относительно низкая чувствительность (1-5%) и возможность использования только через 4 недели и позже после аллоТГСК [3].

Известен способ выявления сателлитных последовательностей, характеризующихся высокой степенью полиморфизма. Исследование заключается в определении минисателлитов (10-70 пар оснований) (variable number tandem repeats, VNTR) или микросателлитов (2-5 пар оснований) (short tandem repeats, STR) [6]. Методы исследования, основанные на анализе STR, отличаются высокой чувствительностью (от 1 до 0,001%), быстротой и простотой в исполнении, возможностью количественной оценки химеризма.

Наиболее близким к предполагаемому изобретению является исследование полиморфизма InDel, типа генетической вариации, при котором специфическая нуклеотидная последовательность присутствует (инсерция) или отсутствует (делеция) [8]. Главным преимуществом InDel ПЦР по сравнению с мультиплексной STR ПЦР является отсутствие конкуренции и влияния эффекта «плато» на результат реакции ПЦР [1], что делает данный способ наиболее чувствительным из всех перечисленных.

Техническим результатом заявляемого изобретения является создание способа оценки гемопоэтического химеризма на основании анализа информативных аллелей в генах F2, F5, F7, F13, FGB, ITGA2, ITGB3, PAI-1. Технология анализа однонуклеотидных полиморфизмов (single nucleotide polymorphisms - SNPs) позволяет выявить замену в нуклеотидной последовательности ДНК и три варианта генотипа: гомозиготность с исходной последовательностью нуклеотидов, гетерозиготность и гомозиготность с заменой в последовательности нуклеотидов. Предлагаемый способ позволяет определить маркерные локусы, необходимые для оценки состояния больного после трансплантации ГСК.

Для достижения указанного результата в соответствии с аналогом (Alizadeh М., 2002) проводят типирование генов донора и реципиента и выявляют информативные аллели, позволяющие дифференцировать ДНК донора и реципиента. В отличие от прототипа, в котором проводится ГТЦР коротких тандемных повторов (STR-PCR) биаллельных генетических систем S01-S11, в предлагаемом способе осуществляется анализ однонуклеотидных полиморфизмов генов F2, F5, F7, F13, FGB, ITGA2, ITGB3, PAI-1. Анализ химеризма проводится методом ПЦР в режиме реального времени.

В процессе проведения патентно-информационного поиска не выявлено источников, порочащих новизну предполагаемого изобретения.

Заявляемое изобретение разработано в лаборатории иммуногематологии ФГБУН КНИИГиПК ФМБА России в соответствии с планом научно-исследовательской работы.

Способ осуществляется следующим образом: Этап 1. Исследуют полиморфизм генов F2, F5, F7, F13, ITGA, ITGB, FGB, PAI-1 у донора и реципиента. С этой целью проводят выделение ДНК из периферической крови донора и реципиента согласно инструкции, прилагающейся к наборам реагентов. Маркируют пробирки для каждого исследуемого образца и отрицательного контроля в расчете на восемь полиморфизмов. В пробирки вносят соответствующие смеси для амплификации, ПЦР-буфер, Taq-полимеразу, исследуемый образец ДНК (100 нг) и отрицательный контрольный образец. Пробирки устанавливают в блок детектирующего амплификатора. ПЦР проводят при следующих параметрах: 2 мин при 80°С, 5 мин при 94°С с последующей амплификацией продуктов в течение 5 циклов (94°С - 30 сек, 67°С - 10 сек), 45 циклов (94°С - 5 сек, 67°С - 5 сек),1 цикл (25°С - 30 сек), 50 циклов (25°С - 15 сек). Смесь для амплификации содержит флуоресцентные метки Fam и Hex для соответствующего варианта полиморфизма. В конце амплификации осуществляется температурное плавление дуплексов (ампликон + сигнальный зонд), изменяющее уровень флуоресценции. Анализ кривых плавления позволяет определить специфичность фрагментов ДНК. Оба варианта искомой последовательности определяются в одной пробирке при одновременной гибридизации с двумя альтернативными типирующими зондами с различными флуорофорами. Описание SNP-генов, используемых в исследовании, представлено в таблице 1.

Этап 2. Определение информативных генов, позволяющих выявить аллельные различия донора и реципиента. Аллель считается информативным, если он позитивен для реципиента и негативен для донора или наоборот. Для определения процента донорского химеризма строят калибровочную кривую для выбранных информативных аллелей в серии разведений ДНК реципиента в ДНК донора (100, 10-1, 10-2, 10-4, 10-5), содержащих следующее отношения ДНК:

- 100% ДНК донора;

- 10% ДНК реципиента и 90% ДНК донора;

- 1% ДНК реципиента и 99% ДНК донора;

- 0,1% ДНК реципиента и 99,9% ДНК донора;

- 0,01% ДНК реципиента и 99,99% ДНК донора.

Этап 3. Исследование гемопоэтического химеризма проводят на 28, 42, 56, 70, 100, 120 дни после трансплантации, при этом анализируют информативные аллели. Протокол амплификации должен соответствовать описанному в «Этап 1». Оценку количественных значений химеризма осуществляют с использованием формулы:

Химеризм, %=2-DDCt × 100%,

где DDCt - разница между уровнями пороговой флуоресценции исследуемого маркера и референсного гена в исследуемом образце разведения и в образце ДНК донора.

Представленные ниже клинические примеры подтверждают возможность использования заявляемого способа при оценке гемопоэтического химеризма после аллоТГСК.

Пример 1.

Пациент С, 44 года, с диагнозом: Миелодиспластический синдром: рефрактерная анемия с избытком бластов (RAEB-1) IPSS-1.5. АллоТКМ после немиелоаблативного режима кондиционирования выполнена 21.01.2016 от HLA-идентичного родственного донора (сестра, возраст 47 лет). Результаты типирования генов тромбофилии методом ПЦР в режиме реального времени представлены в таблице 2. Перед трансплантацией были выявлены информативные маркеры - гены F7 и F13, в которых у реципиента имелись аллельные специфичности, отсутствующие у донора.

Выстроена калибровочная кривая в серии разведений ДНК донора в ДНК реципиента (100, 10-1, 10-2, 10-4, 10-5). Мониторинг химеризма проведен через 28, 42, 60, 70, 90, 100, 120, 300, 330 дней после аллоТГСК. Донорский химеризм >95% зарегистрирован в 28 и 42 дни. Донорский химеризм >99% определен с 60 дня и далее. Клинической картины отторжения или недостаточности трансплантата не наблюдалось. Больной в настоящее время не получает иммуносупрессивную терапию, ведет полноценную жизнь хорошего качества.

Пример 2.

Пациент С., 24 года с диагнозом Острый миелобластный лейкоз высокий риск. АллоТГСК с немиелоаблативным режимом кондиционирования выполнена 05.09.2016 для консолидации ремиссии 1. Донором явилась HLA-идентичная сестра больного (27 лет). С целью выявления маркеров посттрансплантационного химеризма проведено исследование генов тромбофилии. Результаты типирования представлены в таблице 3. Информативным маркером явился ген F13, в котором у донора был определен аллель G, отсутствующий у реципиента. Построена калибровочная кривая в серии разведений ДНК донора и реципиента. Исследование гемопоэтического химеризма выполнено на 28, 42, 60 дни после аллоТГСК. Донорский химеризм >95% регистрировался в 28 и 45 дни. При исследовании на 60 день донорский химеризм не превышал 5%. Наблюдались признаки отторжения трансплантата. Больной умер на +65 сутки после трансплантации от тяжелого сепсиса, септического шока.

Список литературы:

1. Лавриненко В.А., Савицкая Т.В., Волочник Е.В., Марейко Ю.Е., Алейникова О.В. Количественный анализ химеризма после аллогенной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток молекулярно-генетическими методами // Онкогематология, 2014, 9(2): 29-36.

2. Alizadeh М., Bernard М., Danic В. et al. Quantitative assessment of hematopoietic chimerism after bone marrow transplantation by real-time quantitative polymerase chain reaction. Blood 2002; 99(12): 4618-25.

3. Bader P., Niethammer D., Willasch A., Kreyenberg H., Klingebiel T. How and when should we monitor chimerism after allogeneic stem cell transplantation? // Bone Marrow Transpantation, 2005, 35(2): 107-119.

4. Fehse В., Chuchlovin A., Kuhcke K. et al. Real-time quantitative Y chromosome-specific PCR (QYCS-PCR) for monitoring hematopoietic chimerism after sex-mismatched allogeneic stem cell transplantation // J. Hematother. Cell Res., 2001, 10(3): 419-425.

5. Koldehoff M., Steckel N.K., Hlinka M. et al. Quantitative analysis of chimerism after allogeneic stem cell transplantation by real-time polymerase chain reaction with single nucleotide polymorphisms, standard tandem repeats, and Y-chromosome-specific sequences // Am. J. Hematol., 2006, 81(10): 735-16.

6. Kreyenberg H., Holle W., Mohrle S. et al. Quantitative analysis of chimerism after allogeneic stem cell transplantation by PCR amplification of microsatellite markers and capillary electrophoresis with fluorescence detection: the Tuebingen experience // Leukemia, 2003, 17: 237-240.

7. Kristt D., Israeli M., Narinski R. et al. Hematopoietic chimerism monitoring based on STRs: quantitative platform performance on sequential samples // J. Biomolecular Techniques., 2005; 16(4): 378-89.

8. Rodriguez-Murillo L. and Salem R.M. Insertion/Deletion Polymorphism. In M.D. Gellman & J.R. Turner (eds.). // Encyclopedia of behavioral medicine. New York: Springer, 2013, part 16: 1076.

Способ определения посттрансплантационного донорского химеризма при анализе точечных мутаций замены оснований в генах тромбофилии, включающий в себя получение образцов ДНК, проведение генотипирования донора и реципиента, определение информативных маркеров химеризма, посттрансплантационный мониторинг гемопоэтического химеризма, отличающийся тем, что для оценки химеризма анализируют однонуклеотидные полиморфизмы генов F2, F5, F7, F13, FGB, ITGA2, ITGB3, PAI-1, причем в качестве метода детекции используют полимеразную цепную реакцию в режиме реального времени, при этом определяют три варианта генотипа: гомозиготность с исходной последовательностью нуклеотидов, гетерозиготность и гомозиготность с заменой в последовательности нуклеотидов, и в случае обнаружения у реципиента аллельных специфичностей, отсутствующих у донора, определяют наличие химеризма, а в случае определения у донора алелля, отсутствующего у реципиента, - отсутствие химеризма после трансплантации аллогенных гемопоэтических стволовых клеток.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к экологии, а именно к способу регулирования загрязнения окружающей среды в зоне техногенного воздействия горнометаллургических, горно-обогатительных комплексов.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к способам обнаружения молекулы-мишени в тест-образце, что может быть использовано в медицине. Описанные способы облегчают детекцию мишени, отличающейся от нуклеиновой кислоты (например, белка-мишени), в исследуемом образце путем детекции нуклеиновой кислоты (т.е., аптамера).

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к оценке терапевтической эффективности химиотерапии с использованием противоопухолевого средства, и может быть использовано в медицине.

Предложенная группа изобретений относится к области медицины. Предложены способы определения и выбора терапии для пациента и набор для определения, может ли пациент получать пользу от лечения с помощью антагониста VEGF.

Предложенная группа изобретений относится к области молекулярной биологии и медицины. Предложены способ и набор для специфической идентификации по меньшей мере одной последовательности ДНК в образце путем проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР), включающие одну пару праймеров, специфичных для этой последовательности ДНК, и пару зондов, в которой один представляет собой олигонуклеотидный мишень-специфичный зонд, имеющий 3'-сегмент, комплементарный идентифицируемому участку последовательности ДНК и содержащий метку, и 5'-сегмент, некомплементарный идентифицируемой последовательности ДНК и содержащий метку, а другой - олигонуклеотидный сигнальный зонд, комплементарный 5'-сегменту мишень-специфичного зонда и содержащий метку.

Изобретение относится к металлургии, в частности к области анализа и определения водорода в алюминиевых сплавах. Предложен способ определения содержания водорода в алюминиевых сплавах, включающий отбор расплава, его последующую кристаллизацию сразу в двух подогреваемых тиглях: один под атмосферным давлением, а другой под низким давлением, и измерение разности плотностей полученных слитков.

Изобретение относится к области измерений и может быть использовано для исследования теплофизических характеристик электроизоляционных материалов. Согласно предложенному способу определения температуры стеклования проводят серии испытаний вдавливанием индентора в поверхность испытуемого материала при плавно изменяющейся температуре.

Изобретение относится к области пищевой промышленности, в частности к кондитерской отрасли, и может быть использовано для контроля качества кондитерских изделий. Способ определения витамина B2 в кондитерских изделиях включает последовательное проведение кислотного и ферментного гидролиза пробы с последующей фильтрацией, фотолиз, флюориметрическое определение и обработку результатов, при этом перед фотолизом проводят концентрирование водной фазы, полученной после фильтрации, путем твердофазной экстракции.

Изобретение относится к медицине, а именно к гистологии, и может быть использовано в диагностике нарушений сперматогенеза различной этиологии, включая идиопатическое бесплодие.

Изобретение относится к аналитической химии и касается способов определения ионов хрома (III) и железа (III) в растворе при совместном присутствии. Способ определения концентрации ионов хрома (III) и железа (III) при совместном присутствии в растворе включает добавление к анализируемому раствору, содержащему ионы хрома (III) и железа (III), 4 мл раствора трилона Б (концентрацией 80 г/л), нагревание полученной смеси на кипящей водяной бане в течение 10 мин, охлаждение смеси до комнатной температуры, добавление к охлажденной смеси 0,5 мл водного раствора аммиака, доведение дистиллированной водой до 25 мл, определение оптической плотности раствора и вычисление концентрации ионов по калибровочным зависимостям, при этом измерение оптической плотности производят при 660 нм для ионов хрома (III) и при 315 нм для ионов железа (III).

Изобретение относится к клинической иммунологии и касается способа определения функциональной активности С3-конвертазы альтернативного пути активации системы комплемента (АПАК).

Группа изобретений относится к in vitro диагностике и определению эффективности лечения болезни Гоше. Способ in vitro для диагностики болезни Гоше у индивидуума включает выявление биомаркера в образце от индивидуума, определение уровня биомаркера, присутствующего в образце, и сравнение уровня биомаркера с пороговым уровнем.

Изобретение относится к медицине. Выделяют территорию с постоянным присутствием алюминия и устанавливают перечень наиболее вероятных негативных эффектов - нарушений здоровья у детей, ассоциированных с повышенной аэрогенной экспозицией алюминия.

Предложенная группа изобретений относится к области медицины. Предложены способы определения и выбора терапии для пациента и набор для определения, может ли пациент получать пользу от лечения с помощью антагониста VEGF.

Группа изобретений относится к медицине, а именно к гинекологии, и может быть использована для оценки кислотно-щелочного состояния женских половых органов. Для этого осуществляют введение влагалищного зеркала и рН-метрического зонда во влагалище.

Изобретение относится к области медицины, а именно к кардиологии, и касается способа определения вероятности наличия нестабильных атеросклеротических бляшек в коронарных артериях у пациентов с коронарным атеросклерозом.

Группа изобретений относится к медицине и биотехнологии, и может быть использована для проведения направленной эволюции белков. Для этого проводят (a) получение данных о последовательности и данных об активности для каждого из множества вариантов белков; (b) генерацию мультипликативной модели последовательность-активность по данным о последовательности и данным об активности, где модель последовательность-активность связывает аминокислоты варианта белка или нуклеотидов, кодирующих вариант белка, с активностью варианта белка, и мультипликативная модель последовательность-активность содержит: произведение множественных невзаимодействующих мультипликативных членов, причем каждый невзаимодействующий мультипликативный член содержит произведение независимой переменной и коэффициента, где: (i) независимая переменная представляет определенную аминокислоту варианта белка или определенный нуклеотид, кодирующий вариант белка, и (ii) коэффициент представляет вклад в активность варианта бека только определенной аминокислотой или определенным нуклеотидом (c) использование модели последовательность-активность для осуществления цикла направленной эволюции одного или нескольких вариантов белка.

Изобретение относится к области ветеринарии и предназначено для диагностики мутантного аллеля, вызывающего короткий позвоночник или брахиспину у крупного рогатого скота.

Изобретение относится к медицине, а именно к сосудистой хирургии, и представляет собой способ прогнозирования развития тромбоэмболии легочной артерии у онкологических больных с флеботромбозом нижних конечностей, заключающийся в том, что при развитии венозного тромбоза в системе нижней полой вены до начала антикоагулянтной терапии определяют исходный количественный показатель D-димера и при уровне D-димера выше 2,88 нг/мл прогнозируют развитие тромбоэмболии легочной артерии.
Изобретение относится к области медицины и касается способа прогнозирования угрозы невынашивания беременности ранних сроков при цитомегаловирусной инфекции. Способ заключается в том, что у беременных женщин с выявленной цитомегаловирусной инфекцией на первом триместре беременности проводят определение в сыворотке крови уровня антител IgM и содержания PlGF.

Группа изобретений относится к in vitro диагностике и определению эффективности лечения болезни Гоше. Способ in vitro для диагностики болезни Гоше у индивидуума включает выявление биомаркера в образце от индивидуума, определение уровня биомаркера, присутствующего в образце, и сравнение уровня биомаркера с пороговым уровнем.

Изобретение относится к области медицины, в частности к гематологии, и предназначено для определения посттрансплантационного донорского химеризма при анализе точечных мутаций замены оснований в генах тромбофилии. Для оценки химеризма анализируют однонуклеотидные полиморфизмы генов F2, F5, F7, F13, FGB, ITGA2, ITGB3, PAI-1 методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени. В случае обнаружения у реципиента аллельных специфичностей, отсутствующих у донора, определяют наличие химеризма, а в случае определения у донора алелля, отсутствующего у реципиента, - отсутствие химеризма после трансплантации аллогенных гемопоэтических стволовых клеток. Изобретение обеспечивает создание способа оценки гемопоэтического химеризма на основании анализа информативных аллелей в генах F2, F5, F7, F13, FGB, ITGA2, ITGB3, PAI-1. Предлагаемый способ позволяет определить маркерные локусы, необходимые для оценки состояния больного после трансплантации ГСК. 3 табл., 2 пр.

Наверх