Мутантный кальретикулин для диагностики миелоидных новообразований

Авторы патента:

КРАЛОВИЧ Роберт (AT)

ГИССЛИНГЕР Хайнц (AT)

КЛАМПФЛ Торстен (GB)

G01N33/57426 - Исследование или анализ материалов особыми способами, не отнесенными к предыдущим группам

G01N2333/4727 - Исследование или анализ материалов путем определения их химических или физических свойств (разделение материалов вообще B01D,B01J,B03,B07; аппараты, полностью охватываемые каким-либо подклассом, см. в соответствующем подклассе, например B01L; измерение или испытание с помощью ферментов или микроорганизмов C12M,C12Q; исследование грунта основания на стройплощадке E02D 1/00;мониторинговые или диагностические устройства для оборудования для обработки выхлопных газов F01N 11/00; определение изменений влажности при компенсационных измерениях других переменных величин или для коррекции показаний приборов при изменении влажности, см. G01D или соответствующий подкласс, относящийся к измеряемой величине; испытание

C12Q2600/172 - Способы измерения или испытания, использующие ферменты или микроорганизмы (иммунологический анализ G01N 33/53); составы или индикаторная бумага для них; способы получения подобных составов; контроль за условиями в микробиологических или ферментативных процессах

C12Q1/6886 - Способы измерения или испытания, использующие ферменты или микроорганизмы (устройства для измерения или испытания при работе с ферментами или микроорганизмами, например счетчики колоний C12M 1/34); составы для них; способы получения подобных составов

C12Q1/68 - использующие нуклеиновые кислоты

C12N2310/14 - Микроорганизмы или ферменты; их композиции (биоциды, репелленты или аттрактанты или регуляторы роста растений, содержащие микроорганизмы, вирусы, микробные грибки, ферменты, агенты брожения или вещества, получаемые или экстрагируемые из микроорганизмов или из материала животного происхождения A01N 63/00; пищевые составы A21,A23; лекарственные препараты A61K; химические аспекты или использование материалов для бандажей, перевязочных средств, впитывающих подкладок или хирургических приспособлений A61L; удобрения C05); размножение, консервирование или сохранение микроорганизмов (консервирование живых тканей или органов людей или животных A01N 1/02); мутации или генная инженерия; питательные среды (среды для микробиологических испытаний C12Q)

C12N15/113 - Получение мутаций или генная инженерия; ДНК или РНК, связанные с генной инженерией, векторы, например плазмиды или их выделение, получение или очистка; использование их хозяев (мутанты или микроорганизмы, полученные генной инженерией C12N 1/00,C12N 5/00,C12N 7/00; новые виды растений A01H; разведение растений из тканевых культур A01H 4/00; новые виды животных A01K 67/00; использование лекарственных препаратов, содержащих генетический материал, который включен в клетки живого организма, для лечения генетических заболеваний, для генной терапии A61K 48/00 пептиды вообще C07K)

C07K2317/76 - Пептиды (пептиды в пищевых составах A23, например получение белковых композиций для пищевых составов A23J, препараты для медицинских целей A61K; пептиды, содержащие бета-лактамовые кольца, C07D; циклические дипептиды, не содержащие в молекуле любого другого пептидного звена, кроме образующего их кольцо, например пиперазин-2,5-дионы, C07D; алкалоиды спорыньи циклического пептидного типа C07D519/02; высокомолекулярные соединения, содержащие статистически распределенные аминокислотные единицы в молекулах, т.е. при получении предусматривается не специфическая, а случайная последовательность аминокислотных единиц, гомополиамиды и блоксополиамиды, полученные из аминокислот, C08G 69/00; высокомолекулярные продукты, полученные из протеинов, C08H 1/00; получение

C07K16/18 - против материала из животных или человека

C07K14/4728 - Пептиды, содержащие более 20 аминокислот; гастрины; соматостатины; меланотропины; их производные

C07K14/47 - из млекопитающих

A61K39/0005 - Лекарственные препараты, содержащие антигены или антитела (материалы для иммунологического анализа G01N 33/53)

Владельцы патента RU 2668808:

ЦЕММ - ФОРШУНГСЦЕНТРУМ ФЮР МОЛЕКУЛАРЕ МЕДИЦИН ГМБХ (AT)

Изобретение относится к биотехнологии. Изобретение касается способа диагностики миелоидных новообразований. Способ включает определение присутствия мутантного аллеля гена кальретикулина. Если присутствует указанный один или более мутантных аллелей гена кальретикулина, то пациент страдает миелоидным новообразованием. Изобретение также включает геномные последовательности, последовательности кДНК, последовательности мРНК и белковые последовательности мутантного кальретикулина. 5 н. и 57 з.п. ф-лы, 10 ил., 5 табл., 2 пр.

Настоящее изобретение относится к способу диагностики миелоидного новообразования, включающему определение присутствия мутантного аллеля гена кальретикулина. Также предметом настоящего изобретения являются геномные последовательности, последовательности кДНК, последовательности мРНК и белковые последовательности мутантного кальретикулина. Кроме того, изобретение относится к медицинским применениям ингибиторов мутантного кальретикулина.

Первичный миелофиброз (ПМФ), эссенциальная тромбоцитемия (ЭТ) и истинная полицитемия (ИП) представляют собой клональные гематологические расстройства, которые относятся к классическим BCR-ABL-негативным миелопролиферативным новообразованиям (МПН) (Campbell & Green, 2006). С момента открытия в 2005 г. соматической мутации в гене киназы JAK2 был достигнут огромный прогресс в области молекулярной диагностики, клинического ведения, лечения и молекулярного понимания МПН. Мутация с заменой валина на фенилаланин (V617F) конститутивно активирует киназу Jak2, приводя к повышенному фосфорилированию ее субстратов (Stat5, STAT3, Erk и т.д.) и приводя к повышенной реактивности цитокинов миелоидных клеток (Baxter et al., 2005; James et al., 2005; Kralovics et al., 2005; Levine et al., 2005). Вскоре последовало обнаружение дополнительных мутаций, таких как в экзоне 12 гена JAK2 при ИП (Scott ЭТ al., 2007) и в гене MPL рецептора тромбопоэтина при ПМФ и ЭТ (Pardanani ЭТ al., 2006; Pikman ЭТ al., 2006). Хотя эти три заболевания, относящиеся к MPN, различаются по своей клинической картине, они разделяют многие молекулярные, а также клинические признаки. Мутация JAK2-V617F имеется примерно в 95% случаев ИП, 60% ПМФ и 50% случаев ЭТ соответственно. Мутации в экзоне 12 гена JAK2 специфичны примерно для 3% случаев ИП, в то время как мутации MPL сводятся к ПМФ (5%) и ЭТ (3%). Во всех трех группах МПН имеется предрасположенность с различной степенью к тромбозам, кровотечению и лейкозному перерождению (Sverdlow et al., 2008). Несмотря на то, что пациенты могут оставаться в хронической фазе МПН в течение нескольких лет, прогрессирование заболевания происходит в форме вторичного миелофиброза при ИП и ЭТ, развитии ускоренной фазы с различной степенью панцитопении с последующим лейкозным перерождением, имеющим место во всех трех группах МПН (Sverdlow et al., 2008).

Соматические мутации накапливаются в течение всей клональной эволюции гемопоэтических стволовых клеток при МПН. Эти приобретенные генетические изменения могут представлять точечные мутации, хромосомные повреждения и эпигенетические дефекты, и все они могут вносить свой вклад в адекватность развивающегося клона (Klampfl et al., 2011; Kralovics, 2008). Эти мутации могут ускорить пролиферацию посредством различных механизмов, снизить потенциал дифференцировки предшественников или сделать их менее восприимчивыми к апоптозу. Мутации, влияющие на эти механизмы, были описаны в генах, таких как TЕТ2 (Delhommeau et al., 2009), EZH2 (Ernst et al., 2010), DNMT3A (Stegelmann et al., 2011), ASXL1 (Stein et al., 2011) и TP53 (Harutyunyan et al., 2011) при различных типах миелоидных новообразований, включая МПН (Milosevic & Kralovics, 2013). Однако до сих пор только мутации JAK2 и MPL рассматриваются как сильно ассоциированные с МПН, и они представляют собой самые полезные молекулярные маркеры МПН.

Несмотря на достигнутый прогресс в понимании молекулярного патогенеза МПН примерно у половины пациентов с ПМФ и ЭТ отсутствует молекулярный маркер для диагностики, поскольку эти пациенты являются негативными для обеих мутаций JAK2 и MPL.

Таким образом, технической проблемой, лежащей в основе настоящего изобретения, является обеспечение средств и способов диагностики миелоидного новообразования.

Следовательно, настоящее изобретение относится к способу оценки того, страдает ли пациент миелоидным новообразованием или предрасположен страдать миелоидным новообразованием, где указанный способ включает:

- определение присутствия одного или более мутантных аллелей гена кальретикулина в образце от указанного пациента; и

- оценку того, что указанный пациент страдает миелоидным новообразованием или предрасположен страдать миелоидным новообразованием, когда присутствует указанный один или более мутантных аллелей гена кальретикулина.

Техническая проблема решается обеспечением вариантов осуществления, охарактеризованных в формуле изобретения.

Настоящее изобретение решает вышеуказанную техническую проблему, поскольку, как описано здесь ниже и в прилагаемых примерах, было с удивлением обнаружено, что у пациентов, страдающих миелоидным новообразованием, предпочтительно первичным миелофиброзом (ПМФ) и эссенциальной тромбоцитемией (ЭТ), имеются соматические мутации в гене кальретикулина (CALR). Еще одним неожиданным открытием было то, что эти соматические мутации в гене CALR, специфические для миелоидных клеток, у пациентов с МПН сильно ассоциированы с теми пациентами, которые являются негативными на обе мутации JAK2 и MPL (которые ранее описывались, как болезнетворные мутации при МПН). Как здесь показано, мутации CALR встречаются в 88% случаев ПМФ, и в 68% случаев ЭТ это двойные отрицательные на JAK2 и MPL. Таким образом, настоящее изобретение обеспечивает надежную диагностику миелоидных новообразований. Изобретение особенно пригодно для пациентов, для которых не существует надежных маркеров, таких как пациенты, которые являются отрицательными на мутации JAK2 и MPL.

Кроме того, было установлено, что представленные здесь соматические мутации в гене кальретикулина (CALR) приводят к образованию С-конца белка кальретикулина, который имеет совершенно другие характеристики по сравнению с белком кальретикулином дикого типа. Полагается, что эти другие характеристики вызывают или вносят свой вклад в развитие миелоидного новообразования, предпочтительно первичного миелофиброза (ПМФ) и эссенциальной тромбоцитемии (ЭТ).

Все мутации CALR, идентифицированные здесь, находятся в последнем экзоне 9, кодирующем С-концевые аминокислоты белка и преимущественно представляют мутации по типу инсерции/делеции. Большинство мутаций находилось в гетерозиготном состоянии, и они вызывали сдвиг рамки считывания на альтернативную рамку считывания (альтернативная рамка считывания 1, как показано на фигуре 3А). Этот сдвиг рамки считывания приводит к замене С-концевых отрицательно заряженных аминокислот (богатого аспарагиновой и глутаминовой кислотами) кальретикулина преимущественно положительно заряженным полипептидом, богатым аргинином и метионином. Кроме того, последние 4 аминокислоты кальретикулина (KDEL (SEQ ID NO: 1331)) содержат сигнал удерживания в эндоплазматическом ретикулуме. Этот сигнал отсутствует в мутантном кальретикулине, что позволяет предположить, что мутантный белок менее представлен в ЭР по сравнению с белком дикого типа. Поскольку отрицательно заряженный С-конец кальретикулина представляет Са²⁺-связывающий домен с низкой аффинностью и высокой емкостью, то предполагается, что Са²⁺-связывающая функция мутантного белка отсутствует. В данном документе было показано, что преобладающие мутации CALR представляют мутации типа 1 и типа 2, как здесь определено; смотри фиг. 3E. Следовательно, эти мутанты и их применение по настоящему изобретению являются более предпочтительным. Последовательности нуклеиновых кислот, кодирующих С-конец, и аминокислотная последовательность С-конца при мутациях CALR типа 1 и типа 2, показаны в SEQ ID NO:5-12. В настоящем документе раскрыты дополнительные мутации нуклеиновых кислот CALR типа 1 и типа 2.

Настоящее изобретение относится к следующим пунктам:

1. Способ оценки того, страдает ли пациент миелоидным новообразованием или предрасположен страдать миелоидным новообразованием, где указанный способ включает:

2. Способ по п. 1,

где указанный один или более мутантных аллелей содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую мутантный белок кальретикулин.

3. Способ по п. 2, где указанный мутантный белок кальретикулин выбран из группы, включающей:

(а) белок, кодированный молекулой нуклеиновой кислоты, имеющей последовательность нуклеиновой кислоты, показанную в SEQ ID NO:1, 2 или 3;

(b) белок, содержащий аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 4;

(d) белок, кодированный молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей белок, содержащий аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 4;

(e) белок, содержащий аминокислотную последовательность, кодированную нуклеиновой кислотой, гибридизующейся в жестких условиях с комплементарной цепью молекул нуклеиновой кислоты, определенных в пп. (а) или (с);

(f) белок, обладающий, по меньшей мере, 70% идентичностью с белком по любому из пп. (а)-(е); и

(g) белок, содержащий аминокислотную последовательность, кодированную нуклеиновой кислотой, которая является вырожденной в результате свойства генетического кода по отношению к нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты, определенной в пп. (а), (d) или (e).

4. Способ по пп. 2 или 3, где указанный мутантный белок кальретикулин выбран из группы, включающей:

(d) белок, кодированный молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей белок, содержащий аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64, 68, 72, 76, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 124, 128, 132, 136, 140 или 144;

(f) белок, обладающий, по меньшей мере, 70% идентичностью с белком по любому из пп. (а)-(е); и

5. Способ по любому из пп. 2-4, где указанный мутантный белок кальретикулин выбран из группы, включающей:

(a) белок, кодированный молекулой нуклеиновой кислоты, имеющей последовательность нуклеиновой кислоты, показанную в SEQ ID NO: 291, 292, 293, 295, 296, 297, 299, 300, 301, 303, 304, 305, 307, 308, 309, 311, 312, 313, 315, 316, 317, 319, 320, 321, 323, 324, 325, 327, 328, 329, 331, 332, 333, 335, 336, 337, 339, 340, 341, 343, 344, 345, 347, 348, 349, 351, 352, 353, 355, 356, 357, 359, 360, 361, 363, 364, 365, 367, 368, 369, 371, 372, 373, 375, 376, 377, 379, 380, 381, 383, 384, 385, 387, 388, 389, 391, 392, 393, 395, 396, 397, 399, 400, 401, 403, 404, 405, 407, 408, 409, 411, 412, 413, 415, 416, 417, 419, 420, 421, 423, 424, 425, 427, 428, 429, 431, 432 или 433;

(b) белок, содержащий аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 294, 298, 302, 306, 310, 314, 318, 322, 326, 330, 334, 338, 342, 346, 350, 354, 358, 362, 366, 370, 374, 378, 382, 386, 390, 394, 398, 402, 406, 410, 414, 418, 422, 426, 430 или 434;

(d) белок, кодированный молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей белок, содержащий аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 294, 298, 302, 306, 310, 314, 318, 322, 326, 330, 334, 338, 342, 346, 350, 354, 358, 362, 366, 370, 374, 378, 382, 386, 390, 394, 398, 402, 406, 410, 414, 418, 422, 426, 430 или 434;

(f) белок, обладающий, по меньшей мере, 70% идентичностью с белком по любому из пп. (а)-(е); и

6. Способ по любому из пп. 2-5, где указанный мутантный белок кальретикулин выбран из группы, включающей:

(d) белок, кодированный молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей белок, содержащий аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 228, 232, 236, 240, 244, 248, 252, 256, 260, 264, 268, 272, 276, 280, 284, или 288;

(f) белок, обладающий, по меньшей мере, 70% идентичностью с белком по любому из пп. (а)-(е); и

7. Способ по любому из пп. 1-6, где указанный один или более мутантных аллелей гена кальретикулина находится в области, охватывающей экзон 9 гена кальретикулина.

8. Способ по любому из пп. 1-7, где указанный мутантный аллель содержит мутацию сдвига рамки считывания в гене кальретикулина дикого типа.

9. Способ по п. 8, где указанная мутация сдвига рамки считывания находится в экзоне 9 гена кальретикулина.

10. Способ по пп. 8 или 9, где указанная мутация сдвига рамки считывания представляет делецию одного нуклеотида или добавление двух нуклеотидов.

11. Способ по любому из пп. 8 или 9, где (1+(3×n₀)) нуклеотидов делецировано из гена кальретикулина.

12. Способ по любому из пп. 8, 9 и 11, где 1, 4, 19, 22, 31, 34, 46, 52 нуклеотида делецированы.

13. Способ по любому из пп. 8, 9, 11 и 12,

где 1 нуклеотид делецирован и где 6 нуклеотидов инсерцированы;

где 2 нуклеотида делецированы и где 4 нуклеотида инсерцированы;

где 3 нуклеотида делецированы и где 5 нуклеотидов инсерцированы;

где 12 нуклеотидов делецированы и где 5 нуклеотидов инсерцированы;

где 18 нуклеотидов делецированы и где 11 нуклеотидов инсерцированы;

где 18 нуклеотидов делецированы и где 14 нуклеотидов инсерцированы;

где 20 нуклеотидов делецированы и где 1 нуклеотид инсерцирован;

где 28 нуклеотидов делецированы и где 6 нуклеотидов инсерцированы;

где 35 нуклеотидов делецированы и где 1 нуклеотид инсерцирован; или

где 36 нуклеотидов делецированы и где 2 нуклеотида инсерцированы.

14. Способ по пп. 8 или 9, где (2+(3×n₀)) нуклеотидов инсерцированы в ген кальретикулина.

15. Способ по п. 14, где 5 нуклеотидов инсерцированы.

16. Способ по любому из пп. 1-15, где указанный ген кальретикулина содержит последовательность, выбранную из группы, включающей:

(а) нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 290;

(b) нуклеиновую кислоту, содержащую нуклеотидную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 289;

(c) нуклеиновую кислоту, гибридизующуюся в жестких условиях с комплементарной цепью нуклеиновой кислоты, определенной в (а) или (b);

(d) нуклеиновую кислоту, содержащую нуклеотидную последовательность, по меньшей мере, с 70% идентичностью с нуклеотидной последовательностью нуклеиновых кислот по любому из пп. (а)-(с); и

(e) нуклеиновую кислоту, содержащую нуклеотидную последовательность, которая является вырожденной в результате свойства генетического кода по отношению к нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты по любому из пп. (а)-(d).

17. Способ по любому из пп. 10-16, где указанный нуклеотид(ы) делецирован из и/или инсерцирован в экзоне 9 гена кальретикулина.

18. Способ по любому из пп. 9-17, где указанный экзон 9 гена кальретикулина содержит последовательность, выбранную из группы, включающей:

(а) нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 436;

(b) нуклеиновую кислоту, содержащую нуклеотидную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 435;

19. Способ по любому из пп. 1-18, где указанный мутантный аллель содержит нуклеиновую кислоту, выбранную из группы, включающей:

(а) нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64, 68, 72, 76, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 124, 128, 132, 136, 140, 144, 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 228, 232, 236, 240, 244, 248, 252, 256, 260, 264, 268, 272, 276, 280, 284, 288; 294, 298, 302, 306, 310, 314, 318, 322, 326, 330, 334, 338, 342, 346, 350, 354, 358, 362, 366, 370, 374, 378, 382, 386, 390, 394, 398, 402, 406, 410, 414, 418, 422, 426, 430 или 434;

(b) нуклеиновую кислоту, содержащую нуклеотидную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 1, 5, 9, 13, 17, 21, 25, 29, 33, 37, 41, 45, 49, 53, 57, 61, 65, 69, 73, 77, 81, 85, 89, 93, 97, 101, 105, 109, 113, 117, 121, 125, 129, 133, 137, 141, 145, 149, 153, 157, 161, 165, 169, 173, 177, 181, 185, 189, 193, 197, 201, 205, 209, 213, 217, 221, 225, 229, 233, 237, 241, 245, 249, 253, 257, 261, 265, 269, 273, 277, 281, 285, 291, 295, 299, 303, 307, 311, 315, 319, 323, 327, 331, 335, 339, 343, 347, 351, 355, 359, 363, 367, 371, 375, 379, 383, 387, 391, 395, 399, 403, 407, 411, 415, 419, 423, 427 или 431;

(c) нуклеиновую кислоту, гибридизующуюся в жестких условиях с комплементарной цепью нуклеиновой кислоты, определенной в пп. (а) или (b);

20. Способ по любому из пп. 1-19, где указанный мутантный аллель представляет ДНК, предпочтительно геномную ДНК.

21. Способ по п. 20, где присутствие указанной ДНК определяется секвенированием.

22. Способ оценки того, страдает ли пациент миелоидным новообразованием или предрасположен страдать миелоидным новообразованием, где указанный способ включает:

- определение присутствия генного продукта одного или более мутантных аллелей гена кальретикулина в образце от указанного пациента; и

- оценку того, что указанный пациент страдает миелоидным новообразованием или предрасположен страдать миелоидным новообразованием, когда присутствует указанный генный продукт.

23. Способ по п. 22,

24. Способ по п. 23, где указанный мутантный белок кальретикулин выбран из группы, включающей:

(b) белок, содержащий аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 4;

(f) белок, обладающий, по меньшей мере, 70% идентичностью с белком по любому из пп. (а)-(е); и

25. Способ по пп. 23 или 24, где указанный мутантный белок кальретикулин выбран из группы, включающей:

(f) белок, обладающий, по меньшей мере, 70% идентичностью с белком по любому из пп. (а)-(е); и

26. Способ по любому из пп. 23-25, где указанный мутантный белок кальретикулин выбран из группы, включающей:

(f) белок, обладающий, по меньшей мере, 70% идентичностью с белком по любому из пп. (а)-(е); и

(g) белок, содержащий аминокислотную последовательность, кодированную нуклеиновой кислоты, которая является вырожденной в результате свойства генетического кода по отношению к нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты, определенной в пп. (а), (d) или (e).

27. Способ по любому из пп. 23-26, где указанный мутантный белок кальретикулин выбран из группы, включающей:

(f) белок, обладающий, по меньшей мере, 70% идентичностью с белком по любому из пп. (а)-(е); и

28. Способ по любому из пп. 22-27, где указанный аллель содержит нуклеиновую кислоту, выбранную из группы, включающей:

29. Способ по любому из пп. 22-28, где указанный генный продукт содержит нуклеиновую кислоту, выбранную из группы, включающей:

(а) нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO:4;

(b) нуклеиновую кислоту, содержащую нуклеотидную последовательность, показанную в SEQ ID NO:3;

30. Способ по любому из пп. 22-29, где указанный генный продукт содержит нуклеиновую кислоту, выбранную из группы, включающей:

(b) нуклеиновую кислоту, содержащую нуклеотидную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 3, 7, 11, 15, 19, 23, 27, 31, 35, 39, 43, 47, 51, 55, 59, 63, 67, 71, 75, 79, 83, 87, 91, 95, 99, 103, 107, 111, 115, 119, 123, 127, 131, 135, 139 или 143;

31. Способ по любому из пп. 22-30, где указанный генный продукт содержит нуклеиновую кислоту, выбранную из группы, включающей:

(а) нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 294, 298, 302, 306, 310, 314, 318, 322, 326, 330, 334, 338, 342, 346, 350, 354, 358, 362, 366, 370, 374, 378, 382, 386, 390, 394, 398, 402, 406, 410, 414, 418, 422, 426, 430 ил 434;

(b) нуклеиновую кислоту, содержащую нуклеотидную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 293, 297, 301, 305, 309, 313, 317, 321, 325, 329, 333, 337, 341, 345, 349, 353, 357, 361, 365, 369, 373, 377, 381, 385, 389, 393, 397, 401, 405, 409, 413, 417, 421, 425, 429 или 433;

32. Способ по любому из пп. 22-31, где указанный генный продукт содержит нуклеиновую кислоту, выбранную из группы, включающей:

(а) нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 228, 232, 236, 240, 244, 248, 252, 256, 260, 264, 268, 272, 276, 280, 284 или 288;

(b) нуклеиновую кислоту, содержащую нуклеотидную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 147, 151, 155, 159, 163, 167, 171, 175, 179, 183, 187, 191, 195, 199, 203, 207, 211, 215, 219, 223, 227, 231, 235, 239, 243, 247, 251, 255, 259, 263, 267, 271, 275, 279, 283 или 287;

33. Способ по любому из пп. 22-28, где указанный генный продукт содержит полипептид, выбранный из группы, включающей:

(a) белок, кодированный молекулой нуклеиновой кислоты, имеющей последовательность нуклеиновой кислоты, показанную в SEQ ID NO: 1, 2 или 3;

(b) белок, содержащий аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO:4;

(f) белок, обладающий, по меньшей мере, 70% идентичностью с белком по любому из пп. (а)-(е); и

34. Способ по любому из пп. 22-28 и 33, где указанный генный продукт содержит полипептид, выбранный из группы, включающей:

(f) белок, обладающий, по меньшей мере, 70% идентичностью с белком по любому из пп. (а)-(е); и

35. Способ по любому из пп. 22-28, 33 и 34, где указанный генный продукт содержит полипептид, выбранный из группы, включающей:

(f) белок, обладающий, по меньшей мере, 70% идентичностью с белком по любому из пп. (а)-(е); и

36. Способ по любому из пп. 22-28 и 33-35, где указанный генный продукт содержит полипептид, выбранный из группы, включающей:

(f) белок, обладающий, по меньшей мере, 70% идентичностью с белком по любому из пп. (а)-(е); и

37. Способ по любому из пп. 22-36, где указанный генный продукт представляет мРНК.

38. Способ по п. 37, где присутствие или количество указанной мРНК определяется ПЦР в режиме реального времени, ПЦР с обратной транскрипцией, полногеномным транскриптомным шот-ган секвенированием (секвенированием РНК), гибридизацией in situ или технологией микрочипов.

39. Способ по п. 38, где определение ПЦР в режиме реального времени и ПЦР с обратной транскрипцией дополнительно включает стадии:

(i) контактирование нуклеиновой кислоты в образце с одним или двумя олигонуклеотидами:

(ii) получение продукта амплификации, содержащего последовательность-мишень.

40. Способ по любому из пп. 22-28 и 33-36, где указанный генный продукт является белком.

41. Способ по п. 40, где присутствие или количество указанного белка определяется иммуногистохимией (IHC), иммуноанализом, методами на основе гель-электрофореза или блоттинга, IHC, масс-спектрометрией, проточной цитометрией или FACS.

42. Способ по любому из пп. 1-41, где указанный пациент является пациентом-человеком.

43. Способ по любому из пп. 1-42, где указанный образец представляет образец костного мозга.

44. Способ по любому из пп. 1-42, где указанный образец представляет образец крови.

45. Способ по пп. 43 или 44, где указанный образец костного мозга получают с помощью биопсии.

46. Способ по любому из пп. 1-45, дополнительно включающий введение ингибитора мутантного кальретикулина пациенту.

47. Нуклеиновая кислота, выбранная из группы, включающей:

(b) нуклеиновую кислоту, содержащую нуклеотидную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 2;

48. Нуклеиновая кислота по п. 47, где указанная нуклеиновая кислота выбрана из группы, включающей:

(b) нуклеиновую кислоту, содержащую нуклеотидную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 42, 46, 50, 54, 58, 62, 66, 70, 74, 78, 82, 86, 90, 94, 98, 102, 106, 110, 114, 118, 122, 126, 130, 134, 138 или 142;

49. Нуклеиновая кислота по пп. 47 или 48, где указанная нуклеиновая кислота выбрана из группы, включающей:

(b) нуклеиновую кислоту, содержащую нуклеотидную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 292, 296, 300, 304, 308, 312, 316, 320, 324, 328, 332, 336, 340, 344, 348, 352, 356, 360, 364, 368, 372, 376, 380, 384, 388, 392, 396, 400, 404, 408, 412, 416, 420, 424, 428 или 432;

50. Нуклеиновая кислота по пп. 47-49, где указанная нуклеиновая кислота выбрана из группы, включающей:

(b) нуклеиновую кислоту, содержащую нуклеотидную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 146, 150, 154, 158, 162, 166, 170, 174, 178, 182, 186, 190, 194, 198, 202, 206, 210, 214, 218, 222, 226, 230, 234, 238, 242, 246, 250, 254, 258, 262, 266, 270, 274, 278, 282 или 286;

51. Нуклеиновая кислота по любому из пп. 47-50, где указанная нуклеиновая кислота является кДНК.

52. Нуклеиновая кислота, выбранная из группы, включающей:

(b) нуклеиновую кислоту, содержащую нуклеотидную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 3;

53. Нуклеиновая кислота по п. 52, где указанная нуклеиновая кислота выбрана из группы, включающей:

54. Нуклеиновая кислота по пп. 52 или 53, где указанная нуклеиновая кислота выбрана из группы, включающей:

55. Нуклеиновая кислота по пп. 52 или 54, где указанная нуклеиновая кислота выбрана из группы, включающей:

56. Нуклеиновая кислота по любому из пп. 52-55, где указанная нуклеиновая кислота является мРНК.

57. Нуклеиновая кислота, выбранная из группы, включающей:

(b) нуклеиновую кислоту, содержащую нуклеотидную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 1;

58. Нуклеиновая кислота по п. 57, где указанная нуклеиновая кислота выбрана из группы, включающей:

59. Нуклеиновая кислота по пп. 57 или 58, где указанная нуклеиновая кислота выбрана из группы, включающей:

(b) нуклеиновую кислоту, содержащую нуклеотидную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 291, 295, 299, 303, 307, 311, 315, 319, 323, 327, 331, 335, 339, 343, 347, 351, 355, 359, 363, 367, 371, 375, 379, 383, 387, 391, 395, 399, 403, 407, 411, 415, 419, 423, 427 или 431;

60. Нуклеиновая кислота по пп. 57 или 59, где указанная нуклеиновая кислота выбрана из группы, включающей:

(b) нуклеиновую кислоту, содержащую нуклеотидную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 145, 149, 153, 157, 161, 165, 169, 173, 177, 181, 185, 189, 193, 197, 201, 205, 209, 213, 217, 221, 225, 229, 233, 237, 241, 245, 249, 253, 257, 261, 265, 269, 273, 277, 281 или 285;

61. Нуклеиновая кислота по любому из пп. 57-60, где указанная нуклеиновая кислота является геномной ДНК.

62. Белок, выбранный из группы, включающей:

(b) белок, содержащий аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 4;

(e) белок, содержащий аминокислотную последовательность, кодированную нуклеиновой кислотой, гибридизующуюся в жестких условиях с комплементарной цепью молекул нуклеиновой кислоты, определенных в пп. (а) или (с);

(f) белок, обладающий, по меньшей мере, 70% идентичностью с белком по любому из пп. (а)-(е); и

63. Белок по п. 62, где указанный белок выбран из группы, включающей:

(а) белок, кодированный молекулой нуклеиновой кислоты, имеющей последовательность нуклеиновой кислоты, показанную в SEQ ID NO: 1, 2, 3, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 13, 14, 15, 17, 18, 19, 21, 22, 23, 25, 26, 27, 29, 30, 31, 33, 34, 35, 37, 38, 39, 41, 42, 43, 45, 46, 47, 49, 50, 51, 53, 54, 55, 57, 58, 59, 61, 62, 63, 65, 66, 67, 69, 70, 71, 73, 74, 75, 77, 78, 79, 81, 82, 83, 85, 86, 87, 89, 90, 91, 93, 94, 95, 97, 98, 99, 101, 102, 103, 105, 106, 107, 109, 110, 111, 113, 114, 115, 117, 118, 119, 121, 122, 123, 125, 126, 127, 129, 130, 131, 133, 134, 135, 137, 138, 139, 141, 142 или 143;

(f) белок, обладающий, по меньшей мере, 70% идентичностью с белком по любому из пп. (а)-(е); и

64. Белок по пп. 62 или 63, где указанный белок выбран из группы, включающей:

(а) белок, кодированный молекулой нуклеиновой кислоты, имеющей последовательность нуклеиновой кислоты, показанную в SEQ ID NO: 291, 292, 293, 295, 296, 297, 299, 300, 301, 303, 304, 305, 307, 308, 309, 311, 312, 313, 315, 316, 317, 319, 320, 321, 323, 324, 325, 327, 328, 329, 331, 332, 333, 335, 336, 337, 339, 340, 341, 343, 344, 345, 347, 348, 349, 351, 352, 353, 355, 356, 357, 359, 360, 361, 363, 364, 365, 367, 368, 369, 371, 372, 373, 375, 376, 377, 379, 380, 381, 383, 384, 385, 387, 388, 389, 391, 392, 393, 395, 396, 397, 399, 400, 401, 403, 404, 405, 407, 408, 409, 411, 412, 413, 415, 416, 417, 419, 420, 421, 423, 424, 425, 427, 428, 429, 431, 432 или 433;

(f) белок, обладающий, по меньшей мере, 70% идентичностью с белком по любому из пп. (а)-(е); и

65. Белок по любому из пп. 62-64, где указанный белок выбран из группы, включающей:

(а) белок, кодированный молекулой нуклеиновой кислоты, имеющей последовательность нуклеиновой кислоты, показанную в SEQ ID NO: 145, 146, 147, 149, 150, 151, 153, 154, 155, 157, 158, 159, 161, 162, 163, 165, 166, 167, 169, 170, 171, 173, 174, 175, 177, 178, 179, 181, 182, 183, 185, 186, 187, 189, 190, 191, 193, 194, 195, 197, 198, 199, 201, 202, 203, 205, 206, 207, 209, 210, 211, 213, 214, 215, 217, 218, 219, 221, 222, 223, 225, 226, 227, 229, 230, 231, 233, 234, 235, 237, 238, 239, 241, 242, 243, 245, 246, 247, 249, 250, 251, 253, 254, 255, 257, 258, 259, 261, 262, 263, 265, 266, 267, 269, 270, 271, 273, 274, 275, 277, 278, 279, 281, 282, 283, 285, 286 или 287;

(f) белок, обладающий, по меньшей мере, 70% идентичностью с белком по любому из пп. (а)-(е); и

66. Вакцина, содержащая белок по пп. 62 или 63.

67. Антитело, специфически связывающееся с белком по любому из пп. 62-65.

68. siРНК, специфически направленная на нуклеиновую кислоту по любому из пп. 52-56.

69. siРНК по п. 68, где указанная siРНК состоит из молекулы нуклеиновой кислоты, содержащей, по меньшей мере, десять смежных оснований.

70. siРНК по пп. 68 или 69, где до 10% смежных оснований являются некомплементарными.

71. siРНК по любому из пп. 68-70, где указанная siРНК дополнительно содержит, по меньшей мере, одно основание на 5’-конце и/или, по меньшей мере, одно основание на 3’-конце.

72. Ингибитор мутантного кальретикулина для применения в лечении миелоидного новообразования.

73. Способ лечения пациента с миелоидным новообразованием, включающий введение эффективного количества ингибитора мутантного кальретикулина пациенту.

74. Ингибитор по п. 72 или способ по пп. 46 или 73, где указанный мутантный кальретикулин представляет мутантный белок кальретикулин по любому из пп. 62-65.

75. Ингибитор по пп. 72 или 74 или способ по любому из пп. 56, 73 или 74, где указанный ингибитор представляет антитело.

76. Ингибитор по пп. 72 или 74 или способ по любому из пп. 56, 73 или 74, где указанный ингибитор выбран из группы, состоящей из внеклеточных партнеров по связыванию, небольших связывающих молекул, аптамеров и интрамеров.

77. Ингибитор по п. 72 или способ по пп. 46 или 73, где указанный мутантный кальретикулин представляет нуклеиновую кислоту по любому из пп. 52-56.

78. Ингибитор по пп. 72 или 77 или способ по любому из пп. 46, 73 и 77, где указанный ингибитор выбран из группы, состоящей из siРНК, miРНК, dsРНК, shРНК, stРНК и антисмысловых молекул.

79. Ингибитор по любому из пп. 72 и 74-78 или способ по любому из пп. 1-46 и 73-78, где указанное миелоидное новообразование является миелопролиферативным новообразованием.

80. Ингибитор по п. 79 или способ по п. 79, где указанное миелоидное новообразование является первичным миелофиброзом (ПМФ).

81. Ингибитор по п. 79 или способ по п. 79, где указанное миелоидное новообразование является эссенциальной тромбоцитемией (ЭТ).

82. Ингибитор по любому из пп. 72 и 74-78 или способ по любому из пп. 1-46 и 73-78, где указанное миелоидное новообразование является миелодиспластическим синдромом.

83. Ингибитор по п. 82 или способ по п. 82, где указанное миелоидное новообразование является рефрактерной анемией с кольцевыми сидеробластами и тромбоцитемией (RARS-T).

84. Ингибитор по любому из пп. 72 и 74-83 или способ по любому из пп. 73-83, где пациент, подвергающийся лечению, оценивается как страдающий миелоидным новообразованием или предрасположенный страдать миелоидным новообразованием по любому из пунктов из пп. 1-46.

85. Белок по пп. 62 или 63, антитело по п. 67, siРНК по любому из пп. 68-71 или ингибитор мутантного кальретикулина по любому из пп. 72-78 для применения в качестве лекарственного средства.

86. Вектор, содержащий нуклеиновую кислоту по любому из пп. 47-51 и 57-61.

87. Клетка-хозяин, содержащая нуклеиновую кислоту по любому из пп. 47-51 и 57-61, или вектор по п. 86.

88. Способ получения полипептида по пп. 62-65, где указанный способ включает культивирование клеток-хозяев по п. 87 в условиях, обеспечивающих экспрессию полипептида и выделение полученного полипептида из культуры.

Обнаружение представленных здесь мутаций CALR на уровне геномной ДНК, РНК, кДНК и белка является пригодным для диагностики миелоидного новообразования, например, имеется ли у пациента миелоидное новообразование, какой тип миелоидного новообразования и также определение специфических признаков заболевания.

Как здесь используется, термин «диагностика» относится, среди прочего, к определению природы заболевания или идентификации физиологической или патофизиологической причины, лежащей в основе симптома. Таким образом, «диагностика миелоидного новообразования» относится к определению: (а) имеется ли у пациента миелоидное новообразование и/или (b) какой тип(ы) миелоидного новообразования и/или (с) особенностей конкретного миелоидного новообразования. Диагностика может быть осуществлена, например, на основе изучения симптомов и/или проведения дополнительных анализов (например, цитогенетических или молекулярных анализов).

Выражения «оценка того, страдает ли пациент миелоидным новообразованием» и «диагностировать миелоидное новообразование» можно использовать здесь взаимозаменяемо. Диагностика также может включать или относиться к оценке того, насколько пациент предрасположен страдать миелоидным новообразованием, т.е. имеет ли пациент риск развития миелоидного новообразования.

Настоящее изобретение относится к способу оценки того, страдает ли пациент миелоидным новообразованием или предрасположен страдать миелоидным новообразованием, где указанный способ включает:

Способы, обеспеченные здесь, могут включать стадию получения образца от пациента. «Получение» включает прием образца, который предоставляется третьей стороной. Так, например, кровь или костный мозг можно получить от пациента, поместить в соответствующий контейнер и затем предоставить для анализа.

- получение образца от пациента;

Согласно настоящему изобретению пациент оценивается как «положительный» в отношении наличия миелоидного новообразования, если один или более мутантных аллелей гена кальретикулина присутствуют в образце, предпочтительно в образце крови от указанного пациента.

Как здесь используется, термин «миелоидное новообразование» относится к клоновым гематологическим заболеваниям, поражающим миелоидный росток крови, включая заболевания с хроническим и острым клиническим течением. Миелоидные новообразования включают миелопролиферативные новообразования, миелодиспластические синдромы и острые миелоидные лейкозы. Предпочтительно, здесь миелоидное новообразование представляет миелопролиферативное новообразование, в частности, первичный миелофиброз (ПМФ) или эссенциальную тромбоцитемию (ЭТ) или миелодиспластический синдром, в частности, рефрактерную анемию с кольцевыми сидеробластами и тромбоцитемией (RARS-T).

Таким образом, диагностика миелоидного новообразования может представлять дальнейшую диагностику подтипов заболевания. В других вариантах осуществления в диагностике используются дополнительные тесты в комбинации, например, биохимический анализ крови, цитология и генетический анализ. В зависимости от природы миелопролиферативного новообразования дополнительные диагностические анализы могут включать определение эритроцитарной массы (при полицитемии), аспирацию костного мозга и трепанобиопсию, определение уровня насыщения кислородом артериальной крови и уровня карбоксигемоглобина, уровня щелочной фосфатазы в нейтрофилах, витамин B12 (или способность к связыванию B12) и концентрацию уратов в сыворотке крови. Генетические тесты доказали свое все более возрастающее важное значение в диагностике.

Следующие анализы традиционно проводятся для диагностики следующих заболеваний. Смотри, например, Vardiman, et al. (2009). «The 2008 revision of the World Health Organization (WHO) classification of myeloid neoplasms and acute leukemia: rationale and important changes». Blood, 114 (5):937-51.

Хронический миелоидный лейкоз (CML)

При определении транслокации t(9, 22), филадельфийской хромосомы, BCR-ABL транслокации, которая имеет три точки разрыва:

• u-BCR-ABL (P230): приводит к CML с обычной нейтрофилией и базофилией;

• минорная BCR-ABL (P190): приводит к развитию CML, который имеет тенденцию перейти в острый лимфобластный лейкоз (ALL), как правило, предшественник B ALL и редко предшественник T ALL;

• мажорная BCR-ABL (P210): нормальная обычная точка разрыва.

Эссенциальная тромбоцитемия (ЭТ)

ЭТ связана с мутацией JAK2V617F не более чем в 55% случаев и с мутацией MPL (рецептор тромбопоэтина) не более чем в 5% случаев:

• клеточная фаза - повышенное количество крупных мегакариоцитов с фиброзом и небольшим увеличением других элементов костного мозга;

• фиброзная фаза - коллагеновый фиброз с отсутствием элементов костного мозга.

Эти нарушения все еще пересматриваются в соответствии с более специфическими генетическими мутациями, и как часто имеет место летальный исход пациентов на стадии фиброза костного мозга.

Истинная полицитемия (ИП)

ИП чаще всего ассоциируется с мутацией JAK2V617F в более чем 95% случаев, в то время как в остальных случаях имеется мутация в экзоне 12 гена JAK2:

• клеточная фаза - повышенное количество мегакариоцитов, которые сгруппированы в «кучки», утолщение коллагеновой ткани, позднее фиброз, выявляемый трехцветной окраской, и увеличение количества миелоидных и эритроидных предшественников;

• фиброзная фаза - коллагеновый фиброз с отсутствием элементов костного мозга.

Первичный миелофиброз (ПМФ)

ПМФ ассоциирован с мутацией JAK2V617F не более чем в 50% случаев, мутациями в экзоне 12 гена JAK2 в 1-2% случаев и мутацией MPL (рецептор тромбопоэтина) не более чем в 5% случаев:

• фиброзная фаза - коллагеновый фиброз с отсутствием элементов костного мозга.

Рефрактерная анемия с кольцевыми сидеробластами, связанная с выраженным тромбоцитозом (RARS-T), часто рассматривается в качестве миелоидного новообразования. Диагностика RARS-T традиционно может включать гематологию и цитологию, анализ костного мозга и отсутствие аномалий кариотипа, таких как del (5q), t(3; 3) (q21; q26) или inv(3) (q21; q26). Смотри публикацию Broseus et al. «Clinical features and course of refractory anemia with ring sideroblast associated with marked thrombocytosis», Haematologica, 9(7):1036-1041 (2012).

Не смотря на то, что тип миелоидного новообразования определяет диагностику и лечение, отдельные новообразования могут иметь специфические мутации, которые в дальнейшем определяют прогноз и курс лечения. Генетические маркеры являются особенно пригодными, поскольку часто они освещают лежащий в основе заболевания патогенез.

Определение присутствия одного (или более) мутантных аллелей гена кальретикулина или его генного продукта, как здесь описано, можно провести в качестве отдельного анализа. Альтернативно этот анализ может следовать или предшествовать анализу других маркеров для миелоидных новообразований, таких как мутации генов JAK2 и MPL. Например, пациенты с подозрением на то, что они страдают миелоидным новообразованием, таким как миелопролиферативное новообразование (и в частности, первичный миелофиброз (ПМФ) или эссенциальная тромбоцитемия (ЭТ)), могут быть тестированы, в первую очередь, в отношении мутации JAK2 (в частности, мутации V617F). Если они дают отрицательный результат на мутацию JAK2, то они могут быть тестированы на мутантный кальретикулин. Если затем они дают отрицательный результат в отношении мутантного кальретикулина, то можно провести анализ в отношении мутаций MPL, например, мутаций в экзоне 10 гена MPL. Конечно, могут быть определены дополнительные маркеры. Кроме того, здесь предусматриваются другие последовательности или схемы тестирования мутаций JAK2, мутантного кальретикулина и/или мутаций MPL и, необязательно, дополнительные маркеры. Например, после положительного теста на мутацию JAK2 может следовать тест на мутантный кальретикулин (и, наоборот) для дальнейшей диагностики или прогностической оценки миелоидного новообразования. Также предусматривается одновременное определение таких маркеров, как и одновременный анализ на мутацию(и) JAK2 и мутантный кальретикулин (и, необязательно, дополнительные маркеры) или одновременный анализ на мутацию(и) JAK2, мутантный кальретикулин и мутацию(и) MPL (и, необязательно, дополнительные маркеры). Предпочтительно, чтобы пациенты (или образцы от пациентов), страдающие миелоидным новообразованием или предрасположенные страдать миелоидным новообразованием, были отрицательными для обеих мутаций JAK2 и MPL, то есть мутации JAK2 и MPL отсутствуют у пациентов, которых оценивают в качестве страдающих миелоидным новообразованием или предрасположенных страдать миелоидным новообразованием по настоящему изобретению. Другими словами, пациенты (или образец от пациентов), которых оценивают в качестве страдающих миелоидным новообразованием или предрасположенных страдать миелоидным новообразованием по настоящему изобретению, предпочтительно имеют JAK2 и MPL дикого типа. Для дальнейшей диагностики предусматривается использование дополнительных маркеров/анализов. Например, можно использовать обычный анализ костного мозга. Такие дополнительные маркеры/анализ, такой как анализ костного мозга, могут быть использованы для подтверждения, например, положительного теста на мутантный кальретикулин или может следовать, например, отрицательный тест на мутантный кальретикулин.

Известны последовательности нуклеиновых кислот и аминокислотные последовательности JAK2 и MPL дикого типа, и они могут быть получены из соответствующих баз данных, таких как NCBI. Примеры последовательностей нуклеиновых кислот и аминокислотных последовательностей JAK2 дикого типа показаны в NM_004972.3 (кДНК JAK2) и NP_004963.1 (белок JAK2) соответственно. Примеры последовательностей нуклеиновых кислот и аминокислотных последовательностей MPL дикого типа показаны в NM_005373.2 (кДНК MPL) и NP_005364.1 (белок MPL).

Мутации JAK2 и MPL в миелоидных новообразованиях были описаны здесь выше. Такие мутации, например, V617F-мутация в JAK2 (мутация с заменой валина на фенилаланин в положении 617 в аминокислотной последовательности JAK2), мутации в экзоне 12 последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей JAK2 и/или мутации в экзоне 10 MPL.

Мутация с заменой валина на фенилаланин (V617F) раскрыта в публикациях Baxter et al., 2005; James et al., 2005; Kralovics et al., 2005; Levine et al., 2005). Мутации в экзоне 12 JAK2 при ИП и в гене рецептора тромбопоэтина MPL при ПМФ и ЭТ были раскрыты соответственно в публикации Scott et al., 2007 и Pardanani et al., 2006; Pikman et al., 2006. Все эти ссылки включены во всей их полноте в настоящее описание в качестве ссылки.

Присутствие мутаций JAK2 и MPL может быть исключено с использованием аллель-специфической ПЦР для JAK2-V617F (ссылка) и с помощью секвенирования по Сэнгеру экзона 12 JAK2 и экзона 10 MPL. Примерный протокол, который может быть использован в данном контексте, раскрыт Kralovics R., Teo S.S., Li S., Theocharides A., Buser A.S., Tichelli A., Skoda R.C. Приобретение мутации V617F из JAK2 является поздним генетическим событием в подгруппе пациентов с миелопролиферативными расстройствами. Blood. 2006, Aug 15;108(4):1377-80. Epub 2006 May 4, эта публикация включена в настоящее описание в качестве ссылки.

Следовательно, настоящее изобретение относится к новой группе пациентов с миелоидным новообразованием, которая оценивается как положительная на мутантный кальретикулин и отрицательная на мутантный JAK2 и мутантный MPL (или, другими словами, новая группа пациентов с миелоидным новообразованием оценивается как положительная на мутантный кальретикулин и положительная на JAK2 дикого типа и MPL дикого типа).

В предпочтительном варианте осуществления способы по настоящему изобретению включают:

- стадию определения присутствия белка JAK2 дикого типа или нуклеиновой кислоты JAK2 дикого типа в образце от пациента; и/или

- стадию определения присутствия белка MPL дикого типа или нуклеиновой кислоты MPL дикого типа в образце от пациента.

В особенно предпочтительном варианте осуществления способы по настоящему изобретению включают:

- стадию определения присутствия белка JAK2 дикого типа или нуклеиновой кислоты JAK2 дикого типа в образце от пациента; и

Описанные выше стадии определения присутствия белка JAK2 дикого типа или нуклеиновой кислоты JAK2 дикого типа в образце от пациента и/или определения присутствия белка MPL дикого типа или нуклеиновой кислоты MPL дикого типа в образце от пациента, могут быть проведены до или после стадии определения присутствия одного или нескольких мутантных аллелей гена кальретикулина в образце от указанного пациента, как здесь представлено и определено.

- определение присутствия одного или более мутантных аллелей гена кальретикулина в образце от указанного пациента;

- определение присутствия белка JAK2 дикого типа или нуклеиновой кислоты JAK2 дикого типа в образце от пациента; и

- определение присутствия белка MPL дикого типа или нуклеиновой кислоты MPL дикого типа в образце от пациента; и

- определение присутствия белка JAK2 дикого типа или нуклеиновой кислоты JAK2 дикого типа в образце от пациента;

- определение присутствия белка MPL дикого типа или нуклеиновой кислоты MPL дикого типа в образце от пациента;

Предпочтительно способ по изобретению относится исключительно к оценке того, страдает ли пациент миелоидным новообразованием.

Настоящее изобретение относится к способу оценки того, страдает ли пациент первичным миелофиброзом или предрасположен страдать первичным миелофиброзом, где указанный способ включает:

- оценку того, что указанный пациент страдает первичным миелофиброзом или предрасположен страдать первичным миелофиброзом, когда присутствует указанный один или более мутантных аллелей гена кальретикулина.

Настоящее изобретение относится к способу оценки того, страдает ли пациент эссенциальной тромбоцитемией или предрасположен страдать эссенциальной тромбоцитемией, где указанный способ включает:

- оценку того, что указанный пациент страдает эссенциальной тромбоцитемией или предрасположен страдать эссенциальной тромбоцитемией, когда присутствует указанный один или более мутантных аллелей гена кальретикулина.

Настоящее изобретение относится к способу оценки того, страдает ли пациент рефрактерной анемией с кольцевыми сидеробластами и тромбоцитемией или предрасположен страдать рефрактерной анемией с кольцевыми сидеробластами и тромбоцитемией, где указанный способ включает:

- оценку того, что указанный пациент страдает рефрактерной анемией с кольцевыми сидеробластами и тромбоцитемией или предрасположен страдать рефрактерной анемией с кольцевыми сидеробластами и тромбоцитемией, когда присутствует указанный один или более мутантных аллелей гена кальретикулина.

Способ, обеспеченный здесь, включает определение присутствия предпочтительно только одного мутантного аллеля гена кальретикулина в образце от пациента. Предпочтительно способ представляет способ в условиях in vitro. Представленные и раскрытые здесь мутации гена кальретикулина представляют соматические мутации. Эти мутации могут находиться в гомозиготном состоянии или гетерозиготном состоянии, предпочтительно в гетерозиготном состоянии.

Один или более мутантных аллелей гена кальретикулина может включать нуклеиновую кислоту, кодирующую мутантный белок кальретикулина. Мутантные белки кальретикулины, раскрытые и представленные здесь, характеризуются общей C-концевой аминокислотной последовательностью. Как следует, например, из таблицы 2 в примере, С-концы мутантных белков кальретикулинов имеют общую минимальную последовательность. Указанная общая минимальная последовательность представляет аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 4 и кодируется молекулами нуклеиновой кислоты, имеющими последовательность нуклеиновой кислоты, показанную в SEQ ID NO: 1, 2 или 3.

Следовательно, мутантный белок кальретикулин, используемый по настоящему изобретению, выбран из группы, включающей:

(b) белок, содержащий аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 4;

(f) белок, обладающий, по меньшей мере, 70% идентичностью с белком по любому из пп. (а)-(е); и

В одном варианте осуществления мутантный белок кальретикулин, используемый по настоящему изобретению, представляет:

(а) белок, кодированный молекулой нуклеиновой кислоты, имеющей последовательность нуклеиновой кислоты, показанную в SEQ ID NO: 1, 2 или 3; или

(b) белок, содержащий аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 4.

где указанный один или более мутантных аллелей гена кальретикулина включает нуклеиновую кислоту, кодирующую мутантный белок кальретикулин,

где указанный мутантный белок кальретикулин выбран из группы, включающей:

(b) белок, содержащий аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 4;

(f) белок, обладающий, по меньшей мере, 70% идентичностью с белком по любому из пп. (а)-(е); и

где указанный мутантный белок кальретикулин представляет:

(b) белок, содержащий аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 4.

где указанный мутантный белок кальретикулин выбран из группы, включающей:

(b) белок, содержащий аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 4;

(f) белок, обладающий, по меньшей мере, 70% идентичностью с белком по любому из пп. (а)-(е); и

где указанный мутантный белок кальретикулин представляет:

(b) белок, содержащий аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 4.

Настоящее изобретение относится к способу оценки того, страдает ли пациент рефрактерной анемией с кольцевыми сидеробластами и тромбоцитемией (RARS-T) или предрасположен страдать рефрактерной анемией с кольцевыми сидеробластами и тромбоцитемией (RARS-T), где указанный способ включает:

- оценку того, что указанный пациент страдает рефрактерной анемией с кольцевыми сидеробластами и тромбоцитемией (RARS-T) или предрасположен страдать рефрактерной анемией с кольцевыми сидеробластами и тромбоцитемией (RARS-T), когда присутствует указанный один или более мутантных аллелей гена кальретикулина,

где указанный мутантный белок кальретикулин выбран из группы, включающей:

(b) белок, содержащий аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 4;

(f) белок, обладающий, по меньшей мере, 70% идентичностью с белком по любому из пп. (а)-(е); и

где указанный мутантный белок кальретикулин представляет:

(b) белок, содержащий аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 4.

Мутантные белки кальретикулины, обеспеченные и используемые здесь, имеют характерные С-концы, которые показаны в SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64, 68, 72, 76, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 124, 128, 132, 136, 140 и 144. Данные С-концы включают аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 4.

Мутантный белок кальретикулин согласно вышеописанному может быть выбран из группы, включающей:

(f) белок, обладающий, по меньшей мере, 70% идентичностью с белком по любому из пп. (а)-(е); и

где указанный мутантный белок кальретикулин выбран из группы, включающей:

(f) белок, обладающий, по меньшей мере, 70% идентичностью с белком по любому из пп. (а)-(е); и

где указанный мутантный белок кальретикулин выбран из группы, включающей:

(f) белок, обладающий, по меньшей мере, 70% идентичностью с белком по любому из пп. (а)-(е); и

где указанный мутантный белок кальретикулин выбран из группы, включающей:

(f) белок, обладающий, по меньшей мере, 70% идентичностью с белком по любому из пп. (а)-(е); и

В одном варианте осуществления мутантный белок кальретикулин выбран из группы, включающей:

где указанный мутантный белок кальретикулин выбран из группы, включающей:

В данном документе было идентифицированы 36 типов мутантного белка кальретикулина (смотри таблицу 2, в которой показаны С-концы полноразмерных мутантных белков кальретикулинов). Данные мутантные белки объединены на основе их общего характерного С-конца, показанного в SEQ ID NO: 4. Полноразмерные последовательности мутантных белков кальретикулинов показаны в SEQ ID NO: 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 228, 232, 236, 240, 244, 248, 252, 256, 260, 264, 268, 272, 276, 280, 284, и 288.

Следовательно, мутантный белок кальретикулин, обеспеченный и используемый здесь, выбран из группы, включающей:

(f) белок, обладающий, по меньшей мере, 70% идентичностью с белком по любому из пп. (а)-(е); и

где указанный мутантный белок кальретикулин выбран из группы, включающей:

(f) белок, обладающий, по меньшей мере, 70% идентичностью с белком по любому из пп. (а)-(е); и

где указанный мутантный белок кальретикулин выбран из группы, включающей:

(f) белок, обладающий, по меньшей мере, 70% идентичностью с белком по любому из пп. (а)-(е); и

где указанный мутантный белок кальретикулин выбран из группы, включающей:

(f) белок, обладающий, по меньшей мере, 70% идентичностью с белком по любому из пп. (а)-(е); и

В одном варианте осуществления мутантный белок кальретикулин, обеспеченный и используемый здесь, может быть выбран из группы, включающей:

где указанный мутантный белок кальретикулин выбран из группы, включающей:

В данном документе было показано, что указанные мутации имеют место в экзоне 9 гена кальретикулина. Следовательно, последующее относится к мутациям в гене кальретикулина дикого типа и в его экзоне 9.

Ген кальретикулина дикого типа хорошо известен. Его последовательность нуклеиновой кислоты и аминокислотную последовательность можно получить из базы данных, такой как NCBI, под инвентарным номером NG_029662.1 (ген) и NP_004334.1 (белок).

Приведенная в качестве примера последовательность нуклеиновой кислоты гена кальретикулина дикого типа показана в SEQ ID NO: 289. Соответствующая аминокислотная последовательность показана в SEQ ID NO: 290.

Таким образом, ген кальретикулина дикого типа может содержать последовательность, выбранную из группы, включающей:

(b) нуклеиновую кислоту, содержащую нуклеотидную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 289;

Один или более мутантных аллелей гена кальретикулина может находиться в области, охватывающей экзон 9 вышеописанного гена кальретикулина. Последовательность нуклеиновой кислоты экзона 9 гена кальретикулина дикого типа показана в SEQ ID NO: 435. Соответствующая аминокислотная последовательность дикого типа показана в SEQ ID NO: 436.

Согласно вышеприведенному экзон 9 гена кальретикулина дикого типа может содержать последовательность, выбранную из группы, включающей:

(b) нуклеиновую кислоту, содержащую нуклеотидную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 435;

Как показано в настоящем документе (смотри, например, таблицу 2), обеспеченные здесь мутантные аллели генов кальретикулина содержат мутацию сдвига рамки считывания в гене кальретикулина дикого типа. Мутация сдвига рамки считывания может находиться в экзоне 9 гена кальретикулина дикого типа. За счет мутации сдвига рамки считывания, открытая рамка считывания гена кальретикулина дикого типа больше не используется, а используется альтернативная рамка считывания 1, которая приводит к возникновению характерного С-конца мутантных белков кальретикулинов (общая минимальная аминокислотная последовательность мутантных белков показана в SEQ ID NO: 4).

Мутация сдвига рамки считывания может быть вызвана делецией одного или более нуклеотидов, инсерцией двух или более нуклеотидов или комбинацией инсерции и делеции одного или более нуклеотидов, при условии, что мутантный белок содержит характерный С-конец (показанный в SEQ ID NO: 4) или его фрагмент.

Например, мутация сдвига рамки считывания представляет (или вызвана) делецию одного нуклеотида из кодирующей последовательности гена кальретикулина дикого типа, в частности, из его экзона 9, или инсерцию двух нуклеотидов в кодирующую последовательность гена кальретикулина дикого типа, в частности, в его экзон 9.

Например, (1+(3×n₀)) нуклеотидов могут быть делецированы из гена кальретикулина (или из его экзона 9), в результате чего n₀ может представлять любое натуральное число, включая нуль. Неограничивающие примеры количества нуклеотидов, которые могут быть делецированы из гена кальретикулина (или из его экзона 9) с получением нуклеиновой кислоты, кодирующей обеспеченные здесь мутантные белки кальретикулины, представляют 1, 4, 19, 22, 31, 34, 46, 52 нуклеотида.

Аналогично мутация сдвига рамки может представлять (или может быть вызвана) инсерцией двух нуклеотидов в кодирующую последовательность гена кальретикулина дикого типа, в частности, в его экзон 9. Следовательно, (2+(3×n₀)) нуклеотидов могут быть инсерцированы в ген кальретикулина (или в его экзон 9), в результате чего n₀ может представлять любое натуральное число, включая нуль. Например, 5 нуклеотидов могут быть инсерцированы в ген кальретикулина (или в его экзон 9) с получением нуклеиновой кислоты, кодирующей обеспеченные здесь мутантные белки кальретикулины.

Мутация сдвига рамки считывания также может быть вызвана комбинацией инсерции и делеции одного или более нуклеотидов в/из гена кальретикулина дикого типа (или в/из его экзона 9), при условии, что полученный мутантный белок содержит характерный С-конец (показанный в SEQ ID NO: 4) или его фрагмент.

Например, мутация сдвига рамки считывания может представлять (или может быть вызвана) делецию одного нуклеотида из кодирующей последовательности гена кальретикулина дикого типа, в частности, из экзона 9, и инсерцию шести нуклеотидов в кодирующую последовательность гена кальретикулин дикого типа, в частности, в его экзон 9.

Например, мутация сдвига рамки считывания может представлять (или может быть вызвана) делецию двух нуклеотидов из кодирующей последовательности гена кальретикулина дикого типа, в частности, из его экзона 9, и инсерцию четырех нуклеотидов в кодирующую последовательность гена кальретикулина дикого типа, в частности, в его экзон 9.

Например, мутация сдвига рамки считывания может представлять (или может быть вызвана) делецию трех нуклеотидов из кодирующей последовательности гена кальретикулина дикого типа, в частности, из его экзона 9, и инсерцию пяти нуклеотидов в кодирующую последовательность гена кальретикулина дикого типа, в частности, в его экзон 9.

Например, мутация сдвига рамки считывания может представлять (или может быть вызвана) делецию 12 нуклеотидов из кодирующей последовательности гена кальретикулина дикого типа, в частности, из его экзона 9, и инсерцию 5 нуклеотидов в кодирующую последовательность гена кальретикулина дикого типа, в частности, в его экзон 9.

Например, мутация сдвига рамки считывания может представлять (или может быть вызвана) делецию 18 нуклеотидов из кодирующей последовательности гена кальретикулина дикого типа, в частности, из его экзона 9, и инсерцию 11 нуклеотидов в кодирующую последовательность гена кальретикулина дикого типа, в частности, в его экзон 9.

Например, мутация сдвига рамки считывания может представлять (или может быть вызвана) делецию 18 нуклеотидов из кодирующей последовательности гена кальретикулина дикого типа, в частности, из его экзона 9, и инсерцию 14 нуклеотидов в кодирующую последовательность гена кальретикулина дикого типа, в частности, в его экзон 9.

Например, мутация сдвига рамки считывания может представлять (или может быть вызвана) делецию 20 нуклеотидов из кодирующей последовательности гена кальретикулина дикого типа, в частности, из его экзона 9, и инсерцию 1 нуклеотида в кодирующую последовательность гена кальретикулина дикого типа, в частности, в его экзон 9.

Например, мутация сдвига рамки считывания может представлять (или может быть вызвана) делецию 28 нуклеотидов из кодирующей последовательности гена кальретикулина дикого типа, в частности, из его экзона 9, и инсерцию 6 нуклеотидов в кодирующую последовательность гена кальретикулина дикого типа, в частности, в его экзон 9.

Например, мутация сдвига рамки считывания может представлять (или может быть вызвана) делецию 35 нуклеотидов из кодирующей последовательности гена кальретикулина дикого типа, в частности, из его экзона 9, и инсерцию 1 нуклеотида в кодирующую последовательность гена кальретикулина дикого типа, в частности, в его экзон 9.

Например, мутация сдвига рамки считывания может представлять (или может быть вызвана) делецию 36 нуклеотидов из кодирующей последовательности гена кальретикулина дикого типа, в частности, из его экзона 9, и инсерцию 2 нуклеотидов в кодирующую последовательность гена кальретикулина дикого типа, в частности, в его экзон 9.

Другие комбинации инсерции/делеции по изобретению, которые приводят к получению характерного С-конца мутантных белков кальретикулинов (общая минимальная аминокислотная последовательность мутантных белков показана в SEQ ID NO: 4) или его фрагмента, легко возможны.

В результате вышеописанных инсерций, делеций и комбинаций инсерций/делеций, сдвиг рамки считывания вводится в (кодирующую последовательность) ген кальретикулина дикого типа и, в частности, в его экзон 9. Следовательно, мутантный белок кальретикулин, раскрытый здесь и используемый по настоящему изобретению, содержит мутантный аминокислотный участок, кодируемый этими последовательностями мутантного экзона 9.

Следовательно, мутантный белок кальретикулин может быть выбран из группы, включающей: