Способы формирования банка клеток высокой плотности (варианты)

Группа изобретений относится к биотехнологии. Предложены способы формирования без центрифугирования банка замороженных клеток млекопитающих с высокой плотностью (варианты). Способы предусматривают культивирование клеток в перфузионном биореакторе, связанном с системой чередующейся тангенциальной проточной фильтрации, концентрирование без центрифугирования с использованием фильтра либо с применением системы чередующейся тангенциальной проточной фильтрации и криоконсервирование концентрированной клеточной популяции. Изобретения обеспечивают формирование банка жизнеспособных клеток высокой плотности с низким уровнем апоптоза. 2 н. и 15 з.п. ф-лы, 15 ил., 8 табл., 6 пр.

 

РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

Эта заявка притязает на приоритет по предварительной заявке на патент США № 61/793021, зарегистрированной 15 марта 2013, содержание которой включено в данный документ посредством ссылки во всей ее полноте для всех целей.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Обычное формирование банка клеток широко используют для сохранения запасов замороженных, характеристических клеток, которые могут быть разморожены для использования в ряде видов применения, включая получение терапевтически важных белков. Как правило, криоконсервированные запасы поддерживают при пониженных плотностях или центрифугируют, чтобы создать увеличенную плотность аликвот для хранения. Пониженная плотность запасов не обеспечивает эффективную инокуляцию большого объема культур, в то время как методы концентрирования с применением центрифугирования могут быть очень разрушающими для клеток (которые будут становиться еще более ломкими во время процесса криоконсервирования). Соответственно, имеет место потребность в улучшенных способах формирования банка клеток.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Данное изобретение предоставляет улучшенные способы создания банка клеток. В определенных аспектах, способ формирования банка клеток по данному изобретению использует перфузионные методы культивирования и концентрирование клеток без центрифугирования, чтобы предоставить возможность криоконсервирования при неожиданно высоких плотностях клеток наряду с сохранением превосходной жизнеспособности клеток для последующего применения для получения культуры клеток.

Соответственно, в одном из аспектов, данное изобретение предоставляет способ формирования без центрифугирования банка замороженных клеток с высокой плотностью, данный способ включает: a) культивирование клеток в перфузионном биореакторе, где указанный биореактор связан с системой удерживания клеток; b) концентрирование указанных клеток без центрифугирования, чтобы получить концентрированную клеточную популяцию; и c) криоконсервирование концентрированной клеточной популяции, чтобы получить банк замороженных клеток с высокой плотностью.

В одном из вариантов осуществления система удерживания клеток содержит систему чередующейся тангенциальной проточной фильтрации, содержащую фильтр. В другом варианте осуществления фильтр имеет площадь поверхности по меньшей мере 0,3 м2. В другом варианте осуществления фильтр имеет площадь поверхности от примерно 0,5 до примерно 1,0 м2. В другом варианте осуществления фильтр имеет площадь поверхности от примерно 0,7 до примерно 0,8 м2. В другом варианте осуществления фильтр имеет площадь поверхности от примерно 2,0 до примерно 3,0 м2. В другом варианте осуществления фильтр имеет площадь поверхности от примерно 4 до примерно 5 м2.

В одном из вариантов осуществления фильтр имеет размер пор примерно 0,2 мкм.

В одном из вариантов осуществления концентрированная клеточная популяция имеет плотность клеток по меньшей мере примерно 1×108 клеток/мл.

В одном из вариантов осуществления концентрированная клеточная популяция имеет плотность клеток примерно 1×108 клеток/мл.

В одном из вариантов осуществления криоконсервирование включает добавление диметилсульфоксида (DMSO) к концентрированной клеточной популяции при конечной концентрации от примерно 5% до примерно 10% по объему. В другом варианте осуществления криоконсервирование включает замораживание по меньшей мере части концентрированной клеточной популяции в контейнере, подходящем для хранения при условиях криоконсервирования.

В одном из вариантов осуществления контейнер является флаконом. В одном из вариантов осуществления контейнер имеет объем по меньшей мере 2 мл. В одном из вариантов осуществления контейнер имеет объем примерно 5 мл.

В одном из вариантов осуществления банк замороженных клеток с высокой плотностью содержит примерно 4,5×108 клеток.

В одном из вариантов осуществления контейнер является криомешком. В другом варианте осуществления криомешок имеет объем от примерно 5 до примерно 150 мл.

В одном из вариантов осуществления банк замороженных клеток с высокой плотностью имеет плотность клеток примерно 1×108 клеток/мл.

В одном из вариантов осуществления скорость перфузии в перфузионном биореакторе составляет по меньшей мере примерно 0,2 нл/клетку/день.

В одном из вариантов осуществления культура клеток в перфузионном биореакторе имеет pH примерно 7 и концентрацию растворенного кислорода по меньшей мере примерно 40%.

В одном из вариантов осуществления биореактор является биореактором в виде эластичного мешка. В другом варианте осуществления биореактор в виде эластичного мешка имеет объем 10 л. В другом варианте осуществления биореактор в виде эластичного мешка имеет объем по меньшей мере 20 л. В другом варианте осуществления биореактор в виде эластичного мешка дополнительно содержит по меньшей мере одну погружную трубку.

В одном из вариантов осуществления банк замороженных клеток с высокой плотностью имеет жизнеспособность после размораживания по меньшей мере 60%. В другом варианте осуществления банк замороженных клеток с высокой плотностью имеет жизнеспособность после размораживания по меньшей мере 90%. В другом варианте осуществления банк замороженных клеток с высокой плотностью имеет жизнеспособность после размораживания по меньшей мере 95%.

В одном из вариантов осуществления клетки являются клетками млекопитающих. В другом варианте осуществления клетки млекопитающих выбраны из группы, состоящей из: CHO, CHO-DBX11, CHO-DG44, CHO-S, CHO-K1, Vero, BHK, HeLa, COS, MDCK, HEK-293, NIH-3T3, W138, BT483, Hs578T, HTB2, BT20, T47D, NS0, CRL7030, HsS78Bst клеток, PER.C6, SP2/0-Agl4 и гибридомных клеток.

В одном из вариантов осуществления клетки являются трансфицированными клетками.

В одном из аспектов, данное изобретение предоставляет способ формирования без центрифугирования банка замороженных клеток с высокой плотностью, данный способ включает: a) культивирование клеток в перфузионном биореакторе, связанном с системой чередующейся тангенциальной проточной фильтрации, где биореактор содержит биореактор в виде эластичного мешка, и где фильтр имеет площадь фильтрующей поверхности по меньшей мере 0,3 м2 и размер пор, соответствующий номинальному отсечению по молекулярной массе (MWCO) по меньшей мере 50 кДа; b) концентрирование без центрифугирования клеток с применением системы чередующейся тангенциальной проточной фильтрации, чтобы получить концентрированную клеточную популяцию, имеющую плотность примерно 1×108 клеток/мл; c) криоконсервирование концентрированной клеточной популяции, чтобы получить банк замороженных клеток с высокой плотностью, где криоконсервирование включает добавление диметилсульфоксида (DMSO) к концентрированной клеточной популяции до конечной концентрации от примерно 5% до примерно 10% по объему; и где банк замороженных клеток с высокой плотностью имеет плотность клеток примерно 108 клеток/мл.

В одном из вариантов осуществления pH и концентрацию растворенного кислорода (DO) культуры регулируют автоматическими методами.

В одном из вариантов осуществления pH и концентрацию растворенного кислорода (DO) культуры регулируют неавтоматическими методами. В другом варианте осуществления pH и концентрацию растворенного кислорода (DO) регулируют посредством любой одной или нескольких из следующих операций: регулирование смеси газов, которую вводят к культуре, регулирование скорости качания биореактора или регулирование угла качания биореактора.

В одном из вариантов осуществления биореактор качают при 15 об/мин и при угле качания 8°.

Соответственно, в одном из аспектов, данное изобретение предоставляет способ формирования без центрифугирования банка замороженных клеток с высокой плотностью, данный способ включает: a) культивирование клеток в перфузионном биореакторе, где указанный биореактор связан с системой удерживания клеток; b) концентрирование указанных клеток без центрифугирования, чтобы получить концентрированную клеточную популяцию; и c) криоконсервирование концентрированной клеточной популяции, чтобы получить банк замороженных клеток с высокой плотностью.

В одном из вариантов осуществления система удерживания клеток содержит систему чередующейся тангенциальной проточной фильтрации, содержащую фильтр. В другом варианте осуществления фильтр имеет площадь поверхности по меньшей мере 0,3 м2. В другом варианте осуществления фильтр имеет площадь поверхности от примерно 0,5 до примерно 1,0 м2. В другом варианте осуществления фильтр имеет площадь поверхности от примерно 0,7 до примерно 0,8 м2. В другом варианте осуществления фильтр имеет площадь поверхности от примерно 2,0 до примерно 3,0 м2. В другом варианте осуществления фильтр имеет площадь поверхности от примерно 4 до примерно 5 м2.

В одном из вариантов осуществления фильтр имеет размер пор примерно 0,2 мкм.

В одном из вариантов осуществления концентрированная клеточная популяция имеет плотность клеток по меньшей мере примерно 1,1×108 клеток/мл.

В одном из вариантов осуществления концентрированная клеточная популяция имеет плотность клеток примерно 1,1×108 клеток/мл.

В одном из вариантов осуществления криоконсервирование включает добавление диметилсульфоксида (DMSO) к концентрированной клеточной популяции при конечной концентрации от примерно 5% до примерно 10% по объему. В другом варианте осуществления криоконсервирование включает замораживание по меньшей мере части концентрированной клеточной популяции в контейнере, подходящем для хранения при условиях криоконсервирования.

В одном из вариантов осуществления контейнер является флаконом. В одном из вариантов осуществления контейнер имеет объем по меньшей мере 2 мл. В одном из вариантов осуществления контейнер имеет объем примерно 5 мл.

В одном из вариантов осуществления банк замороженных клеток с высокой плотностью содержит примерно 4,5×108 клеток.

В одном из вариантов осуществления контейнер является криомешком. В другом варианте осуществления криомешок имеет объем от примерно 5 до примерно 150 мл.

В одном из вариантов осуществления банк замороженных клеток с высокой плотностью имеет плотность клеток примерно 1×108 клеток/мл.

В одном из вариантов осуществления скорость перфузии в перфузионном биореакторе составляет по меньшей мере примерно 0,2 нл/клетку/день.

В одном из вариантов осуществления культура клеток в перфузионном биореакторе имеет pH примерно 7 и концентрацию растворенного кислорода по меньшей мере примерно 40%.

В одном из вариантов осуществления биореактор является биореактором в виде эластичного мешка. В другом варианте осуществления биореактор в виде эластичного мешка имеет объем 10 л. В другом варианте осуществления биореактор в виде эластичного мешка имеет объем по меньшей мере 20 л. В другом варианте осуществления биореактор в виде эластичного мешка дополнительно содержит по меньшей мере одну погружную трубку.

В одном из вариантов осуществления банк замороженных клеток с высокой плотностью имеет жизнеспособность после размораживания по меньшей мере 60%. В другом варианте осуществления банк замороженных клеток с высокой плотностью имеет жизнеспособность после размораживания по меньшей мере 90%. В другом варианте осуществления банк замороженных клеток с высокой плотностью имеет жизнеспособность после размораживания по меньшей мере 95%.

В одном из вариантов осуществления клетки являются клетками млекопитающих. В другом варианте осуществления клетки млекопитающих выбраны из группы, состоящей из: CHO, CHO-DBX11, CHO-DG44, CHO-S, CHO-K1, Vero, BHK, HeLa, COS, MDCK, HEK-293, NIH-3T3, W138, BT483, Hs578T, HTB2, BT20, T47D, NS0, CRL7030, HsS78Bst клеток, PER.C6, SP2/0-Agl4 и гибридомных клеток.

В одном из вариантов осуществления клетки являются трансфицированными клетками.

В одном из аспектов, данное изобретение предоставляет способ формирования без центрифугирования банка замороженных клеток с высокой плотностью, данный способ включает: a) культивирование клеток в перфузионном биореакторе, связанном с системой чередующейся тангенциальной проточной фильтрации, где биореактор содержит биореактор в виде эластичного мешка, и где фильтр имеет площадь фильтрующей поверхности по меньшей мере 0,3 м2 и размер пор, соответствующий номинальному отсечению по молекулярной массе (MWCO) по меньшей мере 50 кДа; b) концентрирование без центрифугирования клеток с применением системы чередующейся тангенциальной проточной фильтрации, чтобы получить концентрированную клеточную популяцию, имеющую плотность примерно 1,1×108 клеток/мл; c) криоконсервирование концентрированной клеточной популяции, чтобы получить банк замороженных клеток с высокой плотностью, где криоконсервирование включает добавление диметилсульфоксида (DMSO) к концентрированной клеточной популяции до конечной концентрации от примерно 5% до примерно 10% по объему; и где банк замороженных клеток с высокой плотностью имеет плотность клеток примерно 108 клеток/мл.

В одном из вариантов осуществления pH и концентрацию растворенного кислорода (DO) культуры регулируют автоматическими методами.

В одном из вариантов осуществления pH и концентрацию растворенного кислорода (DO) культуры регулируют неавтоматическими методами. В другом варианте осуществления pH и концентрацию растворенного кислорода (DO) регулируют посредством любой одной или нескольких из следующих операций: регулирование смеси газов, которую вводят к культуре, регулирование скорости качания биореактора или регулирование угла качания биореактора.

В одном из вариантов осуществления биореактор качают при 15 об/мин и при угле качания 8°.

В одном из аспектов, данное изобретение предоставляет способ формирования без центрифугирования банка замороженных клеток с высокой плотностью, данный способ включает: a) культивирование клеток в перфузионном биореакторе, где указанный биореактор перемешивают для эффективного смешивания и газообмена, при этом указанный биореактор связан с системой удерживания клеток; b) концентрирование указанных клеток без центрифугирования чтобы получить концентрированную клеточную популяцию; и c) криоконсервирование концентрированной клеточной популяции, чтобы получить банк замороженных клеток с высокой плотностью.

В одном из вариантов осуществления система удерживания клеток содержит систему чередующейся тангенциальной проточной фильтрации, содержащую фильтр. В другом варианте осуществления фильтр имеет площадь поверхности по меньшей мере 0,3 м2. В другом варианте осуществления фильтр имеет площадь поверхности от примерно 0,5 до примерно 1,0 м2. В другом варианте осуществления фильтр имеет площадь поверхности от примерно 0,7 до примерно 0,8 м2. В другом варианте осуществления фильтр имеет площадь поверхности от примерно 2,0 до примерно 3,0 м2. В другом варианте осуществления фильтр имеет площадь поверхности от примерно 4 до примерно 5 м2.

В одном из вариантов осуществления фильтр имеет размер пор, выбранный из группы, состоящей из 0,2 мкм, 0,4 мкм и 0,65 мкм.

В одном из вариантов осуществления концентрированная клеточная популяция имеет плотность клеток, выбранную из группы, состоящей из 1,0×108 клеток/мл, 1,1×108 клеток/мл, 1,2×108 клеток/мл, 1,3×108 клеток/мл, 1,5×108 клеток/мл, 1,7×108 клеток/мл и 2,0×108 клеток/мл.

В одном из вариантов осуществления криоконсервирование включает добавление диметилсульфоксида (DMSO) к концентрированной клеточной популяции при конечной концентрации от примерно 5% до примерно 10% по объему. В другом варианте осуществления криоконсервирование включает замораживание по меньшей мере части концентрированной клеточной популяции в контейнере, подходящем для хранения при условиях криоконсервирования.

В одном из вариантов осуществления контейнер является флаконом. В одном из вариантов осуществления контейнер имеет объем по меньшей мере 2 мл. В одном из вариантов осуществления контейнер имеет объем примерно 5 мл.

В одном из вариантов осуществления банк замороженных клеток с высокой плотностью содержит примерно 4,5×108 клеток.

В одном из вариантов осуществления контейнер является криомешком. В другом варианте осуществления криомешок имеет объем от примерно 5 до примерно 150 мл.

В одном из вариантов осуществления банк замороженных клеток с высокой плотностью имеет плотность клеток примерно 1×108 клеток/мл.

В одном из вариантов осуществления скорость перфузии в перфузионном биореакторе находится в интервале от примерно 0,02 нл/клетку/день до примерно 0,5 нл/клетку/день.

В одном из вариантов осуществления культура клеток в перфузионном биореакторе имеет pH между примерно 6,8 и примерно 7,2.

В одном из вариантов осуществления культура клеток в перфузионном биореакторе имеет концентрацию растворенного кислорода по меньшей мере примерно 30%.

В одном из вариантов осуществления биореактор является биореактором в виде эластичного мешка. В другом варианте осуществления биореактор в виде эластичного мешка имеет объем 10 л. В другом варианте осуществления биореактор в виде эластичного мешка имеет объем по меньшей мере 20 л. В другом варианте осуществления биореактор в виде эластичного мешка дополнительно содержит по меньшей мере одну погружную трубку.

В одном из вариантов осуществления банк замороженных клеток с высокой плотностью имеет жизнеспособность после размораживания по меньшей мере 60%. В другом варианте осуществления банк замороженных клеток с высокой плотностью имеет жизнеспособность после размораживания по меньшей мере 90%. В другом варианте осуществления банк замороженных клеток с высокой плотностью имеет жизнеспособность после размораживания по меньшей мере 95%.

В одном из вариантов осуществления клетки являются клетками млекопитающих. В другом варианте осуществления клетки млекопитающих выбраны из группы, состоящей из: CHO, CHO-DBX11, CHO-DG44, CHO-S, CHO-K1, Vero, BHK, HeLa, COS, MDCK, HEK-293, NIH-3T3, W138, BT483, Hs578T, HTB2, BT20, T47D, NS0, CRL7030, HsS78Bst клеток, PER.C6, SP2/0-Agl4 и гибридомных клеток.

В одном из вариантов осуществления клетки являются трансфицированными клетками.

В одном из аспектов, данное изобретение предоставляет способ формирования без центрифугирования банка замороженных клеток с высокой плотностью, данный способ включает: a) культивирование клеток в перфузионном биореакторе, связанном с системой чередующейся тангенциальной проточной фильтрации, где биореактор содержит биореактор в виде эластичного мешка, и где фильтр имеет площадь фильтрующей поверхности по меньшей мере 0,3 м2 и размер пор, соответствующий номинальному отсечению по молекулярной массе (MWCO) по меньшей мере 50 кДа; b) концентрирование без центрифугирования клеток с применением системы чередующейся тангенциальной проточной фильтрации, чтобы получить концентрированную клеточную популяцию, имеющую плотность более чем примерно 1,0×108 клеток/мл; c) криоконсервирование концентрированной клеточной популяции, чтобы получить банк замороженных клеток с высокой плотностью, где криоконсервирование включает добавление диметилсульфоксида (DMSO) к концентрированной клеточной популяции до конечной концентрации от примерно 5% до примерно 10% по объему; и где банк замороженных клеток с высокой плотностью имеет плотность клеток примерно 108 клеток.

В одном из вариантов осуществления pH и концентрацию растворенного кислорода (DO) культуры регулируют автоматическими методами.

В одном из вариантов осуществления pH и концентрацию растворенного кислорода (DO) культуры регулируют неавтоматическими методами. В другом варианте осуществления pH и концентрацию растворенного кислорода (DO) регулируют посредством любой одной или нескольких из следующих операций: регулирование смеси газов, которую вводят к культуре, регулирование скорости качания биореактора или регулирование угла качания биореактора.

В одном из вариантов осуществления биореактор качают по меньшей мере при скорости 15 об/мин и при угле качания по меньшей мере 8°.

В одном из вариантов осуществления биореактор качают при скорости 15 об/мин и при угле качания 8°.

В одном из вариантов осуществления биореактор качают при 22 об/мин и при угле качания 10°.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фиг. 1: представляет собой схему процесса формирования криобанка клеток высокой плотности.

Фиг. 2: представляет собой график, изображающий профили роста клеток перфузионных культур в WAVE® при применении разных способов удерживания клеток.

Фиг. 3: представляет собой график характеристик после формирования банка (плотность жизнеспособных клеток (Xv), жизнеспособность) для минибанков, полученных при использовании культур, отобранных при нескольких моментах времени во время роста.

Фиг. 4: представляет собой диаграмму характеристик после формирования банка (поздний апоптоз) для минибанков, полученных при использовании культур, отобранных при нескольких моментах времени во время роста.

Фиг. 5: представляет собой график, показывающий рост клеток при автоматическом регулировании с обратной связью pH и концентрации растворенного кислорода (DO) и без такого регулирования.

Фиг. 6: представляет собой график, показывающий профили pH и концентрации растворенного кислорода (DO) при автоматическом регулировании с обратной связью pH и концентрации растворенного кислорода (DO) и без такого регулирования.

Фиг. 7A-B: представляют собой график плотности жизнеспособных клеток (A) и диаграмму позднего апоптоза (B) клеток на различных стадиях: перед концентрированием, после концентрирования и после выдерживания в диметилсульфоксиде (DMSO) от 0 до 120 мин.

Фиг. 8A-B: представляют собой график характеристик после формирования банка (A) и диаграмму позднего апоптоза (B) линии 1 клеток rCHO для банка высокой плотности по сравнению с банком нормальной плотности.

Фиг. 9A-B: представляют собой график характеристик после формирования банка (A) и диаграмму позднего апоптоза (B) линии 2 клеток rCHO для банка высокой плотности по сравнению с банком нормальной плотности.

Фиг. 10A-B: представляют собой график характеристик после формирования банка (A) и диаграмму позднего апоптоза (B) линии 3 клеток rCHO для банка высокой плотности по сравнению с банком нормальной плотности.

Фиг. 11: представляет собой график, показывающий концентрирование культур с течением времени при применении различных систем удерживания клеток.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

Данное изобретение предоставляет способ формирования криобанка клеток высокой плотности, который включает применение системы перфузионного культивирования клеток, связанной с узлом для удерживания клеток без центрифугирования.

I. Определения

Как использовано в данном документе, термин «периодическое культивирование» относится к методу культивирования клеток, в котором некоторое количество свежей культуральной среды засеивают клетками, которые быстро входят в фазу логарифмического роста, и в котором среду для выращивания культуры не удаляют непрерывным образом и не заменяют свежей средой.

Как использовано в данном документе, термин «культивирование с подпиткой» относится к методу культивирования клеток, в котором некоторое количество свежей культуральной среды засеивают клетками первоначально, и добавляют дополнительные питательные вещества (непрерывным образом или отдельными порциями) к культуре во время процесса культивирования, с периодическим отбором клеток, выросших в культуре, и/или продукта перед завершением культивирования или без такого отбора.

Как использовано в данном документе, термин «перфузионное культивирование» относится к методу культивирования клеток, в котором некоторое количество свежей культуральной среды засеивают клетками, которые быстро входят в фазу логарифмического роста (как указано выше), и в котором среду для выращивания культуры удаляют непрерывным образом из культуры и заменяют свежей средой.

Как использовано в данном документе, термин «биореактор» относится к сосуду для культивирования клеток.

В одном из вариантов осуществления биореактор является «биореактором в виде эластичного мешка». «Биореактор в виде эластичного мешка» является стерильной камерой, способной к приему жидких сред, и которая в дополнение к этому содержит соединители, горловины, адаптеры и гибкие трубки. В одном из вариантов осуществления камера изготовлена из пластика. В определенном варианте осуществления камера изготовлена из многослойного ламинированного прозрачного пластика. В другом определенном варианте осуществления камера изготовлена из многослойного ламинированного прозрачного пластика и имеет слой, контактирующий с жидкостью, изготовленный из сополимера этиленвинилацетата и полиэтилена низкой плотности класса USP VI, в то время как внешний слой полиэтилена низкой плотности.

В дополнение к этому, соединители, горловины и адаптеры могут быть изготовлены из пластика любого вида, включая, однако без ограничения ими: полиэтилен, полипропилен и поликарбонат, наряду с тем, что трубки могут быть изготовлены из пластика любого вида, включая, однако без ограничения ими: термопластичный эластомер или силикон (например, вулканизированный платиной силикон).

Подходящие камеры, являющиеся «биореактором в виде эластичного мешка», известны в данной области и включают, однако без ограничения ими, те, что описаны в патенте США № 6544788, который настоящим включен посредством ссылки в данный документ во всей его полноте.

Камера, являющаяся «биореактором в виде эластичного мешка», может быть частично заполнена культуральными средами и затем надута для придания жесткости. Она может быть затем размещена на качающейся платформе (такой как качающийся узел BASE20/50EHT от компании GE Healthcare Life Sciences), которая перемещается вперед и назад при заданном угле качания и заданной скорости качания. Это качательное движение индуцирует волнообразные перемещения в культуральных средах, способствуя перемешиванию и переносу кислорода для того, чтобы улучшить эффективность культивирования клеток. Заданный угол качания может составлять по меньшей мере примерно 4 градусов, например, примерно 4 градуса, 5 градусов, 6 градусов, 7 градусов, 8 градусов, 9 градусов, 10 градусов, 11 градусов или 12 градусов. Кроме того, заданная скорость качания может быть установлена при скорости качания в минуту (об/мин), которая составляет по меньшей мере примерно 6 об/мин, например, примерно 7 об/мин, 8 об/мин, 9 об/мин, 10 об/мин, 11 об/мин, 12 об/мин, 13 об/мин, 14 об/мин, 15 об/мин, 16 об/мин, 17 об/мин, 18 об/мин, 19 об/мин, 20 об/мин, 21 об/мин, 22 об/мин, 23 об/мин, 24 об/мин, 25 об/мин, 26 об/мин, 27 об/мин, 28 об/мин, 29 об/мин, 30 об/мин, 31 об/мин, 32 об/мин, 33 об/мин, 34 об/мин, 35 об/мин, 36 об/мин, 37 об/мин, 38 об/мин, 39 об/мин или 40 об/мин. В определенном варианте осуществления скорость качания в минуту составляет примерно 8 об/мин. В определенном варианте осуществления скорость качания в минуту составляет примерно 15 об/мин. В другом определенном варианте осуществления скорость качания в минуту составляет примерно 22 об/мин.

Как использовано в данном документе, термин «система удерживания клеток» относится ко всем устройствам, обладающих способностью отделять клетки от среды и побочных продуктов в ней посредством применения фильтра. Фильтры могут включать мембрану, керамические или металлические фильтры в любой форме, включая фильтры со спиральной намоткой, трубчатые или листовые фильтры. Фильтры могут иметь разные площади поверхности. Например, площадь фильтрующей поверхности может составлять примерно 0,3 м2 до примерно 5 м2, например, примерно 0,3 м2, 0,4 м2, 0,5 м2, 0,6 м2, 0,7 м2, 0,77 м2, 0,8 м2, 0,9 м2, 1,0 м2, 1,1 м2, 1,2 м2, 1,3 м2, 1,4 м2, 1,5 м2, 1,6 м2, 1,7 м2, 1,8 м2, 1,9 м2, 2,0 м2, 2,1 м2, 2,2 м2, 2,3 м2, 2,4 м2, 2,5 м2, 2,6 м2, 2,7 м2, 2,8 м2, 2,9 м2, 3,0 м2, 3,1 м2, 3,2 м2, 3,3 м2, 3,4 м2, 3,5 м2, 3,6 м2, 3,7 м2, 3,8 м2, 3,9 м2, 4,0 м2, 4,1 м2, 4,2 м2, 4,3 м2, 4,4 м2, 4,5 м2, 4,6 м2, 4,7 м2, 4,8 м2, 4,9 м2 или примерно 5 м2. В определенных вариантах осуществления фильтрующий модуль имеет величину номинального отсечения по молекулярной массе (MWCO) от примерно 10 килодальтонов (кДа) до примерно 100кДа, например, она составляет примерно 10 кДа, 20 кДа, 30 кДа, 40 кДа, 50 кДа, 60 кДа, 70 кДа, 80 кДа, 90 кДа или 100 кДа. В других вариантах осуществления фильтрующий модуль имеет размер отверстий сетки или размер пор от примерно 0,1 мкм до примерно 3 мкм, например, примерно 0,1 мкм, 0,2 мкм, 0,3 мкм, 0,4 мкм, 0,5 мкм, 0,6 мкм, 0,65 мкм, 0,7 мкм, 0,8 мкм, 0,9 мкм, 1,0 мкм, 1,1 мкм, 1,2 мкм, 1,3 мкм, 1,4 мкм, 1,5 мкм, 1,6 мкм, 1,7 мкм, 1,8 мкм, 1,9 мкм, 2,0 мкм, 2,1 мкм, 2,2 мкм, 2,3 мкм, 2,4 мкм, 2,5 мкм, 2,6 мкм, 2,7 мкм, 2,8 мкм, 2,9 мкм или примерно 3,0 мкм.

Как использовано в данном документе, термин «криоконсервирование» относится к процессу, посредством которого клетки, ткани или любые другие вещества, чувствительные к повреждению, вызываемому протеканием времени или ферментативной или химической активностью, сохраняют посредством охлаждения и хранения их при температурах ниже нуля.

Как использовано в данном документе, термин «формирование криобанка» относится к методу, посредством которого клетки смешивают с криопротектором (например, диметилсульфоксидом (DMSO) с гидроксиэтилкрахмалом (HES) или без него) и помещают в контейнер, подходящий для хранения при условиях криоконсервирования. Эти контейнеры затем замораживают при применении методов, хорошо известных в данной области, и хранят при низких температурах, как правило, между примерно -130°C и примерно -195°C. Коллекция клеток, полученная посредством такого процесса, представляет собой банк клеток.

В одном из вариантов осуществления банк клеток является банком клеток высокой плотности. Как использовано в данном документе, термин «банк клеток высокой плотности» относится к хранящимся в криобанке аликвотам клеток, которые были заморожены при высокой плотности, при этом плотность составляет по меньшей мере примерно 7×107 жизнеспособных клеток/мл, например, она составляет примерно 7×107 жизнеспособных клеток/мл, 8×107 жизнеспособных клеток/мл, 9×107 жизнеспособных клеток/мл, 1×108 жизнеспособных клеток/мл, 2×108 жизнеспособных клеток/мл или 3×108 жизнеспособных клеток/мл. Клетки могут быть заморожены в соответствии с любым методом, применимым в данной области, и в любом контейнере, подходящем для хранения при условиях криоконсервирования.

В другом варианте осуществления банк клеток является маточным банком клеток. Как использовано в данном документе, термин «маточный банк клеток» относится к культуре клеток (например, полностью характеристических клеток), которые были выращены из одного клона, распределены в контейнеры для хранения (например, распределены в контейнеры в ходе одной операции) и сохранены при условиях криоконсервирования, как описано выше. В определенных вариантах осуществления клетки подходят для последующего применения для получения культуры клеток и дальнейшего сбора терапевтически важных белков, полученных таким образом.

В другом варианте осуществления банк клеток является минибанком клеток. Как использовано в данном документе, термин «минибанк» относится к аликвотам клеток, которые были подвергнуты криоконсервированию в соответствии с процедурами «формирования криобанка» (как описано выше), однако состоят из меньшего количества образцов, по сравнению с тем, что обычно используют для создания банка клеток. Этот тип банка может быть, как правило, использован для оптимизации условий, рассматриваемых для криоконсервирования линии клеток, перед созданием банков клеток, таких как «маточный банк клеток». В качестве примера, «минибанк» используют, чтобы определить оптимальную плотность клеток для процедуры формирования банка клеток высокой плотности, описанной в данном документе.

Как использовано в данном документе, термин «контейнер, подходящий для хранения при условиях криоконсервирования» включает любой контейнер, который может быть использован при условиях, подходящих для хранения клеток между примерно -130°C и примерно -195°C. Эти контейнеры включают, однако без ограничения ими, флаконы, которые изготовлены из материалов, подходящих для криоконсервирования. Эти материалы включают полимеры (например, политетрафторэтилен, полистирол, полиэтилен или полипропилен). Кроме того, поверхностные обработки могут быть применены к поверхности флакона для криоконсервирования для того, чтобы улучшить условия криоконсервирования (например, формирование гидрофильных покрытий, которые уменьшают адсорбцию и денатурацию). В примерах осуществления флакон может иметь объем более чем примерно 0,1 мл, например, флаконом может иметь объем примерно 0,1 мл, примерно 0,5 мл, примерно 0,75 мл, примерно 1 мл, примерно 2 мл, примерно 2,5 мл, примерно 5 мл, примерно 10 мл, примерно 15 мл, примерно 20 мл, примерно 25 мл или примерно 50 мл. Контейнер может также являться криомешком.

Как использовано в данном документе, термин «криомешок» относится к стерильной камере, которая способна принимать жидкую среду, подходит для хранения клеток между примерно -130°C и примерно -195°C и может дополнительно содержать соединители, каналы, адаптеры и гибкие трубки. Криомешок может быть изготовлен из любого подходящего материала, включая, однако без ограничения ими, полимеры, такие как политетрафторэтилен, полистирол, полиэтилен, полипропилен, фторсодержащий этиленпропилен (FEP) и этиленвинилацетат (EVA). Примеры криомешков включают, однако не ограничиваются ими: мешки для криоконсервирования KryoSure®, мешки PermaLife™ (OriGen Biomedical), мешки для замораживания CryoStore, биоконтейнеры Freeze-Pak™.

Как использовано в данном документе, термин «качалочная колба» относится к сосуду, используемому в качестве колбы для культур, в которой среду постоянно перемешивают во время инкубирования.

Как использовано в данном документе, термин «засевание-выращивание в качалочной колбе» относится к способу выращивания клеток, в котором аликвоту клеток первоначально культивируют (засевают) в качалочной колбе и выращивают в ней. Клетки культивируют в соответствии с их скоростью роста и обычно разделяют в увеличенные сосуды и/или большее число сосудов во время их роста до тех пор, пока биомасса не достигала уровня, достаточного для засеивания биореактора.

Как использовано в данном документе, термин «плотность посева» относится к первоначальной плотности клеток, при которой засеивают колбу или биореактор.

Как использовано в данном документе, термин «терапевтически важный белок» относится к любому белку, который может быть использован, чтобы оказывать лечебное действие в отношении болезни или нарушения или чтобы обрабатывать болезнь или нарушение у животных, включая млекопитающих, таких как мыши, крысы, обезьяны, человекообразные обезьяны, и людей. Эти белки могут включать, однако без ограничения ими, связующие полипептиды, такие как моноклональные антитела, Fc-гибридные белки, антикоагулянты, факторы крови, костные морфогенетические белки, сконструированные белковые «скеффолды», ферменты, факторы роста, гормоны, интерфероны, интерлейкины и тромболитики.

Как использовано в данном документе, термин «связующий полипептид» или «связующий полипептид» относится к полипептиду (например, антителу), который содержит по меньшей мере одно место связывания, которое ответственно за селективное связывание с целевым антигеном, представляющим интерес, (например, человеческим антигеном). Примеры мест связывания включают вариабельный домен антитела, место связывания рецептора с лигандом или место связывания лиганда с рецептором. В определенных аспектах, связующие полипептиды данного изобретения содержат несколько (например, два, три, четыре или более) мест связывания.

Как использовано в данном документе, термин «антитело» относится к таким сборкам (например, молекулам интактных антител, фрагментам антител или их вариантам), которые обладают значительной известной удельной иммуннореактивной активностью по отношению к антигену, представляющему интерес, (например, антигену, связанному с опухолью). Антитела и иммуноглобулины содержат легкие и тяжелые цепи, с межцепьевым ковалентным связыванием между ними или без такого связывания. Базовые структуры иммуноглобулина в системах позвоночных сравнительно хорошо изучены.

Родовой термин «антитело» содержит пять различных классов антител, которые могут быть дифференцированы биохимически. Все пять классов антител находятся очевидным образом в пределах объема данного изобретения, и последующее обсуждение будет в основном направлено на класс IgG молекул иммуноглобулина. Что касается IgG, иммуноглобулины содержат две идентичных легких цепи с молекулярной массой приблизительно 23000 дальтонов и две идентичных тяжелых цепи с молекулярной массой 53000-70000. Четыре цепи соединены дисульфидными мостиками в конфигурации «Y», в которой легкие цепи окружают в виде скобок тяжелые цепи, начиная от входа в «Y» и продолжаясь через вариабельный участок.

II. Перфузионное культивирование клеток

Традиционное культивирование клеток включает процесс «периодического» культивирования. В этом виде культивирования, некоторое количество свежей среды засеивают клетками, которые быстро входят в фазу логарифмического роста. Когда эти клетки растут и делятся, они потребляют доступные питательные вещества от среды и выделяют вредные побочные продукты. С течением времени культура будет входить в стационарную фазу роста и в конечном счете в фазу разложения. Несмотря на то, что модификации процесса «периодического» культивирования сделали его более эффективным с течением времени, результирующие модифицированные протоколы периодического культивирования все же приводят к циклам быстрого роста и разложения. Кроме того, процесс «периодического» культивирования имеет ограниченную способность к достижению уровней плотности клеток, которые требуются, чтобы сделать возможным формирование банка клеток высокой плотности.

Процесс «культивирования с подпиткой» относится к дополнительному улучшению метода культивирования клеток по отношению к традиционным методам «периодического» культивирования. Наряду с тем, что этот процесс делает возможным выращивание клеток при более высокой плотности, он все еще ограничен в своей способности к предоставлению возможности эффективного выращивания культур клеток высокой плотности и, поэтому, к эффективному генерированию клеток для формирования банка клеток высокой плотности.

В предпочтительных вариантах осуществления изобретение использует процесс перфузионного культивирования. Перфузионное культивирование является способом выращивания клеток, в котором некоторое количество свежей культуральной среды засеивают клетками, которые быстро входят в фазу логарифмического роста (как указано выше), и в котором среду для выращивания культуры удаляют непрерывным образом из культуры и заменяют свежей средой. Таким образом, культура постоянно получает свежую среду с высокими уровнями питательных веществ, наряду с тем, что среда, содержащая побочные продукты и имеющая низкие уровни питательных веществ, удаляется. Этот вид культивирования делает возможным поддержание логарифмического роста клеток, в котором по меньшей мере один объем культуры заменяют ежесуточно, и концентрирование клеток может быть гораздо выше, чем те его величины, которые достигаются в традиционном или модифицированном периодическом культивировании (увеличение от 2 до более чем 10 раз). В одном из вариантов осуществления данного изобретения удельная скорость перфузии клеток (CSPR) может составлять между примерно 0,02 нл/клетка/сутки и примерно 0,5 нл/клетка/сутки, например, она может составлять примерно 0,02 нл/клетка/сутки, 0,05 нл/клетка/сутки, 0,1 нл/клетка/сутки, 0,2 нл/клетка/сутки, 0,3 нл/клетка/сутки, 0,4 нл/клетка/сутки или 0,5 нл/клетка/сутки. В определенном варианте осуществления перфузионное культивирование может быть выполнено в биореакторе с по меньшей мере одной погружной трубкой.

В определенных вариантах осуществления pH, температура, концентрация растворенного кислорода (DO) и осмотическая концентрация раствора культуры могут быть отрегулированы для максимизирования жизнеспособности культуры и производительности. Одним из методов регулирования концентрации растворенного кислорода (DO) и pH культур является применение автоматического регулятора с обратной связью. Этот вид автоматического регулятора функционирует при применении компьютеров на базе микропроцессоров, чтобы контролировать и регулировать pH и концентрацию растворенного кислорода (DO) культуры и посредством этого поддерживать оптимальные условия для роста клеток. Однако эти системы автоматического регулирования с обратной связью являются дорогими. Соответственно, в определенных вариантах осуществления может быть использован неавтоматический метод регулирования этих параметров. В одном из примеров варианта осуществления может быть использован любой метод из регулирования газовой смеси, протекающей поверх культуры, регулирования скорости качания WAVE® или регулирования угла качания культуры, чтобы регулировать выбранные параметры (например, pH или концентрацию растворенного кислорода (DO)).

В одном из вариантов осуществления начальный уровень газообразного диоксида углерода находится при примерно 10% и начальный уровень газообразного кислорода находится при примерно 20% при расходе воздуха примерно 0,2 литра в минуту (л/мин). Если pH составляет не более чем примерно 6,9, заданное значение для CO2 может быть уменьшено от 10% до 5%. Если pH все еще не более чем примерно 6,9 в более поздний момент времени, заданное значение для CO2 может быть дополнительно уменьшено от 5% до 0%. Если pH все еще не более чем примерно 6,9, скорость перфузии может быть увеличена. Если концентрация растворенного кислорода (DO) составляет не более чем примерно 45%, заданное значение для O2 должно быть увеличено от 20% до 30%. Если концентрация растворенного кислорода (DO) составляет не более чем примерно 45% в более поздний момент времени, уровень O2 должен быть увеличен от 30% до 40%, скорость качания должна быть увеличена до примерно 25 об/мин и угол качания должен быть изменен до примерно 12°.

В варианте осуществления скорость качания культуры может также быть отрегулирована во время стадии конечного концентрирования, чтобы избежать включения воздуха в систему удерживания клеток.

i. Среды для культивирования клеток

Любой вид среды для культивирования клеток, подходящий для данного культивирования клеток может быть использован в способах данного изобретения. Рекомендации для выбора подходящей среды для клеток хорошо известны в данной области и предоставлены, например, в главах 8 и 9 Freshney, R. I. Culture of Animal Cells (a manual of basic techniques), 4th edition 2000, Wiley-Liss; и в Doyle, A., Griffiths, J.B., Newell, D.G. Cell & Tissue Culture: Laboratory Procedures 1993, John Wiley & Sons. Каждая из этих ссылок включена настоящим здесь во всей ее полноте. Имеются другие способы в области приготовления и поддержания культур клеток в условиях отсутствия компонентов животного происхождения и отсутствия белка (включающие способы в отношении клеток CHO клеток), такие как те, что представлены в международной заявке на патент № WO 97/05240, № WO 96/26266 и № WO 00/11102, патентах США № 6100061, № 6475725 и 8084252. Каждый из предшествующих документов настоящим включен здесь посредством ссылки во всей его полноте. В одном из вариантов осуществления данного изобретения может быть использована среда, не содержащая компонентов животного происхождения (ADC). Обычные синтетические минимальные среды могут содержать неорганические соли, аминокислоты, витамины, источник углевода и воду. В определенном варианте осуществления данного изобретения средой, которая может быть использована, является CD-CHO (GIBCO, Invitrogen Corp.; среда, не содержащая компонентов животного происхождения, которая имеет известный химический состав и не содержит белков, гидролизатов или компонентов неизвестного происхождения. В дополнение к этому, среда может иметь дополнительные компоненты, включающие глутамин и/или метотрексат или другие факторы, которые могут способствовать росту или адгезии. В определенном варианте осуществления дополнительным компонентом может являться GLUTAMAX-1 или L-глутамин, добавленный между примерно 2 мМ и примерно 8 мМ, например, при примерно 2 мМ, примерно 3 мМ, примерно 4 мМ, примерно 5 мМ, примерно 6 мМ, примерно 7 мМ или примерно 8 мМ.

ii. Клетки-хозяева и экспрессирующие векторы

В определенных вариантах осуществления клетки, используемые в способе формирования банка клеток по данному изобретению, являются клетками-хозяевами, включающими экспрессионную конструкцию для экспрессии терапевтически важного белка или другого полипептида, представляющего интерес. Любая клетка, которая может быть использована, чтобы экспрессировать полипептид, представляющий интерес, (например, связующий полипептид), может быть использована в соответствии со способами, описанными в данном документе. Клетки могут необязательно содержать последовательности природной или рекомбинантной нуклеиновой кислоты, например, экспрессирующий вектор, который содержит полипептид, представляющий интерес. Экспрессирующий вектор может необязательно содержать подходящие транскрипционные и трансляционные контрольные последовательности и может быть сформирован при применении технологии рекомбинантной ДНК, известной в данной области. Экспрессирующие векторы могут быть перемещены к любой клетке-хозяине посредством методов, известных в данной области, и перемещенные клетки могут затем быть культивированы в соответствии со способом данного изобретения, чтобы создать банк клеток высокой плотности. Кроме того, банк клеток высокой плотности может затем быть разморожен и культивирован в соответствии с методами, известными в данной области, для того, чтобы получить кодируемый белок, представляющий интерес, и там, где это требуется, этот белок может быть затем очищен.

В определенных вариантах осуществления ряд систем экспрессии хозяина может быть использован, чтобы изготавливать терапевтически важные белки. Кроме того, система экспрессии хозяина может быть системой для клетки млекопитающих (например, CHO, CHO-DBX11, CHO-DG44, CHO-S, CHO-K1, Vero, BHK, HeLa, COS, MDCK, HEK-293, NIH-3T3, W138, BT483, Hs578T, HTB2, BT20, T47D, NSO, CRL7030, HsS78Bst клеток, PER.C6, SP2/0-Agl4 и гибридомных клеток), включающей конструкции рекомбинантной экспрессии, содержащие промоторы, производные от генома клеток млекопитающих. Вирусные системы экспрессии могут также быть использованы совместно с клетками млекопитающих (см., например, статью Logan et al, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8:355-359, которая настоящим включена посредством ссылки в данный документ во всей ее полноте). Эффективность экспрессии может быть улучшена посредством добавления элементов, включающих (однако без ограничения ими) подходящие элементы усиления транскрипции и терминаторы транскрипции (см., например, статью Bittner et al., 1987, Methods in Enzymol. 153:516-544, которая настоящим включена посредством ссылки в данный документ во всей ее полноте).

В других вариантах осуществления может быть выбран штамм клетки-хозяина, который регулирует экспрессию введенных последовательностей или который модифицирует и обрабатывает генный продукт определенным требуемым образом. Различные клетки-хозяева имеют характерные и конкретные механизмы для посттрансляционной обработки и модификации белков и генных продуктов. Подходящие линии клеток или системы хозяина могут быть выбраны, чтобы обеспечить надлежащую модификацию и обработку экспрессированного полипептида (например, связующего полипептида). Такие клетки включают, например, установленные линии клеток млекопитающих и животные клетки, а также линии клеток насекомых, грибные клетки и дрожжевые клетки.

iii. Биореакторы

Любой биореактор, подходящий для культивирования клеток в условиях перфузионного культивирования может быть использован в способах данного изобретения. Биореактор может быть засеян при применении аликвоты клеток при подходящей плотности посева (такой как флакон клеток или клетки из стартовой культуры, например, из качалочной колбы или системы «засевание-выращивание» в качалочной колбе, которые были культивированы до такой плотности). Подходящая плотность посева для культуры зависит от нескольких факторов, включающих вид используемых клеток и засеиваемого биореактора. Подходящая плотность посева может быть определена при применении способов, применимых в данной области.

В определенных вариантах осуществления биореактор может быть биореактором одноразового использования, например, биореактор может являться эластичным мешком или пластиковой колбой, которые соединены с узлом для удерживания клеток посредством гибких трубок. Он может иметь объем примерно 1 л, 2 л, 5 л, 10 л, примерно 20 л, 50 л, 75 л, 85 л, 100 л, 150 л или примерно 400 л. В определенном варианте осуществления данного изобретения, биореактор является эластичным мешком объемом 10 л, который был модифицирован двумя погружными трубками, т.е. трубками, которые используют для удаления среды или продукта. Примерами доступных одноразовых биореакторов являются биореакторы в виде мешка для культивирования клеток WAVE® (GE Healthcare, Pittsburgh, PA), такие как биореактор WAVE® на 20 л. Эти перфузионные биореакторные системы описаны, среди других документов, в статье Singh, 1999, Disposable bioreactor for cell culture using wave-induced agitation, Cytotechnology, p.149-158, которая настоящим включена в данный документ посредством ссылки во всей ее полноте.

Рабочий объем реактора является объемом, занятым культурой. Рабочий объем может составлять, например, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% или более для культуры, однако предпочтительно не более чем 75%.

В качестве варианта, биореактор может быть многоразового использования. Например, биореактор может быть изготовлен из нержавеющей стали или стекла. Альтернативные биореакторы, подходящие для применения в данном изобретении, включают, однако без ограничения ими, качалочные колбы, резервуары с механическим перемешиванием, барботажные сосуды и одноразовые мешки, содержимое которых может смешиваться посредством качания, встряхивания или перемешивания.

В варианте осуществления биореактор может быть связан с системой удерживания клеток, включающей, однако без ограничения ими, встроенные фильтры, системы тангенциальной проточной фильтрации (TFF) с картридж-сеткой и системы фильтрации с чередующимся тангенциальным потоком (ATF).

II. Концентрирование без центрифугирования

Перфузионная культура зависит от возможности удаления из культуры сред, обедненных питательным веществом и содержащих отходы, при минимизировании повреждения клеток. Первоначальные методы удерживания клеток, в которых истощенную среду отделяют от культивированных клеток, часто повреждают клетки вследствие присущих им проблем, таких как создание сдвиговых усилий. Это в конечном счете приводит к засорению фильтров и отказу перфузионных устройств, многие из которых являлись внутренними узлами системы культивирования. Соответственно, в одном из аспектов, данное изобретение предоставляет способ, который применяет «систему удерживания клеток», которая предоставляет возможность обмена сред и затем используется для дополнительного концентрирования культуры клеток для формирования криобанка.

В одном из вариантов осуществления видом используемой системы удерживания клеток является фильтр «встроенного» типа, где фильтр размещен в камере биореактора и способен перемещаться внутри камеры. Фильтр может быть связан с одной из труб, выходящих из камеры, предоставляя тем самым возможность отфильтрованной среде извлекаться из культуры. Один из примеров фильтра «встроенного» типа может быть найден в патенте США № 6544788, который настоящим включен посредством ссылки в данный документ во всей его полноте.

В другом варианте осуществления используемая система удерживания клеток является системой тангенциальной проточной фильтрации (TFF). В системе TFF, культуральную среду циркулируют от сосуда с культурой через фильтрационный модуль с последующим возвращением в сосуд с культурой посредством насоса, присоединенного к трубкам между фильтрующим модулем и сосудом с культурой, создавая тангенциальный поток через фильтрующий модуль. Второй насос располагают на стороне фильтрата фильтрующего модуля и применяют для регулирования расхода, при котором удаляют фильтрат. Применение половолоконных мембранных фильтров является предпочтительным в этой системе, поскольку они легче стерилизуются и предоставляют возможность поддержания равномерного потока через фильтрующий модуль. Однако когда половолоконные фильтры применяют в этой системе, они склонны к засорению, поскольку однонаправленный поток приводит к агрегированию механических включений на входе протока.

В определенном варианте осуществления видом применяемой системы удерживания клеток является система с чередующимся тангенциальным потоком (ATF). В системе удерживания клеток с чередующимся тангенциальным потоком (ATF) фильтрующий отсек соединен с сосудом для хранения на одном конце и диафрагменным насосом на другом. Насос первоначально перемещает среду из сосуда через фильтрующий элемент к насосу и затем изменяет направление подачи, чтобы подавать среду из насоса через фильтр и насад в сосуд, создавая двунаправленный или чередующийся поток. Это называют чередующимся тангенциальным потоком (ATF), поскольку имеет место чередующийся тангенциальный поток на фильтрующем модуле, т.е. имеет место один поток в одном и том же направлении к поверхностям мембраны фильтрующего модуля (тангенциально к этой поверхности) и имеет место другой поток, который по существу перпендикулярен этим поверхностям. Этот тип фильтрации представлен в литературе с 2000 года и приводит к быстрому, с низким сдвиговым усилием, равномерному потоку. Фильтрация с чередующимся тангенциальным потоком (ATF) может быть выполнена способами, известными в данной области, такими как те, что описаны в патенте США № 6544424, который настоящим включен посредством ссылки в данный документ во всей его полноте. Кроме того, системы с чередующимся тангенциальным потоком коммерчески доступны от производителей, таких как Refine Technology, и включают различные модели, такие как системы ATF2, ATF4, ATF6, ATF8 и ATF10.

В другом определенном варианте осуществления данного изобретения фильтр является трубчатым мембранным фильтром и, кроме того, может быть половолоконным фильтром.

Как указано выше, способы данного изобретения предоставляют возможность концентрирования клеток без центрифугирования при высоких плотностях. В частном варианте осуществления данного изобретения культуру выращивают до плотности по меньшей мере 1×107 клеток/мл, например, до примерно 1×107 клеток/мл, примерно 2×107 клеток/мл, примерно 3×107 клеток/мл, примерно 4×107 клеток/мл, примерно 5×107 клеток/мл, примерно 6×107 клеток/мл, примерно 7×107 клеток/мл или примерно 8×107 клеток/мл, и после этого периода роста имеет место стадия дополнительного концентрирования, которую выполняют при применении способов без центрифугирования. Эта стадия концентрирования может концентрировать культуру до плотности по меньшей мере 5×107 клеток/мл, например, примерно 5×107 клеток/мл, 6×107 клеток/мл, 7×107 клеток/мл, 8×107 клеток/мл, 9×107 клеток/мл, 10×107 клеток/мл, 11×107 клеток/мл, 12×107 клеток/мл, 13×107 клеток/мл, 14×107 клеток/мл, 15×107 клеток/мл, 16×107 клеток/мл или 17×107 клеток/мл. В способе без центрифугирования, применяемом для дополнительного концентрирования культуры, может быть использована любая система удерживания клеток, известная в данной области (например, фильтр «встроенного» типа, система тангенциальной проточной фильтрации (TFF) или система с чередующимся тангенциальным потоком (ATF), включая те, что описаны выше).

III. Криоконсервирование и формирование банка клеток

Криоконсервирование относится к процессу, посредством которого клетки, ткани или любые другие вещества, чувствительные к повреждению, вызываемому протеканием времени или ферментативной или химической активностью, сохраняют посредством охлаждения и хранения их при температурах ниже нуля. Значимость криоконсервирования важных линий клеток не может быть недооценена, поскольку (среди других важных преимуществ) это делает возможным сохранение этих линий без поддерживания их в состоянии постоянного культивирования, уменьшает риск загрязнения и снижает риск генетического дрейфа.

При применении способов криоконсервирования важно достигать этих низких температур и оставаться при них без вызывания дополнительного повреждения вследствие образования льда во время процесса замораживания. Способы в данной области традиционно используют вещества, которые уменьшают криоповреждение клеток, называемые криопротекторами. Криопротекторы могут быть добавлены к среде клеточных культур перед процессом замораживания. В определенном варианте осуществления применяемый криопротектор может быть одним или более видом из глицерина или диметилсульфоксида (DMSO). Кроме того, криопротектор может быть добавлен с гидроксиэтилкрахмалом (HES) или без него. В другом определенном варианте осуществления диметилсульфоксид (DMSO) может быть добавлен при концентрации по меньшей мере 5%, например, он может быть добавлен при примерно 5%, примерно 6%, примерно 7%, примерно 8%, примерно 9%, примерно 10%, примерно 11%, примерно 12%, примерно 13%, примерно 14%, примерно 15%, примерно 16%, примерно 17%, при примерно 18%, примерно 19% или при примерно 20%.

Культура с добавленным криопротектором может затем быть распределена в контейнеры, подходящие для хранения при условиях криоконсервирования. В одном из вариантов осуществления этот контейнер может быть флаконом, изготовленным из материала, который может включать (однако без ограничения ими) полимеры, такие как политетрафторэтилен, полистирол, полиэтилен или полипропилен. В определенном варианте осуществления флакон может иметь дополнительно обработанную поверхность для того, чтобы улучшить условия криоконсервирования (например, гидрофильные покрытия, которые уменьшают адсорбцию и денатурацию). В примерах осуществления флакон может иметь объем более чем примерно 0,1 мл, например, флаконом может иметь объем примерно 0,1 мл, примерно 0,5 мл, примерно 0,75 мл, примерно 1 мл, примерно 2 мл, примерно 2,5 мл, примерно 5 мл, примерно 10 мл, примерно 15 мл, примерно 20 мл, примерно 25 мл или примерно 50 мл. В другом варианте осуществления контейнер может также быть криомешком. Криомешок может быть изготовлен из любого подходящего материала, включая, однако без ограничения ими, полимеры, такие как политетрафторэтилен, полистирол, полиэтилен, полипропилен, фторсодержащий этиленпропилен (FEP) и этиленвинилацетат (EVA). Примеры одноразовых биореакторов включают, однако без ограничения ими: мешки для криоконсервирования KryoSure®, мешки PermaLife™ (OriGen Biomedical), мешки для замораживания CryoStore, биоконтейнеры Freeze-Pak™.

Эти контейнеры затем замораживают при применении методов и устройств, хорошо известных в данной области, перед хранением при низких температурах, как правило, между примерно -130°C и примерно -195°C. В одном из вариантов осуществления используемым методом замораживания может быть медленное замораживание с регулируемой скоростью (также называемое медленным программируемым замораживанием или SPF). Коллекция клеток, полученная посредством такого процесса, представляет собой банк клеток.

В варианте осуществления банк клеток может быть, однако без ограничения ими, банком клеток высокой плотности, маточным банком клеток или минибанком.

IV. Определение жизнеспособности клеток

Как указано выше, способы данного изобретения делают возможным формирование банка клеток при высоких плотностях, наряду с сохранением высокой жизнеспособности клеток для последующего применения. Как использовано в данном документе, термин «жизнеспособность клеток» может быть определен как число или процентное содержание здоровых клеток в данном образце. Жизнеспособность клеток может быть определена при использовании любого метода, применимого в данной области, в любой момент описанного процесса формирования банка клеток высокой плотности. Обычно используемые методы определения жизнеспособности клеток большей частью базируются на том принципе, что живые клетки обладают неповрежденными клеточными мембранами, которые не впускают определенные красители, такие как трипановый синий (диазокраситель), эозин или пропидий, в то время как мертвые клетки не делают этого.

В одном из вариантов осуществления трипановый синий может быть использован, чтобы окрасить некоторое количество клеток и посредством этого индицировать присутствие клеток с неповрежденными мембранами (не окрашенных) и присутствие клеток с поврежденными мембранами (синих). Эти клетки могут затем быть подсчитаны, чтобы определить численные количества как живых, так и мертвых клеток в культуре и представить их как процентное содержание, чтобы показать относительное здоровье культуры.

В определенном варианте осуществления жизнеспособность клеток может быть определена при использовании культуры, которая была концентрирована, однако еще не была заморожена (т.е. перед замораживанием культуры). В определенном варианте осуществления жизнеспособность клеток может быть определена при использовании культуры, которая была концентрирована, заморожена и затем разморожена (т.е. после размораживания культуры).

В определенном варианте осуществления жизнеспособность клеток может составлять более чем примерно 60%, например, примерно 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% или 95%. В определенных вариантах осуществления жизнеспособность после размораживания клеток составляет более чем примерно 80%, например, более чем 85%, 90% или 95% вплоть до 100%.

Апоптоз представляет собой программируемую клеточную смерть и является активным механизмом регулирования роста клеток и пролиферации. Клетки реагируют на определенные индукционные сигналы, что приводит к характеристическим физиологическим изменениям. Одним среди них является экстернализация фосфатидилсерина (PS) к внешней поверхности клеток во время раннего апоптического механизма. Guava Nexin® Assay использует аннексин V-PE (кальций-зависимый фосфолипид-связывающий белок с высоким сродством к PS), чтобы обнаружить PS на наружной мембране апоптических клеток. Краситель, неспособный к проникновению в клетку, 7-AAD, также используют в качестве индикатора структурной целостности клеточной мембраны. 7-AAD исключен из живых здоровых клеток, а также из ранних апоптических клеток. Три популяции клеток могут быть дифференцированы при такой оценке:

1) Неапоптические клетки (или здоровые клетки):

2) Аннексин V(-) и 7-AAD(-).

3) Ранние апоптические клетки: Аннексин V(+) и 7-AAD(-)

4) Поздние апоптические и мертвые клетки: Аннексин V(+) и 7-AAD(+)

Количество поздних апоптических клеток является другой мерой здоровья культур после размораживания и может быть проконтролировано, как показано на Фиг. 4 и 7B. В определенном варианте осуществления после размораживания поздние апоптические клетки должны составлять менее чем 30% жизнеспособной клеточной популяции. В другом варианте осуществления после размораживания поздние апоптические клетки должны составлять менее чем 20% жизнеспособной клеточной популяции. В другом варианте осуществления после размораживания поздние апоптические клетки должны составлять менее чем 10% жизнеспособной клеточной популяции.

V. Терапевтически важные белки

Клетки, полученные способом формирования криобанка клеток высокой плотности по данному изобретению, могут быть использованы в последующей фазе образования продукта для производства белка. Например, клетки, размноженные в биореакторе и замороженные в аликвотах банка высокой плотности в соответствии со способами данного изобретения, могут быть использованы для производства биологических веществ, включающих терапевтически важные белки. Эти биологические вещества могут включать, однако без ограничения ими: вирусы (см., например, WO200138362), связующие полипептиды, такие как антитела, например, моноклональные антитела и их фрагменты, например, Fab-фрагменты; Fc-гибридные белки, антикоагулянты, факторы крови, костные морфогенетические белки, сконструированные белковые «скеффолды», ферменты, факторы роста, гормоны, интерфероны, интерлейкины и тромболитики. Эти биологические вещества могут быть отобраны при применении любого метода, применимого в данной области. В одном из вариантов осуществления данное изобретение предоставляет способ получения биологического вещества, данный способ включает: культивирование клеток, способных к экспрессированию биологического вещества при условиях, подходящих для производства биологического вещества, в котором клетки были получены из банка замороженных клеток с высокой плотностью, образованного при применении способов перфузионного культивирования и концентрирования без центрифугирования. Биологическое вещество может быть (однако без ограничения им) белком (например, любым терапевтически важным белком).

ПРИМЕРЫ

Данное изобретение дополнительно иллюстрировано приведенными ниже примерами, которые не должны истолковываться как дополнительно ограничивающие. Содержание фигур и все ссылки, патенты и опубликованные заявки на патент, процитированные на протяжении этой заявки, включены явным образом в данный документ посредством ссылки во всей их полноте.

Пример 1: Разработка и реализация протокола формирования банка клеток высокой плотности

Этот протокол формирования криобанка клеток высокой плотности начинается с флакона на 2 мл маточного банка клеток (рабочий объем 1,5 мл) при примерной плотности 2,0-2,4×107 жизнеспособных клеток/мл (нормальное условие криоконсервирования клеток). Клетки затем выращивают в перфузионной культуре и концентрируют посредством чередующегося тангенциального потока. После добавления диметилсульфоксида (DMSO) к данной концентрированной культуре клеток, эту культуру клеток высокой плотности распределяют примерно в 200 отдельных флаконов на 5 мл (рабочий объем примерно 4,5 мл) для хранения в качестве банка клеток высокой плотности (примерно 10×107 клеток/мл).

Пример 2: Определение оптимальных способов удерживания клеток для поддержки быстрого роста клеток и скорости концентрирования.

Для того чтобы определить оптимальный способ удерживания клеток для применения при создании системы формирования банка культуры клеток высокой плотности (Фиг. 1), встроенный плавающий фильтр в стандартном GE перфузионном биореакторе, TFF (тангенциальный проточный фильтр), ATF2 и ATF4 оценивали в отношении их способности к поддержанию увеличенного роста клеток и плотности жизнеспособных клеток при определенных параметрах (Таблица 1).

Таблица 1
Экспериментальные параметры, применяемые для сравнения способов удерживания клеток
Параметр Подробное описание
Линия клеток Линия 1 клеток rCHO
Среда системы «засевание-выращивание» CD CHO с глутамином и метотрексатом
Среда биореактора CD CHO с глутамином
Биореакторы Стандартный перфузионный биореактор GE в виде мешка для культивирования клеток на 10 л;
заказной перфузионный биореактор в виде мешка для культивирования клеток на 10 л с двумя погружными трубками
Рабочий объем биореактора
Способы удерживания клеток Встроенный плавающий фильтр (0,2 пм) в стандартном GE перфузионном биореакторе, тангенциальный проточный фильтр (TFF) (0,2 мкм), тангенциальный проточный фильтр (TFF) (0,65 мкм), фильтр с чередующимся тангенциальным потоком ATF2 (0,2 мкм), фильтр с чередующимся тангенциальным потоком ATF4 (0,2 мкм)
Посевная культура биореактора «засевание-выращивание» в качалочной колбе
Плотность посева для биореактора ~5×105 /мл
Удельная скорость перфузии клеток ≥0,2 нл/клетку/день
pH 7,0±0,1
Концентрация растворенного кислорода (DO) ≥40%

Система фильтрации с чередующимся тангенциальным потоком ATF4, поддерживающая более быстрый рост клеток, достигнута при применении этих параметров наряду с быстрым (30 мин) заключительным 4-кратным концентрированием культуры без засорения фильтра. Другие способы при проведении исследования приводили к более низким величинам концентрирования жизнеспособных клеток на мл, что демонстрировало более низкую эффективность концентрирования, и/или приводили к засорению фильтра во время культивирования и/или концентрирования. Эти результаты можно видеть на Фиг. 2, Фиг. 11 и в Таблице 2.

Таблица 2
Результаты сравнения различных способов удерживания клеток
Способ удерживания Максимальная плотность жизнеспособных клеток Xv (жизнеспособных клеток/мл) DT (часы) Скорость концентрирования Эксплуатационные примечания
ATF4;
0,2мкм
6,6×107 32 30 мин; 4X Частично одноразовый, простая эксплуатация
Встроенный
фильтр
0,2мкм
2,4×107 36 20 мин; 2X Фильтр засорялся во время концентрирования
TFF 0,2 мкм 6,3×107 37 50 мин; 3X Картридж засорялся во время культивирования, использовано в совокупности два картриджа
TFF 0,65 мкм 3,5×107 34 Неприменимо Картридж засорялся во время культивирования
ATF2; 0,2мкм 2,1×107 34 90 мин; 5X Частично одноразовый

Пример 3: Определение оптимального времени для отбора культивированных клеток для концентрирования и формирования банка высокой плотности

Для того чтобы определить оптимальное время для отбора клеток для последующего заключительного концентрирования и формирования криобанка клеток высокой плотности, культуры линии 1 клеток rCHO выращивали в заказном биореакторе WAVE® (GE Healthcare Life Sciences) в виде мешка для культивирования клеток на 10 л при условиях перфузионного культивирования с применением системы с чередующимся тангенциальным потоком. Клетки при разных плотностях (14×106, 33×106, 56×106/мл) отбирали при нескольких моментах времени в течение перфузионного культивирования, чтобы создать минибанки (Фиг. 1).

Эти банки оценивали посредством сравнения после размораживания качества клеток в отношении скорости роста, жизнеспособности и смерти клеток (апоптоза). Параметры, при которых эти клетки выращивали во время первоначального культивирования и при оценке после формирования банка, представлены в Таблице 3.

Таблица 3
Экспериментальные параметры, использованные для определения момента времени для оптимального отбора клеток
Параметр Подробное описание
Линия клеток Линия 1 клеток rCHO
Среда системы «засевание-выращивание» CD CHO с глутамином и метотрексатом
Среда биореактора CD CHO с глутамином
Биореакторы заказной перфузионный биореактор в виде мешка для культивирования клеток на 10 л с двумя погружными трубками
Рабочий объем биореактора
Способы удерживания клеток ATF4 (0,2 мкм)
Посевная культура биореактора «засевание-выращивание» в качалочной колбе
Плотность посева для биореактора ~5×105 /мл
Удельная скорость перфузии клеток ≥0,2 нл/клетку/день
pH 7,0±0,1
Концентрация растворенного кислорода (DO) ≥40%
Оценка после формирования банка «Засевание-выращивание» в качалочной колбе для трех пассажей; оценивали плотность жизнеспособных клеток (Xv), жизнеспособность и апоптоз
Среда «засевания-выращивания» для оценки после формирования банка CD CHO с глутамином

Свойства клеток после размораживания для минибанков, полученных при разных плотностях клеток из этих культур, были сравнимыми в отношении их скорости роста, жизнеспособности (Фиг. 3) и степени апоптоза (Фиг. 4). Эти данные показывают, что клетки являются здоровыми и готовы для отбора вплоть до примерно 60×106 клеток/мл.

Плотности отбора примерно (30-40)×106 клеток/мл были выбраны для того, чтобы сократить период культивирования и сделать процесс более практичным. Эти культуры затем дополнительно концентрируют до >11×107 клеток/мл в течение 30 минут при применении системы с чередующимся тангенциальным потоком.

Пример 4: Определение оптимальных параметров WAVE® во время культивирования клеток высокой плотности.

Для того чтобы сделать этот процесс культивирования клеток и формирования банка высокой плотности более надежным и реализуемым в соответствии с надлежащей производственной практикой (GMP), рабочие параметры WAVE® были исследованы и установлены для того, чтобы создать систему, в которой эта культура могла бы поддерживаться при отсутствии автоматического регулирования pH и концентрации растворенного кислорода (DO).

Эти рабочие параметры WAVE® были испытаны в системе перфузионного культивирования, объединенной с системой с чередующимся тангенциальным потоком, установленной при применении параметров, указанных в Таблице 4.

Таблица 4
Экспериментальные параметры, использованные для определения рабочих параметров WAVE®
Параметр Подробное описание
Линия клеток Линия 1 клеток rCHO
Среда системы «засевание-выращивание» CD CHO с глутамином и метотрексатом
Среда биореактора CD CHO с глутамином
Биореакторы заказной перфузионный биореактор в виде мешка для культивирования клеток на 10 л с двумя погружными трубками
Рабочий объем биореактора
Способы удерживания клеток ATF4 (0,2 мкм)
Посевная культура биореактора «засевание-выращивание» в качалочной колбе
Плотность посева для биореактора ~5×105 /мл
Удельная скорость перфузии клеток ≥0,2 нл/клетку/день
pH 7,0±0,1 (с регулированием pH с обратной связью и без него)
Концентрация растворенного кислорода (DO) ≥40% (с регулированием концентрации растворенного кислорода (DO) с обратной связью и без него)

Исследование массопереноса кислорода (kLa) показывает, что скорость и угол качания WAVE® являются ключевыми параметрами, которые влияют на перенос кислорода. Кроме того, концентрация в свободном пространстве как кислорода, так и диоксида углерода может существенно влиять на концентрацию растворенного кислорода (DO) и pH.

Упрощенные рабочие условия биореактора, включающие регулирование качания WAVE® и газовыделения (Таблица 5), в комбинации с высокой скоростью перфузии были применены, чтобы достигнуть целевых уровней концентрации растворенного кислорода (DO) и pH без автоматического регулирования.

Таблица 5
Рабочие параметры WAVE® во время роста без регулирования pH и концентрации растворенного кислорода (DO)
Параметр Первоначальные заданные значения
Скорость качания (об/мин) 22
Угол качания (°) 10
Температура (°C) 37
Расход воздуха (л/мин) 0,2
CO21 10
O22 20

Когда величина pH вне системы, при измерении анализатором газов крови (BGA), составляла ≤6,9, заданное значение для CO2 уменьшали от 10% до 5%. Если измеренная величина pH вне системы снова была ≤6,9, заданное значение для CO2 уменьшали от 5% до 0%. Если величина pH вне системы по-прежнему была ≤6,9, скорость перфузии увеличивали. Когда концентрацию растворенного кислорода (DO) измеряли при ≤45%, заданное значение для O2 повышали от 20% до 30%. Если измеренная концентрация растворенного кислорода (DO) составляла снова ≤45%, скорость качания увеличивали до 25 об/мин и угол качания заменяли на 12°. В дополнение к этому, уровень O2 повышали от 30% до 40%.

Этот способ был дополнительно усовершенствован посредством регулирования скорости качания (Таблица 6) во время стадии конечного концентрирования, чтобы избежать включения воздуха в систему фильтрации с чередующимся тангенциальным потоком ATF4.

Таблица 6
Рабочие параметры WAVE® во время концентрирования
Объем биореактора Предельный угол WAVE® (°) Скорость качания (об/мин) Угол качания (°)
3,5 л - ~5 л Неприменимо 15 8
2,5 л - 3,5 л Неприменимо 5 5
~1,5 л - 2,5 л 10 0 0

Упрощенные заданные рабочие условия биореактора, включающие регулирование качания WAVE® и газовыделения, привели к сравнимым характеристикам роста клеток без опоры на автоматическое регулирование с обратной связью величины pH и концентрации растворенного кислорода (DO), Фиг. 5 и 6. Регулирование качания также приводило к минимальному включению воздуха во время стадии концентрирования системой фильтрации с чередующимся тангенциальным потоком ATF4.

Пример 5: Определение влияния стадии концентрирования системой фильтрации с чередующимся тангенциальным потоком (ATF) и выдерживания в диметилсульфоксиде (DMSO) на здоровье клеток.

Для того чтобы определить влияние стадии концентрирования системой фильтрации с чередующимся тангенциальным потоком ATF4 и выдерживания в диметилсульфоксиде (DMSO) перед замораживанием на качество клеток, качалочные колбы засеивали живыми клетками, отобранными на различных стадиях процедуры формирования банка клеток высокой плотности, для оценки роста. Образцами, отобранными и исследованными при условиях, представленных в Таблице 7, являлись образцы от стадий перед концентрированием, после концентрирования и после выдерживания в диметилсульфоксиде (DMSO) в течение от 0 до 120 мин.

Таблица 7
Экспериментальные параметры, использованные для определения рабочих параметров WAVE®.
Параметр Подробное описание
Линия клеток Линия 1 клеток rCHO
Среда системы «засевание-выращивание» CD CHO с глутамином и метотрексатом
Среда биореактора CD CHO с глутамином
Биореакторы Заказной перфузионный биореактор в виде мешка для культивирования клеток на 10 л с двумя погружными трубками
Рабочий объем биореактора
Способы удерживания клеток ATF4 (0,2 мкм)
Посевная культура биореактора «засевание-выращивание» в качалочной колбе
Плотность посева для биореактора ~5×105 /мл
Удельная скорость перфузии клеток ≥0,2 нл/клетку/день
pH 7,0±0,1 (с регулированием pH с обратной связью и без него)
Концентрация растворенного кислорода (DO) ≥40% (с регулированием концентрации растворенного кислорода (DO) с обратной связью и без него)
Оценка качества клеток Плотность жизнеспособных клеток (Xv), жизнеспособность, апоптоз
Среда системы «засевание-выращивание» для оценки качества клеток CD CHO с глутамином

Рост клеток (Фиг. 7A) и степень апоптоза (Фиг. 7B) клеток перед концентрированием и клеток после концентрирования были сравнимыми, так же как и рост клеток и степени апоптоза клеток при различных продолжительностях выдерживания в диметилсульфоксиде (DMSO). Это предполагает, что практически осуществимо концентрирование фильтрацией с чередующимся тангенциальным потоком ATF4 в сосуде в течение 30 мин и полномасштабное высвобождение для 200 флаконов в течение 90 мин наряду с поддержанием качества ячеек перед замораживанием.

Пример 6: Определение качества клеток после формирования банка и применимости платформы к различным линиям клеток

Для того чтобы определить качество клеток после формирования банка для банков клеток высокой плотности, клетки после размораживания культивировали и исследовали, чтобы определить относительные скорости роста клеток, жизнеспособность и уровни апоптоза. Кроме того, три разных линии клеток (линии 1, 2 и 3 клеток rCHO) использовали для того, чтобы гарантировать то, что эта платформа может быть легко применена к другим линиям клеток. Экспериментальные условия, при которых эти клетки выращивали перед формированием банка и после него, подробно представлены в Таблице 8.

Таблица 8
Экспериментальные параметры, использованные для оценки качества клеток после формирования банков высокой плотности (HD) для различных линий клеток
Параметр Подробное описание
Линия клеток Линии 1, 2 и 3 клеток rCHO
Среда системы «засевание-выращивание» CD CHO с глутамином и метотрексатом для линии 1 клеток rCHO, CD CHO с глутамином для линий 2 и 3 клеток rCHO
Среда биореактора CD CHO с глутамином
Биореакторы Заказной перфузионный биореактор в виде мешка для культивирования клеток на 10 л с двумя погружными трубками
Рабочий объем биореактора
Способы удерживания клеток ATF4 (0,2 мкм)
Посевная культура биореактора «засевание-выращивание» в качалочной колбе
Плотность посева для биореактора ~5×105 /мл
Удельная скорость перфузии клеток ≥0,2 нл/клетку/день
pH 7,0±0,1 (без регулирования pH с обратной связью)
Концентрация растворенного кислорода (DO) ≥40% (без регулирования концентрации растворенного кислорода (DO) с обратной связью)
Оценка после формирования банка «засевание-выращивание» в качалочной колбе для вплоть до трех пассажей; оценивали плотность жизнеспособных клеток (Xv), жизнеспособность и апоптоз
Среда «засевания-выращивания» для оценки после формирования банка CD CHO с глутамином

После размораживания рост клеток, жизнеспособность и уровни апоптоза оценивали в отношении линии 1 клеток rCHO (Фиг. 8A-B), линии 2 клеток rCHO (Фиг. 9A-B) и линии 3 клеток rCHO (Фиг. 10A-B) в образцах банков как с высокой плотностью (10×107 клеток/мл), так и с нормальной плотностью (2,0-2,4×106 жизнеспособных клеток/мл). Клетки показывали высокие скорости роста и жизнеспособность при низких уровнях апоптоза. Степени извлечения варьировались в зависимости от исследуемых линий клеток.

1. Способ формирования без центрифугирования банка замороженных клеток млекопитающих с высокой плотностью, данный способ включает:

a) культивирование клеток в перфузионном биореакторе до первой плотности клеток путем непрерывного удаления среды для выращивания культуры из культуры и замены на свежую среду для выращивания культуры, где указанный биореактор перемешивают для эффективного смешивания и газообмена, при этом указанный биореактор связан с системой удерживания клеток, включающей систему чередующейся тангенциальной проточной фильтрации 4 (ATF4), включающую фильтр;

b) концентрирование без центрифугирования до второй плотности клеток, большей, чем первая плотность клеток, путем удаления среды для выращивания культуры из культуры с использованием фильтра и, таким образом, уменьшения объема среды для выращивания культуры для получения концентрированной клеточной популяции при плотности клеток от 1×108 клеток/мл до 2×108 клеток/мл;

c) криоконсервирование концентрированной клеточной популяции для получения банка замороженных клеток с высокой плотностью с жизнеспособностью после размораживания от 60 до 95%.

2. Способ по п.1, в котором фильтр имеет площадь поверхности 0,3 м2, предпочтительно от 0,3 до 0,5 м2, от 0,5 до 1,0 м2, от 0,7 до 0,8 м2, от 1,0 до 2,0 м2, от 2,0 до 3,0 м2, от 3,0 до 4,0 м2 или от 4,0 до 5,0 м2.

3. Способ по п.1, в котором фильтр имеет размер пор, выбранный из группы, состоящей из 0,2 мкм, 0,4 мкм и 0,65 мкм.

4. Способ по п.1, в котором концентрированная клеточная популяция имеет плотность клеток, выбранную из группы, состоящей из 1,0×108, 1,1×108 клеток/мл, 1,2×108 клеток/мл, 1,3×108 клеток/мл, 1,5×108 клеток/мл, 1,7×108 клеток/мл и 2,0×108 клеток/мл.

5. Способ по п.1, в котором указанное криоконсервирование включает добавление диметилсульфоксида (DMSO) к концентрированной клеточной популяции при конечной концентрации от 5 до 10% по объему.

6. Способ по п.1, в котором указанное криоконсервирование включает замораживание части концентрированной клеточной популяции в контейнере, подходящем для хранения при условиях криоконсервирования.

7. Способ по п.6, в котором контейнер является флаконом.

8. Способ по п.6, в котором контейнер является криомешком.

9. Способ по п.1, в котором скорость перфузии в перфузионном биореакторе находится в интервале от 0,02 до 0,5 нл/клетку/день.

10. Способ по п.1, в котором культура клеток в перфузионном биореакторе имеет pH между 6,8 и 7,2.

11. Способ по п.1, в котором культура клеток в перфузионном биореакторе имеет концентрацию растворенного кислорода примерно 30%.

12. Способ по п.1, в котором биореактор является биореактором в виде эластичного мешка.

13. Способ по п.1, в котором банк замороженных клеток с высокой плотностью имеет жизнеспособность после размораживания, выбранную из 90% и 95%.

14. Способ по п.1, в котором клетки являются трансфицированными клетками.

15. Способ формирования без центрифугирования банка замороженных клеток млекопитающих с высокой плотностью, данный способ включает:

a) культивирование клеток в перфузионном биореакторе до плотности клеток 1×108 клеток/мл путем непрерывного удаления среды для выращивания культуры из культуры и замены на свежую среду для выращивания культуры, где перфузионный биореактор связан с системой чередующейся тангенциальной проточной фильтрации, включающей фильтр, где биореактор включает биореактор в виде эластичного мешка, и где фильтр имеет площадь фильтрующей поверхности от 0,3 до 5 м2 и фильтр с величиной номинального отсечения по молекулярной массе (MWCO) от 10 до 100 кДа;

b) концентрирование без центрифугирования клеток путем удаления среды для выращивания культуры из культуры и уменьшения объема среды для выращивания культуры с применением системы чередующейся тангенциальной проточной фильтрации, чтобы получить концентрированную клеточную популяцию, имеющую плотность от 1,0×108 до 4,5×108 клеток/мл;

c) криоконсервирование концентрированной клеточной популяции, чтобы получить банк замороженных клеток с высокой плотностью, где криоконсервирование включает добавление диметилсульфоксида (DMSO) к концентрированной клеточной популяции до конечной концентрации от 5 до 10% по объему; и где банк замороженных клеток с высокой плотностью имеет плотность клеток примерно 1×108 клеток/мл, и где банк замороженных клеток с высокой плотностью обладает жизнеспособностью после размораживания 60%.

16. Способ по п.1 или 15, в котором pH и концентрацию растворенного кислорода (DO) культуры регулируют автоматическими методами.

17. Способ по п.1 или 15, в котором pH и концентрацию растворенного кислорода (DO) культуры регулируют неавтоматическими методами.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области биохимии. Предложено устройство для формирования двухслойной клеточной модели на пористой мембране культуральной вставки Трансвелл.

Изобретение относится к медицине, в частности к хранению биологических образцов. Устройство для криоконсервации в закрытой системе для витрификации биологических образцов содержит удлиненный корпус, усеченный конус, проходящий от первого конца удлиненного корпуса, наконечник для сбора образцов, проходящий от указанного конуса в направлении, противоположном удлиненному корпусу, и удлиненный колпачок для герметичного закрытия биологического образца удлиненной полой камерой.

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности молекулярной биологии и онкологии. Описан способ для прогнозирования метастазирования рака яичников на основе группы генов микроРНК путем выявления метилирования по крайней мере трех маркеров из пяти, способ отличается тем, что маркерами системы являются гены: miR-137, miR-193a, miR-1258, miR-203 и miR-127.

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ стимуляции выработки гранулоцитарного колониестимулирующего фактора клетками костного мозга in vitro, заключающийся в том, что клетки костного мозга культивируют в CO2-инкубаторе при 37°C, 5% СО2 и 100% влажности воздуха в течение 24 часов в полной культуральной среде следующего состава: 90% среды RPMI-1640, 10% ЭТС, 280 мг/л L-глутамина, 50 мг/л гентамицина с добавлением стимулятора, где культивируют неприлипающую фракцию клеток костного мозга, а в качестве стимулятора используют ингибитор PI3K в концентрации 50 мкМ.

Изобретение относится к области клеточной биологии и биотехнологии, а именно к способу получения клеток, экспрессирующих Т-клеточный рецептор (TCR). Способ включает приведение клеток, способных к дифференцировке в клетки Т-клеточной линии, в контакт со стромальными клетками и пептидным антигеном для дифференцировки в DN TCRαβ+ тимоциты.
Изобретение относится к области клеточной биологии и биотехнологии, конкретно к способу увеличения экспрессии NGN3 и NKX6.1 в популяции клеток эндокринной линии поджелудочной железы.

Изобретение относится к области клеточной биологии и биотехнологии, в частности к получению культуральной ростовой добавки для культивирования опухолевых клеток.

Группа изобретений относится к биотехнологии. Предложены варианты определенного состава культивирования клеток для культивирования, обновления и размножения плюрипотентных стволовых клеток.

Изобретение относится к области клеточной биологии и биотехнологии, конкретно к увеличению экспрессии инсулина и MAFA в панкреатических эндокринных клетках. Способ включает дифференцировку плюрипотентных стволовых клеток человека, полученных без разрушения человеческого эмбриона, или плюрипотентных стволовых клеток человека не эмбрионального происхождения, или клеток из линий человеческих эмбриональных стволовых клеток H1 или H7, или H9, или SA002, в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, и последующее культивирование в среде, содержащей добавленное количество ингибитора циклин-зависимой киназы, что приводит к увеличению экспрессии инсулина и MAFA.

Изобретение относится к биотехнологии. Описаны композиции и способы для определения находящихся в системе кровообращения биомолекул до, во время и/или после лечения пациента противораковым или противоопухолевым лекарственным препаратом (или предполагаемым лекарственным препаратом).

Изобретение относится к области биохимии. Предложено устройство для формирования двухслойной клеточной модели на пористой мембране культуральной вставки Трансвелл.

Изобретение относится к области биохимии. Предложен носитель для культивирования клеток человека и животных.

Изобретение относится к области биохимии. Предложен способ экспресс-оценки жизнеспособности клеток в тканеинженерных конструкциях.
Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к культуральной среде для ооцитов и эмбрионов, характеризующейся тем, что содержит в своем составе кальцитонин в концентрации 10-40 нг/мл и трифенилфосфонийсодержащие производные пластохинола в концентрации 10-16-10-9 моль/л.

Изобретение относится к области медицины и молекулярной биологии, а именно к фтизиатрии, и может быть использовано в лабораторной диагностике туберкулеза легких. Способ выделения ДНК клинических изолятов Mycobacterium tuberculosis из ткани легкого заключается в добавлении к образцу ткани легкого, находящемуся в пробирке, содержащей стеклянные шарики, деконтаминирующего лизирующего буфера состава 5 М GuSCN, 100 мМ TRIS HCl рН 8.0, 10 мМ EDTA рН 8.0, 100 мМ NaCl, 0,5% SDS, с последующими центрифугированием и осаждением спиртом.

Изобретение относится к области биохимии. Описана группа изобретений, включающая способ прижизненного определения уровня цитопролиферативного фактора (фактора старения) у млекопитающего, исключая человека, способ прижизненного определения уровня цитопролиферативного фактора у собаки и способ прижизненного определения уровня цитопролиферативного фактора у кошки.

Группа изобретений относится к биотехнологии и медицине, а именно к безвекторной микрожидкостной платформе для внутриклеточной доставки в цитозоль эукариотической клетки соединения или композиции.

Изобретение относится к области биомедицины и касается способа получения ростовой добавки к среде для культивирования клеток человека из тромбоцитарной массы доноров.

Изобретение относится к области биохимии, генной инженерии и биотехнологии, в частности к конъюгату рекомбинантной бутирилхолинэстеразы человека и окисленной каламиновой кислоты со средней молекулярной массой 27 кДа.

Изобретение относится к области биохимии. Предложен биореактор для выращивания тканеинженерных конструкций.

Изобретение относится к области биохимии. Предложено устройство для формирования двухслойной клеточной модели на пористой мембране культуральной вставки Трансвелл.

Группа изобретений относится к биотехнологии. Предложены способы формирования без центрифугирования банка замороженных клеток млекопитающих с высокой плотностью. Способы предусматривают культивирование клеток в перфузионном биореакторе, связанном с системой чередующейся тангенциальной проточной фильтрации, концентрирование без центрифугирования с использованием фильтра либо с применением системы чередующейся тангенциальной проточной фильтрации и криоконсервирование концентрированной клеточной популяции. Изобретения обеспечивают формирование банка жизнеспособных клеток высокой плотности с низким уровнем апоптоза. 2 н. и 15 з.п. ф-лы, 15 ил., 8 табл., 6 пр.

Наверх