Модифицированный молозивный белок и его применение
Изобретение относится к области биохимии и биотехнологии, в частности к модифицированному молозивному белку. Указанный белок применяется для повышения иммунной реакции у животного и имеет аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO.: 1. Настоящий белок отличается от молозивного белка дикого типа тем, что аминокислотные остатки Ile в положении 33, Glu в положении 101 и Arg в положении 175 заменены на Ala, Cys и Cys соответственно. Настоящее изобретение также относится к животному корму, содержащему указанный модифицированный молозивный белок, и к применению указанного белка для получения корма для повышения иммунной реакции у животного. Настоящее изобретение позволяет получать животный корм, вызывающий повышение иммунной реакции у животного. 6 н. и 2 з.п. ф-лы, 8 ил., 3 табл.
ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0001] Данное изобретение относится к молозивному белку и, в частности, к модифицированному молозивному белку.
ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0002] Животноводческое хозяйство играет важную роль в сельскохозяйственном производстве, при этом основную причину низкого воспроизводства свиней связывают с высоким процентом их смертности. Обычно полагают, что облигатный возбудитель является основной причиной заболеваний среди свиней, где заболевания с высоким уровнем смертности составляют подавляющее большинство болезней свиней. Однако, согласно результату серологического исследования, проведенного в Институте ветеринарной патобиологии при Национальном университете Чан Син (graduate institute of veterinary pathobiology at National Chung Hsing University), отсутствует выраженная вспышка заболеваний, вызванных облигатными возбудителями, например, чума свиней или инфекционный бульбарный паралич свиней. Некоторые болезни у свиней, вызванные инфекцией с одним типом возбудителя среди патогенных микроорганизмов с относительно низкой патогенностью (например, микоплазма, стеурелла и сальмонелла), не являются серьезными. Однако, если свиней с низким иммунитетом в первую очередь и во вторую очередь заражают комплексом патогенов с относительно низкой патогенностью, синергические воздействия болезней вызовут смерть свиней. Таким образом, патогенные микроорганизмы с низкой патогенностью оказывают существенное влияние на стада с малым количеством свиней.
[0003] Молозиво является формой молока, выделяемого самками млекопитающих в первые 2-3 дня после родов, и молоко, выделяемое после выделения молозива, представляет собой переходное молоко и зрелое молоко. Молозиво содержит пять типов иммуноглобулинов, которые являются IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, в котором содержание IgG является самым высоким. Эти иммуноглобулины имеют решающее значение для защиты от вирусной инфекции, бактериальной инфекции, паразитов и дрожжей.
[0004] Однако, полезные ингредиенты в молозиве крайне редко выделяются эффективно и применяются, за исключением лактоферрина, который очищают от молозива и используют, и культивируют в трансгенных животных. Кроме того, из-за таких факторов, как, например, короткий период времени выделения молозива, нестабильный белок в молозиве и затрудненность сбора и сохранения молозива, существует еще много трудностей в практическом применении молозива даже несмотря на то, что имеются многочисленные преимущества молозива.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0005] Таким образом, целью данного изобретения является создание модифицированного молозивного белка улучшенной стабильности in vitro, что может понизить процент смертности у животных (например, свиней).
[0006] Технические средства, использованные в настоящем изобретении для преодоления недостатков известного уровня техники, состоят в том, что обеспечен модифицированный молозивный белок, который генерируется путем замены Ile в позиции 33, Glu в положении 101 и Arg в позиции 175, присутствующих в аминокислотной последовательности молозивного белка дикого типа, приведенного в SEQ ID: 2, соответственно, на Ala, Cys и Cys.
[0007] В одном из вариантов реализации настоящего изобретения предлагается ДНК, кодирующая аминокислотную последовательность модифицированного молозивного белка, упомянутого выше, и ДНК имеет нуклеотидную последовательность, приведенную в SEQ ID: 3.
[0008] В одном из вариантов реализации настоящего изобретения предлагается лекарственная форма для перорального применения, включающая упомянутый выше модифицированный молозивный белок.
[0009] В одном из вариантов реализации настоящего изобретения предлагается состав животного корма, включающий упомянутый выше модифицированный молозивный белок.
[0010] В одном из вариантов реализации настоящего изобретения предлагается состав животного корма, в котором модифицированный молозивный белок присутствует в составе животного корма в диапазоне от 0,01 вес. % до 0,02 вес. %.
[0011] В одном из вариантов реализации настоящего изобретения предлагается фармацевтическая композиция, включающая носитель лекарственного средства и вакцинный адъювант и упомянутый выше модифицированный молозивный белок.
[0012] В одном из вариантов реализации настоящего изобретения предлагается применение упомянутого выше модифицированного молозивного белка для получения корма для повышения иммунного ответа у животного.
[0013] В одном из вариантов реализации настоящего изобретения предлагается применение, в котором иммунный ответ у животного повышается при увеличении продуцирования иммуноглобулина A (IgA) животного.
[0014] В одном из вариантов реализации настоящего изобретения предлагается применение упомянутого выше модифицированного молозивного белка для получения корма, который дается животному.
[0015] В одном из вариантов реализации настоящего изобретения предлагается применение упомянутого выше модифицированного молозивного белка для получения фармацевтической композиции, которую вводят животному.
[0016] В одном из вариантов реализации настоящего изобретения предлагается применение упомянутого выше модифицированного молозивного белка для получения корма для профилактики или лечения птичьего гриппа.
[0017] В одном из вариантов реализации настоящего изобретения предлагается применение упомянутого выше модифицированного молозивного белка для получения фармацевтической композиции для профилактики или лечения птичьего гриппа.
[0018] В одном из вариантов реализации настоящего изобретения предлагается применение упомянутого выше модифицированного молозивного белка для получения фармацевтической композиции для профилактики или лечения гриппа у человека.
[0019] В одном из вариантов реализации настоящего изобретения предлагается применение упомянутого выше модифицированного молозивного белка для получения фармацевтической композиции для профилактики или лечения репродуктивно-респираторного синдрома свиней (PRRS) (porcine reproductive and respiratory syndrome).
[0020] В одном из вариантов реализации настоящего изобретения предлагается применение модифицированного молозивного белка по п. 1 для получения фармацевтической композиции для профилактики или лечения заболевания, которое может вызвать мукозный иммунный ответ.
[0021] За счет технологии по настоящему изобретению третичная структура модифицированного молозивного белка, представленная в данном изобретении, является более стабильной по сравнению с третичной структурой молозивного белка дикого типа. Кроме того, смесь модифицированного молозивного белка и корма может увеличить продуцирование иммуноглобулина IgA у свиней после того, как ею кормили свиней, и тем самым в дальнейшем способствовала предотвращению инфицирования свиней некоторыми патогенными микроорганизмами.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
[0022]
На Фиг. 1 показан разделенный молозивный белок, связанный с бактериальной мембраной;
на Фиг. 2 показана молозивная сыворотка от свиней, содержащая PGRP;
Фиг. 3 иллюстрирует белок распознавания патологии у свиней, экспрессированный в системе экспрессии дрожжей;
на Фиг. 4 изображена диаграмма в виде ломаной линии, иллюстрирующая модифицированный молозивный белок в соответствии с одним из вариантов реализации настоящего изобретения и молозивный белок дикого типа, процессированный прибавлением 50 мкг/мл циклогексимида в питательную среду;
на Фиг. 5 показан результат вестерн-блоттинга модифицированного молозивного белка в соответствии с одним из вариантов реализации настоящего изобретения;
на Фиг. 6 показаны данные исследования с помощью электронной микроскопии модифицированного молозивного белка в соответствии с одним из вариантов реализации настоящего изобретения, смешанного с Escherichia coli (кишечной палочкой);
на Фиг. 7 изображена диаграмма в виде ломаной линии, иллюстрирующая бактериальную популяцию у мышей после того, как мышам с помощью принудительного кормления ввели предлагаемый модифицированный молозивный белок;
на Фиг. 8 показано иммуногистохимическое окрашивание кишечника мыши после введения мыши модифицированного молозивного белка.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНЫХ ВАРИАНТОВ РЕАЛИЗАЦИИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0023] Ниже приводится описание предпочтительных вариантов осуществления настоящего изобретения со ссылкой на фиг. 1 - фиг. 8. Описание является только разъяснением предпочтительных вариантов реализации данного изобретения и не является ограничением для его осуществления.
[0024] Согласно одному из вариантов осуществления настоящего изобретения модифицированный молозивный белок имеет аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID: 1, которая образуется путем замены Ile в положении 33, Glu в положении 101 и Arg в положении 175, присутствующих в аминокислотной последовательности молозивного белка дикого типа, приведенного в SEQ ID: 2, соответственно, на Ala, Cys и Cys. Аминокислотная последовательность модифицированного молозивного белка кодируется ДНК с нуклеотидной последовательностью, приведенной в SEQ ID: 3.
[0025] В частности, модифицированный молозивный белок, описанный в настоящем изобретении, получают путем очистки белка, связанного с пептидогликановым слоем в клеточной оболочке бактерии, и изменением (модифицированием) его нуклеотидной последовательности, и модифицированный молозивный белок называется белком распознавания патологии (Pathological Recognition Protein, PRP) в соответствии с его свойством.
[0026] Кроме того, модифицированный молозивный белок можно приготовить в виде лекарственной формы для перорального применения, например, твердая пероральная лекарственная форма, полутвердая пероральная лекарственная форма или жидкая пероральная лекарственная форма. В частности, твердая пероральная лекарственная форма может быть в виде таблетки, множества обособленных частиц, порошка или капсулы.
[0027] Кроме того, состав корма для животного можно изготовить путем объединения модифицированного молозивного белка, описанного в настоящем изобретении, с кормом для животных, где состав корма для животных включает от 0,01 вес. % до 0,02 вес. % модифицированного молозивного белка. Конечно, настоящее изобретение этим не ограничивается. В других вариантах осуществления изобретения процентное содержание модифицированного молозивного белка в составе корма для животных может отличаться в зависимости от различных ситуаций.
[0028] Кроме того, модифицированный молозивный белок, описанный в настоящем изобретении, может применяться для приготовления корма для повышения иммунной реакции у животного, где иммунная реакция у животного повышается за счет увеличения продуцирования иммуноглобулина A (IgA) животного. В частности, животное может быть млекопитающим, например, свиньей или коровой.
[0029] Помимо того, модифицированный молозивный белок, описанный в настоящем изобретении, может применяться для получения фармацевтической композиции, которая предназначена для введения животному, при этом фармацевтическая композиция содержит лекарственное средство для профилактики заболевания, носитель лекарственного средства и вакцинный адъювант.
[0030] Также модифицированный молозивный белок, описанный в настоящем изобретении, может применяться для получения фармацевтической композиции для профилактики или лечения птичьего гриппа.
[0031] Кроме того, модифицированный молозивный белок, описанный в настоящем изобретении, может применяться для получения фармацевтической композиции для профилактики или лечения гриппа человека.
[0032] Также модифицированный молозивный белок, описанный в настоящем изобретении, может применяться для получения фармацевтической композиции для профилактики или лечения репродуктивно-респираторного синдрома свиней (PRRS).
[0033] Кроме того, модифицированный молозивный белок, описанный в настоящем изобретении, может применяться для получения фармацевтической композиции для профилактики или лечения заболевания, которое может вызвать мукозный иммунный ответ.
[0034] Как правило, в данном варианте реализации изобретения, свиное молозиво используется в качестве образца, который анализируется с помощью метода электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE) для того, чтобы очистить молозивные белки в свином молозиве, связанных с пептидогликановым слоем в клеточных оболочках бактерий. В других вариантах реализации изобретения молозиво от других млекопитающих может также приниматься в качестве образца для анализа, например, коровье молозиво. Далее, подлинность и свойства пептидогликан-связанных белков определяются с помощью анализа LC/MS/MS и компаративного генетического исследования, и пептидогликан-связанный белок называется белком распознавания патологии (Pathological Recognition Protein, PRP). После того, как получена аминокислотная последовательность PRP, клонированный ген белка распознавания патологии у свиней вставляется в вектор pYES2.1V5-His ТОРО, и затем вектор pYES2.1V5-His ТОРО, содержащий клонированный ген белка распознавания патологии у свиней, применяют для преобразования дрожжевых клеток. Активность PRP определяется при помощи следующих процессов: оценки уровня экспрессии PRP in vitro; ферментационного теста; анализа бактериальной флоры кишечника после принудительного кормления мыши; теста ингибирования Escherichia coli и Salmonella, и т.д..
[0035] Очистка белка
[0036] Получение частиц грамположительной энхансерной матрицы (Gram-Positive Enhancer Matrix, GEM): введение жидкости лактококк лактис (Lactococcus lactis) в асептических условиях; инокулирование жидкости лактококк лактис в бульоне DifcoTM Lactobacilli MRS в качестве питательной среды; отбор бактериальной колонии; выбор одного отдельного бактериального штамма и инокулирование его в 25 мл MRS бульона; проведение культивирования при анаэробном условии в течение 18 часов при 37°C; расщепление и перенос культуральной среды, содержащей штамм, в 50 мл центрифужные пробирки; центрифугирование центрифужных пробирок при 13000 xg в течение 10 минут; удаление супернатанта и суспендирование скоплений бактерий с половиной первоначального объема бактериальной жидкости ddH2O; центрифугирование центрифужных пробирок при 13000 xg в течение 10 минут и удаление супернатанта; прибавление одной пятой первоначального объема бактериальной жидкости кислого раствора (0,6 М ТСА, рН=1); освобождение крышек и нагревание центрифужных пробирок на водяной бане 30 минут; центрифугирование центрифужных пробирок при 13000 xg 10 минут, удаление супернатанта и суспендирование скоплений бактерий с использованием половины первоначального объема PBS; повторение последней стадии три раза и центрифугирование центрифужных пробирок при 13000 xg в течение 10 минут; удаление супернатанта; повторное растворение скоплений бактерий с одной десятой частью первоначального объема бактериальной жидкости PBS; подсчет количества GEM частиц на миллиметр с использованием цитометра и, наконец, сохранение частиц при -80°С для использования в будущем.
[0037] Получение молочной сыворотки:
распределение полученного молозива в 50 мл центрифужные пробирки; центрифугирование центрифужных пробирок 30 минут при 10000 xg при 37°С и затем забор и перенос подслоя молозива в другую 50 мл центрифужную пробирку; прибавление 100% уксусной кислоты, доводя концентрацию уксусной кислоты до 1%; выдерживание образцов в термостате при 37°С в течение 10 минут, где можно осуществить подкисление; прибавление 1 М ацетата, составляющего одну десятую часть объема после подкисления, для нейтрализации молозива; и, наконец, отсасывание пипеткой супернатанта после 10 минутного центрифугирования при 10000 xg при 4°С, где извлеченный супернатант представляет собой молочную сыворотку. Методом Бредфорда проводят количественный анализ полученной молочной сыворотки, которая хранится при -20°С для использования в будущем.
[0038] Ассоциация (связывание) GEM частиц и молочной сыворотки: смешивание 100 мкл GEM частиц и приблизительно 7 мг молочной сыворотки; смесь помещают на прибор, совершающий возвратно-поступательные движения, для выполнения качаний в течение 30 минут при комнатной температуре; центрифугирование смеси в течение 10 минут при 13000 xg; удаление супернатанта; суспендирование осадка с 1 мл буфера PBS и центрифугирование при 13000 xg в течение 10 минут; повторение последней стадии три раза и суспендирование снова с 1 мл элюирующего буфера (содержащего 1 М NaCl); проведение центрифугирования при 13000 xg в течение 10 минут, удаление супернатанта и повторное растворение осадка в 20 мкл буфера PBS; перемешивание образца до однородного состояния с образцом буфера, объем которого в два раза больше объема образца; нагревание в бане сухого нагрева при 95°С в течение 10 минут; проведение центрифугирования при 13000 xg в течение 10 минут; отсасывание пипеткой супернатанта и проведение анализа супернатанта методом гель-электрофореза белков.
[0039] Иммунизация мыши:
перемешивание 2,2×109 GEM частиц до однородного состояния с приблизительно 25 мг молозивной сыворотки и встряхивание смеси; удаление супернатанта после проведения центрифугирования при 13000 xg в течение 10 минут; суспендирование осадка в 1 мл буфера PBS и проведение центрифугирования при 13000 xg в течение 10 минут; повторение последней стадии три раза; суспендирование осадка с 1 мл раствора NaCl и проведение центрифугирования при 13000 xg в течение 10 минут; удаление супернатанта и повторное растворение осадка в 50 мкл буфера PBS; прибавление буфера для белкового образца в объеме в два раза большем первоначального объема и перемешивание до однородного состояния буфера для образца с образцом; нагревание при 95°С в бане сухого нагрева в течение 10 минут; проведение центрифугирования при 13000 xg в течение 10 минут; отсасывание пипеткой и количественное определение верхнего слоя с буфером PBS вплоть до 100 мкл; прибавление полного адъюванта Фрейнда того же объема; смешивание качанием при 4°С в течение 12 часов и смесь применяют для первичной иммунизирующей инъекции. Впоследствии полный адъювант Фрейнда используют для эмульгирования антигенного белка. В тесте иммунизации с инъекцией антигенов, являющихся вакцинаторами, цикл иммунизации составляет три недели. В течение первой недели белковые антигены, смешанные с полным адъювантом Фрейнда, используются для абдоминальной иммунизирующей инъекции у мышей. Образцы крови мыши отбирали каждую неделю из щеки мыши при помощи скальпелей и образцы крови использовали для получения сыворотки, которую затем хранили при -20°С для использования в будущем. После третьей иммунизации кровь мыши получают и используют в качестве первичного антитела вестерн-блоттинга для обнаружения пептидогликан-связывающих белков в молозивной сыворотке. Если концентрация антител увеличивается по сравнению с антителами в иммунизированных сыворотках, собранных после первичной иммунизации и вторичной иммунизации, соответственно, выполняется четвертая иммунизирующая инъекция антигеновых белков, смешанных с полным адъювантом Фрейнда, и цельную кровь мыши собирают через одну неделю.
[0040] Тест белкового вестерн-блоттинга:
увлажнение мембраны PVDF безводным метанолом в течение 15 минут и помещение мембраны PVDF в буфер для блоттинга для использования в будущем; укладка гигроскопической ваты, фильтровальной бумаги, электрофоретического геля для переносимого белка, PVDF мембраны, фильтровальной бумаги, соответственно, на блок переноса во избежание образования пузырьков; заполнение блока переноса буфером для блоттинга и охлаждение блока переноса в ледяной бане; осуществление переноса при образцовом напряжении 100 вольт в течение одного часа; погружение мембраны PVDF в буфер TBS, содержащий 5% (вес./об.) сухого обезжиренного молока; встряхивание по меньшей мере в течение двух часов, и пропитка буфером TBS по 5 минут шесть раз; пептидогликан-связывающий белок, полученный из иммунизированной молозивной сыворотки мыши в вышеупомянутом тесте иммунизации, используется в качестве зонда антитела; пептидогликан-связывающие белки разбавляют 1000-кратно буфером TBS и встряхивают, чтобы способствовать реакции с мембраной PVDF при комнатной температуре в течение одного часа; пропитка буфером TBS по 5 минут шесть раз; антитела, переносящие щелочную фосфатазу, используются в качестве вторичных антител; антитела, переносящие щелочную фосфатазу, разбавляют 1500-кратно для выполнения роли вторичных антител и встряхивают, чтобы способствовать реакции с мембраной PVDF при комнатной температуре в течение одного часа; пропитка буфером TBS по 5 минут шесть раз; и наконец, прибавление BCIP/NBT в виде жидкого субстрата для визуализации; всякий раз, когда визуализация достигнута, прекращение цветной реакции путем двукратной промывки.
[0041] Демаскировка генов
[0042] LC-MS/MS: LC-MS/MS представляет собой жидкостную хроматографию (liquid chromatography, LC) в комбинации с тандемной масс-спектрометрией (mass spectrometry, MS), которая применяется для анализа образцов. LC-MS/MS использует высокую разрешающую способность жидкостной хроматографии для разделения смесей, содержащих полипептидные сегменты, и затем превращение газообразных образцов в ионы с помощью первичных ионов в масс-спектрометрии, которая генерирует пептиды различных размеров и электрических зарядов, которые поступают в первую стадию MS, в которой анализируемые ионы фрагментируются столкновениями с электронами или газом для соударений. Во второй стадии масс-спектрометрии измеряют отношения массы к заряду (m/z) фрагментов образца, с помощью которых можно получить массу анализируемого вещества с учетом количеств заряженных ионных фрагментов. Аминокислотные последовательности пептидов, разделенных жидкостной хроматографией, получают путем двукратной ионизации, фрагментации и, наконец, генетического сравнения. Соответствующие гены затем получают путем проведения сравнения последовательностей ДНК при помощи программного обеспечения поиска биологической информации, такой как Mascot Analysis (Matrix Science, London, UK).
[0043] Клонирование генов и активационный анализ белка распознавания патологии у свиней: аминокислотная последовательность, полученные из LC-MS/MS, используется в качестве основы конструирования вырожденных праймеров. Праймер действует как заместитель вместе с Olgo-d(T) для гена белка распознавания патологии у к ДНК молочной железы свиней. После RT-PCR, фрагменты, приведенные при электрофорезе в геле, будут клонировать последовательно (друг за другом) в ТА-векторы. Полные гены белка распознавания патологии у свиней, приведенные в SEQ ID NO.: 3, можно получить путем секвенирования ДНК и биоинформационного сравнения. Клонированный ген бежа распознавания патологии у свиней с модифицированной последовательностью впервые используют для трансформации клеток Е. coli, чтобы вызвать экспрессию белка распознавания патологии, и затем белок распознавания патологии очищают. Если способность белка распознавания патологии связываться с частицами GEM по-прежнему сохраняется и он стабилен после очистки, тестировать и анализировать с применением вестерн-блоттинга будут после того, как очищенные белки распознавания патологии и GEM частицы связываются.
[0044] Трансформация дрожжей:
чтобы предотвратить Е. coli экспрессирующую систему от загрязнения средой, связанной с выращиванием свиней, дрожжевые клетки, которые уже используются в корме, применяются в качестве носителей для экспрессии белка распознавания патологии. Клонированные, модифицированные и секвенированные гены белка распознавания патологии у свиней вставляются в pYES2.1V5-His ТОРО векторы (Invitrogen), разновидность дрожжевых экспрессирующих векторов, которые далее вводятся в дрожжевые штаммы INVSc1. Механизм индукции исходной экспрессии этой дрожжевой системы экспрессии был модифицирован, чтобы начать экспрессию белка распознавания патологии только при определенном диапазоне температуры или при наличии определенных питательных веществ. Однако, поскольку методика еще не заявлена на получение патента, информация в отношении условий культивирования здесь не раскрывается.
[0045] Тест на кишечные микроорганизмы у мыши
Исследование кишечной бактериальной флоры:
белок распознавания патологии вводится мыши при помощи перорального принудительного кормления с весом белка, составляющим одну сотою часть от веса мышей; проведение перорального принудительного кормления дважды в день в течение шести дней, в то время как контрольная группа получает дважды только обеззараженную воду того же объема; мышей умерщвляли, и тонкий кишечник (1,5 см ~ 2,5 см ниже желудка) каждой мыши брали для анализа; внутреннее содержимое кишечника мыши разбавляли до нужного разбавления, используя стерилизованный PBS, и культивировали, используя основы культуры; проведение подсчета количества бактериальных штаммов после 24 часов. Бактериальная флора выражается в log cfu бактериальных штаммов. Кроме того, система идентификации бактерий API 20Е используется для идентификации Enterobacteriaceae и грамотрицательных бактерий с результатами, которые интерпретируются с помощью таблицы 1 ниже.
[0047] Ферментативный тест:
трансформированные дрожжи культивируют в биореакторе Winpact и ферментере и затем дрожжи сначала активируют и суспендируют, разбавляют в зависимости от значения OD и культивируют в течение 8 часов после замены питательной среды, в ходе чего вариантные факторы, такие как температура, скорость вращения, величина рН и растворенный кислород, поддерживают постоянными. Каждый пэтч культивированных дрожжей отбирается для анализа экспрессии белка распознавания патологии. Дрожжи в ферментативном бульоне отделяют после восьми часов ферментации. Из приблизительно 1 литра ферментационного бульона можно получить 9-10 граммов рекомбинантных дрожжей. Рекомбинантные дрожжи затем сохраняют в сухой среде для использования в будущем.
[0048] Очистка бактериального мембран-связывающего белка и качественный анализ белка:
пути связывания чужеродного белка с клеточной мембраной или клеточной стенкой микроорганизма можно подразделить на пять категорий: (1) связывание клеточной мембраны микроорганизма через гидрофобный трансмембранный домен трансмембранного белка; (2) ковалентное связывание длинноцепочечных жирных кислот клеточной мембраны путем ацетилирования через концевые аминогруппы липопротеина; (3) создание условия для белков временно оставаться на клеточных стенках посредством LPCTG якорного мотива и ковалентного связывания; (4) с помощью нековалентных связываний между клеточными стенками, которые существуют в лизиновом мотиве (LysM) различных бактерий; и (5) при помощи связываний между поверхностными белками инородных белков и поверхностными белками клеточных стенок микроорганизмов. Хроматографическую колонку заполняют полученными GEM частицами и наполняют молозивом, и белки, связанные с бактериальной мембраной, анализируются с помощью метода SDS-PAGE. В тесте SDS-PAGE найдено, что существует несколько белков, которые могут связываться с бактериальными мембранами. После отделения белков от бактериальных мембран и секвенирования белков, насчитывалось семь белков, причем один из них представлял лактоферрин, известный белок, и С7 идентифицировали как один из семейства белков распознавания пептидогликана. С C1~C7 можно ознакомиться на фиг. 1. (С7: RecName: белок распознавания пептидогликана;
Признаки: Прекурсор, номинальная масса (Mr): 21024; Вычисленное значение pI: 9,62, вариабельные модификации: карбамидометил (С), окисление (М) расщепление трипсином: отрезают С-концевую сторону KR, пока следующий остаток не станет Р, охват последовательности: 11%).
[0049] Из-за отсутствия антител PGRP на рынке, в настоящем эксперименте мышам вводили инъекцию очищенного С7 сначала в брюшную полость, и затем применяли иммунизированные асциты для исследования экспрессии протеина С7 в свином молозиве и зрелом молоке. Как показано на фиг. 2, которая иллюстрирует свиную молочную сыворотку 2-4 дней после родов, с символом *, обозначающим PGRP с молекулярной массой 17 кДа, в наших исследованиях установлено, что свиная сыворотка также содержит PGRP, и что количество PGRP в молочной сыворотке свиного молозива намного выше, чем в молочной сыворотке зрелого молока свиньи. Однако, в процессе данного эксперимента также обнаружено, что белок С7 является крайне нестабильным. После двух дней хранения при -20°С белок С7 в образце исчезнет. Нестабильность сдерживает применения С7 белка в смежных отраслях промышленности. Следовательно, при последующей реализации вариантов изобретения, белок С7 модифицируют с тем, чтобы стабилизировать третичную структуру С7 белка, и в соответствии с его характерными признаками С7 белок назван белком распознавания патологии - PRP (pathological recognition protein), то есть модифицированным молозивным белком, описанным в настоящем изобретении, который приведен на фиг. 4.
[0050] Клонирование белка распознавания патологии у свиней, трансформация дрожжей и мониторинг производительности:
согласно прежнему опыту при применении рекомбинантного белка разработчиками, хотя рекомбинантный белок с рыночной стоимостью может разрабатываться в лабораториях, производство рекомбинантных белков с рыночной стоимостью является трудным для реализации в связи с некоторыми сложностями, такими как уровень экспрессии, стабильность и производственная себестоимость белка. Принимая во внимание вышеуказанные проблемы, ген белка распознавания патологии у свиней применяется для трансформации дрожжевых клеток. Несмотря на то, что условия культивирования трудно определить, дрожжевые клетки используются для экспрессии белка распознавания патологии у свиней (как показано на фиг. 3) потому, что дрожжевые клетки эффективны при коммерческом применении. Белок распознавания патологии у свиней может теперь устойчиво экспрессироваться после изменения рецептурного состава, температуры, скорости растворения кислорода и времени ферментации в несколько раз. Ежемесячный выход - 280 тонн корма для свиней. Один миллиметр корма отбирается в качестве образца до его ферментации и после ферментации снова отбирается образец корма для анализа. Образцы анализируются с помощью вестерн-блоттинга для определения технических характеристик и выхода белка распознавания патологии. Фиг. 5 показывает результат мониторинга экспрессии белка на основании одной ферментации. Как показано на фиг. 5, анализ образцов, отобранных в разные моменты времени, проанализировали и показали, что образец, который подвергался 8 часовой ферментации, достигает наилучшего уровеня экспрессии, как указано стрелкой при 17 кДа. Такой мониторинг осуществляется сразу же после окончания каждой ферментации, чтобы подтвердить, что условия ферментации и штамм находятся в наилучших состояниях. Дрожжи, собранные после ферментации, центрифугируют и супернатант затем удаляют, и твердое вещество сразу замораживают при -50°С и сушат, после чего его сохраняют без доступа влажности. Прежде чем происходит смешивание с другими компонентами корма, сохраненные дрожжи первыми смешивают с кормовыми субстратами.
[0051] Обратимся к фиг. 6 - фиг. 8. Мышам линии ICR (Institute for Cancer Research, ICR - Институт исследований раковых заболеваний) вводили принудительным кормлением один раз в два дня белок распознавания патологии, составляющий по весу одну сотую от веса каждой мыши. Продолжительность введения составляет в конечном итоге шесть дней. Контрольной группе дают обеззараженную воду того же объема дважды. После эксперимента животных умерщвляют и тонкие кишечники (1,5 см ~ 2,5 см ниже желудка) животных отбирают для анализа. В каждом эксперименте экспериментальная группа и контрольная группа каждая содержит 25 животных. Если какое-любо животное умирает во время экспериментов вследствие принудительного кормления, данные мертвых животных должны быть удалены. Общее количество бактерий в экспериментальной группе, т.е. группе, которую кормили белком распознавания патологии, на 50% меньше, чем количество бактерий в контрольной группе. Как показано на фиг. 7, синяя кривая представляет собой экспериментальную группу с мышами, которых кормили PRP, а когда время проходит, PRP ингибирует рост бактерий на 50 процентов. Из результата определения бактериальной флоры ингибируемые бактерии главным образом являются грамположительными бактериями. Кроме того, поскольку белок распознавания патологии обладает свойством прилипать к бактериальной мембране, в данном эксперименте, очищенные дрожжи, трансформированные белками распознавания патологии, смешивают с Е. coli. После двукратной замены культуральной среды, Е. coli наблюдают под электронным микроскопом для определения имеются ли белки распознавания патологии, связанные с Е. coli., как показано на фиг. 6, где части, обведенные кружками, представляют собой места, где происходят связывания.
[0052] Ниже приводятся тесты введения смеси модифицированного молозивного белка и животного корма поросятам.
[0053] Сравнение продуктивности сверстниц: 16 поросят 4-недельного возраста подразделяют на две группы и содержат в двух соседний свинарниках; проведение забора крови для исследования титра антител против PRRS (IgG); проведение забора крови для исследования титра антител против PRRS (IgG) после прибавления 0,02% PRP в корм.
[0054] Результат: таблица 2 показывает отрицательные результаты для IgG в обеих экспериментальных группах и контрольной группе до эксперимента. Однако, результаты IgG тестов остаются отрицательными в экспериментальной группе, которая получает добавку PRP, когда свиньи 8-недельного возраста, в то время как все результаты IgG тестов являются положительными в контрольной группе. Вышеуказанные результаты доказывают, что PRP может увеличить продуцирование иммуноглобулина IgA, который нейтрализует вирус PRRS (Porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS), с тенденцией проникать через слизистую ткань свиней и далее активировать лимфатическую систему для продуцирования IgG. Нейтрализация вируса PRRS проходит в слизистой оболочке.
Примечание: Результат титра антител ниже 0,4 оценивается отрицательным
Примечание: Результат титра антител ниже 0,4 оценивается отрицательным
1. Модифицированный молозивный белок, который применяется для повышения иммунной реакции у животного, имеет аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO.: 1, которая образуется при замещении Ile в положении 33, Glu в положении 101 и Arg в положении 175, присутствующих в аминокислотной последовательности молозивного белка дикого типа, приведенной в SEQ ID NO.: 2 соответственно на Ala, Cys и Cys.
2. ДНК, кодирующая аминокислотную последовательность модифицированного молозивного белка по п. 1, с нуклеотидной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO.: 3.
3. Животный корм, содержащий модифицированный молозивный белок по п. 1, в котором модифицированный молозивный белок присутствует в составе животного корма в диапазоне от 0,01 вес.% до 0,02 вес.%.
4. Применение модифицированного молозивного белка по п. 1 для получения корма для повышения иммунной реакции у животного.
5. Применение по п. 4, в котором иммунная реакция у животного повышается за счет увеличения продуцирования иммуноглобулина A (IgA) животного.
6. Применение модифицированного молозивного белка по п. 1 для получения корма, предназначенного для введения животному.
7. Применение модифицированного молозивного белка по п. 1 для получения корма для профилактики или лечения заболевания, которое может вызвать мукозный иммунный ответ.
8. Применение по п. 7, в котором заболевание является репродуктивно-респираторным синдромом свиней (PRRS), ящуром (FMD), эпизоотической диареей свиней (PED) или птичьим гриппом.
