Способ ингибирования нуклеарного фактора каппа в с использованием 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридиния l-2,6-диаминогексаноата в культуре клеток



Способ ингибирования нуклеарного фактора каппа в с использованием 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридиния l-2,6-диаминогексаноата в культуре клеток
Способ ингибирования нуклеарного фактора каппа в с использованием 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридиния l-2,6-диаминогексаноата в культуре клеток
G01N2033/248 - Исследование или анализ материалов путем определения их химических или физических свойств (разделение материалов вообще B01D,B01J,B03,B07; аппараты, полностью охватываемые каким-либо подклассом, см. в соответствующем подклассе, например B01L; измерение или испытание с помощью ферментов или микроорганизмов C12M,C12Q; исследование грунта основания на стройплощадке E02D 1/00;мониторинговые или диагностические устройства для оборудования для обработки выхлопных газов F01N 11/00; определение изменений влажности при компенсационных измерениях других переменных величин или для коррекции показаний приборов при изменении влажности, см. G01D или соответствующий подкласс, относящийся к измеряемой величине; испытание

Владельцы патента RU 2669348:

федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Белгородский государственный национальный исследовательский университет" (НИУ "БелГУ") (RU)

Изобретение относится к медицине, в частности к экспериментальной фармакологии Предложен способ ингибирования нуклеарного фактора каппа В в культуре клеток, включающий добавление бактериального липополисахарида в концентрации 1 мкг/мл к свежевыделенным по стандартной методике на градиенте плотности фиколла мононуклеарным клеткам крови крыс Wistar, отличающийся тем, что к данной смеси затем добавляют 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридиния L-2,6-диаминогексаноат в конечной концентрации 35 мкг/мл. Технический результат состоит в выраженном ингибировании нуклеарного фактора каппа В в культуре клеток и в благоприятном профиле безопасности. 1 табл.

 

Способ ингибирования нуклеарного фактора каппа В с использованием 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридиния L-2,6-диаминогексаноата в культуре клеток

Изобретение относится к медицине, в частности к экспериментальной фармакологии.

По известным литературным источникам – нуклеарный фактор каппа В (NF-κB) на сегодняшний день является одной из перспективных мишеней для разработки инновационных лекарственных средств в рамках развития современной фармакологии и формирования концепции таргетной терапии [Test system for evaluation of the influence of the biological activity of substances on the signal system of NF-κB: focus on the derivatives of 3 hydroxypyridine / Skachilova S.Y., Ragulina V.A., Kostina D.A., Burda Y.E. // Research result: pharmacology and clinical pharmacology. – 2017. – Vol. 3, №2. – Р. 50-56. doi: 10.18413/2313-8971-2017-3-2-50-56].

NF-κB является одним из факторов транскрипции. Повышенный интерес к изучению биологической роли данной сигнальной системы и вкладе её в развитие сердечно-сосудистых, онкологических и аутоиммунных заболеваний очевиден [Role of nuclear factor-κB activation in acute ischaemia-reperfusion injury in myocardium / A. Kis, D.M. Yellon, G.F. Baxter // British Journal of Pharmacology. – 2003. – 138(5). – P. 894-900, doi:10.1038/sj.bjp.0705108; Nuclear factor kappa B: important transcription factor and therapeutic target. Lee JI, Burckart GJ. J Clin Pharmacol. 1998 Nov;38(11):981-93]. Целый ряд стимулов (провоспалительные цитокины: фактор некроза опухоли α, интерлейкин 1β; лиганд CD40 и др.), запускают канонический и неканонический пути активации сигнального пути NF-κB, что повышает экспрессию генов, регулирующих синтез цитокинов и хемокинов, пролиферацию и дифференцировку клеток, ангиогенез, иммунные реакции и апоптоз [Nuclear factor kappa B as a potential target for pharmacological correction endothelium-associated pathology / V.A. Ragulina, D.A. Kostina, A.P. Dovgan, Y.E. Burda, S.V. Nadezhdin // Research result: pharmacology and clinical pharmacology. – 2017. – Vol. 3, №1 – P. 114-124. DOI: 10.18413/2500-235X-2017-3-1-114-124].

Потенциальными кандидатами, снижающими активность данного транскрипционного фактора являются производные 3-оксипиридина. В связи с вышесказанным следует отметить актуальность изучения 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридиния L-2,6-диаминогексаноата в качестве ингибитора NF-κB in vitro с оценкой активности p65 субъединицы в мононуклеарных клетках (МНК) крови крыс линии Wistar, стимулированных бактериальным липополисахаридом.

Известен способ ингибирования NF-κB композициями тритерпенов (патент на изобретение RU 2288706, публ. 10.12.2006). Сущность его заключается в ингибировании воспаления путем обеспечения клетки монотерпеновыми композициями, которые ингибируют фактор NF-κB. Композиция может включать дополнительные химические функциональные агенты. Технический результат - повышение эффективности лечения воспалительных состояний, в частности предраковых.

Основным недостатком способа является то, что применяемые терапевтические дозы монотерпеновых/тритерпеновых соединений могут привести к значительным побочным эффектам или к другим неблагоприятным реакциям. У субъектов с далеко зашедшим заболеванием может наблюдаться определенная степень побочных эффектов при применении терапевтических доз монотерпеновых/тритерпеновых соединений.

Известно зависящее от концентрации влияние (R)- и (S)-флурбипрофена на активацию фактора транскрипции NF-κВ в RAW-клетках (патент на изобретение RU 2250103, публ. 20.04.2005). Анализ гельудерживания показывает, что липополисахарид (ЛПС) (1 мкг/мл) приводит к активации NF-κВ (комплекс р50/р65 NF-κВ). Микромолярные концентрации (R)-флурбипрофена были в состоянии ингибировать эту индуцированную ЛПС активацию NF-κВ.

Изобретение относится к области фармации, а именно к применению (R)-энантиомеров арилпропионовых кислот. Сущность изобретения - применение названных кислот для получения лекарственных средств, которые ингибируют каскад активации NF-κB. На основе их создана композиция. Технический результат - использование для лечения заболеваний, на которые может терапевтически положительно воздействовать ингибирование образования NF-κB.

Недостатком данного изобретения является то, что арилпропионовые кислоты и их производные обладают рядом побочных эффектов при их применении, а именно тошнота, анорексия, метеоризм, запор, изжога, диарея, НПВС-гастропатия, вплоть до эрозивно-язвенных поражений ЖКТ.

Наиболее близким к заявленному решению является способ ингибирования NF-κB с использованием производных 3-оксипиридина (Test system for evaluation of the influence of the biological activity of substances on the signal system of NF-κB: focus on the derivatives of 3hydroxypyridine / Skachilova S.Y., Ragulina V.A., Kostina D.A., Burda Y.E. // Research result: pharmacology and clinical pharmacology. – 2017. – Vol. 3, №2. – Р. 50-56), включающий добавление бактериального липополисахарида в концентрации 1 мкг/мл к свежевыделенным по стандартной методике на градиенте плотности фиколла МНК крови крыс Wistar, затем добавление к данной смеси исследуемого фармакологического агента, растворенного в фосфатно-солевом буфере, в соответствующей конечной концентрации, отличающийся тем, что в качестве фармакологического агента используют мексидол, этоксидол, 3-гидрокси-2-этил-6-метилпиридиния глутаминат, 3-гидрокси-2-этил-6-метилпиридиния аспарагинат, 3-гидрокси-2-этил-6-метилпиридиния 4-аминобензоат, 3-гидрокси-2-этил-6-метилпиридиния никотинат, 3-гидрокси-2-этил-6-метилпиридиния N-ацетиламиногексаноат, 3-гидрокси-2-этил-6-метилпиридиния N-ацетиламиноацетат, 3-гидрокси-2-этил-6-метилпиридиния N-ацетиламиноглутаминат, 3-гидрокси-2-этил-6-метилпиридиния ацетилсалицилат, бета-гидроксиникотиноилгидразон 2-метил-3-гидрокси-4-формил-5-оксиметилпиридина дигидрохлорид. Наибольшей ингибирующей способностью на ЛПС-индуцированную экспрессию p65 NF-κB в МНК обладали мексидол, этоксидол и бета-гидроксиникотиноилгидразон 2-метил-3-гидрокси-4-формил-5-оксиметилпиридина дигидрохлорид.

Недостатком данного решения является то, что наблюдаемая ингибирующая активность in vitro в отношении сигнального пути NF-κB мексидола, этоксидола и бета-гидроксиникотиноилгидразон 2-метил-3-гидрокси-4-формил-5-оксиметилпиридина дигидрохлорида не достигает целевых значений и более чем в 3,5 раза отличается от значений интактных крыс.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является эффективный способ ингибирования NF-κB с использованием 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридиния L-2,6-диаминогексаноата, подтверждаемый результатами оценки активности p65 субъединицы в МНК крови крыс Wistar, стимулированных бактериальным липополисахаридом, обладающий более благоприятным профилем безопасности по сравнению с рассмотренными аналогами и более высокой ингибирующей активностью NF-κB по сравнению с прототипом.

Задачей предлагаемого изобретения является создание эффективного способа ингибирования нуклеарного фактора каппа В с использованием 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридиния L-2,6-диаминогексаноата в культуре мононуклеарных клеток крови крыс Wistar.

Поставленная задача достигается тем, что предложен способ ингибирования нуклеарного фактора каппа В с использованием 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридиния L-2,6-диаминогексаноата в культуре клеток, включающий добавление бактериального липополисахарида в концентрации 1 мкг/мл к свежевыделенным по стандартной методике на градиенте плотности фиколла МНК крови крыс Wistar, затем добавление к данной смеси исследуемого фармакологического агента, растворенного в фосфатно-солевом буфере, в соответствующей конечной концентрации, отличающийся тем, что в качестве фармакологического агента используют 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридиния L-2,6-диаминогексаноат.

Основным преимуществом предлагаемого способа является то, что введение нового производного 3-оксипиридина, 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридиния L-2,6-диаминогексаноата, в исследуемой in vitro концентрации, 35 мкг/мл, приводит к выраженному ингибированию NF-κB в культуре клеток, что подтверждается результатами оценки активности p65 субъединицы в МНК крови крыс Wistar, стимулированных бактериальным липополисахаридом. Помимо этого, предлагаемый способ обладает более благоприятным профилем безопасности по сравнению с рассмотренными аналогами и более высокой ингибирующей активностью NF-κB по сравнению с прототипом.

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ 2-ЭТИЛ-6-МЕТИЛ-3-ГИДРОКСИПИРИДИНИЯ L-2,6-ДИАМИНОГЕКСАНОАТА

В трехгорлую колбу, снабженную мешалкой, термометром и обратным холодильником, загружают 30 мл этилового спирта. При перемешивании добавляют 2,74 г (0,02 м) 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина. После растворения добавляют постепенно 3,92 г (0,02 м) L-2,6-диаминогексановой кислоты. Массу нагревают до 75 °C, выдерживают при этой температуре в течение 1 часа, полученный раствор фильтруют. От фильтрата отгоняют растворитель, приливают к остатку 15 мл ацетонитрила, кристаллизуют при +5 °C в течение 8-10 часов. Кристаллы отделяют фильтрацией, сушат в вакууме при 35-40 °C, получают 5,4 г гигроскопичного мелкокристаллического вещества, растворимого в воде. C14H25N3O3

Найдено, % : C 59,21; H 8,94; N 14,79

Вычислено, % : C 59,34; H 8,89; N 14,83; O 16,94

ИК-спектр, ν см-1: 3495 (OH); 3370, 3285 (NH2); 2560 (N+); 1645, 1610 (C=C); 1287 (CH2)

УФ-спектр, нм: 231, 296 (0,001% раствор в воде)

ТСХ: система бензол-ацетон (2-3), пластины Merck, Rf – 0,43

ФАРМАКОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА

2-ЭТИЛ-6-МЕТИЛ-3-ГИДРОКСИПИРИДИНИЯ L-2,6-ДИАМИНОГЕКСАНОАТА

При изучении ингибирующей активности в отношении NF-κB были исследованы 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридиния L-2,6-диаминогексаноат и мексидол (препарат сравнения), которые добавляли к свежевыделенным по стандартной методике на градиенте плотности фиколла (ρ = 1,077, «Панэко», Россия) МНК крови крыс линии Wistar. Исследуемая in vitro концентрация каждого препарата составляет 35 мкг/мл.

В каждой экспериментальной группе 6 крыс, 3 самца и 3 самки. Для исследования взяты крысы без внешних признаков заболевания, прошедшие карантинный режим, массой 225-275 г.

Исследование активности NF-κB проводили в 2 мл пробирках типа Eppendorf (Gen Follower, Китай), куда вносили 1 мл суспензии МНК крови крыс, 1×106 клеток в 1 мл среды RPMI-1640 («Панэко», Россия) с 5% сыворотки эмбрионов коров (HiClone, США), затем добавляли бактериальный липополисахарид («Пирогенал», ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи, Россия) в концентрации 1 мкг/мл, затем добавляли исследуемый препарат, растворенный в фосфатно-солевом буфере, в соответствующей конечной концентрации. Клетки инкубировали в течение 30 мин при 37°С на шейкере, после чего центрифугировали 5 мин при 200g, надосадочную жидкость удаляли, осадок МНК исследовали на активность p65 субъединицы NF-κB в строгом соответствии с инструкцией к набору NFkB p65 TotalMultispecies InstantOne™ ELISA Kit (Invitrogen / Thermo Fisher Scientific, cat. 85-86081-11).

МНК крови крыс в количестве 1×106 лизировали в 1 мл лизирующего буфера, входящего в состав набора, супернатант вносили в лунки 96-луночного планшета из указанного ИФА набора. После нескольких этапов продукты сэндвич-реакции определяли на микропланшетном ридере Multiskan FC (Thermo Fisher, Германия) при 450 нм.

Для упрощения расчетов относительного влияния исследуемых веществ были выбраны единицы оптической плотности, непосредственно получаемые с микропланшетного ридера, округленные до 2-го знака после запятой. Статистическую обработку результатов проводили в программе MS Excel 2013 с модулем Attestatv.13 с применением метода непараметрической статистики – критерия Крускала-Уоллиса, т.к. распределение активности p65 субъединицы NF-κB в клетках не являлось нормальным.

ПРИМЕР КОНКРЕТНОГО ВЫПОЛНЕНИЯ

Результаты оценки ингибирующей NF-κB активности исследуемых препаратов представлены в табл. 1 (Медианы – Ме и 1, 3 квартили – Q1; Q3).

Как видно из табл. 1, наибольшей ингибирующей способностью на ЛПС-индуцированную экспрессию p65 NF-κB в МНК крови крыс Wistar в исследуемых концентрациях обладает 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридиния L-2,6-диаминогексаноат. Ингибирующая активность NF-κB 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридиния L-2,6-диаминогексаноата выше на 34,6%, чем у препарата сравнения мексидола, в конечной концентрации 35 мкг/мл при индуцированной ЛПС активации NF-κВ.

Способ ингибирования нуклеарного фактора каппа В в культуре клеток, включающий добавление бактериального липополисахарида в концентрации 1 мкг/мл к свежевыделенным по стандартной методике на градиенте плотности фиколла мононуклеарным клеткам крови крыс Wistar, отличающийся тем, что к данной смеси затем добавляют 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридиния L-2,6-диаминогексаноат в конечной концентрации 35 мкг/мл.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области медицины, а именно к способам интерпретации результатов лабораторных анализов, и может быть использовано при лимфопролиферативных заболеваниях, а именно неходжкинской лимфоме и лимфогранулематозе для уточнения стадии опухолевого процесса.

Изобретение относится к медицине, а именно к профессиональной патологии и пульмонологии, и может быть использовано для диагностики профессиональной хронической обструктивной болезни легких, сформировавшейся в условиях действия токсических промаэрозолей.

Изобретение относится к медицине, а именно к медицинской иммунологии, и может быть использовано для дифференциальной диагностики первичного и вторичного иммунного ответа на вирус эпидемического паротита.

Изобретение относится к медицине, преимущественно к фтизиатрии, и может быть использовано при оценке активности туберкулезной инфекции у детей и подростков. Для этого в пробы цельной крови пациента вносят специфические антигены: ППД-Л, Rv2660c, ESAT-6, гибридного белка CFP10-ESAT-6.

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии, и может быть использовано для дифференциальной диагностики первичного и вторичного иммунного ответа на вирус краснухи.
Изобретение относится к медицине. Способ характеризуется тем, что в сыворотке крови пациента определяют концентрации пепсиногенов I и II, вычисляют отношение концентрации пепсиногена I к концентрации пепсиногена II.
Предлагаемое изобретение относится к области биотехнологии и касается способа получения иммуноферментной тест-системы для определения эпитопов оболочечного белка вируса Пуумала протективной направленности в вакцинных препаратах против геморрагической лихорадки с почечным синдромом (ГЛПС).
Изобретение относится к медицине, а именно к педиатрии, и может быть использовано для прогнозирования формирования окклюзионной постгеморрагической гидроцефалии у недоношенных детей с экстремально низкой массой тела при рождении.
Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использовано для дифференциальной диагностики высокодифференцированного рака у больных с узловыми формами заболеваний щитовидной железы.
Изобретение относится к области биотехнологии и экологии, в частности к тест-системам для определения содержания микополисахаридов и их производных, имеющих в своем составе участки, аналогичные синтетическому линейному нона-β-(1→3)-D-глюкозиду в окружающей среде, в том числе в пыли помещений, и может быть использовано для оценки пирогенности объектов окружающей среды при проведении экологического мониторинга жилых и производственных помещений с целью количественного определения пирогенной нагрузки пыли окружающей среды при помощи ингибиторного иммуноферментного анализа на твердой фазе.

Группа изобретений относится к медицине, в частности к фармакологии, и может быть использована для идентификации и количественного определения основных компонентов в инъекционных лекарственных средствах методом спектрометрии комбинационного рассеяния света.

Предлагается способ обучения персонала контролю качества при расфасовке аморфных товаров (128) в первичное упаковочное средство (118). Способ включает в себя следующие шаги: а) по меньшей мере один шаг обеспечения, причем на шаге обеспечения обеспечивают по меньшей мере один тестовый набор (112) заполненных первичных упаковочных средств (118), причем тестовый набор (112) имеет несколько заполненных аморфным товаром первичных упаковочных средств (118), причем по меньшей мере одно первичное упаковочное средство (118) из заполненных первичных упаковочных средств (118) имеет по меньшей мере одно загрязнение (138), причем загрязнение (138) имеет по меньшей мере один флуоресцирующий маркер (142), б) по меньшей мере один шаг обучения, причем на шаге обучения тестовый набор (112) предъявляют по меньшей мере одному обучаемому лицу, причем обучаемое лицо выполняет визуальный контроль качества для обнаружения загрязнений (138), причем результат шага обучения документируют, в) по меньшей мере один шаг верификации, причем на шаге верификации тестовый набор (112) облучают светом (116) возбуждения, причем обнаруживают флуоресцирующие загрязнения (138), причем результат шага верификации документируют, и г) по меньшей мере один шаг сравнения, причем на шаге сравнения сравнивают результат шага обучения и результат шага верификации.

Изобретение относится к медицине, а именно к химико-фармацевтической промышленности, и касается способа оценки биологической активности тетрадекапептида, состоящего из 14 аминокислотных остатков, общей формулы TEKKRRETVEREKE (ТДП).

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способу идентификации модулятора вкуса. Указанное изобретение представляет собой метод анализа для измерения интернализации вкусовых рецепторов, который позволяет идентифицировать соединения, являющиеся модуляторами вкуса.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к иммуногенным эпитопам UBE2T, и может быть использовано в медицине для лечения пациента, страдающего раком. Получают модифицированные эпитопные пептиды UBE2T, которые связываются с HLA-A*2402 или HLA-A*0201 и обладают более высокой способностью индуцирования цитотоксических T-лимфоцитов (ЦТЛ), чем эпитопный пептид UBE2T дикого типа.

Изобретение относится к аналитической химии, а именно к фармацевтическому анализу, и может быть использовано для количественного определения фенобарбитала в таблетках “Корвалол” методом УФ-спектрофотометрии.

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано в контрольно-аналитических лабораториях для стандартизации и контроля качества лекарственных средств.

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано в контрольно-аналитических лабораториях для стандартизации и контроля качества лекарственных средств.

Изобретение относится к области медицины и фармации, а именно к количественному определению таурина и аллантоина при совместном присутствии в лекарственных формах и смесях методом спектрофотомерии.

Изобретение относится к биотехнологии и контролю качества и может быть использовано в фармацевтической промышленности и научно-исследовательской деятельности для количественного определения гиалуронидазной активности лекарственных средств.

Изобретение относится к сварочной отрасли, а именно к способам улавливания твердой составляющей сварочного аэрозоля. Способ отбора пробы для последующего анализа ТССА включает зажигание сварочной дуги и улавливание частиц ТССА с помощью таблетки углеродного скотча, которую по окончании процесса сварки помещают в контейнер для осуществления последующего анализа.

Изобретение относится к медицине, в частности к экспериментальной фармакологии Предложен способ ингибирования нуклеарного фактора каппа В в культуре клеток, включающий добавление бактериального липополисахарида в концентрации 1 мкгмл к свежевыделенным по стандартной методике на градиенте плотности фиколла мононуклеарным клеткам крови крыс Wistar, отличающийся тем, что к данной смеси затем добавляют 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридиния L-2,6-диаминогексаноат в конечной концентрации 35 мкгмл. Технический результат состоит в выраженном ингибировании нуклеарного фактора каппа В в культуре клеток и в благоприятном профиле безопасности. 1 табл.

Наверх