Способ получения бруцеллезного эритроцитарного диагностикума для реакции непрямой гемагглютинации (рнга)

Изобретение относится к области ветеринарии, в частности к получению бруцеллезного эритроцитарного диагностикума для реакции непрямой гемагглютинации (РНГА). Способ включает изготовление формалинизированных эритроцитов барана с их последующей сенсибилизацией бруцеллезным антигеном. Сенсибилизацию формалинизированных эритроцитов проводят суспензией бруцелл штамма В. abortus 19, полученной в концентрации 70-80 млрд микробных клеток в 1 мл гипертонического 12%-ного раствора хлористого натрия. Добавляют 4-4,5% поверхностно активного средства «Прогресс» и 0,25% додецилсульфата натрия, смесь подогревают до 45-50°С и выдерживают 45 мин на водяной бане. После чего ее используют для сенсибилизации формалинизированных эритроцитов из расчета 2,0-2,5 мл на 1 мл 10%-ной взвеси эритроцитов. Использование данного способа позволяет получитьспецифический диагностикум, имеющий активность РНГА со стандартным образцом сыворотки 1:1600, при совместном применении детергентов поверхностно-активного средства «Прогресс» и 0,25% додецилсульфата натрия 2,0-2,5 мл на 1 мл 10%-ной взвеси эритроцитов. 4 табл., 1 пр.

 

Изобретение относится к области ветеринарии, а именно к получению бруцеллезного эритроцитарного диагностикума для реакции непрямой гемагглютинации (РНГА).

Известен «Способ получения эритроцитарного антигена для серологической диагностики бруцеллеза», включающий изготовление формалинизированных эритроцитов барана с их последующей сенсибилизацией бруцеллезным антигеном, отличающийся тем, что антиген для сенсибилизации формалинизированных эритроцитов инактивируют путем обработки бактериальной массы, полученной после выращивания бруцелл в количестве 50-60 млрд м.к. в 1 мл с 2%-ным детергентом вторичным алкилсульфатом натрия и сенсибилизируют формалинизированные эритроциты инактивированным антигеном из расчета 0,75-1,0 мл антигена на 1 мл 10% взвеси эритроцитов в течение 2 часов при 45°C (патент на изобретение №2415434, патентообладатель Прикаспийский зональный научно-исследовательский ветеринарный институт, авторы Хаиров С.Г., Юсупов О.Ю., Рамазанова Д.М. и др.). Для получения данного антигена в процессе его изготовления к суспензии бруцелл, используемой для сенсибилизации 10%-ных формалинизированных эритроцитов, в качестве детергента добавляют выпускаемый Новочеркасским заводом синтетических продуктов поверхностно-активное моющее средство «Прогресс», действующим веществом которого является вторичный алкилсульфат натрия (ТУ 3810719-92; СТО 05807999-007-2006).

В связи с банкротством и закрытием Новочеркасского завода синтетических продуктов и отсутствием в продаже указанного детергента для его замены нами испытано множество поверхностно-активных веществ, в том числе препарат додецилсульфат натрия, моющие средства «Золушка», «Прогресс» (производитель ООО АМС Медиа, г. Лосино-Петровский, Московской обл.) и сильно концентрированное моющее средство «Прогресс» Московской фирмы «Селена». Обнадеживающие результаты получены при испытании универсального моющего средства «Прогресс» и препарата додецилсульфат натрия. Однако диагностикумы, изготовленные с применением указанных препаратов, не обладали достаточной активностью. Титры РНГА с диагностикумами, изготовленными с использованием данных препаратов при исследовании стандартного образца национальной агглютинирующей сыворотки, не превышали 1:800, тогда как в соответствии с нормативными документами (инструкция по изготовлению, ТУ) он должен быть не ниже 1:1600 с оценкой в четыре креста. Так как при серологическом исследовании в РНГА с применением диагностикума, обладающего недостаточно высокой активностью, часть животных, положительно реагирующих в РА и РСК, может остаться невыявленной, возникла необходимость в усовершенствовании способа получения диагностикума.

Целью изобретения является получение высокоактивного эритроцитарного диагностикума для РНГА, путем сочетанного применения в качестве детергентов новых поверхностно-активных препаратов.

Эта цель достигается тем, что для более полного извлечения из бруцелл антигенных комплексов, расширения их антигенного спектра и наиболее полного насыщения ими эритроцитов, следовательно, лучшей сенсибилизации эритроцитов и повышения активности диагностикума в РНГА, перед сенсибилизацией формалинизированных эритроцитов, суспензию бруцелл обрабатывают новым отечественным поверхностно-активным моющим средством «Прогресс» производства ООО АМС Медиа (г. Лосино-Петровский, Московская обл.; ТУ 2383-018-52662802-2002; ГОСТ Р51696-2000) в сочетании с препаратом додецилсульфат натрия (CH3(CH2)11OS3Na). Данное средство («Прогресс»), несмотря на одинаковое коммерческое название со средством «Прогресс», выпускавшимся Новочеркасским заводом синтетических продуктов и использовавшимся ранее по известному «Способу получения эритроцитарного антигена для серологической диагностики бруцеллеза» для производства антигена для РНГА (патент на изобретение №2415434) - совершенно другой препарат, что видно из нормативных документов на эти препараты - ТУ, ГОСТ и СТО. Препараты отличаются также по составу.

Сущность изобретения заключается в разработке способа получения бруцеллезного эритроцитарного диагностикума для РНГА путем сенсибилизации формалинизированных эритроцитов суспензией бруцелл, содержащей более широкий спектр антигенных комплексов, извлеченных из бруцелл путем автоклавирования их в гипертоническом 12%-ном растворе хлористого натрия, и воздействия композиции, состоящей из поверхностно-активного средства «Прогресс», основным действующим веществом которого является вторичный алкилсульфат натрия, в сочетании с додецилсульфатом натрия.

Преимущество изобретения заключается в том, что при сенсибилизации эритроцитов суспензией бруцелл, содержащей более широкий спектр антигенных комплексов, извлеченных из бруцелл, в присутствии смеси поверхностно-активных веществ достигается повышение активности диагностикума. Применение его для исследования сывороток крови животных на бруцеллез позволяет выявить более широкий спектр иммуноглобулинов, обладающих агглютинирующей и комплементсвязывающей активностью, т.е. установить бруцеллез у животных, реагирующих как в РА, так и РСК.

Пример

Культуру бруцелл штамма 19 В.abortus 19 трехсуточного роста смывают с поверхности питательной среды - мясопептонно-печеночно глюкозоглицеринового агара стерильным 12%-ным раствором хлорида натрия. Полученную суспензию доводят до концентрации 70-80 млрд м.к. в 1 мл по оптическому бруцеллезному стандарту мутности 12% раствором NaCl и для извлечения антигенного комплекса и обезвреживания бруцелл автоклавируют в течение 20-30 минут.

После установления стерильности, чистоты и типичности роста бруцелл штамма 19, бакмассу (взвесь бруцелл) подогревают до 45°C и в нее добавляют 4-4,5% препарата «Прогресс» и 0,25% додецилсульфата натрия. Смесь взвеси бруцелл с указанными детергентами в течение 45 минут выдерживают в водяной бане при температуре 45-50°C, периодически перемешивая через каждые 5-10 минут, после чего ее используют для сенсибилизации формалинизированных эритроцитов барана.

Формалинизацию эритроцитов проводят по способу Вайнбаха в модификации Прикаспийского зонального НИВИ, которая заключается в том, что формалинизацию эритроцитов проводят в течение 16-18 часов, вместо 24 часов, и встряхивают их в Шутель-аппарате не постоянно, как рекомендует автор, а через каждые 30 минут в течение 1,5-2 минут. Это дает возможность значительно сократить время стабилизации и получить максимальный выход эритроцитов без признаков гемолиза и склеивания, которые наблюдались иногда при постоянном встряхивании их в течение 24 часов. Сокращение времени формалинизации до 16-18 часов с периодическим встряхиванием способствовало также лучшей сохранности эритроцитов и их сорбционных свойств, а также увеличению срока хранения.

Подготовленные таким способом эритроциты сохраняют свою стабильность и адсорбционные свойства в течение двух лет и более при условии хранения при температуре 4-6°C.

Титрация бруцеллезного антигена для сенсибилизации эритроцитов

Для каждой серии формалинизированных эритроцитов определяют оптимальную дозу бруцеллезного антигена путем исследования в РНГА со стандартным образцом сыворотки антибруцелла абортус. Предварительно антиген (взвесь бруцелл концентрации 70-80 млрд м.к. в 1 мл) подогревают до температуры 45-50°C, выдерживают в водяной бане при этой температуре в течение 45 минут при периодическом встряхивании, добавляют 4-4,5% нового поверхностно-активного моющего средства «Прогресс» производства ООО АМС Медиа и 0,25% препарата додецилсульфат натрия. Сенсибилизацию эритроцитов проводят возрастающими дозами антигена в пробирках в присутствии указанных детергентов (4-4,5% препарата «Прогресс» и 0,25% додецилсульфата натрия) при температуре 45-50°C в течение 2 часов. Для титрации антигена к 1 мл 10%-ной взвеси эритроцитов, подогретых также до 45°C, добавляют по 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; 3,0 антигена с детергентами. Штатив с пробирками встряхивают и выдерживают в водяной бане при 45-50°C в течение 2-х часов для сенсибилизации эритроцитов. Сенсибилизированные эритроциты трижды отмывают физиологическим раствором от избытка антигена путем центрифугирования при 1000 об/мин в течение 5-6 минут. После последнего центрифугирования в пробирки вносят по 4 мл физиологического раствора с целью получения 2,5%-ной взвеси эритроцитов. Взвесь эритроцитов гомогенизируют путем встряхивания пробирок. Полученную взвесь эритроцитов 2,5%-ной концентрации используют в качестве диагностикума для постановки РНГА. Реакцию ставят со стандартным образцом сыворотки антибруцелла абортус в разведениях 1:100, 1:200, 1:400, 1:800, 1:1600, 1:3200, 1:6400 и негативной сывороткой крови в разведениях 1:50, 1:100, 1:200, 1:400. Сыворотки разводят физиологическим раствором. Все разведения сыворотки прогревают в водяной бане при 60-62°C в течение 30 минут. После чего к 0,5 мл каждого разведения сыворотки вносят по 0,05 мл (по одной капле) взвеси эритроцитов, сенсибилизированных разными дозами антигена. Затем содержимое полистиролового планшета (разведения сыворотки + эритроцитарный антиген) тщательно перемешивают и выдерживают при комнатной температуре 3-4 часа, после чего проводят учет реакции.

За оптимальную дозу антигена принимают ту, с которой в РНГА получена четкая положительная реакция со стандартным образцом сыворотки антибруцелла абортус в разведении 1:1600 с оценкой четыре креста.

Пример

Результаты проверки активности и специфичности 3-х эритроцитарных диагностикумов для РНГА, полученных путем сенсибилизации формалинизированных эритроцитов бруцеллезным антигеном (взвесью бруцелл), обработанным новым поверхностно-активным средством «Прогресс» производства ООО АМС Медиа и препаратом додецилсульфатом натрия в отдельности и при сочетанном применении обоих препаратов даны в таблицах 1-3.

Из приведенных в таблицах 1 и 2 данных видно, что диагностикумы, изготовленные путем сенсибилизации эритроцитов бруцеллезными антигенами (взвесью бруцелл), обработанными новым поверхностно-активным средством «Прогресс» производства ООО АМС Медиа и препаратом додецилсульфат натрия имеют недостаточную активность. При исследовании в РНГА стандартного образца сыворотки антибруцелла абортус с применением эритроцитов, сенсибилизированных указанными препаратами (эритроцитарный диагностикум), титр реакции не превышал 1:800. Вместе с тем, результаты титрации антигена показали, что сенсибилизация эритроцитов взвесью бруцелл (антиген), обработанных смесью обоих препаратов, повышает активность сенсибилизированных эритроцитов и позволяет получить специфичный диагностикум, имеющий активность в РНГА со стандартным образцом сыворотки титр 1:1600 с оценкой в четыре креста (табл. 3). Одновременно установлено, что наиболее оптимальной для обработки бакмассы является 4-4,5%-ная концентрация поверхностно-активного средства «Прогресс» и 0,25% концентрация препарата додецилсульфата натрия. Наименьшей дозой антигена (сенситина), позволяющей получить эритроцитарный антиген с высокой активностью (титр 1:1600) и специфичностью при сочетанном применении детергентов, является 2,0-2,5 мл на 1 мл 10%-ной взвеси эритроцитов.

Изготовление опытной серии бруцеллезного эритроцитарного диагностикума для РНГА

В автоклавированную бакмассу, имеющую концентрацию 70-80 млрд бруцелл в 1 мл добавляют 4,5% нового поверхностно-активного средства «Прогресс» производства ООО АМС Медиа и 0,25% препарата додецилсульфат натрия, смесь подогревают до 45-50°C и выдерживают в водяной бане в течение 45 минут, после чего ее используют для сенсибилизации формалинизированных эритроцитов. С учетом результатов титрации для сенсибилизации эритроцитов антиген добавляют из расчета 2-2,5 мл на 1 мл 10% взвеси эритроцитов.

Для сенсибилизации эритроцитов смесь выдерживают при 45-50°C в водяной бане в течение 2-х часов при периодическом встряхивании через каждые 5-10 минут. Затем сенсибилизированные эритроциты отмывают от избытка антигена три раза физиологическим раствором путем центрифугирования при 1500 об/мин в течение 10-15 минут. После последнего центрифугирования надосадочную жидкость удаляют, к осадку эритроцитов добавляют физиологический раствор с таким расчетом, чтобы получить 5% взвесь эритроцитов, добавляют в качестве консерванта 0,25-0,3 формальдегида. Антиген проверяют на специфичность и активность в РНГА и хранят при 4-6°C.

Результаты проверки готового эритроцитарного диагностикума на активность и специфичность представлены в таблице 4.

Как видно из данных приведенных в таблице 4, сенсибилизация формалинизированных эритроцитов бруцеллезным антигеном, обработанным новым поверхностно-активным средством «Прогресс» производства ООО АМС Медиа в сочетании с 0,25% препарата додецилсульфат натрия, позволяет получить специфичный эритроцитарный диагностикум, имеющий титр РНГА со стандартным образцом сыворотки антибруцелла абортус 1:1600 с оценкой четыре креста, то есть диагностикум, отвечающий по активности требованиям утвержденной нормативной документации (регламент по изготовлению, инструкция по применению и ТУ).

Способ получения бруцеллезного эритроцитарного диагностикума для реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) при диагностике бруцеллеза, включающий изготовление формалинизированных эритроцитов барана с их последующей сенсибилизацией бруцеллезным антигеном, отличающийся тем, что сенсибилизацию формалинизированных эритроцитов проводят суспензией бруцелл штамма В. abortus 19, полученной в концентрации 70-80 млрд микробных клеток в 1 мл гипертонического 12%-ного раствора хлористого натрия, к которой добавляют 4-4,5% поверхностно-активного средства «Прогресс» и 0,25% додецилсульфата натрия, смесь подогревают до 45-50°С и выдерживают 45 мин на водяной бане, после чего ее используют для сенсибилизации формалинизированных эритроцитов из расчета 2,0-2,5 мл на 1 мл 10%-ной взвеси эритроцитов.



 

Похожие патенты:

Группа изобретений относится к области медицины. Предложены способ и набор для исследования на присутствие цитомегаловируса (CMV), вируса простого герпеса I (HSV I), вируса простого герпеса II (HSV II), вируса Эпштейна-Барра (EBV), HHV6, HHV7, HHV8, парвовируса 19, вируса гепатита В (HBV), вируса гепатита С (HCV), коксаки-вируса, вирусов иммунодефицита человека (HIV-1, HIV-2), аденоассоциированного вируса (AAV), вируса краснухи, HPV, хламидий, токсоплазмы и норовируса внутри сперматозоидов.

Группа изобретений относится к области медицины. Предложены способ и набор для исследования на присутствие цитомегаловируса (CMV), вируса простого герпеса I (HSV I), вируса простого герпеса II (HSV II), вируса Эпштейна-Барра (EBV), HHV6, HHV7, HHV8, парвовируса 19, вируса гепатита В (HBV), вируса гепатита С (HCV), коксаки-вируса, вирусов иммунодефицита человека (HIV-1, HIV-2), аденоассоциированного вируса (AAV), вируса краснухи, HPV, хламидий, токсоплазмы и норовируса внутри сперматозоидов.

Изобретение касается способа диагностики респираторной инфекции, связанной с бактериальной инфекцией; способа выбора пациентов с респираторной инфекцией для приема антибиотика; способа определения времени для прекращения введения антибиотика пациенту с респираторной инфекцией, получающему антибиотик; способа выбора пациентов, которым будет прекращено введение антибиотика из пациентов с респираторной инфекцией, принимающих антибиотик; способа лечения респираторной инфекции, связанной с бактериальной инфекцией, основанных на выявлении повышения уровня sCD14-ST в моче, используемого в качестве индикатора, относительно порогового значения, составляющего 3338–5758 пг/мл.
Группа изобретений относится к ветеринарии и касается способа серологической диагностики вирусных болезней лососевых рыб, включающего взаимодействие специфических иммуноглобулинов с гомологичными антигенами и антителами, меченными ферментом, добавление субстратной смеси, инкубацию 25-30 минут и учет результатов реакции по интенсивности окраски образовавшегося комплекса.
Группа изобретений относится к ветеринарии и касается способа серологической диагностики вирусных болезней лососевых рыб, включающего взаимодействие специфических иммуноглобулинов с гомологичными антигенами и антителами, меченными ферментом, добавление субстратной смеси, инкубацию 25-30 минут и учет результатов реакции по интенсивности окраски образовавшегося комплекса.

Изобретение относится к области лабораторной диагностики, молекулярной биологии и эпидемиологии. Предложен набор синтетических олигонуклеотидов для количественного определения ДНК Ureaplasma parvum, Ureaplasma urealyticum и Mycoplasma hominis в слизистой оболочке влагалища методом полимеразной цепной реакции, включающий праймеры и зонды с флуоресцентной меткой.

Изобретение относится к области лабораторной диагностики, молекулярной биологии и эпидемиологии. Предложен набор синтетических олигонуклеотидов для количественного определения ДНК Ureaplasma parvum, Ureaplasma urealyticum и Mycoplasma hominis в слизистой оболочке влагалища методом полимеразной цепной реакции, включающий праймеры и зонды с флуоресцентной меткой.

Изобретение касается рекомбинантных белков, содержащих антигенные эпитопы белков Core, Small Envelope, NS2A и preM вируса Зика, и комплексного антигена, содержащего указанные белки.

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к способу детекции комплекса Mycobacterium tuberculosis. Способ детекции комплекса Mycobacterium tuberculosis, включает иммунологический анализ специфического для комплекса Mycobacterium tuberculosis белка, где внеклеточную секрецию указанного белка осуществляют посредством термической обработки биологического образца, содержащего комплекс Mycobacterium tuberculosis, при 45-50°C в течение от 15 до 60 минут.

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к способу детекции комплекса Mycobacterium tuberculosis. Способ детекции комплекса Mycobacterium tuberculosis, включает иммунологический анализ специфического для комплекса Mycobacterium tuberculosis белка, где внеклеточную секрецию указанного белка осуществляют посредством термической обработки биологического образца, содержащего комплекс Mycobacterium tuberculosis, при 45-50°C в течение от 15 до 60 минут.

Изобретение относится к области ветеринарии, в частности к получению бруцеллезного эритроцитарного диагностикума для реакции непрямой гемагглютинации. Способ включает изготовление формалинизированных эритроцитов барана с их последующей сенсибилизацией бруцеллезным антигеном. Сенсибилизацию формалинизированных эритроцитов проводят суспензией бруцелл штамма В. abortus 19, полученной в концентрации 70-80 млрд микробных клеток в 1 мл гипертонического 12-ного раствора хлористого натрия. Добавляют 4-4,5 поверхностно активного средства «Прогресс» и 0,25 додецилсульфата натрия, смесь подогревают до 45-50°С и выдерживают 45 мин на водяной бане. После чего ее используют для сенсибилизации формалинизированных эритроцитов из расчета 2,0-2,5 мл на 1 мл 10-ной взвеси эритроцитов. Использование данного способа позволяет получитьспецифический диагностикум, имеющий активность РНГА со стандартным образцом сыворотки 1:1600, при совместном применении детергентов поверхностно-активного средства «Прогресс» и 0,25 додецилсульфата натрия 2,0-2,5 мл на 1 мл 10-ной взвеси эритроцитов. 4 табл., 1 пр.

Наверх