Способ центильной оценки микроценоза слизистой влагалища у девочек в зависимости от стадии полового созревания с учетом шкалы таннера

Изобретение относится к области медицины, в частности к гинекологии. Предложен способ центильной оценки микроценоза слизистой влагалища у девочек путем отбора биоматериала со слизистой боковой стенки влагалища за физиологическим отверстием девственной плевы соскобом одноразовым урогенитальным зондом. Методом ПЦР в режиме реального времени определяют количество геном-эквивалентов и долю в общей бактериальной массе Lactobacillus spp., облигатных анаэробов и факультативных анаэробов и сравнивают с центильным интервалом соответствующей группы микроорганизмов, полученным для соответствующей стадии полового созревания девочки по шкале Таннера. Для 1 и 2 стадии полового созревания по Таннеру нормой считают преобладание доли суммарного количества облигатных анаэробов над долей Lactobacillus spp. Для 3 стадии полового развития нормоценоз влагалища меняется в сторону преобладания Lactobacillus spp. 49,99%. Для 4 и 5 стадии полового созревания по Таннеру считают нормой преобладание доли Lactobacillus spp. над долей суммарного количества облигатных и факультативных анаэробов. Изобретение позволяет оценить микроценоз слизистой оболочки влагалища при обследовании девочек в возрасте от 3-х до 18-ти лет согласно стадиям созревания по шкале Таннера при использовании ПЦР в режиме реального времени. 1 ил., 12 табл., 4 пр.

 

Изобретение относится к области гинекологии и представляет собой способ оценки состояния микрофлоры влагалища у девочек в зависимости от стадии полового развития согласно критериям Таннера.

Забор биоматериала производят со слизистой боковой стенки влагалища путем мазка-соскоба. С помощью ПЦР в режиме реального времени определяют количество геном-эквивалентов представителей условно-патогенной микрофлоры и сравнивают с центильным интервалом соответствующей группы микроорганизмов; нормоценозом будет считаться общая бактериальная обсемененность в центильном интервале от 10^5,1 до 10^6,2 ГЭ/образец с представительством определенных микроорганизмов в установленных интервалах. Изобретение обеспечивает упрощение и ускорение анализа, а также разработку критериев его количественной и качественной оценки микробиоценоза.

Способ позволяет оценить микроценоз слизистой оболочки влагалища при обследовании девочек в возрасте от 3х лет до 18 лет включительно согласно стадиям созревания по шкале Таннера при использовании ПЦР - исследования в режиме реального времени.

Описанные результаты были получены в рамках диссертации на соискание степени доктора медицинских наук по теме: «Медико-социальные и гигиенические основы формирования репродуктивного здоровья девочек в различные периоды полового созревания».

В 1990 году М.Л. Коршуновым впервые в мире были разработаны критерии нормоценоза у девочек от 1 до 15 лет, базирующиеся на анализе данных микроскопии мазка, взятого из просвета влагалища. По мнению автора за нормоценоз у девочек 1-3 лет следует принимать данные микроскопии мазка, в котором микрофлора представлена незначительным количеством грамположительных коккобактерий, число лейкоцитов колеблется от 0 до 2, встречаются 1-2 эпителиальные клетки и незначительное количество дегенеративно и реактивно измененных клеток. Такой метод не позволяет подробно охарактеризовать особенности пристеночных микробиологических сообществ на стенке слизистой влагалища и оценить особенности их количественных значений.

Микроскопическая картина мазка вагинального отделяемого здоровых девочек в возрасте 3-7 лет, описанная Султановой Ф.Ш. и соавторами, 2003 г., характеризуется наличием единичных клеток или отдельных скоплений грамположительных кокков, палочек, гарднерелл, строгих анаэробов, колиформных палочек, эпителиальных клеток парабазального, промежуточного слоев, тяжей слизи.

Микроскопическое исследование мазков, окрашенных по Граму, позволяют получить общую, только качественную оценку состава микробиоты, без возможности видовой характеристики и подсчета точного количества микроорганизмов. Вышеуказанные ближайшие аналоги предложенного метода характеризуются субъективизмом исследования в зависимости от профессиональной квалификации лаборанта и врача, предоставляющего заключение.

Видовой состав аэробных, факультативно-анаэробных и некоторых облигатно-анаэробных бактерий позволяет установить микробиологическое (культуральное) исследование.

В 1970, Hammerschlag и соавтры охарактеризовали нормофлору здоровых девочек до 15 лет наличием Candida albicans, Corynebacterium vaginale, и генитальных микоплазм [Hammerschlag MR, Alpert S, Rosner I, et al. Microbiology of the vagina in children: normal and potentially pathogenic organisms. Pediatrics 1978; 62:57-62]. Указанный аналог метода диагностики имеет существенные недостатки из-за отсутствия повозрастной характеристики микроценоза, кроме того, автором описываются группы микроорганизмов без указания их количественных значений, что не позволяет полностью оценить нормоценоз влагалища и решить вопрос о возможном терапевтическом подходе.

Е.В. Гриневич 2005 охарактеризовала нормоценоз влагалища у детей в возрасте до 3-х лет наличием стафилококков (сапрофитный, эпидермальный), кишечной палочки, дрожжеподобных грибов рода Candida, клебсиелл в количествах, не превышающих 1 степень обсеменения.

Султанова Ф.Ш., Уварова Е.В., Анкирская А.С., 2003 охарактеризовали нормоценоз здоровых девочек в возрасте 3-7 лет ассоциациями микроорганизмов трех типов: факультативных анаэробов с бифидобактериями (47,4%); факультативных и строгих анаэробов в том числе и бифидобактериями (36,8%), только факультативных анаэробов (15,8%).

Недостатком описанных методов диагностики является необходимость наличия специальной лаборатории, оснащенной дорогостоящим оборудованием для создания особых условий, высококачественных селективных питательных сред и высококвалифицированных врачей-микробиологов. Существенными недостатками также являются длительные сроки культивирования (в среднем 7 дней) микроорганизмов и необходимость сохранения жизнеспособности их до момента поступления биоматериала в лабораторию, а также отсутствие возможности контроля качества преаналитического этапа, определяющего эффективность любого лабораторного анализа в целом. Кроме того, имеющиеся микробиологические критерии базируются лишь на оценке процентного соотношения тех или иных микроорганизмов без учета референсных значений каждого микроорганизма.

Одним из ближайших аналогов предлагаемого способа является метод оценки микробиоценоза влагалища (RU 2249821), описанный как «одновременный забор отделяемого и соскобного материала из влагалища, с последующим смывом из влагалища 5,0 мл 6,0% раствора полиглюкина, цитологическим исследованием окрашенного по Граму мазка соскобного материала с определением бактериальной обсемененности эпителиоцитов, количества лейкоцитов и ключевых клеток, посева отделяемого влагалища и соскобного материала из серийных разведений на питательные среды с определением количества лактобацилл, условно-патогенной факультативно-анаэробной и облигатно-анаэробной микрофлоры, определяют в смыве из влагалища концентрации IgA, sIgA, IgM и свободного секреторного компонента». Полученные данные сравнивали с критериями, установленными для нормоценоза влагалища при наличии на поверхности эпителиоцита менее 25 бактериальных клеток, представленных грамположительными палочками, при количестве лейкоцитов менее 10 в поле зрения, при отсутствии ключевых клеток, при содержании в отделяемом 6-8 lg КОЕ/г лактобацилл, при содержании в соскобном материале 7-10 lg КОЕ/г лактобацилл, при отсутствии в отделяемом и в соскобном материале условно-патогенной факультативно-анаэробной и облигатно-анаэробной микрофлоры и при концентрации в смыве IgA 0 мкг/мл, sIgA≤10 мкг/мл, IgM 0 мкг/мл, свободного секреторного компонента ≤10 мкг/мл.

Существенным недостатком данного способа является необходимость многократного и трудоемкого забора исследуемого материала, оценка микробиологического состояния без учета ее видовой идентификации и их количественных значений, а нормативные критерии могут быть использованы лишь в возрастной группе женщин репродуктивного периода.

Метод полимеразной цепной реакции в «реальном времени» позволяет быстро и точно выявить широкий спектр микроорганизмов и провести количественный анализ представленности различных групп. В практике акушеров и гинекологов метод ПЦР в режиме реального времени с успехом применяется для оценки состояния микробиоты влагалища среди женщин репродуктивного возраста [Л.Д. Андросова, Медицинский Альманах №4 (13) ноябрь 2010, с. 177-179]. Описанный способ диагностики дисбаланса микробиоты различных биотопов человека и степени его выраженности (RU 2362808), заключающийся в том, что с помощью метода полимеразной цепной реакции в «реальном времени» в исследуемой биопробе определяют общее число геномов бактерий, характерных для конкретного биотопа, число геномов нормобиоты и условно-патогенной биоты. Полученные величины сравнивают между собой, определяют соотношение между числом геномов нормобиоты и условно-патогенной биоты и при превышении числа геномов нормобиоты относительно числа геномов условно-патогенной биоты в 1000 раз констатируют отсутствие дисбаланса, оценивая данный показатель как вариант нормы. При значении данного показателя менее чем 1000 раз диагностируют дисбаланс и устанавливают степень его выраженности путем определения соотношения между числом геномов нормобиоты и общим числом геномов бактерий, присутствующих в исследуемой пробе, а также между числом геномов условно-патогенной биоты и нормобиоты. При снижении числа геномов нормобиоты относительно общего числа геномов бактерий в 10-100 раз и снижении числа геномов условно-паогенной биоты относительно числа геномов нормобиоты в 100-1000 раз устанавливают легкую степень дисбаланса, а при превышении числа геномов нормобиоты относительно общего числа геномов микроорганизмов более чем в 100 раз и превышении числа геномов условно-патогенной биоты относительно числа геномов нормобиоты в 10 раз и более раз или менее этой величины устанавливают выраженную степень дисбаланса. Указанный способ не учитывает возможные возрастные изменения микроценоза конкретного биотопа, а именно влагалища, отсутствует указание конкретных групп микроорганизмов и их количественные изменения, определяющие нормобиоту у детей дошкольного возраста, что делает невозможным его широкое практическое использование в допубертатном периоде. В свою очередь, анализ известных методов оценки нормоценоза у детей раннего возраста указывает о крайней необходимости совершенствования и модернизации существующих характеристик и диагностических подходов к идентификации микрофлоры, формирующей симбиотическую биопленку и создающей колонизационную резистентность слизистых оболочек у девочек периода раннего детства.

В 2014 году рядом авторов (Д.Ю. Трофимов, Е.В. Уварова, З.К. Батырова, А.Е. Донников) проведена работа по анализу микробного пейзажа у девочек от 0 до 3 лет (№2545897). Описанные результаты были получены в рамках диссертации на соискание степени кандидата медицинских наук по теме: «Патогенетическое обоснование дифференцированного лечения рецидивирующих сращений малых половых губ в периоде раннего детства».

Авторы определили микроценоз слизистой оболочки влагалища здоровых девочек в возрасте от 0 до 3 лет, оцениваемый путем ПЦР-исследования в режиме реального времени. Для этой возрастной группы установили такие параметры как общую бактериальную обсемененность в центильном интервале от 10^5,1 до 10^6,2 ГЭ/образец с представительством микроорганизмов: Prevotella bivia/Porphiromonas ГЭ/обр от 10^3,0 до 10^6,0, Enterobacterium spp. ГЭ/обр от 10^2,0 до 10^5,0, Eubacterium spp. ГЭ/обр от 10^3,0 до 10^6,0, Megasphaera spp/Velionella spp/Dialister ГЭ/обр от 10^3,0 до 10^5,0, Peptostreptococcus spp. ГЭ/обр от 10^3,0 до 10^5,0, Streptococcus spp. ГЭ/обр от 10^3,0 до 10^5,0, Mobiluncus spp./Corynebacterium spp. ГЭ/обр от 10^3,0 до 10^5,0, Snethia spp/Fusobacterium spp/Leptotrihia ГЭ/обр от 102,0 до 10^5,0, Lachnobacterium spp/Clostridium spp. ГЭ/обр от 10^3,0 до 10^4,0, Staphylococcus spp. ГЭ/обр от 10^3,0 до 10^4,0, Gardnerella vaginalis ГЭ/обр от 0 до 10^3,0, Lactobacillus spp. ГЭ/обр от 0 до 10^2,0, Bifidobacterium ГЭ/обр от 0 до 10^3,0, Enterococcus spp. ГЭ/обр от 0 до 10^4,0, Atopobium vaginae ГЭ/обр от 0 до 10^3,0 при отсутствии ДНК патогенных микроорганизмов.

Еще одним исследованием, проведенным теми же авторами, явилась разработка способа комплексной оценки микробиоты слизистой влагалища совместно с маркером воспалительной реакции у девочек в возрасте от 0 до 8 лет (№2563182). Установлено, что у девочек в возрасте от 0 до 8 лет воспаление вульвы и влагалища бактериальной этиологии, оцениваемое путем количественного ПЦР исследования в режиме реального времени, характеризуется обнаружением мРНК гена CD45 в 25%-75% интервале от 0,5 до 1,4 единиц относительно референсных генов (HPRT1, ТВР, В2М, GUSB, ABL) с микроорганизмами Prevotella bivia/Porphiromonas от 10^3,7 до 10^6,0, Eubacterium spp. от 10^3,5 до 10^5,7, Enterobacterium spp. от 10^2,6 до 10^4,5, Megasphaera spp./Velionella spp./Dialister от 10^2,8 до 10^5,8, Peptostreptococcus spp. от 10^3,0 до 10^5,9, Streptococcus spp. от 10^3,0 до 10^5,0, Mobiluncus spp./Corynebacterium spp. от 10^3,2 до 10^4,9, Snethia spp./Fusobacterium spp./Leptotrihia от 0 до 10^4,0, Lachnobacterium spp./Clostridium spp. от 10^2,4 до 10^4,0, Staphylococcus spp. от 0 до 10^3,3, Lactobacillus spp. от 0 до 10^2,5, Enterococcus spp. от 0 до 10^2,3, Atopobium vaginae от 0 до 10^3,9 ГЭ/образец.

Во всех проведенных исследованиях учитывали только биологический возраст обследуемых. Исследований микробного пейзажа в зависимости от стадии полового развития авторами проведено не было.

Задачей изобретения является разработка критериев оценки микроценоза слизистой оболочки влагалища у девочек при различных стадиях полового созревания (шкала Таннера) при использовании метода ПЦР в режиме реального времени.

Методика исследования

Исследование было произведено у 233 девочек.

Критериями отбора в группу обследуемых девочек явились: возраст от 3х лет до 18 лет включительно, отсутствие субъективных жалоб, соматическое и гинекологическое здоровье, подтвержденное клинически и лабораторно, соответствие физического, полового и психического развития возрастным нормативам.

Перед исследованием проводили детальный анализ анамнестических данных девочек, включая изучение наследственной предрасположенности к заболеваниям, вредных привычек и хронических заболеваний у родителей до зачатия, течения беременности и родов у матерей девочек, острых и хронических соматических и эндокринных заболеваний, перенесенных и имеющихся у девочек к моменту осмотра. После получения информированного согласия родителя или законного представителя девочки проводилась оценка жалоб, физического (рост, масса тела, индекс массы тела) и полового развития (половая формула по Таннеру, данные наружного гинекологического осмотра). Затем девочек разделили на группы в соответствии с признаками полового развития согласно шкале Таннера и оценивали данные ПЦР - исследования в режиме реального времени биоматериала мазка-соскоба со слизистой боковой стенки влагалища за гименом, взятые одноразовым урогенитальным зондом. Перед началом анализа количественного и качественного состава биоты исследуемого региона подтверждалось соблюдение техники получения соскоба эпителиоцитов. Показателем адекватности процедуры получения биоматериала являлось достаточное количество геномной ДНК человека (контроль взятия материала - КВМ), попадающей в пробу из эпителиальных клеток, при правильной технике взятия биоматериала. Показатель КВМ оценивался в абсолютных значениях (геном-эквивалент на образец, ГЭ/обр.), за минимально достаточный уровень принимался показатель, равный 10⁴ГЭ. При снижении данного показателя результат ПЦР в режиме реального времени считался недостоверным. Уровень КВМ, был валиден во всех случаях, что подтверждает объективность последующего анализа полученных результатов. Полученные данные клинических и лабораторных исследований обрабатывались статистическими методами, после чего рассчитывали долю содержания Lactobacillus spp., факультативных анаэробов, облигатных анаэробов в процентах относительно бактериальной массы в разные периоды полового созревания соответствующие шкале Таннера.

Для определения референтного интервала нормы у девочек на различных стадия полового развития применили центильный метод. Для этого в пределах каждой стадии полового развития по отдельным группам микроорганизмов производили расчет следующих перцентилей: 10, 25, 50, 75 и 90. Трактовка выделяемых центильных коридоров, или интервалов:

1-й интервал (величины содержания микроорганизмов меньше 10 перцентилия) трактуются как «пониженные»;

2-й интервал (величины содержания микроорганизмов между 10 и 25 перцентилями) трактуются как «ниже среднего»;

3-4-е интервалы (величины содержания микроорганизмов между 25 и 75 перцентилями) трактуются «средние, или в норме»;

5-й интервал (величины содержания микроорганизмов между 75 и 90 перцентилями) трактуются как «выше среднего»;

6-й интервал (величины содержания микроорганизмов выше 90 перцентиля) трактуются как «повышенные».

Полученные результаты:

Проанализировав частоту встречаемости и количественное содержание лактобактерий, факультативно анаэробной микрофлоры, и облигатных анаэробов влагалища, нами получены результаты представленные на фигуре №1.

Задачей изобретения являлась разработка критериев оценки микроценоза слизистой оболочки влагалища у девочек в зависимости от стадии становления полового созревания при использовании метода ПЦР - в режиме реального времени. Сущность способа заключается в том, что производят забор биоматериала путем соскоба с боковой стенки слизистой влагалища за физиологическим отверстием девственной плевы, с помощью ПЦР в режиме реального времени определяют количество геном-эквивалентов представителей условно-патогенной микрофлоры с разделением на центильные корридоры. В качестве групповых сообществ микроценоза влагалища определяли долю Lactobacillus spp., долю факультативных анаэробы, долю облигатных анаэробов относительно бактериальной массы.

Нормоценозом влагалища у девочек с первой стадией полового развития по Таннеру будет преобладание облигатных анаэробов. Относительное содержание данной группы микроорганизмов в этом возрастном периоде 89,42%. Тогда как Lactobacillus spp. и факультативные анаэробы встречаются в микроценозе влагалища в 4,47% и 5,73% случаев.

В препубертатном периоде полового созревания соответствующего второй и третьей стадии полового развития по Таннеру происходит увеличение количества Lactobacillus spp. Нормоценозом при второй стадии полового развития характеризуется доля Lactobacillus spp. 26,95%, долей факультативных анаэробов 2,54%, долей облигатных анаэробов 70,51% относительно бактериальной массы.

При третьей стадии полового развития нормоценоз влагалища меняется в сторону преобладания Lactobacillus spp. 49,99%, факультативных анаэробов 16,82% и облигатных анаэробов 33,19%.

Учитывая, что достоверных изменений в соотношение микробиоты влагалища между четвертой и пятой стадией полового развития не выявлено, эти группы нами объединены. С менархе до 18 лет включительно (по шкале Таннера соответствует четвертой и пятой стадии развития), у девочек относительное содержание Lactobacillus spp. возрастает до 64,30% от общей бактериальной массы. Доля факультативных анаэробов снижается до 3, 69% относительно третьей стадии развития по Таннеру. Облигатные анаэробы составляют 1/3 от общей бактериальной массы среди девочек пубертатного периода.

Способ позволяет путем простой процедуры взятия биоматериала в течение суток получить объективную как количественную, так и качественную характеристику биоты слизистой оболочки влагалища у девочек от 3 до 18 лет с учетом стадий полового развития. В основу способа положена впервые предлагаемая авторами комплексная оценка микробиоты, соотношение лактобактерий, факультативных и облигатных анаэробов слизистой оболочки влагалища у девочек при всех стадиях полового развития согласно шкале Таннера с использованием метода ПЦР в реальном времени с оценкой определенных представителей биоты и их количества в рамках центильных интервалов.

Способ осуществляется следующим образом.

Биоматериал со слизистой боковой стенки влагалища соскоба за физиологическим отверстием девственной плевы, взятого одноразовым урогенитальным зондом (артикул: 3400-01), помещают в отдельные одноразовые пластиковые пробирки типа Эппендорф с транспортной средой (1,5 мл с 300 мкл стерильного физиологического раствора или в пробирки с реагентом ПРОБА-РАПИД (ООО «НПО ДНК-Технология»),

С помощью ПЦР в режиме реального времени определяют количество геном-эквивалентов представителей условно-патогенной микрофлоры и сравнивают с центильным интервалом соответствующей группы микроорганизмов (Таблица 1-12).

Описывая нормоценоз влагалища девочек с 1 стадией по Таннеру, с учетом центильных интервалов, необходимо отметить преобладание облигатных анаэробов в 99,66% случаев. Медиана количественного содержания этой группы микроорганизмов соответствует 5,83 ГЭ/обр., тогда как факультативные анаэробы содержатся у 0,20% девочек в количестве 3,40 ГЭ/обр., Lactobacillus spp. не встречаются.

У девочек со 2 стадией полового развития по Таннеру медиана встречаемости и количество облигатных, факультативные анаэробов и Lactobacillus spp. не меняется.

При 3 стадии полового созревания, происходит смещение частоты встречаемости микроорганизмов в сторону преобладания Lactobacillus spp. Медиана встречаемости данных микроорганизмов отмечается у 50% девочек. Тогда как встречаемость облигатных анаэробов уменьшилась в 11 раз.

У девочек с 4 стадией полового развития медиана встречаемости Lactobacillus spp. отмечается у 84,95%. Наличие облигатных анаэробов в микробиоценозе увеличивается до 10,01%, факультативные анаэробы встречаются в незначительном количестве случаев. Медиана количественного содержания Lactobacillus spp. соответствует 7,45 ГЭ/обр., а содержание облигатных анаэробов увеличивается в 1,5 раза.

У абсолютного большинства девушек с пятой стадией полового развития преобладают Lactobacillus spp., в количественном содержании 7,33 ГЭ/обр.

Клинические примеры.

Пример 1. Девочка Р., 3 лет обратилась с целью профилактического осмотра. На основании результатов клинического осмотра данных за воспалительный процесс половых органов не получено. Стадия полового развития соответствует 1 стадии по Таннеру. Произведен забор материала для исследования с помощью ПЦР в режиме реального времени. В течение суток получен следующий результат: Общая бактериальная масса - 10^6,5 ГЭ/обр., относительное содержание облигатных анаэробов - 100%, тогда как Lactobacillus spp. и факультативных анаэробов не выявлено. ДНК патогенных микроорганизмов отсутствуют.

По результатам проведенного исследования диагностирован нормоценоз. Даны рекомендации по гигиене. Повторный осмотр назначен на следующий декретируемый возраст. С помощью предлагаемого метода удалось получить объективное подтверждение клинического диагноза, сократить сроки обследования.

Пример 2. Девочка Т., 7 лет 5 месяцев обратилась с целью профилактического осмотра. На основании результатов клинического осмотра данных за воспалительный процесс половых органов не получено. Половая стадия развития соответствует 2 стадии по Таннеру. По результатам микроскопии мазка из влагалища: Эпителий промежуточные клетки. Флора кокковая, умеренная. Лейкоциты отсутствуют. Слизи мало.

Произведен забор материала для исследования с помощью ПЦР в режиме реального времени. В течение суток получен следующий результат: Общая бактериальная масса - 10^6,0 ГЭ/обр., абсолютное количество облигатно анаэробных микроорганизмов 10^5,69 ГЭ/обр., факультативно анаэробых - 10^5,22 ГЭ/обр., Lactobacillus spp. не выявлены. Относительное содержание облигатных анаэробов - 75,37%, факультативных анаэробов - 24,63%. ДНК патогенных микроорганизмов не выявлены.

По результатам проведенного исследования диагностирован нормоценоз. Повторный осмотр назначен на следующий декретируемый возраст. С помощью предлагаемого метода удалось получить объективное подтверждение клинического диагноза, сократить сроки обследования.

Пример 3. Девочка Л., 14 лет 3 месяца обратилась с целью профилактического осмотра. На профилактическом осмотре девочка имела жалобы на незначительные слизистые выделения из влагалища. Менархе с 11 лет. Половая стадия развития соответствует 4 стадии по Таннеру. На основании результатов клинического осмотра данных за воспалительный процесс половых органов не получено.

Произведен забор материала для исследования с помощью ПЦР в режиме реального времени. В течение суток получен следующий результат: Общая бактериальная масса - 10^8,6 ГЭ/обр., Lactobacillus spp. - 10^8,6 ГЭ/обр., облигатные анаэробы 10^7,2 ГЭ/обр., факультативные анаэробы - 10^4,2 ГЭ/обр. Относительное содержание Lactobacillus spp. - 96,53%, облигатных анаэробов - 3,39%, факультативные анаэробы отсутствовали. ДНК патогенных микроорганизмов не выявлено.

По результатам проведенного исследования диагностирован нормоценоз. Незначительные слизистые выделения, на которые жаловалась пациентка, оценены как вариант нормы и не требуют дальнейшего дообследования и терапии. Повторный осмотр назначен на следующий декретируемый возраст. С помощью предлагаемого метода удалось установить наличие нормоценоза слизистой влагалища, что позволило уточнить клинический диагноз и исключить лишние лечебные и диагностические процедуры.

Пример 4. Девочка П., 4 года 4 месяца, обратилась с жалобами на периодически возникающие выделения из половых путей с неприятным запахом. Половое развитие соответствует 1 стадии по Таннеру. В анамнезе у пациентки частые респираторные заболевания. Выделения из наружных половых путей с неприятным запахом стали появляться в течение последнего года. Произведена микроскопия мазка, ПЦР мазка-соскоба в режиме реального времени.

По данным микроскопии - значительное количество эпителиальных клеток. Лейкоциты в поле зрения отсутствуют. Флора кокковая, умеренно. Произведен забор материала для исследования с помощью ПЦР в режиме реального времени. В течение суток получен следующий результат: Общая бактериальная масса - 10^5,8ГЭ/обр.. Микроценоз представлен Enterobacterium 10^5,1 ГЭ/обр, Streptococcus spp. 10^3,7ГЭ ГЭ/обр, Staphylococcus spp. 10^3,2ГЭ ГЭ/обр, Eubacterium spp. 10^4,8ГЭ ГЭ/обр, Peptostreptococcus spp. 10^4,5ГЭ ГЭ/обр, Mobiluncus spp./Corynebacterium spp. 10^4,7 ГЭ ГЭ/обр, Megasphaera spp/Velionella spp/Dialister 0 ГЭ/обр, Snethia spp./Fusobacterium spp/Leptotrihia 0 ГЭ/обр, Lachnobacterium spp./Clostridium 0 ГЭ/обр, Lactobacillus spp. 0 ГЭ/обр, Bifidobacterium 0 ГЭ/обр, Atopobium vaginae 0 ГЭ/обр. Gardnerella vaginalis, Prevotella bivia/Porphiromonas не выявлено. Абсолютное количество Lactobacillus spp не выявлено, облигатно анаэробных микроорганизмов 52,23%, факультативно анаэробых - 47,77% от общей бактериальной массы. ДНК патогенных микроорганизмов не выявлены.

По результатам полученного исследования диагностировано присутствие в высоком титре энтеробактерий и облигатно анаэробных микроорганизмов таких как: Eubacterium spp., Peptostreptococcus spp., Mobiluncus spp./Corynebacterium spp. Диагностирован вульвовагинит обусловленный кишечной микрофлорой. Назначена терапия. Даны рекомендации по гигиене. Полученные данные свидетельствуют о не редко встречающемся в практике детского гинеколога не совпадении результатов исследования стандартными методами и предлагаемым способом. В отличие от стандартных методов диагностики с помощью предлагаемого метода удалось установить этиологический агент патологического процесса в течение суток путем проведения однократного забора исследуемого материала, с назначением этиологически значимых препаратов.

Список литературы.

1. Андросова Л.Д., Медицинский Альманах №4 (13), ноябрь 2010, с. 177-179.

2. Анкирская А.С., Муравьева В.В. Опыт микробиологической диагностики оппортунистических инфекций влагалища. // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2001. №2. Т. 3, с. 101-105.

3. Анкирская А.С., Муравьева В.В. Инфекции влагалища: Лабораторная диагностика оппортунистических инфекций влагалища // Consilium Medicum. 2005, №3, т. 7.

4. Гриневич Е.В. Характеристика микробиоценозов влагалища, кишечника и мочевыводящих путей при вульвовагинитах у девочек раннего возраста в зависимости от различных факторов риска: дис. канд. мед. наук, 2005.

5. Дмитриев Г.А. Лабораторная диагностика бактериальных урогенитальных инфекций. - М.: Мед. книга, Н. Новгород: Издательство НГМА, 2003. - 336 с.

6. Коротяев А.И., Бабичев С.А. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология: учебник для мед. вузов - СПб.: Спец. Лит., 2008, 4-е изд., - 767 с.

7. Кисина В.И. Микроценоз влагалища в норме и при вагинальных инфекциях: методы его коррекции // Consilium Medicum. Том 04/№7/2002.

8. Лапченко М.Л. Гинекологические заболевания у девочек и девушек, 2004. Гл. 6, стр. 146-148.

9. Локун М.В. Особенности регуляции микроэкологических нарушений у девочек с неспецифическими вульвовагинитами. Дис… 2005.

10. Маркин Л.Б., Яковлева Э.Б. Детская гинекология // Знания / стр. 109-118, 2004.

11. Малова И.О. Влагалищные выделения у девочек: этиология, клиника, диагностика, лечение // Педиатрия. Том 07/№2/2005.

12. Маркин Л.Б. Детская гинекология: Справочник. - К.: Знания, 2004 - 476 с.

13. Прилепская В.Н., Довлетханова Э.Р., Байрамова Г.Р., Фофанова И.Ю. Современный взгляд на вопросы этиологии, патогенеза и лечения бактериального вагиноза // Гинекология №2 / том 12/2010.

14. Пересада О.А., Кудина О.Л., Тимошенко Т.Н. Влияние микрофлоры матери на формирование микробиоценоза влагалища девочки БелМАПО. Опубликовано: "Медицинская панорама", №1, январь, 2002.

15. Препутневич Т.В., Мелкумян А.Р., Анкирская А.С. Использование современных лабораторных технологий в видовой идентификации лактобактерий при оценке состояния микробиоты влагалища у женщин репродуктивного возраста // Акушерство и гинекология №1/2013.

16. Рахматулина М.Р. Вульвовагиниты у девочек до 12 лет: этиология, клиника, диагностика. Дис… 2004.

17. Скала Л.З., Сидоренко С.В. Практические аспекты современной клинической микробиологии. - Тверь: ООО Издательство «Триада», 2004. - 312 с.

18. Субботина С.В. Клинико-иммунологические особенности вульвовагинитов у девочек, дис… 2000.

19. Султанова Ф.Ш. Состояние влагалища и шейки матки у девочек допубертатного возраста с различным уровнем стероидных гормонов, дис… 2003.

20. Творогова Т.М. Воспалительные заболевания гениталий у девочек // РМЖ//№7, 2005 г.

21. Тихомиров А.Л., Олейник Ч.Г. Бактериальный вагиноз: некоторые аспекты этиологии, патогенеза, клиники, диагностики и лечения // Гинекология. Том 06/№2/2004.

22. Трачук Т.Ю. Особенности формирования биоценоза влагалища новорожденных и его роль в снижении детской гинекологической заболеваемости, дис… 1999.

23. Уварова Е.В. Детская и подростковая гинекология. Руководство для врачей - М.: Литтерра, 2009 г.

24. Уварова Е.В. Современные лечебно-диагностические технологии в детской гинекологии // Гинекология. Том 9, №5, стр. 16/2007.

25. Уварова Е.В. Кандидный вульвовагинит в практике детского гинеколога. // Русский медицинский журнал, 2002, том 10, №18, с. 798-802.

26. Уварова Е.В., Латыпова Н.Х., Плиева З.А. Результаты применения Лактогина для устранения дисбиотических состояний кишечника и влагалища у девочек с хроническим вульвовагинитом // Репродуктивное здоровье детей и подростков / 2008, №4, с. 71-82.

27. Уварова Е.В., Султанова Ф.Ш. Неспецифические вагиниты у детей и подростков. Недетские детские проблемы // Consilium Provisorum. Том 03/№5/2003.

28. Arne K. Myhre. Changes in Genital Anatomy and Microbiology in Girls between Age 6 and Age 12 Years: A Longitudinal Study, J Pediatr Adolesc Gynecol (2009).

29. Bacon JL. Prepubertal labial adhesions: Evaluluation of a referral population. Am. J Obstet Gynecol 2002; 187:327.

30. Jonathan Batchelor et al. Skin disorders affecting the vulva // obstetrics, gynaecology and reproductive medicine, 2008; 18:3 p. 53-58.

31. Celeste J. Brown, May ее Wong. Preliminary characterization of the normal microbiota of the human vulva using cultivation-independent methods // Journal of Medical Microbiology (2007), 56, 271-276.

32. Aldo Cavallini et al. Estrogen receptor and ER-related receptor expression in normal and atrophic vagina // Maturitas 59 (2008) 219-225.

33. Consensus Conference on Pediatric Atopic Dermatitis // J. Am. Acad. Dermatol. 2003; 49: 1088-1095. Atopic eczema in primary care. MeReC Bulletin. 2003; 14:1.

34. Caglar M.K. Serum Estradiol levels, in infants with and without Labial Adhesions: The role of estrogen in the etiology and treatment, 2007.

35. Cambell M.F. Vulvar fusion // JAMA, No 115 Pages 513-515, 1940.

36. Tamara L. Callahan, Aaron B. Caughey. Blueprints in obstetrics and gynecology / 2nd ed. 2001.

37. Crone AM. Aetiological factors in vulvar dermatitis JEADV (2000) 14, 181-186.

38. Cuadros Juan. The aetiology of paediatric inflammatory vulvovaginitis// Eur J Pediatr (2004) 163: 105-107.

39. Metella Dei et al. Vulvovaginitis in childhood; Best practice & research clinical obstetrics and gynecology 24 (2010)129-137.

40. Denney Jeff M. Bacterial vaginosis: A problematic infection from both a perinatal and neonatal perspective // Seminars in Fetal & Neonatal Medicine 14 (2009) 200-203.

41. Donders GG. Bosmans E, Dekeersmaecker A, Vereecken A, Van Bulck B, Spitz B. Pathogenesis of abnormal vaginal bacterial flora. Am J Obstet Gynecol 2000; 182:872-8.

42. Forsum U. Bacterial vaginosis - a microbiological and immunological enigma // APMIS 113: 81-90, 2005.

48. Jasper Jill M. Vulvovaginitis in the Prepubertal Child // Clinical pediatric emergency medicine 2009; 10-13.

43. Manohara Joishy, Chetan Sandeep Ashtekar, Arpana Jain, Rohini Gonsalves, Do we need to treat vulvovaginitis in prepubertal girls? Clinical review. BMJ, 2005V 330 186-188 Metella Dei. Vulvovaginitis in childhood// Best Practice & Research Clinical Obstetrics and Gynaecology 24 (2010) 129-137.

44. Lyubov A Matytsin. Vaginal microbiocoenosis and cytology of prepubertal and adolescent girls: their role in health and disease // World J Pediatr, Vol 6 #1, 2010.

45. Hammerschlag MR, Alpert S, Rosner I, et al. Microbiology of the vagina in children: normal and potentially pathogenic organisms. Pediatrics 1978; 62:57-62 Howard Maibach, Miranda Farage. Lifetime changes in the vulva and vagina// Arch Gynecol Obstet (2006) 273: 195-202.

46. Myhre A.K. Anogenital bacteriology in non-abused preschool children: a Acta Paediatr 91:885-891/2002.

47. Noverr M.C., Huffnagle G.B. The 'microflora hypothesis' of allergic diseases // Clin Exp Allergy 2005; 35:1511-1520.

48. Strieker Т., Navratil F., Sennhauser F.H. Vulvovaginitis in prepubertal girls // Arch Dis Child 2003; 88:324-326.

Фиг. №1 Видовое соотношение микроорганизмов во влагалище в зависимости от стадии полового развития.

Способ центильной оценки микроценоза слизистой влагалища у девочек путем отбора биоматериала со слизистой боковой стенки влагалища за физиологическим отверстием девственной плевы соскобом одноразовым урогенитальным зондом и исследованием биоматериала методом ПЦР в режиме реального времени, отличающийся тем, что с помощью комплекта реагентов «Фемофлор-16» определяют количество геном-эквивалентов и долю в общей бактериальной массе Lactobacillus spp., облигатных анаэробов и факультативных анаэробов, сравнивают с центильным интервалом соответствующей группы микроорганизмов, полученным для соответствующей стадии полового созревания девочки по шкале Таннера, где нормой считают попадание в 3-4 центильный интервал, где определены центильные интервалы количественного содержания микроорганизмов в биоценозе влагалища в геном-эквивалентах на образец (ГЭ/обр.) у девочек I стадии по шкале Таннера как 3,9-7,14 для облигатных анаэробов, 3,4-5,07 для факультативных анаэробов и 3,54 для Lactobacillus spp.; для II стадии по шкале Таннера как 3,36-7,47 для облигатных анаэробов, 3,61-5,18 для факультативных анаэробов и 3,0-7,38 для Lactobacillus spp.; для III стадии по шкале Таннера как 3,46-6,67 для облигатных анаэробов, 3,2-5,61 для факультативных анаэробов и 7,93-8,39 для Lactobacillus spp.; для IV-V стадии по шкале Таннера как 3,69-7,93 для облигатных анаэробов, 3,41-5,37 для факультативных анаэробов и 6,25-8,42 для Lactobacillus spp., причем для 1 и 2 стадии полового созревания по Таннеру нормой считают преобладание доли суммарного количества облигатных анаэробов над долей Lactobacillus spp.; для 3 стадии полового развития нормоценоз влагалища меняется в сторону преобладания Lactobacillus spp. 49,99%, для 4 и 5 стадии полового созревания по Таннеру считают нормой преобладание доли Lactobacillus spp. над долей суммарного количества облигатных и факультативных анаэробов.