Способ активации спор бактерий bacillus subtilis вкпм в-12079 перед определением количества жизнеспособных клеток

Изобретение относится к области биохимии. Предложен способ активации спор бактерий Bacillus subtilis ВКПМ В-12079 перед определением количества жизнеспособных клеток. Способ включает активацию сухих спор Bacillus subtilis ВКПМ В-12079 ультразвуком в течение 15-20 секунд при температуре 32-34°С, частоте колебаний 35-37 кГц и мощности 140 Вт. Изобретение обеспечивает уменьшение времени активации, повышение безопасности работ и точности результатов. 1 табл., 1 пр.

 

Область техники

Изобретение относится к микробиологии, биотехнологии и может быть использовано для уменьшения времени активации и повышения эффективности и безопасности метода количественного определения жизнеспособных клеток Bacillus subtilis ВКПМ В-12079.

Препараты на основе Bacillus subtilis используются для получения пробиотических средств, биоконсервантов, биологических фунгицидов, биологических дезинфектанов и. т.д. Штамм Bacillus subtilis ВКПМ В-12079 составляет основу кормовой добавки «Энзимспорин». Поскольку, количество жизнеспособных микроорганизмов в готовом продукте, является одним из важных показателем его качества, искажение этих результатов недопустимо.

Известен способ определения количества живых микроорганизмов (метод Коха), заключающийся в высеве микробных суспензий на плотную питательную среду. Данный способ включает в себя последовательные десятикратные разведения микробной суспензии, высев конечного разведения на плотную питательную среду, инкубацию в условиях, определяемых видом микроорганизма, подсчет выросших колоний и определение количества живых клеток в единице объема исследуемой микробной суспензии [1].

Недостатком является то, что не учитывается специфика спорообразующих микроорганизмов, так как спорообразующим бактериям (в. т.ч. Bacillus subtilis ВКПМ В-12079) для прорастания споры необходимо 2-3 часа в обычных условия или активация перед приготовлением суспензии [2].

В качестве прототипа выбран метод определения количества жизнеспособных споровых бактерий, указанный в СТО 40092868-0003-2016 (стандарт ООО «Алтбиотех» Фермасил, технические условия СТО 33976740-0001-2017) кормовая добавка «Энзимспорин».

Определение количества жизнеспособных клеток бактерий проводят путем высева соответствующего разведения пробы на агаризованную среду. Для этого от каждой партии биопрепарата отбирают навеску массой 1,0 г. Отобранные пробы в асептических условиях разводят стерильным физиологическим раствором в пробирках объема 10 мл. Содержимое пробирок перемешивают до гомогенной суспензии на водяной бане при температуре 80 С°, в течение 15 минут. Из полученной взвеси готовят серию десятикратных разведений. Из двух последних разведений делают высевы на чашки Петри. Чашки с посевом помещают в термостат на 24 часа, при температуре 37 С°.

Недостатками данного метода являются:

- трудоемкость;

- работа с горячей водяной баней является опасной;

- затраты времени, для подготовки водяной бани, прогрева пробирок и охлаждение пробирок до комнатной температуры;

- если для приготовления суспензии использовали споры, которые были активированы кратковременным прогреванием, это может привести к увеличению процента проросших спор [2]. Что в свою очередь, может исказить результат анализа готового биологического продукта.

Метод определения количества жизнеспособных клеток Bacillus subtilis ВКПМ В-12079 является основным в процессе технологического контроля и контроля качества готовой продукции биологических препаратов. Искажение его результатов негативно скажется на технологическом процессе и качестве готового биопрепарата.

Цель изобретения - разработка быстрого, безопасного, эффективного метода активации спор бактерий Bacillus subtilis ВКПМ В-12079 в процессе определения количества жизнеспособных клеток бактерий споровых микроорганизмов Bacillus subtilis ВКПМ В-12079.

В предложенном способе технический результат достигается тем, что сухие лиофилизированные споры Bacillus subtilis ВКПМ В-12079 активируют ультразвуком в течение 15-20 секунд при температуре 32-34°С, частоте колебаний 35-37 кГц и мощности 140 Вт перед приготовлением микробной суспензии. Затем проводят стандартный метод последовательных десятикратных разведений с высевом в чашки Петри с агаризованной средой. Таким образом, время активации снижается с 15 минут до 15-20 секунд, устраняется стадия прогрева на водяной бане, что повышает безопасность работ, после разведения на твердую среду будут высеяны вегетативных клеток, а не спор, что повышает точность результатов и соответствует методу Коха.

Описание изобретения

Способ осуществляется следующим образом.

0,1 г сухих спор Bacillus subtilis ВКПМ В-12079 помещают в асептических условиях в стерильную микропробирку на 1,5 мл, которую плотно закрывают. Затем производят активацию спор ультразвуком при температуре 32-34°С, частоте колебаний 35-37 кГц и мощности 140 Вт определенное время (пример). Для обработки спор может быть использована любая ультразвуковая установка, соответствующая заявленным выше параметрам. Затем, в микропробирку добавляют 1 мл питательной среды, которую предварительно готовят, при следующем соотношении компонентов (г/л): пептон ферментативный - 15, дрожжевой экстракт - 5, натрий хлористый - 5, остальное - дистиллированная вода. Значение рН 7,0-7,2. Стерилизуют при 1,1 атм. в течение 40 мин.

Затем 1 мл суспензии из микропробирки переносят в пробирку с 9 мл раствора хлорида натрия с массовой долей хлорида натрия 8,5 г/л и далее производят разбавление стандартным метод последовательных десятикратных разведений с высевом в чашки Петри со стандартной агаризованной средой. Чашки помещают в термостат на 24 часа, температура 37 С°. Затем осуществляют подсчет колоний, с учетом разведений и навески сухих спор.

Пример 1.

0,1 г сухих спор Bacillus subtilis ВКПМ В-12079 помещают в асептических условиях в стерильную микропробирку на 1,5 мл, которую плотно закрывают. Затем производят активацию спор ультразвуком при температуре 32-34°С, частоте колебаний 35-37 кГц и мощности 140 Вт определенное время от 5 до 60 сек. После этого в микропробирку добавляют 1 мл питательной среды, которую предварительно готовят, при следующем соотношении компонентов (г/л): пептон ферментативный - 15, дрожжевой экстракт - 5, натрий хлористый - 5, остальное - дистиллированная вода. Значение рН 7,0-7,2. Стерилизация при 1,1 атм. в течение 40 мин.

Далее, методом микрокопирования, оценивалось, какое количество спор и вегетативных клеток, вышедших из спор, в процессе активации ультразвуком, находится в пробе, в зависимости от времени воздействия ультразвука на споры. Количество микроорганизмов Bacillus subtilis ВКПМ- В-12079 определялось для каждой пробы стандартным методом десятикратных разведений (метод Коха) после проведения активации. Все опыты проводились в семикратном повторении.

Из приведенных данных видно, что активация ультразвуком в течение 15-20 сек. способствует ускоренному выходу Bacillus subtilis ВКПМ В-12079 из спор за счет механического повреждения споры, т.е. через 40 минут, к окончанию процесса десятикратных разбавлений, 95-99% спор перейдет в вегетативное состояние. Без активации, процесс выхода из спор занимает 2-3 часа [2]. В этом случае, на твердую агаризованную среду происходит высев спор, а не вегетативных клеток, что может исказить результат.

При активации более 20 сек. начинается рост численности микроорганизмов, за счет стимулирующего действия ультразвука со 100 до 151% [3]. Это приводит к искажению данных об исходном количестве спор в пробе.

Таким образом, оптимальное время активации спор бактерий Bacillus subtilis ВКПМ В-12079 ультразвуком при температуре 32-34°С, частоте колебаний 35-37 кГц и мощности 140 Вт составляет 15-20 сек. Предложенный способ позволяет:

- уменьшить время активации с 15 минут до 15-20 секунд;

- устраняется стадия прогрева на водяной бане, что повышает безопасность работ;

- после разведения на твердую агаризованную среду высевают вегетативные клетки, а не споры, что повышает точность результатов.

Литература

1. Луста К.А., Фихте Б.А. Методы определения жизнеспособности микроорганизмов. Пущино, 1990. - 187 с.

2. Ноздрин Г.А. Научные основы применения пробиотиков в птицеводстве. - Новосиб. гос. аграр. ун-т. - Новосибирск, 2005. - 224 с.

3. Бойко С.С., Яценко Е.С. Влияние ультразвука на Bacillus subtilis в процессе стационарного культивирования // Технологии и оборудование химической, биотехнологический и пищевой промышленности. Материалы X Всероссийской научно-практической конференции студентов, аспирантов и молодых ученых с международным участием. - Бийск, 2017. - С. 321-324.

Способ активации спор бактерий Bacillus subtilis ВКПМ В-12079 перед определением количества жизнеспособных клеток споровых бактерий Bacillus subtilis ВКПМ В-12079, отличающийся тем, что сухие споры Bacillus subtilis ВКПМ В-12079 активируют ультразвуком в течение 15-20 секунд при температуре 32-34°С, частоте колебаний 35-37 кГц и мощности 140 Вт.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к биотехнологии и микробиологии. Питательная среда для культивирования бактерий Bacillus subtilis содержит пептон ферментативный, дрожжевой экстракт, натрий хлористый, 40%-ный спиртовой экстракт кровохлебки лекарственной (Sanguisorba officinalis L.) и дистиллированную воду при заданном соотношении компонентов.

Группа изобретений относится к области биотехнологии. Предложен модифицированный полипептид, обладающий активностью сигма-фактора А РНК-полимеразы, где по меньшей мере одна аминокислота, выбранная из группы, состоящей из аминокислот в следующих положениях полипептида, имеющего аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 2, заменена, и аминокислотная замена представляет собой по меньшей мере одну из следующих аминокислотных замен: 136G, 254N, 268S, 281S, 381R, 429R, 447H, 451I, 455V, 479R, 483R, 488T и 491R.

Изобретение относится к биотехнологии и микробиологии. Питательная среда для культивирования бактерий Bacillus subtilis ВКПМ В-12079 содержит пептон ферментативный, дрожжевой экстракт, натрий хлористый, 96%-ный спиртовой экстракт кофе арабика и дистиллированную воду при заданном соотношении компонентов.

Изобретение относится к области биохимии. Предложен способ выращивания факультативно-анаэробных микроорганизмов.

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ стимуляции активности грибов-биодеструкторов полимерных отходов.

Группа изобретений относится к бактериальным штаммам Clostridium ghonii, способным подавлять рост солидной злокачественной опухоли, вызывать регрессию и разрушение солидной злокачественной опухоли, а также их применению.

Изобретение относится к области биохимии, генной инженерии и биотехнологии, в частности к рекомбинантной плазмидной ДНК pET31b-pHLIP. Указанная плазмидная ДНК кодирует аминокислотную последовательность рекомбинантного рН-зависимого встраивающегося пептида и обеспечивает его синтез в составе белка-слияния с кетостероидизомеразой.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в спиртовой промышленности. Штамм дрожжей Saccharomyces cerevisiae, обладающий способностью продуцировать этанол, депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов под регистрационным номером ВКПМ Y-4280.

Группа изобретений относится к биотехнологии. Предложены штаммы молочнокислых бактерий, обладающие антимикробной активностью (варианты); применение одного или более штаммов бактерий; композиция для лечения или предотвращения диареи у новорожденного млекопитающего, не являющегося человеком.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в спиртовой промышленности. Штамм дрожжей Saccharomyces cerevisiae, обладающий способностью продуцировать этанол, депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов под регистрационным номером ВКПМ Y-4281.

Группа изобретений относится к области биохимии. Предложен микросенсор и способ для определения концентрации клеток плесневых грибов в водных и воздушных средах, а также способ получения данного микросенсора.

Изобретение относится к области микробиологии. Предложен способ получения трехмерных структур, используемых для детекции, выделения или подсчета микроорганизмов.

Изобретение относится области микробиологии и медицины. Изобретение представляет собой способ оценки жизнеспособности клеточного материала, полученного из пуповины и плаценты человека, согласно которому клетки пересевают в полной ростовой среде на 96-луночный планшет по 5000 клеток первые 8 лунок, по 2500 клеток во вторые 8 лунок и по 1250 клеток в третьи 8 лунок, через 6 часов из лунок удаляют среду и вносят в каждую лунку по 100 мкл культуральной среды без фетальной телячьей сыворотки и по 10 мкл раствора бромид 3 -(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-тетразолия (МТТ) 10 мг/мл в PBS (натрий-фосфатный буфер, представляющий собой водный раствор солей, содержащий хлорид натрия, гидрофосфат натрия, хлорид калия и дигидрофосфат калия, в котором осмолярность и концентрации ионов в растворе соответствуют концентрациям в теле человека - изотонический буферный раствор), затем инкубируют 1 час при 37°С в атмосфере 5% СО2, после инкубации из лунок культурального планшета удаляляют среду без захвата клеток и вносят по 100 мкл диметилсульфоксида для экстракции внутриклеточного МТТ-формазана и измеряют оптическую плотность спектрофотометрически при длине волны 540 нм против диметилсульфоксида, где к жизнеспособному клеточному материалу относят III-VI пассажи с сигналом 6,5*105 опт.ед.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к электрохимическому иммуноанализу. Предложен способ определения содержания грамотрицательных бактерий в анализируемой среде.

Изобретения относятся к области биохимии. Предложен способ обнаружения присутствия термостойких микроорганизмов в пищевом продукте, а также способ обнаружения присутствия в пищевом продукте термостойких микроорганизмов и общего количества микроорганизмов для их сравнения.

Изобретение относится к области микробиологии. Способ обнаружения кластера микроорганизмов на поверхности предусматривает этапы, на которых: а) определяют топографическое представление упомянутой поверхности; b) обнаруживают на топографическом представлении, по меньшей мере, один контур, ограничивающий область, которая может соответствовать скоплению биологических частиц.

Изобретение относится к экспериментальной медицине и может быть использовано для подавления роста метициллин-резистентного штамма Staphylococcus aureus. Способ предусматривает облучение взвеси бактериальных клеток метициллин-резистентного штамма Staphylococcus aureus светом красного лазера (λ - 660 нм).

Изобретение относится к фармацевтике и микробиологии. Способ определения микробиологической чистоты фармацевтической субстанции предусматривает подготовку образца фармацевтической субстанции путем разбавления его в триптиказо-соевом бульоне или среде №8.

Изобретение относится к фармацевтике и микробиологии. Способ определения микробиологической чистоты лекарственных средств предусматривает подготовку образца лекарственного средства путем разбавления его в триптиказо-соевом бульоне или среде №8.

Изобретение относится к области биохимии. Способ определения токсичности среды включает определение показателей роста тест-культур в контроле и опыте.

Предложен способ культивирования ацетогенных бактерий на синтез-газе. Способ включает культивирование ацетогенных бактерий на первом субстрате для получения плотности клеток по меньшей мере около 0,005 г/л.

Изобретение относится к области биохимии. Предложен способ активации спор бактерий Bacillus subtilis ВКПМ В-12079 перед определением количества жизнеспособных клеток. Способ включает активацию сухих спор Bacillus subtilis ВКПМ В-12079 ультразвуком в течение 15-20 секунд при температуре 32-34°С, частоте колебаний 35-37 кГц и мощности 140 Вт. Изобретение обеспечивает уменьшение времени активации, повышение безопасности работ и точности результатов. 1 табл., 1 пр.

Наверх