Способ определения гемопоэтического химеризма при исследовании однонуклеотидных полиморфизмов генов mther: 677, mther: 1298, mtr: 2756, mtrr: 66



Способ определения гемопоэтического химеризма при исследовании однонуклеотидных полиморфизмов генов mther: 677, mther: 1298, mtr: 2756, mtrr: 66
Способ определения гемопоэтического химеризма при исследовании однонуклеотидных полиморфизмов генов mther: 677, mther: 1298, mtr: 2756, mtrr: 66
G01N33/50 - химический анализ биологических материалов, например крови, мочи; испытания, основанные на способах связывания биоспецифических лигандов; иммунологические испытания (способы измерения или испытания с использованием ферментов или микроорганизмов иные, чем иммунологические, составы или индикаторная бумага для них, способы образования подобных составов, управление режимами микробиологических и ферментативных процессов C12Q)

Владельцы патента RU 2667127:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки "Кировский научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови Федерального медико-биологического агентства" (RU)

Изобретение относится к области медицины, в частности к трансплантологии, и предназначено для анализа гемопоэтического химеризма при исследовании однонуклеотидных полиморфизмов генов фолатного цикла. Анализ химеризма проводят методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени. Определяют транзиции или трансверсии в генах MTHFR: 677, MTHFR: 1298, MTR: 2756, MTRR: 66. Наличие химеризма диагностируют при обнаружении у донора аллельных специфичностей, отсутствующих у реципиента, в одном или в нескольких указанных генах; отсутствие химеризма - при выявлении у реципиента аллелей, отсутствующих у донора. Предлагаемый способ позволяет определить информативные маркеры, оценка которых лежит в основе мониторинга посттрансплантационного химеризма. 2 табл., 2 пр.

 

Изобретение относится к области медицины, в частности к трансплантологии и может быть использовано при мониторинге гемопоэтического химеризма после аллогенной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток путем исследовании однонуклеотидных полиморфизмов генов MTHFR: 677, MTHFR: 1298, MTR: 2756, MTRR: 66 методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени.

Трансплантация гемопоэтических стволовых клеток (ТГСК) от родственного и неродственного донора нередко является единственным способом спасения жизни больного с тяжелым поражением костного мозга и иммунной системы. Успех аллогенной ТГСК (аллоТГСК) ограничен развитием таких осложнений, как реакция «трансплантат против хозяина», отторжение трансплантата, рецидив основного заболевания [4]. Соответственно, актуальным является выбор наиболее информативных и чувствительных методов оценки донорского химеризма (ДХ) после аллоТГСК [2]. Несмотря на различия в протоколах, в основе всех методов исследования лежит алгоритм, включающий скрининг ДНК донора и реципиента перед трансплантацией, поиск генетических различий - информативных маркеров, анализ информативных меток после трансплантации для качественного и количественного определения ДХ.

Известен способ цитогенетического анализа для дифференциации между клетками донора и реципиента. При лейкозах и других гематологических нарушениях происходит хромосомная перегруппировка с потерей генетической информации (моносомии или делеции), поэтому цитогенетический анализ является важным аспектом в анализе химеризма. Эти хромосомные исследования в основном проводятся на клетках периферической крови и клетках костного мозга в метафазной стадии. Стандартный цитогенетический анализ G-диапазона обычно проводится при хроническом миелолейкозе для мониторинга наличия филадельфийских (Ph+) клеток. Однако в основном цитогенетический анализ используется при аллоТГСК, несовместимых по полу [6].

Известен способ определения аутологичного гематопоэза, основанный на фенотипировании эритроцитов. Возрастающий процент аутологичных эритроцитов и/или уменьшение количества эритроцитов донорного происхождения всегда коррелирует с рецидивом. Преимущества иммуногематологического метода очевидны: его можно проводить на образцах крови; анализ прост, точен и чувствителен; результат может быть получен в течение 24 часов [5]. Разработанные проточные цитометрические методы увеличили скорость и эффективность данного способа [3]. Методика основана на полном фенотипировании эритроцитов пациента и донора по антигенам А, В, С, с, Е, е, D, K, Fya, Fyb, Jka, Jkb, M, N, S и s. Недостатком метода является его не информативность в раннем посттрансплантационном периоде и субъективность оценки соотношения клеток донора и реципиента.

Известен способ мониторинга донорского химеризма методом амплификации высокополиморфных отрезков ДНК - тандемных повторяющихся блоков ДНК. Когда повторяющаяся последовательность составляет 15-50 нуклеотидов в длину, ее называют VNTR (variable number tandem repeats) или минисателлит, когда повторяющаяся последовательность составляет 2-6 нуклеотидов в длину - STR (short tandem repeats) или микросателлит. Генотипирование STR / VNTR не зависит от несовпадения HLA или несовпадения пола и может быть использовано сразу после трансплантации, когда для анализа доступно очень мало клеток [7]. Для генотипирования STR и VNTR были использованы три метода: типизация на основе зондов, типирование на основе ПЦР и мультиплексирование. К недостаткам метода можно отнести конкурентный характер ПЦР, особенно при проведении мультиплексной реакции. Кроме того, количество образующегося продукта ПЦР не эквивалентно начальной концентрации ДНК матрицы. Alizadeh и соавторы в 2002 году [1] предложили использовать ПЦР в реальном времени и показали, что количественный метод является лучшим для количественного донорского химеризма.

Наиболее близким к предполагаемому изобретению является способ, при котором для идентификации клеток донора и реципиента используют биаллельные InDel (инсерции-делеции) полиморфизмы, расположенные в кодирующих областях [1]. Основным фактором в выборе возможных маркеров является высокий уровень их гетерозиготности. В диагностической тест-системе используют прямые аллель-специфические праймеры. Несмотря на высокую чувствительность, у данного метода имеются ограничения в оценке количественных значений уровня донорского химеризма, что делает целесообразным его использование только при оценке остаточных популяций клеток реципиента.

Техническим результатом заявляемого изобретения является создание способа анализа донорского химеризма при исследовании однонуклеотидных полиморфизмов генов фолатного цикла (MTHFR: 677, MTHFR: 1298, MTR: 2756, MTRR: 66) в качестве информативных маркеров. Технология анализа точечных мутаций замены оснований позволяет выявить однонуклеотидные полиморфизмы (single nucleotide polymorphisms - SNPs) - транзиции или трансверсии в исследуемых генах. Транзиция подразумевает замену одного пуринового основания на другое (аденин и гуанин) или аналогичную замену пиримидиновых оснований (тимин и цитозин). При трансверсии пуриновое основание замещается на пиримидиновое основание или наоборот. Предлагаемый способ позволяет определить информативные маркеры, оценка которых лежит в основе мониторинга посттрансплантационного химеризма.

Для достижения указанного результата в соответствии с аналогом [1] осуществляют генетический скрининг пары донор/реципиент и определяют информативные аллели, дифференцирующие ДНК донора и реципиента. В отличие от прототипа, в основе которого находится исследование коротких тандемных повторов генетических систем S01-S11 (STR-PCR), в предлагаемом способе выполняется определение точечных мутаций замены оснований генов MTHFR: 677, MTHFR: 1298, MTR: 2756, MTRR: 66 методом ПЦР в режиме реального времени.

В процессе проведения патентно-информационного поиска не выявлено источников, порочащих новизну предполагаемого изобретения.

Заявляемое изобретение разработано в лаборатории иммуногематологии ФГБУН КНИИГиПК ФМБА России в соответствии с планом научно-исследовательской работы.

Способ осуществляется следующим образом:

1. Проводят типирование генов MTHFR: 677, MTHFR: 1298, MTR: 2756, MTRR: 66 у донора и реципиента. Представленные гены соответствуют следующим характеристикам:

Ген - MTHFR: 677; хромосомная локализация - 1р36.22; идентификатор - rs1801133; выявляемая мутация- замена основания цитозина на тимин в положении 677; исследуемые генотипы - С/С, С/Т, Т/Т.

Ген - MTHFR: 1298; хромосомная локализация - 1р36.22; идентификатор - rs1801131; выявляемая мутация- замена основания аденина на цитозин в позиции 1298; исследуемые генотипы - А/А, А/С, С/С.

Гена - MTR: 2756; хромосомная локализация - lq43; идентификатор - rs180508; выявляемая мутация- замена аденина на гуанин в позиции 2756; исследуемые генотипы А/А, A/G, G/G.

Ген - MTRR: 66; хромосомная локализация - 5р15.31; идентификатор - rs1801394; выявляемая мутация- замена аденина на гуанин в позиции 66; исследуемые генотипы - А/А, A/G, G/G.

Выделенные ДНК донора и реципиента вносят по 100 нг в пробирки, содержащие смеси для амплификации с флуоресцентными метками Fam и Hex для соответствующего варианта полиморфизма, ПЦР-буфер, Taq-полимеразу. Реакцию амплификации выполняют на детектирующем термоциклере по программе: 80°С - 2 мин, 94°С - 5 мин, 5 циклов - 94°С - 30 сек, 67°С - 10 сек; 45 циклов - 94°С - 5 сек, 67°С - 5 сек; 1 цикл - 25°С - 30 сек; 50 циклов - 25°С - 15 сек. Анализ кривых плавления позволяет идентифицировать аллели ДНК. Оба варианта искомой последовательности определяются в одной пробирке при одновременной гибридизации с двумя альтернативными типирующими зондами с различными флуорофорами.

2. Поиск информативных маркеров заключается d обнаружении различий генотипов донора и реципиента. Если аллель является позитивным для реципиента и негативным для донора или позитивным для донора и негативным для реципиента, он считается информативным. Построение калибровочной кривой в серии разведений ДНК донора в ДНК реципиента для информативных маркеров необходим для последующей оценки ДХ.

3. Мониторинг ДХ осуществляют на 28, 42, 56, 70, 100, 120 дни после аллоТГСК. Для определения процента донорского химеризма строят калибровочную кривую для выбранных информативных аллелей в серии разведений ДНК реципиента в ДНК донора (100, 10-1, 10-2, 10-4, 10-5), содержащих следующее отношения ДНК:

- 100% ДНК донора;

- 10% ДНК реципиента и 90% ДНК донора;

- 1% ДНК реципиента и 99% ДНК донора;

- 0,1% ДНК реципиента и 99,9% ДНК донора;

- 0,01% ДНК реципиента и 99,99% ДНК донора.

Количественную оценку химеризма выполняют по формуле: Химеризм, %=2-DDCt × 100%, где DDCt - разница между уровнями пороговой флуоресценции исследуемого маркера и референсного гена.

Ниже приводятся клинические примеры, подтверждающие возможность использования заявляемого способа при мониторинге донорского химеризма.

Пример 1.

Пациентка Т., 21 год с диагнозом: Острый миелобластный лейкоз, высокий риск, ремиссия 3. АллоТГСК от неродственного HLA-идентичного донора, подобранного в регистре потенциальных доноров ФГБУ РМНПЦ «Росплазма» ФМБА России, выполнена 22.03.2016. Выбран миелоаблативный режим кондиционирования. В таблице 1 представлены результаты типирования генов MTHFR: 677, MTHFR: 1298, MTR: 2756, MTRR: 66 у донора и реципиента. Информативными были признаны гены MTHFR: 677 и MTRR: 66, в которых у донора имелись аллельные специфичности, отсутствующие у реципиента. Калибровочная кривая в серии разведений ДНК донора в ДНК реципиента выстроена в соотношении 100, 10-1, 10-2, 10-4, 10-5. Исследование донорского химеризма выполнено через 30, 40, 60, 80, 180, 200, 360 дней после аллоТГСК. Донорский химеризм >95% установлен на 30 день. Донорский химеризм >99% определен с 40 дня и далее. Больная ведет полноценную жизнь хорошего качества. При обследовании через 1 год после трансплантации подтверждена полная ремиссия заболевания, донорский линейный и общий химеризм >99%, функция трансплантата удовлетворительная, отсутствуют признаки реакции «трансплантат против хозяина».

Пример 2.

Пациентка М., 38 лет. АллоТГСК с миелоаблативным режимом кондиционирования выполнена 20.03.2015 г. для консолидации ремиссии 3 острого миелобластного лейкоза. Донором явилась HLA-идентичная сестра больной (44 года). В таблице 2 представлены результаты типирования генов MTHFR: 677, MTHFR: 1298, MTR: 2756, MTRR: 66 у донора и реципиента. Информативным маркером явился ген MTHFR: 677, в котором у реципиента был определен аллель С, отсутствующий у донора. Построена калибровочная кривая в серии разведений ДНК донора и реципиента. Исследование гемопоэтического химеризма выполнено на 28, 65, 120 и 360 дни после аллоТГСК. Донорский химеризм >95% регистрировался в 30, 65 и 120 дни. При исследовании на 360 день генотип полностью соответствовал генотипу больной до трансплантации - донорский химеризм отсутствовал, произошло отторжение донорского кроветворения при сохранении полной клинико-гематологической ремиссии острого миелобластного лейкоза. Результат исследования подтвержден в референс лаборатории.

Список литературы

1. Alizadeh М., Bernard М., Danic В. et al. Quantitative assessment of hematopoietic chimerism after bone marrow transplantation by real-time quantitative polymerase chain reaction // Blood, 2002, 99: 4618-4625.

2. Antin J.H., Childs R., Filipovich A.H. et al. Establishment of complete and mixed donor chimerism after allogeneic lymphohematopoietic transplantation: Recommendations from a workshop at the 2001 tandem meetings of the international bone marrow transplant registry and the American society of blood and marrow transplantation // Biol Bone Marrow Transplant., 2001, 7(9): 473-485.

3. Hendriks E.C., de Man A.J., van Berkel Y.C. et al. Flow cytometric method for the routine follow-up of red cell populations after bone marrow transplantation // Br. J. Haematol., 1997, 97: 141-145.

4. Lion F., Watzinger S., Preuner H. et al. The EuroChimerism concept for a standardized approach to chimerism analysis after allogeneic stem cell transplantation // Leukemia, 2012, 26(8): 1821-1828.

5. Schaap N., Schattenberg A., Bar B. et al. Red blood cell phenotyping is a sensitive technique for monitoring chronic myeloid leukaemia patients after T-cell-depleted bone marrow transplantation and after donor leucocyte infusion // Br. J. Haematol., 2000, 108: 116-125.

6. Seong С.М., Giralt S., Kantarjian H. et al. Early detection of relapse by hypermetaphase fluorescence in situ hybridization after allogeneic bone marrow transplantation for chronic myeloid leukemia // J. Clin. Oncol., 2000, 18: 1831-1836.

7. Suttorp M., Schmitz N, Dreger P et al. Monitoring of chimerism after allogeneic bone marrow transplantation with unmanipulated marrow by use of DNA polymorphisms // Leukemia, 1993, 7: 679-687.

Способ анализа гемопоэтического химеризма при исследовании однонуклеотидных полиморфизмов генов фолатного цикла, включающий выделение образцов ДНК, осуществление генетического скрининга донора и реципиента, определение информативных маркеров донорского химеризма, мониторинг гемопоэтического химеризма после трансплантации аллогенных гемопоэтических стволовых клеток, отличающийся тем, что для анализа химеризма исследуют однонуклеотидные полиморфизмы генов MTHFR: 677, MTHFR: 1298, MTR: 2756, MTRR: 66, причем в качестве детектирующего метода выполняют полимеразную цепную реакцию в режиме реального времени, при этом определяют транзиции или трансверсии в исследуемых генах; наличие химеризма диагностируют при обнаружении у донора аллельных специфичностей, отсутствующих у реципиента, в одном или в нескольких указанных генах; отсутствие химеризма - при выявлении у реципиента аллелей, отсутствующих у донора.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к медицине, а именно к химико-фармацевтической промышленности, и касается способа оценки биологической активности тетрадекапептида, состоящего из 14 аминокислотных остатков, общей формулы TEKKRRETVEREKE (ТДП).

Изобретение относится к области медицины, в частности к гематологии, и предназначено для определения посттрансплантационного донорского химеризма при анализе точечных мутаций замены оснований в генах тромбофилии.

Изобретение относится к экологии, а именно к способу регулирования загрязнения окружающей среды в зоне техногенного воздействия горнометаллургических, горно-обогатительных комплексов.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к способам обнаружения молекулы-мишени в тест-образце, что может быть использовано в медицине. Описанные способы облегчают детекцию мишени, отличающейся от нуклеиновой кислоты (например, белка-мишени), в исследуемом образце путем детекции нуклеиновой кислоты (т.е., аптамера).

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к оценке терапевтической эффективности химиотерапии с использованием противоопухолевого средства, и может быть использовано в медицине.

Предложенная группа изобретений относится к области медицины. Предложены способы определения и выбора терапии для пациента и набор для определения, может ли пациент получать пользу от лечения с помощью антагониста VEGF.

Предложенная группа изобретений относится к области молекулярной биологии и медицины. Предложены способ и набор для специфической идентификации по меньшей мере одной последовательности ДНК в образце путем проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР), включающие одну пару праймеров, специфичных для этой последовательности ДНК, и пару зондов, в которой один представляет собой олигонуклеотидный мишень-специфичный зонд, имеющий 3'-сегмент, комплементарный идентифицируемому участку последовательности ДНК и содержащий метку, и 5'-сегмент, некомплементарный идентифицируемой последовательности ДНК и содержащий метку, а другой - олигонуклеотидный сигнальный зонд, комплементарный 5'-сегменту мишень-специфичного зонда и содержащий метку.

Изобретение относится к металлургии, в частности к области анализа и определения водорода в алюминиевых сплавах. Предложен способ определения содержания водорода в алюминиевых сплавах, включающий отбор расплава, его последующую кристаллизацию сразу в двух подогреваемых тиглях: один под атмосферным давлением, а другой под низким давлением, и измерение разности плотностей полученных слитков.

Изобретение относится к области измерений и может быть использовано для исследования теплофизических характеристик электроизоляционных материалов. Согласно предложенному способу определения температуры стеклования проводят серии испытаний вдавливанием индентора в поверхность испытуемого материала при плавно изменяющейся температуре.

Изобретение относится к области пищевой промышленности, в частности к кондитерской отрасли, и может быть использовано для контроля качества кондитерских изделий. Способ определения витамина B2 в кондитерских изделиях включает последовательное проведение кислотного и ферментного гидролиза пробы с последующей фильтрацией, фотолиз, флюориметрическое определение и обработку результатов, при этом перед фотолизом проводят концентрирование водной фазы, полученной после фильтрации, путем твердофазной экстракции.

Изобретение относится к области генетики и селекции сельскохозяйственных животных. Предложен способ проведения ПЦР-ПДРФ-анализа для генотипирования крупного рогатого скота по гену RPS3A.

Изобретение относится к области медицины, в частности к гематологии, и предназначено для определения посттрансплантационного донорского химеризма при анализе точечных мутаций замены оснований в генах тромбофилии.

Изобретение относится к клинической иммунологии и касается способа определения функциональной активности С3-конвертазы альтернативного пути активации системы комплемента (АПАК).

Группа изобретений относится к in vitro диагностике и определению эффективности лечения болезни Гоше. Способ in vitro для диагностики болезни Гоше у индивидуума включает выявление биомаркера в образце от индивидуума, определение уровня биомаркера, присутствующего в образце, и сравнение уровня биомаркера с пороговым уровнем.

Изобретение относится к медицине. Выделяют территорию с постоянным присутствием алюминия и устанавливают перечень наиболее вероятных негативных эффектов - нарушений здоровья у детей, ассоциированных с повышенной аэрогенной экспозицией алюминия.

Предложенная группа изобретений относится к области медицины. Предложены способы определения и выбора терапии для пациента и набор для определения, может ли пациент получать пользу от лечения с помощью антагониста VEGF.

Группа изобретений относится к медицине, а именно к гинекологии, и может быть использована для оценки кислотно-щелочного состояния женских половых органов. Для этого осуществляют введение влагалищного зеркала и рН-метрического зонда во влагалище.

Изобретение относится к области медицины, а именно к кардиологии, и касается способа определения вероятности наличия нестабильных атеросклеротических бляшек в коронарных артериях у пациентов с коронарным атеросклерозом.

Группа изобретений относится к медицине и биотехнологии, и может быть использована для проведения направленной эволюции белков. Для этого проводят (a) получение данных о последовательности и данных об активности для каждого из множества вариантов белков; (b) генерацию мультипликативной модели последовательность-активность по данным о последовательности и данным об активности, где модель последовательность-активность связывает аминокислоты варианта белка или нуклеотидов, кодирующих вариант белка, с активностью варианта белка, и мультипликативная модель последовательность-активность содержит: произведение множественных невзаимодействующих мультипликативных членов, причем каждый невзаимодействующий мультипликативный член содержит произведение независимой переменной и коэффициента, где: (i) независимая переменная представляет определенную аминокислоту варианта белка или определенный нуклеотид, кодирующий вариант белка, и (ii) коэффициент представляет вклад в активность варианта бека только определенной аминокислотой или определенным нуклеотидом (c) использование модели последовательность-активность для осуществления цикла направленной эволюции одного или нескольких вариантов белка.

Изобретение относится к области ветеринарии и предназначено для диагностики мутантного аллеля, вызывающего короткий позвоночник или брахиспину у крупного рогатого скота.

Изобретение относится к области генетики и селекции сельскохозяйственных животных. Предложен способ проведения ПЦР-ПДРФ-анализа для генотипирования крупного рогатого скота по гену RPS3A.

Изобретение относится к области медицины, в частности к трансплантологии, и предназначено для анализа гемопоэтического химеризма при исследовании однонуклеотидных полиморфизмов генов фолатного цикла. Анализ химеризма проводят методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени. Определяют транзиции или трансверсии в генах MTHFR: 677, MTHFR: 1298, MTR: 2756, MTRR: 66. Наличие химеризма диагностируют при обнаружении у донора аллельных специфичностей, отсутствующих у реципиента, в одном или в нескольких указанных генах; отсутствие химеризма - при выявлении у реципиента аллелей, отсутствующих у донора. Предлагаемый способ позволяет определить информативные маркеры, оценка которых лежит в основе мониторинга посттрансплантационного химеризма. 2 табл., 2 пр.

Наверх