Способ получения и аттестации стандартного образца антигена вируса клещевого энцефалита



Способ получения и аттестации стандартного образца антигена вируса клещевого энцефалита
Способ получения и аттестации стандартного образца антигена вируса клещевого энцефалита
Способ получения и аттестации стандартного образца антигена вируса клещевого энцефалита
Способ получения и аттестации стандартного образца антигена вируса клещевого энцефалита
Способ получения и аттестации стандартного образца антигена вируса клещевого энцефалита
Способ получения и аттестации стандартного образца антигена вируса клещевого энцефалита
Способ получения и аттестации стандартного образца антигена вируса клещевого энцефалита
G01N2400/02 - Исследование или анализ материалов путем определения их химических или физических свойств (разделение материалов вообще B01D,B01J,B03,B07; аппараты, полностью охватываемые каким-либо подклассом, см. в соответствующем подклассе, например B01L; измерение или испытание с помощью ферментов или микроорганизмов C12M,C12Q; исследование грунта основания на стройплощадке E02D 1/00;мониторинговые или диагностические устройства для оборудования для обработки выхлопных газов F01N 11/00; определение изменений влажности при компенсационных измерениях других переменных величин или для коррекции показаний приборов при изменении влажности, см. G01D или соответствующий подкласс, относящийся к измеряемой величине; испытание

Владельцы патента RU 2667957:

Акционерное общество "Научно-производственное объединение по медицинским иммунобиологическим препаратам "Микроген" (АО "НПО "Микроген") (RU)

Изобретение относится к области медицинской биотехнологии, а именно способу получения и аттестации стандартного образца гликопротеина Е вируса клещевого энцефалита. Для этого вирус клещевого энцефалита репродуцируют в культуре эукариотических клеток, а затем инактивируют формальдегидом. Далее проводят очистку и концентрирование вируса с помощью осаждения, фильтрации, тангенциальной ультрафильтрации, гель-хроматографии и повторной ультрафильтрации. Аттестацию полученного стандартного образца проводят с помощью определения концентрации общего белка спектрофотометрическим методом и относительной концентрации гликопротеина Е вируса клещевого энцефалита методом электрофореза в полиакриламидном геле. Расчет абсолютной концентрации гликопротеина Е в стандартном образце производят с учетом концентрации общего белка и относительной концентрации гликопротеина Е в пробе. Подлинность стандартного образца подтверждают методом иммуноблота. Изобретение обеспечивает определение количественного содержания гликопротеина Е в пробе и контроль специфической активности вируса клещевого энцефалита в вакцине клещевого энцефалита. 2 з.п. ф-лы, 3 табл., 5 ил., 1 пр.

 

Изобретение относится к области медицинской биотехнологии, производству и контролю вирусных вакцин и касается способа получения и аттестации стандартного образца (СО) гликопротеина Е (gpE) вируса клещевого энцефалита (ВКЭ). Изобретение может быть использовано для решения практических задач медицинской биотехнологии -аттестации стандартного образца предприятия (СОП) для контроля специфической активности вакцины и определения количественного содержания гликопротеина Е в полуфабрикатах и готовом препарате вакцины КЭ.

Определение содержания антигена ВКЭ в вакцинах проводится с помощью метода иммуноферментного анализа (ИФА). При этом для количественного определения вирусного антигена методом ИФА необходимо использовать аттестованный СОП вакцины клещевого энцефалита с известной концентрацией белка Е.

Из-за вариабельности антигенных свойств разных штаммов ВКЭ, проявляющейся в индивидуальных особенностях взаимодействия вирусных антигенов каждого штамма с панелями моноклональных антител, наиболее достоверным вариантом является использование для изготовления и аттестации СО, СОП производственного штамма вируса, использующегося при производстве вакцины.

Другая методологическая проблема состоит в том, что белки ВКЭ (и в первую очередь основной иммуноген - gpE) нестабильны и чувствительны к воздействию рН и протеаз. Срок их хранения в жидком виде ограничен, а при замораживании-оттаивании (в том числе лиофилизации) происходят изменения структуры, ведущие к снижению аффинности в иммунологических реакциях.

При аттестации контрольных образцов необходимо применять методы, отличные по физико-химическим принципам от тех, в которых эти образцы в дальнейшем будут выступать стандартами. Наиболее подходящими являются прямые физические методы, например, гравиметрический. Поскольку аттестуемый СОП вакцины будет в дальнейшем использоваться в ИФА и отсутствуют международные или отраслевые стандарты белка Е, то нельзя применять методы, основанные на феномене взаимодействия антиген-антитело, так как результат этих методов будет зависеть от свойств применяемых антител.

Учитывая, что количество gpE в материале для изготовления стандарта невелико, а его очистка сопряжена с опасностью изменений структуры, то оптимальным вариантом является выделение цельновирионной фракции из культуральной жидкости. В составе вирионов gpE наиболее стабилен и сохраняет антигенную активность и иммуногенность. Между тем в таком виде нельзя определить его концентрацию прямыми методами, так как он находится в смеси с другими вирионными белками, белками клеток-продуцентов и компонентами питательной среды.

В связи с этим, в целях аттестации СО нами предложено применять опосредованные вычисления. После определения концентрации общего белка в образце по методу Лоури или Несслера, с помощью электрофореза в полиакриамидном геле (ПААГ) устанавливают долю содержания gpE в образце. Зная два этих показателя, вычисляют абсолютную концентрацию gpE.

Стабильность такого стандартного образца (СО) вирусных белков ограничена. Из-за того, что СО вирусного антигена необходимо хранить в жидком виде, максимальный срок хранения составляет 1 месяц при температуре 2-8°С. Однако, этого времени достаточно для того, чтобы провести аттестацию лиофилизированного СОП вакцины КЭ.

Задачей, решаемой данным изобретением, является получение и аттестация стандартного образца гликопротеина Е вируса КЭ.

Поставленная задача решается следующим образом:

Для изготовления СО антигена ВКЭ используют производственный штамм ВКЭ 205, вирус репродуцируют в культуре первично-трипсинизированных фибробластов куриных эмбрионов. Полученную культуральную жидкость инактивируют формальдегидом, очищают с помощью осаждения протаминсульфатом, фильтрации. Затем концентрируют с помощью ультрафильтрации в тангенциальном потоке. Затем проводят тонкую очистку с помощью эксклюзионной хроматографии и финишное концентрирование с помощью центрифужных концентраторов.

Полученный концентрат СО антигена ВКЭ контролируют по следующим показателям:

- содержание общего белка;

- чистота высокомолекулярной фракции (ВЭЖХ);

- подлинность (идентификация электрофоретических полос, соответствующих gpE, в Western-blot);

- определение относительной концентрации gpE (электрофорез в ПААГ).

После этого расчетно определяют абсолютное содержание gpE в концентрате СО антигена ВКЭ, разводят до необходимой концентрации и упаковывают для хранения.

Новым в предлагаемом способе является использование комплекса методов очистки и характеризации гликопротеина Е в составе стандартного образца антигена вируса КЭ (электрофорез в ПААГ, Western-blot и определение концентрации общего белка), позволяющих напрямую рассчитать содержание основного иммуногена ВКЭ.

Пример 1.

В качестве материала для выделения антигена вируса КЭ использовали:

концентрат вирусной взвеси (с.57) объемом 1,10 л.

Основные показатели качества:

Общий белок 2,33 мг/мл

Антигенная активность 31,96 мкг/мл

Овальбумин 0,080 мкг/мл (80,38 нг/мл)

Концентрат был получен после инактивации, осветляющей фильтрации и концентрирования методом ультрафильтрации в тангенциальном потоке.

Хроматографическая очистка проводилась эксклюзионной хроматографией с использованием хроматографа АКТА Explorer 100 (Amersham bioscience, Sweden), колонны XK-50-70 (GE Healthcare, Sweden), Sepharose 6FF (GE HealthCare, Sweden), 0,05 M фосфатный буферный раствор, рН 7,5-7,7 (Фиг. 1).

Контроль чистоты цельновирионной фракции проводили с помощью ВЭЖХ (колонна ProteinPac 300 SW).

Контроль концентрации общего белка проводили по методу Лоури.

Контроль антигенной активности проводили в ИФА с помощью коммерческой тест-системы.

Условия хроматографии:

Скорость потока: 25,0 мл/мин
Предел давления в системе: 0,3 МПа
Промывка колонны: 8,0 мл элюирущего раствора.
Объем образца: 160-180 мл.
Объем элюции: 1600,0 мл.
Параметры контроля: скорость потока и поглощение UV-280 нм
Продолжительность одного цикла: около 90,0 минут

Анализ методом ВЭЖХ показал, что содержание высокомолекулярной фракции в осветленном концентрате вирусной взвеси составило 9,3%, в очищенном концентрате - 98,8% (Фиг. 2).

Концентрирование антигена ВКЭ проводили с помощью центрифуги Thermo Multifuge 4KR (ThermoScientific, USA; Heraeus, Germany) с баккет-ротором, центрифужных концентраторов MilliporeAmicon Ultra-15 с порогом отсечения 10,0 кДа (Millipore, France).

В каждый концентратор вносили 15 мл очищенного концентрат. Центрифугировали при 4000g, 15°С в течение 20-40,0 мин до объема 1,0 мл раствора в каждом концентраторе. После остановки центрифуги удаляли пермеат и доливали очищенный концентрат. Затем повторяли процесс.

Контроль концентрации общего белка проводили по методу Лоури.

Контроль антигенной активности проводили в ИФА.

В процессе концентрирования всего было получено 30,0 мл центрифужного концентрата и около 1,1 л пермеата. Таким образом, было проведено концентрирование по объему в 37,2 раза (табл. 1).

В ходе аттестации СО антигена ВКЭ проводили контроль концентрации общего белка по методу Лоури без осаждения (ГФ XII, ч. 2). В качестве стандарта использовали ОСО ФГБУ ГНЦ МЗ РФ с содержанием альбумина 10,1%. Измерение ОП растворов проводили на спектрофотометрах Shimazu 1800-UV и при длине волны 750 нм. Расчет концентраций белка в контрольном и исследуемом образцах осуществляли по калибровочной кривой.

Было проведено 5 серий исследований центрифужного концентрата. Среднее значение содержания общего белка составило 1,65 мг/мл.

Определение относительного содержания gpE в СО проводили с помощью электрофореза в полиакриламидном геле, подтверждение подлинности gpE на электрофореграмме проводили с помощью Western-blot (Фиг. 3).

Для анализа использовали маркеры молекулярных масс Spectra Multicolor High Rang Protein Ladder 315-42 кДа и Unstained Protein WW Marker 116-14,4 кДа (ThermoFisher), Coomassi blue, Диаминобензидин («Sigma»), ECL detection reagent (Amersham), пленка Hyperfilm ECL (Amersham), PVDF-мембрану, первичные мышиные моноклональные антитела к белку Е линии 14D51 (ЗАО «Биосан»), вторичные моноклональные антитела к мышиным IgG, коньюгированные с пероксидазой хрена, камеру для электрофореза mini-protean 3 (BIO-RAD), камеру для полусухого переноса (BIO-RAD). Всего было проведено 11 серий исследований.

33 электрофорезные дорожки были подвергнуты денситометрии (Фиг. 4).

По денситограммам были определены молекулярные массы выявленных белков и их относительные концентрации (доля в суммарной площади пиков).

По электрофоретической подвижности можно идентифицировать сывороточный альбумин человека (66 кДа), гликопротеин Е вируса КЭ (53,68 кДа - полипептид, 55 кДа -гликозилированная форма), капсидный белок С ВКЭ (12,1 кДа) и мембранный белок М ВКЭ (8,2 кДа). Остальные полосы на электрофорезе соответствуют различным белкам субстратных клеток и компонентов питательной среды.

В проведенных исследованиях подвижность gpE варьировала от 52,72 до 56,03 кДа (средняя 54,17 кДа, табл. 2), что согласуется с литературными данными (Фиг. 4).

Принадлежность белка с электрофоретической подвижностью, соответствующей 54,17 кДа к gpE ВКЭ была подтверждена специфической реакцией с моноклональными антителами против gpE ВКЭ в Western-blot (Фиг. 5).

Относительную концентрацию целевого белка (gpE) вычисляли, как долю площади пика среди общей площади денситограммы. Она составляла от 18,6 до 32,4% (табл. 2). Однако два результата были исключены из дальнейшей обработки, так как отклонение их значений от среднего арифметического было больше двух стандартных отклонений (табл. 2, №14, 15 помечено серым).

Таким образом, после исключения двух наблюдений, доля пика денситограммы, соответствующего gpE ВКЭ (относительная концентрация) составила 28,18±2,06%.

Расчет концентрации gpE вируса КЭ в центрифужном концентрате проводили по формуле:

CgpE=Ctotal*Pband/l 00%,

где

CgpE - концентрация gpE ВКЭ в пробе

Ctotal - концентрация общего белка в пробе

Pband - доля площади пика gpE ВКЭ (относительная концентрация)

CgpE=l.65 г/л*28.18%/100%=0.465 г/л

Расчет стандартного отклонения среднего концентрации gpE проводили по формуле:

σCgpE=CgpE*SQRT((σCtotal/Ctotal)2+(σPband/Pband)2),

где

CgpE - концентрация gpE ВКЭ в пробе

Ctotal - концентрация общего белка в пробе

Pband - доля площади пика gpE ВКЭ (относительная концентрация)

σ - стандартные отклонения соответствующих величин

σCgpE=0,465*SQRT((0,13/1,65)2+(2,06/28,18)2)=0,050

Таким образом, количественное содержание gpE ВКЭ в центрифужном концентрате составила 0.465±0,050 г/л.

Для приготовления стандартного образца антигена ВКЭ разводили центрифужный концентрат в стабилизирующем растворе в 8,4 раза. Получили СО антигена вируса КЭ (стандарт 1 уровня), содержащий 55,36±5,95 мкг/мл gpE ВКЭ. Полученный стандартный образец разлили в пластиковые пробирки с завинчивающимися крышками по 1 мл.

Стабильность СО в течение 1 месяца хранения при температуре 2-8°С

1. Способ получения и аттестации стандартного образца гликопротеина Е вируса клещевого энцефалита, включающий накопление вируса клещевого энцефалита в культуре эукариотических клеток, инактивацию вируса формальдегидом, очистку и концентрирование вируса с помощью осаждения, фильтрации, тангенциальной ультрафильтрации, гельхроматографии и повторной ультрафильтрации, последующей аттестации полученного стандартного образца с помощью определения концентрации общего белка спектрофотометрическим методом, относительной концентрации гликопротеина Е вируса клещевого энцефалита методом электрофореза в полиакриламидном геле, расчет абсолютной концентрации гликопротеина Е в стандартном образце, исходя из относительной концентрации гликопротеина Е и концентрации общего белка.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что определение подлинности стандартного образца проводят методом иммуноблота с моноклональными антителами против гликопротеина Е вируса клещевого энцефалита.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что для получения стандартного образца используется тот же производственный штамм вируса клещевого энцефалита, что и для производства вакцины.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области молекулярной биологии, медицины и онкологии. Предложена аналитическая тест-система для определения чувствительности злокачественной опухоли конкретного пациента к онколитической биотерапии на основе мультиплексной ПЦР в режиме реального времени, включающая в себя список генов-маркеров CD74, CFI, CSF3, DNAJC24, FGF5, HCFC2, ИСК, IL15, IL1RAPL2, IL8, ITGA7, LEPR, MAP3K13, MAPKAPK3, MDK, PDGFRA, PDIK1L, PIK3CA, S100PBP, SCARB2, STK4, ТМЕМ54, TNFAIP6, TNFRSF1B, TRAF4 и тканеспецифичных референсных генов-хаускиперов GAPDH, АСТВ, RPN1, GUSB, инструкцию, планшеты для проведения ПЦР и смесь для амплификации.

Изобретение относится к ветеринарии и может быть использовано для диагностики хронического дегенеративного заболевания клапанов сердца у животного семейства псовых.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к детектирующему агенту для обнаружения антитела, специфического к HCV-ядерному белку, причем указанный детектирующий агент может специфически связываться с указанным антителом, специфическим к HCV-ядерному белку.

Изобретение относится к области медицины, в частности к трансплантологии, и предназначено для анализа гемопоэтического химеризма при исследовании однонуклеотидных полиморфизмов генов фолатного цикла.

Изобретение относится к медицине, а именно к химико-фармацевтической промышленности, и касается способа оценки биологической активности тетрадекапептида, состоящего из 14 аминокислотных остатков, общей формулы TEKKRRETVEREKE (ТДП).

Изобретение относится к области медицины, в частности к гематологии, и предназначено для определения посттрансплантационного донорского химеризма при анализе точечных мутаций замены оснований в генах тромбофилии.

Изобретение относится к экологии, а именно к способу регулирования загрязнения окружающей среды в зоне техногенного воздействия горнометаллургических, горно-обогатительных комплексов.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к способам обнаружения молекулы-мишени в тест-образце, что может быть использовано в медицине. Описанные способы облегчают детекцию мишени, отличающейся от нуклеиновой кислоты (например, белка-мишени), в исследуемом образце путем детекции нуклеиновой кислоты (т.е., аптамера).

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к оценке терапевтической эффективности химиотерапии с использованием противоопухолевого средства, и может быть использовано в медицине.

Предложенная группа изобретений относится к области медицины. Предложены способы определения и выбора терапии для пациента и набор для определения, может ли пациент получать пользу от лечения с помощью антагониста VEGF.

Изобретение относится к медицине и касается способа оценки агрегационной способности эритроцитов. Способ включает выделение эритроцитов из крови и регистрацию их агрегационной способности, где в качестве индуктора агрегации используют трихлорид железа, при этом эритроциты помещают в кювету агрегометра, добавляют трихлорид железа в финальной концентрации 200-400 мкМ и регистрируют степень агрегации фотометрическим методом.

Изобретение относится к области медицины, а именно к профилактической медицине. Способ прогнозирования значений относительной концентрации гамма-глутамилтрансферазы в сыворотке крови через 4-5 лет у стажированных работающих в условиях экспозиции винилхлоридом без признаков патологии заключается в том, что определяют уровень гамма-глутамилтрансферазы, альбумина и относительного содержания липопротеидов высокой плотности, рассчитывают прогнозируемое значение относительного содержания концентрации гамма-глутамилтрансферазы в сыворотке крови по формуле: У=620,9241+0,5718×ГГТ1-16,832×АЛЬБ1-05181×ЛПВП1+0,1195×АЛЬБ12, где У - прогнозируемое значение относительной концентрации ГГТ в сыворотке крови, 620,9241 - константа; 0,5718; -16,832; -0,5181; 0,1195 - коэффициенты предикторов; ГГТ1 - уровень гамма-глутамилтрансферазы на момент обследования (Е/мл); АЛЬБ1 - содержание альбумина в сыворотке крови на момент обследования (%), ЛПВП1 - содержание липопротеидов высокой плотности в сыворотке крови на момент обследования (%).

Группа изобретений относится к области медицины и медицинской техники. Офтальмологическое устройство содержит: источник энергии; источник света; биомаркерный датчик, выполненный с возможностью обнаруживать изменения в биомолекулах слезной жидкости и генерировать сигналы; а также процессор, находящийся в логической связи с биомаркерным датчиком, выполненный с возможностью получения и обработки данных сигналов и преобразования их в выходные данные.
Изобретение относится к лабораторной диагностике, в частности к способам определения контактного пути коагуляции плазмы крови человека. Скрининг-тест определения контактного пути коагуляции включает смешивание цитратной плазмы крови с хлоридом кальция и последующую фотометрическую регистрацию свертывания.

Изобретение относится к области аналитической химии, а именно анализу фармацевтических препаратов, и может быть использовано для количественного определения содержания биорегуляторных пептидов в суппозиториях на основе полиэтиленгликоля (ПЭГ).
Изобретение относится к медицине, а именно к диагностике дисахаридазной недостаточности. Для этого способ включает исследование мембранных ферментов, ответственных за переваривание лактозы, мальтозы, крахмала и сахара в ткани кишки.

Изобретение относится к области медицины и раскрывает способ определения активности перекисного окисления липидов в ногтевых пластинках живых людей. Способ включает механическое измельчение состриженных ногтевых пластинок живых людей, экстракцию раствором, содержащим фосфатный буфер (pH 7,4) и 96° этиловый спирт в соотношении 5:1 соответственно, диализ смеси, проведение хемилюминесцентного анализа получаемого экстракта, при котором определяют интенсивность быстрой вспышки (Ф max, отн.
Изобретение относится к экспериментальной медицине и касается определения риска летальности при гнойно-септических инфекциях. Для этого проводят заражение кроликов путем подкожного введения взвеси бактерий P.

Изобретение относится к медицине и предназначено для определения исхода острого деструктивного панкреатита (ОДП). У больных с ОДП в первые сутки после постановки диагноза в нейтрофилах венозной крови больных с помощью биолюминесцентного метода определяют активности НАДФ- и НАДФН-зависимой глутаматдегидрогеназы, после чего рассчитывают соотношение активностей дегидрогеназ.

Группа изобретений относится к биотехнологии и медицине. Предложены композиция, набор и способ для обнаружения присутствия биопленки в жизнеспособных тканях.

Изобретение относится к области молекулярной биологии, медицины и онкологии. Предложена аналитическая тест-система для определения чувствительности злокачественной опухоли конкретного пациента к онколитической биотерапии на основе мультиплексной ПЦР в режиме реального времени, включающая в себя список генов-маркеров CD74, CFI, CSF3, DNAJC24, FGF5, HCFC2, ИСК, IL15, IL1RAPL2, IL8, ITGA7, LEPR, MAP3K13, MAPKAPK3, MDK, PDGFRA, PDIK1L, PIK3CA, S100PBP, SCARB2, STK4, ТМЕМ54, TNFAIP6, TNFRSF1B, TRAF4 и тканеспецифичных референсных генов-хаускиперов GAPDH, АСТВ, RPN1, GUSB, инструкцию, планшеты для проведения ПЦР и смесь для амплификации.

Изобретение относится к области медицинской биотехнологии, а именно способу получения и аттестации стандартного образца гликопротеина Е вируса клещевого энцефалита. Для этого вирус клещевого энцефалита репродуцируют в культуре эукариотических клеток, а затем инактивируют формальдегидом. Далее проводят очистку и концентрирование вируса с помощью осаждения, фильтрации, тангенциальной ультрафильтрации, гель-хроматографии и повторной ультрафильтрации. Аттестацию полученного стандартного образца проводят с помощью определения концентрации общего белка спектрофотометрическим методом и относительной концентрации гликопротеина Е вируса клещевого энцефалита методом электрофореза в полиакриламидном геле. Расчет абсолютной концентрации гликопротеина Е в стандартном образце производят с учетом концентрации общего белка и относительной концентрации гликопротеина Е в пробе. Подлинность стандартного образца подтверждают методом иммуноблота. Изобретение обеспечивает определение количественного содержания гликопротеина Е в пробе и контроль специфической активности вируса клещевого энцефалита в вакцине клещевого энцефалита. 2 з.п. ф-лы, 3 табл., 5 ил., 1 пр.

Наверх