Препарат гиалуронидазы и способ его получения

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к способу получения препарата гиалуронидазы. Способ получения препарата гиалуронидазы включает измельчение семенников крупного рогатого скота, экстракцию уксусной кислотой при постоянном перемешивании, центрифугирование экстракта, концентрирование полученного центрифугата, диафильтрацию, стерилизующую фильтрацию, ампулирование и сублимационную сушку, при определенных условиях. Препарат гиалуронидазы. Вышеописанный способ позволяет повысить выход и увеличить активность конечного продукта. 2 н. и 2 з.п. ф-лы, 5 ил., 1 табл., 7 пр.

 

Область изобретения

Изобретение относится к фармацевтической промышленности и может быть использовано в медицине для получения препарата, обладающего гиалуронидазной активностью.

Предшествующий уровень техники

Лидаза - это энзимный препарат, полученный из семенных желез крупного рогатого скота. Активным компонентом препарата служит фермент гиалуронидаза. Данный фермент активирует процесс расщепления главного элемента промежуточного вещества соединительной ткани - гиалуроната (гликозаминогликана, метаболиты которого обеспечивают прочность соединительной ткани). Гиалуронидаза обладает следующими положительными свойствами: снижает вязкость соединительной ткани; усиливает проницаемость тканей и кровеносных сосудов; облегчает перемещение межтканевых жидкостей; уменьшает предрасположенность к отекам; способствует заживанию рубцов; стимулирует заживание гематом; увеличивает подвижность суставов; снижает выраженность контрактур и предупреждает их развитие.

Лидазу используют по различным назначениям: при рубцовых поражениях подкожно (под рубцово-измененные ткани) или внутримышечно (вблизи места поражения), при травматических поражениях нервных сплетений и периферических нервов, в офтальмологической практике, при лечении туберкулеза легких (назначают в комплексной терапии для повышения концентрации антибактериальных лекарственных средств в очагах поражения), наружно, в виде повязок, пропитанных раствором препарата, при электрофорезе для повышения эффективности.

Способы получения данного препарата известны из предшествующего уровня техники.

Известен способ получения лидазы по патенту SU 566875 (опубл. 30.07.1977), включающий экстракцию уксусной кислотой из семенников крупного рогатого скота, отделение экстракта с последующим высушиванием целевого продукта, при этом полученный экстракт концентрируют и отделяют балластные белки, затем экстракт обрабатывают спиртом и полученный осадок промывают многократно ацетоном, а затем серным эфиром. Недостатки данного способа: использование в производстве пожароопасных и экологически опасных веществ, а также невысокий выход конечного продукта (1,3% в расчете на массу исходного сырья) со сравнительно низкой удельной активностью (5,12 у.е./мг).

Немного иной способ получения лидазы описан в RU 1448443 (опубл. 15.08.1994). По этому способу осуществляют обработку сырья уксусной кислотой, центрифугирование, осаждение ацетоном, растворение осадка в воде с последующими фильтрацией и высушиванием целевого продукта, при этом используют жмых семенников после отделения вещества, обладающего гиалуронидазной активностью, или смесь семенников и жмыха, обрабатывают уксусной кислотой при рН 3,5-4,0 в течение 12-24 ч. при температуре 10-15°С с добавлением 0,5 г/л хлористого цинка, а целевой продукт получают осаждением тремя объемами ацетона при температуре от -5 до -10°С. Данный способ предполагает сложный, длительный и многостадийный процесс, включая осаждение при достаточно низких температурах пожароопасным и летучим реагентом (ацетоном), что приводит к повышению опасности при производстве и снижению экологической безопасности.

Также известен способ получения лидазы по патенту SU 111012 (опубл. 01.01.1957), включающий автолиз тестикулярной ткани половозрелого скота крупного в присутствии уксусной кислоты при рН 4,6, очистку полученного лизата известным образом ацетоном с последующим центрифугированием и растворением в дистиллированной воде, с дальнейшей стерилизацией и фильтрованием. Конечный продукт лиофилизуют и ампулируют. Данный способ также предполагает применение пожароопасного реагента - ацетона, что в значительной степени усложняет производственный процесс, делает его пожароопасным и снижает экологическую безопасность.

Получение лидазы известно также из патента SU 827068 (опубл. 07.05.1981). Способ включает обработку семенников крупного рогатого скота в присутствии уксусной кислоты, осаждения ацетоном, растворения осадка в воде с последующей фильтрацией и сублимационной сушкой, при этом, экстрагирование проводят 0,1N уксусной кислотой при температуре 5-10°С, перед фильтрацией проводят переосаждение при 0-1°С, и после фильтрации диализ при 0-10°С в течение 12-16 ч. Данный способ не позволяет получить высокий выход продукта (максимально - до 1,2 г/кг исходного сырья). Удельная активность полученного препарата составляла 2,55 у.е./мг. Этот способ также является экологически нецелесообразным и не безопасным, т.к. предполагает использование ацетона, легколетучего и токсичного вещества.

Недостаток способа: высокая температура экстракции, что в сочетании с высокой концентрацией кислоты приводит к высокому выходу в раствор балластных белков и, как следствие, низкий выход по удельной активности конечного продукта (на мг/белка).

Патент SU 1666534 (с приоритетом от 12.05.1989) описывает способ получения лидазы, включающий экстракцию измельченных семенников крупного рогатого скота водным раствором уксусной кислоты при рН 4,5-4,7 и температуре 2-40°С в течение 2-4 ч с последующим отделением экстракта и очисткой целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа, повышения выхода и удельной активности препарата, экстракцию осуществляют в атмосфере инертного газа, а очистку проводят сорбцией экстракта белой глиной в количестве 25-50 г. на 1 л экстракта в течение 1-2 ч и десорбцией целевого продукта водным раствором уксусной кислоты при рН 4,5-4,7 при массовом соотношении сорбента и раствора 1:10-15. При этом данный способ имеет достаточно низкий выход по сравнению с заявленным способом (всего 7,5-9% от массы исходного сырья), а активность полученной лидазы составляет 1020-2050 у.е. на 100 мг. Дополнительно, при осуществлении данного способа необходимо обеспечить атмосферу инертного газа и герметичность используемого оборудования, что, в свою очередь, приводит к дополнительным тратам и повышению себестоимости продукта.

Наиболее близким аналогом настоящего изобретения является способ получения гиалуронидазы, описанный в патенте RU 2027759 (опубликовано 27.01.1995). Способ включает экстракцию фермента из измельченных семенников крупного рогатого скота водным раствором уксусной кислоты, отделение экстракта центрифугированием, очистку целевого продукта на сорбенте и сушку, при этом полученный после центрифугирования экстракт концентрируют ультрафильтрацией в тангенциальном потоке с пределом задержания по молекулярной массе до 50 КДа и проводят осаждение балластных белков полиэтиленгликолем, очистку ведут катионообменной хроматографией с сорбцией фермента при рН 4,5-4,9 и элюцией при этом же рН 0,6 MNaCl. Однако, данный способ имеет свои недостатки. В частности, сравнительно невысокий выход продукта (0,078% от массы исходного сырья) и низкую удельную активность полученой лидазы (140 усл.ед./мл). Кроме того, использование для осаждения балластных белков полиэтиленгликоля (ПЭГ) может приводить к повышению вязкости системы, сложностям при хроматографии и элюировании, а несвязанный ПЭГ может оставаться в конечном продукте, что является крайне нежелательным для инъекционных форм.

Таким образом, необходимо разработать способ получения препарата гиалуронидазы, не предусматривающий использования токсичных и/или опасных веществ, имеющий высокий выход продукта и по возможности отвечающий требованиям экологически безопасного производства (см. Фиг. 1).

Описание фигур

Фиг. 1 иллюстрирует основные стадии способов получения препарата гиалуронидазы согласно предшествующему уровню техники (слева) и способа согласно настоящему изобретению (справа)

Фиг. 2 показывает динамику накопления общего белка в зависимости от времени экстракции;

Фиг. 3 показывает динамику накопления фермента гиалуронидазы в зависимости от времени экстракции;

Фиг. 4 показывает динамику накопления общего количества активного фермента гиалуронидазы в зависимости от времени экстракции.

Фиг. 5 представляет электрофоретограмму полученного экстракта (проводился электрофорез проб, полученных в результате концентрирования и отмывки экстракта семенников КРС, в ПААГ). Рамкой показаны полосы, соответствующие молекулярной массе фермента гиалуронидаза. Цифрами на Фиг. 5 обозначены:

1 - Маркер фирмы Bio Rad (молекулярные массы 97,4; 66,2; 45; 31; 21,5; 14,4 кДа)

2 - ГСО Лидаза

3 - Экстракт семенников КРС

4 - Концентрат, полученный на кассете 8 кДа

5 - Концентрат, полученный после отмывки на кассете 8 кДа

6 - Концентрат, полученный на кассете 30 кДа

7 - Концентрат, полученный после отмывки на кассете 30 кДа

8 - Концентрат, полученный на кассете 50 кДа

9 - Концентрат, полученный после отмывки на кассете 50 кДа

Краткое описание изобретения

Способ получения препарата гиалуронидазы включает следующие стадии:

1) измельчение репродуктивной ткани крупного рогатого скота (семенников);

2) экстракцию 0,1 н уксусной кислотой в течение не более 2 часов при температуре 4-10°С при рН 4,3-4,7 при постоянном перемешивании;

3) центрифугирование экстракта, полученного на предыдущей стадии;

4) концентрирование полученного центрифугата с помощью мембран для ультрафильтрации с размером пор, пропускающей частицы выше 30 к Да;

5) диафильтрацию через мембраны с аналогичным размером пор,

6) стерилизующую фильтрацию на мембранах с диаметром пор 0,22 мкм;

7) розлив препарата в ампулы;

8) сублимационную сушку.

Способ отличается от способов получения, описанных в предшествующем уровне техники тем, что не используют ацетон в качестве экстрагента или осаждающего агента.

Также, согласно изобретению, предложен препарат гиалуронидазы, полученный согласно описанному способу. Полученный препарат также отличается тем, что не содержит ацетон.

Подробное описание изобретения

Цель изобретения - создание экологически чистого производства, повышение выхода и увеличение удельной активности конечного продукта при снижении себестоимости.

Задача, решаемая настоящим изобретением создание экологически чистого производства, снижение себестоимости, повышение выхода и увеличение удельной активности конечного продукта.

Технический результат заключается в повышении выхода и увеличении удельной активности конечного продукта.

В результате исследования было обнаружено, что можно повысить выход препарата и его удельную активность, если осуществлять получение препарата способом, включающим стадии:

1) измельчение репродуктивной ткани крупного рогатого скота (семенников);

2) экстракцию 0,1 н уксусной кислотой в течение не более 2 часов при температуре 4-10°С при рН 4,3-4,7 при постоянном перемешивании;

3) центрифугирование экстракта, полученного на предыдущей стадии;

4) концентрирование полученного центрифугата с помощью мембран для ультрафильтрации с размером пор, пропускающей частицы выше 30 к Да;

5) диафильтрацию через мембраны с аналогичным размером пор,

6) стерилизующую фильтрацию на мембранах с диаметром пор 0,22 мкм;

7) розлив препарата в ампулы;

8) сублимационную сушку.

При этом, именно сочетание оптимального экстрагента (0,1 н уксусная кислота), времени и постоянного перемешивания позволяют достичь максимального выхода и высокой удельной активности получаемой гиалуролидазы.

Кроме того, было обнаружено, что в данных условиях процесс экстракции можно существенно сократить по времени, до 2 ч., т.к. именно в этих условиях экстрагирование проходит наиболее эффективно, и при экстракции свыше 2 ч. происходит снижение выхода целевого продукта (см. Фиг. 2).

Частный вариант осуществления настоящего изобретения включает способ, согласно которому замороженную репродуктивную ткань крупного рогатого скота (семенники) измельчают, экстрагируют в 1,5-2,0 объемах 0,1 н. уксусной кислоты в течение 2 ч при температуре 4-10°С при постоянном перемешивании, отделяют балластные вещества на центрифуге (3000 об/мин, 30 мин, 4-10°С), затем проводят осветляющую фильтрацию на мембранах с размером пор 9 мкм, затем полученный раствор подают на ультрафильтрацию через мембраны с размером пор, пропускающей частицы выше 30 кДа, далее проводят диафильтрацию (отмывка в 10-кратном объеме) через мембраны с аналогичным размером пор, после чего концентрат стерильно фильтруют, разливают во флаконы (ампулы) из расчета 1500 ME на флакон, сублимируют.

Другой вариант реализации предполагает способ, в котором замороженную репродуктивную ткань крупного рогатого скота (семенники) измельчают, экстрагируют в 2 объемах 0,1 н уксусной кислоты в течение 2 ч при температуре 4-10°С при рН 4,3-4,7 при постоянном перемешивании, концентрируют в 5 раз с помощью мембран для ультрафильтрации с размером пор, пропускающей частицы выше 30 кДа, после чего концентрат стерильно фильтруют, разливают в ампулы и сублимируют.

Полученный препарат имеет имеет выход готовой продукции, увеличенный в 2,4-4,5 раза по сравнению с известными способами получения при сохранении и увеличении удельной активности до.

Примеры

Изобретение относится к фармацевтической промышленности и может быть использовано в медицине для получения препарата, обладающего гиалуронидазной активностью.

Пример 1

Известен способ получения лидазы, согласно которому замороженные семенники половозрелых быков измельчают, измельченную массу дефростируют, добавляют раствор 12%-ной уксусной кислоты из расчета 100 мл на 1 кг сырья. Автолиз проводят в течение 18-20 ч при рН 4,5-4,6, при температуре 39-40°С, после чего жидкую фракцию отделяют, стерилизуют путем фильтрации через фильтр типа Зейтца. Профильтрованный лизат охлаждают до температуры 1-3°С и вливают в 4 объема ацетона с той же температурой, отстаивают 3-5 ч. на холоду и жидкий слой отделяют. Осадок гиалуронидазы растворяют в дистиллированной воде, охлажденной до 2-3°С из расчета 300 мл на 1 л исходного лизата. Раствор передают на стерильную фильтрацию, разливают во флаконы, сушат сублимационной сушкой. Недостаток способа: высокая температура экстракции, что в сочетании с высокой концентрацией кислоты приводит к высокому выходу в раствор балластных белков и, как следствие, низкий выход по удельной активности конечного продукта (на мг/белка).

Пример 2

Существует способ получения лидазы, включающий измельчение семенников половозрелых быков, экстракцию в 1,5-2,0 объемах 0,1 н. уксусной кислоты в течение 4 ч при температуре 4-10°С, фильтрование, осаждение сырца лидазы 99%-ным ацетоном из расчета 4 объема ацетона на 1 объем экстракта при температуре не выше 0°С, перемешивание и отстаивание в течение не менее 4 ч. при температуре не выше 5°С, отделение осадка, растворение осадка в воде из расчета 200-250 мл на 1 кг исходного сырья, фильтрацию, переосаждение лидазы 99%-ным ацетоном из расчета 6 объемов ацетона на 1 объем фильтрата при температуре не выше 0°С, отстаивания в течение 4 ч. при температуре не выше 5°С, промывки 99%-ным ацетоном при температуре не выше 0°С, сушку, стерильный розлив во флаконы и сублимационную сушку конечного продукта. Полученный продукт имеет удельную активность 0,14 у.е./мг.

Пример 3

Замороженную репродуктивную ткань крупного рогатого скота (семенники) измельчали, экстрагировали в 1,5-2,0 объемах 0,1 н. уксусной кислоты в течение 2 ч. при температуре 4-10°С, отделяли балластные вещества на центрифуге (3000 об/мин, 30 мин, 4-10°С), затем проводили осветляющую фильтрацию на мембранах с размером пор 9 мкм, затем полученный раствор подавали на ультрафильтрацию через мембраны с размером пор, пропускающей частицы выше 30 кДа, далее проводили диафильтрацию (отмывку в 10-кратном объеме) через мембраны с аналогичным размером пор, после чего концентрат стерильно фильтровали, разливали во флаконы (ампулы) из расчета 1500 ME на флакон, и подвергали сублимационной сушке.

Выход составлял не менее 3,42 г / кг исходного сырья.

Удельная активность полученной лидазы составляла не менее 7,39 у.е./мг.

Пример 4

Проводились исследования по сравнению влияния времени экстракции на выход белка, удельную и общую активность фермента. Экстракцию сырья проводили на протяжении 1, 2 и 4 ч. Результаты приведены в таблице 1 и на Фиг. 2.

По результатам исследования можно сделать вывод, что продолжительность экстракции не оказывает существенного влияния на выход белка, удельную и общую активность.

Пример 5

Удельную активность измеряли по способу, известному в литературе и являющемуся стандартным для измерений подобного рода.

Пример 6

Для определения молекулярного состава белков в полученном препарате лидазы был проведен электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия по Лэммли (SDS PAGE). Данные, полученные при проведении ультрафильтрации на кассетах с разным размером пор (8, 30 и 50 кДа), представлены на Фиг. 5.

Как видно из результатов анализа, полученный экстракт содержит фермент гиалуронидазу.

Пример 7

Полученные по способу 3 ампулы с препаратом гиалуронидазы упаковывают в коробки по 10 ампул или флаконов, вкладывают инструкцию по применению и используют в случае необходимости по назначению.

1. Способ получения препарата гиалуронидазы, включающий следующие стадии:

1) измельчение семенников крупного рогатого скота;

2) экстракцию 0,1 н. уксусной кислотой при соотношении сырья к экстрагенту 1:(1,5-2) в течение не более 2 часов при температуре 4-10°С при рН 4,3-4,7 при постоянном перемешивании;

3) центрифугирование экстракта, полученного на предыдущей стадии;

4) концентрирование полученного центрифугата с помощью мембран для ультрафильтрации с размером пор, пропускающим частицы выше 30 кДа;

5) диафильтрацию через мембраны с аналогичным размером пор,

6) стерилизующую фильтрацию на мембранах с диаметром пор 0,22 мкм;

7) розлив препарата в ампулы;

8) сублимационную сушку.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что не используют ацетон в качестве экстрагента или осаждающего агента.

3. Препарат гиалуронидазы, полученный согласно способу по п. 1.

4. Препарат гиалуронидазы по п. 3, отличающийся тем, что не содержит ацетон.



 

Похожие патенты:
Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ получения гиалуронидазы из семенников крупного рогатого скота.

Изобретение относится к фармацевтической промышленности и представляет собой способ получения стабильной и гомогенной жидкой композиции, подходящей для энтерального введения, содержащей продукт панкрелипазных ферментов и питательные вещества из питательной смеси, включающий следующие стадии: получение суспензии панкрелипазных ферментов в водном растворе, включающее стадии: уменьшение размера продукта панкрелипазных ферментов, добавление водного раствора, имеющего нейтральный рН, в количестве менее 10 мл, смешивание с образованием суспензии и выдерживание ее в течение периода времени более чем 5 минут и смешивание суспензии с жидкой питательной смесью с образованием стабильной и гомогенной жидкой композиции, где питательная смесь имеет общее содержание жировых, белковых и углеводных питательных веществ от 10 до 35 г/100 мл, или имеет общее содержание жировых и белковых питательных веществ от 4,5 до 11,5 г/100 мл, или имеет общее содержание жировых питательных веществ от 3,0 до 7,0 г/100 мл, или имеет общее содержание белковых питательных веществ от 1,3 до 6,3 г/100 мл, и водный раствор представляет собой очищенную воду, деионизированную воду, стерильную воду, физиологический раствор, 0,9% NaCl или водопроводную воду.

Группа изобретений относится к области биотехнологии. Представлен способ получения молекулярного комплекса, обладающего активностью GAA (кислой альфа-глюкозидазы), включающий контактирование полипептида с активностью GAA с протеазой из гриба вида Aspergillus oryzae, при этом указанная протеаза расщепляет указанный полипептид в одном или более сайтах между аминокислотой 50 и аминокислотой 74 последовательности указанного полипептида.

Изобретение относится к области биохимии, генной инженерии и биотехнологии, в частности к способу получения белка с помощью микроорганизма. Настоящий способ включает введение экспрессионной конструкции в микроорганизм, которая содержит промотор и нуклеиновую кислоту, кодирующую белок, и экспрессию белка в микроорганизме.

Изобретение относится к биотехнологии и медицине и представляет собой фармацевтический состав для расщепления гиалуроновой кислоты in vivo, содержащий эффективное количество выделенного белка гиалуронидазы, который имеет молекулярный вес 44±1 кДа и содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную последовательности SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 4, и фармацевтически приемлемый эксципиент, носитель, разбавитель или вспомогательный агент.

Изобретение относится к области биохимии. Представлено применение модифицированной протеазы в качестве средства для повышения стабильности при хранении амилазы в жидком моющем или чистящем средстве, включающем амилазу и протеазу.

Группа изобретений относится к биотехнологии. Предложены гранула для применения в порошковых моющих средствах и композиция гранулированного моющего средства.

Настоящее изобретение относится к способу предоставления вариантов протеазы или амилазы со значением эффективности, по меньшей мере, в одном интересующем тесте, превышающим показатель эффективности для указанного фермента дикого типа.

Изобретение относится к области биохимии и биотехнологии. Представлена гиалуронидаза из Streptomyces koganeiensis АТСС 31394, включающая N-концевую аминокислотную последовательность AGENGATTTFDGPVA и имеющая молекулярную массу 21,6 кДа, изоэлектрическую точку (pI) в диапазоне от 4,4 до 4,8 и ферментативную активность свыше 40000 МЕ/мг и менее 50000 МЕ/мг.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к полипептиду, обладающему амилазной активностью, происходящему от родительского полипептида, являющегося не-мальтогенной экзоамилазой дикого типа, имеющей по меньшей мере 90% идентичность SEQ ID NO: 13.

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности и представляет собой способ получения комплекса биологически активных пептидов из предстательной железы убойных животных, бычков или быков, включающий операции измельчения и гомогенизации замороженной ткани, экстракции гомогената раствором кислоты уксусной, обработки надосадочной жидкости ацетоном, промывки образовавшегося осадка ацетоном, высушивания осадка, экстракции пептидов из высушенного порошка водой для инъекций, отличающийся тем, что экстракцию гомогената проводят раствором 3% кислоты уксусной, содержащим хлористый цинк в концентрации 1,2 г/л, на стадии экстракции пептидов, из высушенного порошка, добавляют фермент - сериновую эндопротеазу до концентрации 0,3%, выдерживают при температуре 65°C при постоянном перемешивании в течение 3 часов, инактивируют фермент при температуре 90°C в течение 30 минут, охлаждают до комнатной температуры, сепарируют или фильтруют и лиофилизируют.

Изобретение относится к области ветеринарной медицины, в частности к получению биологически активных препаратов для стимуляции половой функции у самок домашних животных.

Изобретение относится к области ветеринарии и предназначено для коррекции функциональной активности яичников при их гипофункции у коров. Способ включает обработку животных препаратом натуральных половых феромонов быка, который распыляют на носовое зеркало животных в дозе 0,5 мл/гол.

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к способу получения из тканей человека белкового экстракта, обогащенного сфингомиелинсинтазой 1.
Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к способу получения средства для восстановления функции предстательной железы. Способ получения средства для восстановления функции предстательной железы, включающий измельчение животной ткани предстательной железы забойных быков и/или бычков, достигших половой зрелости, выдерживание в водном растворе уксусной кислоты и хлористого цинка, после экстракции в водный раствор добавляют ацетон, удаляют балластные белки и жмых сепарированием, добавляют ацетон, водно-ацетоновую смесь перемешивают и отстаивают, осветленную жидкость сливают и фильтруют с отделением сырца, сырец сушат, растирают и просеивают при определенных условиях.

Изобретение относится к медицине, а именно к кардиологии, и может быть использовано в ходе проведения гемодинамической коррекции врожденных пороков сердца у больных с функционально единственным желудочком сердца.
Изобретение относится к животноводству и ветеринарии. .
Изобретение относится к области фармацевтики, касается мази для лечения рубцов путем наружного применения на теле пациента. .
Изобретение относится к медицине и может быть использовано для лечения псориаза, простатита и обусловленных простатитом половых расстройств. .
Изобретение относится к косметологии, бальнеологии, фармацевтике или пищевой промышленности. .
Наверх