Нитритредуктаза в качестве потенциальной мишени против туберкулеза и способ обнаружения степени тяжести туберкулеза

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ определения тяжести туберкулеза у людей, включающий: a) получение образца биологической жидкости от указанного субъекта; b) добавление реагентов А и В в образец, полученный на этапе (а), с получением раствора и определение интенсивности окрашивания указанного раствора, где пурпурное окрашивание является показателем наибольшей тяжести заболевания, а бледно-розовое - наименьшей, где реагент А представляет собой сульфаниловую кислоту и реагент В представляет собой N-(1-нафтил)этилендиамина дигидрохлорид (NEDD), в котором биологическая жидкость представляет собой мокроту, мочу или кровь. Также изобретение представляет собой диагностический набор для обнаружения туберкулеза, включающий реагенты А и В, где реагент А представляет собой сульфаниловую кислоту и реагент В представляет собой N-(1-нафтил)этилендиамина дигидрохлорид (NEDD), вместе с руководством по применению и необязательно с добавками и носителями и применение диагностического набора для определения степени тяжести туберкулеза. Изобретение позволяет обнаружить нитрит в клинических образцах. 3 н. и 1 з.п. ф-лы, 6 ил., 6 табл., 6 пр.

 

Область техники

Данное изобретение относится к нитритредуктазе (nitrite reductase, NIRB) в качестве мишени противотуберкулезного лекарственного средства. Данное изобретение также относится к разработке простого способа выявления нитрита в клинических образцах, а также его корреляции с тяжестью заболевания. Наличие активных, а также дормантных/латентных стадий Mycobacterium tuberculosis (МТВ) может быть определено по нитриту в клинических образцах, таких как мокрота, от потенциальных пациентов с туберкулезом (tuberculosis, ТВ).

Предшествующий уровень техники

Туберкулез (ТВ) ответственен за 5 миллионов смертей в год. Наличие большого числа людей, имеющих двойные инфекции с МТВ и человеческим вирусом иммунодефицита, подчеркивает важность контроля этой инфекции. Основная проблема в лечении этого заболевания заключается в том, что большинство инфекций протекает бессимптомно и латентно. Примерно 3 млрд людей в мире инфицировано латентной формой ТВ, из-за которой в отсутствие лечения умирает более 50% инфицированных людей. Кроме того, лечение туберкулеза требует введения многих антибиотиков в течение длительного периода времени. Это приводит к развитию туберкулезной инфекции с множественной лекарственной устойчивостью (multiple drug-resistant tuberculosis, MDR-TB), усугубляющей проблемы лечения туберкулеза.

Поэтому Всемирная организация здравоохранения объявила о приоритетной необходимости немедленного контроля туберкулезной инфекции для предотвращения распространения лекарственно-устойчивых штаммов.

Заражение млекопитающего хозяина М. tuberculosis, как правило, происходит воздушно-капельным путем, и макрофаги в легких характерно реагируют. Макрофаги являются одними из самых важных участников характерной иммунной защиты, которая контролирует различные инфекционные процессы. Нереплицирующиеся бактерии М. tuberculosis в условиях культивирования in vitro характерно устойчивы к большинству противотуберкулезных агентов и, как правило, известны как дормантные бактерии. Документально подтверждено, что концентрация кислорода в нелегочных тканях человеческого организма значительно ниже концентрации кислорода в окружающем воздухе. Кроме того, концентрация кислорода в фагосоме активированных макрофагов ниже внеклеточной концентрации кислорода. МТВ-клетки в загруженных липидами макрофагах теряют кислотоустойчивое окрашивание, становясь фенотипически устойчивыми к двум передовым антимикобактериальным препаратам рифампицину и изониазиду, и образуют генные транскрипты, вовлеченные в дормантное состояние и липидный обмен патогена. Возбудитель, таким образом, входит в нереплицирующееся состояние фенотипически лекарственной устойчивости при латентной инфекции и создает серьезные препятствия лечению заболевания. Следовательно, люди с латентной туберкулезной инфекцией (latent tuberculosis infection, LTBI) имеют пожизненный риск реактивации инфекции в активное заболевание.

Таким образом, раннее выявление туберкулеза имеет первостепенное значение в лечении этой смертельной инфекции. Окончательный диагноз туберкулеза может быть поставлен только путем культивирования организмов Mycobacterium tuberculosis из образца, взятого от пациента (чаще мокроты, но также образцом может быть гной, CSF, биопсия ткани, и т.д. (Virtanen S. (1960). Acta Tuberc. Scand. 47: 1-116). Диагноз, поставленный другим способом, отличным от культивирования, может быть классифицирован только как "вероятный" или "предполагаемый". Для отрицательной диагностики туберкулезной инфекции большинство протоколов требуют, чтобы отрицательными были две отдельных культуры (Virtanen S. (1960). Acta Tuberc. Scand. 47: 1-116). Полное медицинское обследование на ТВ должно включать сбор медицинского анамнеза, физическое обследование, рентгенографию грудной клетки и микробиологическое обследование (мокроты или некоторых других подходящих образцов). Оно также может включать туберкулиновую кожную пробу, другие сканирования и рентген, хирургическую биопсию. Физическое обследование делается для того, чтобы оценить общее состояние здоровья пациента и найти другие факторы, которые могут повлиять на план лечения ТВ. Оно не может быть использовано для подтверждения или исключения ТВ. В некоторых случаях необходим образец, который не может быть получен путем культивирования мокроты или бронхоскопии. В этих случаях может быть проведена биопсия ткани из предполагаемой системы путем медиастиноскопии.

Анализы высвобождения интерферона у (интерферона-гамма) (interferon-gamma) release assay, IGRA) основаны на способности антигенов Mycobacterium tuberculosis, ранней секреторной антигенной мишени 6 (antigens for early secretary antigen target 6, ESAT-6) и белка 10 культурального фильтрата (culture filtrate protein 10, CFP-10), стимулировать продукцию интерферона-гамма у хозяина. Поскольку эти антигены не присутствуют в нетуберкулезных микобактериях или вакцине BCG, такие анализы могут различить скрытую туберкулезную инфекцию (latent tuberculosis infection, LTBI). Анализы крови QuantiFERON-TB Gold и T-SPOT. TB используют эти антигены для выявления людей с туберкулезом. Лимфоциты крови пациента культивируют с антигенами. Эти анализы называются анализами на интерферон у, и они не эквивалентны. Если пациент подвергался воздействию туберкулеза ранее, то Т-лимфоциты в ответ продуцируют интерферон у. В обоих анализах используется ELISA для обнаружения интерферона у с высокой чувствительностью. Различие между анализами заключается в том, что QuantiFERON-TB Gold оценивает общее количество интерферона у, когда воздействию антигенов подвергается цельная кровь, в то время как T-SPOT.TB, тип анализа ELISPOT, оценивает число активированных Т-лимфоцитов, которые секретируют интерферон у. Руководящие принципы для использования QuantiFERON-TB Gold, одобренные FDA, были выпущены CDC в декабре 2005 года. Общая цель данного изобретения заключается в том, чтобы найти диагностический инструмент для оценки присутствия дормантных туберкулезных бактерий в организме человека. Наша диагностическая процедура в основном опирается на чувствительность к туберкулезному метаболиту. Главная проблема нынешнего лечения туберкулеза лежит также в неспособности оценить переход активной формы бактерий в дормантную в организме человека. Дормантные бактерии, индуцированные лекарственными препаратами, не погибают от имеющихся в настоящее время лекарственных препаратов, и также являются основной причиной резистентности и длительного лечения.

Не существует способов диагностики, доступных для оценки увеличения или уменьшения числа бактерий после начала лечения. Доступные методики опираются либо на иммунологические методики, либо на методики окрашивания, либо на методики культивирования активно растущих бактерий. Эти способы особенно работают на самом начальном этапе, когда пациент находится в критическом состоянии и еще не начал принимать лекарства. Они становятся неэффективными в течение нескольких недель после начала лечения. Главная проблема заключается в неспособности обнаружить бактерии, находящиеся на дормантной стадии, и неэффективном их уничтожении медицинскими препаратами. В большинстве больниц эти способы, повторяющиеся на регулярной основе, не позволяют уверенно обнаруживать бактерии. В результате этого пациентам ставят неправильный диагноз.

Кроме того, выявление внутриклеточной мишени передового ингибитора является обязательным для выполнения необходимой передовой программы.

Чтобы объяснить некоторые особенности персистирующих туберкулезных бактерий, полученных от хозяев, были разработаны модель гипоксии Уэйна и модель дормантного состояния, индуцированного недостатком питательных веществ. Пионерская работа Уэйна показала, что нитратредуктаза (NarGHJI) играет важную роль в переходе аэробной стадии в анаэробную дормантную стадию, и что этот переход происходит во время первоначального воздействия на бессимптомный патогенез, а также во время воздействия противотуберкулезных лекарственных средств.

Недавние отчеты подтвердили, что оксид азота (NO) и супероксид (O₂^-) образуются внутри макрофагов-хозяев и убивают внутриклеточные бактерии после инфицирования путем объединения с образованием крайне нестабильного пероксинитрита (ONOO^-), который впоследствии перегруппировывается, образуя NO₃^- (Nyka, W. studies on the effect of starvation on Mycobacteria. Infect. Immun. 1973, 843-850), который может выступать в качестве источника азота или в качестве альтернативного акцептора электронов на дормантной стадии, индуцированной гипоксией, в отсутствие кислорода. Эти данные показывают, что нитратный метаболический путь играет решающую роль в выживании Mycobacterium tuberculosis на дормантной стадии.

Статья под названием "Nitrate reduction as a marker for hypoxic shiftdown of Mycobacterium tuberculosis" авторов L.G. Wayne, L.G. Hayes в Journal: Tubercle and Lung Disease - TUBERCLE LUNG DIS", Vol. 79, no. 2, pp. 127-132, 1998, DOI: 10.1054/tuld. 1998.0015 характеризует восстановление нитрата во время аэробного роста и гипоксический сдвиг вниз в нереплицирующееся сохранение культур Mycobacterium tuberculosis.

Статья под названием "Bactericidal activity of 2-nitroimidazole against the active replicating stage of Mycobacterium bovis BCG and Mycobacterium tuberculosis with intracellular efficacy in THP-1 macrophages" авторов Arshad Khan, Sampa Sarkar, Dhiman Sarkar в International Journal of Antimicrobial Agents, Volume 32, Issue 1, July 2008, Pages 40-45 оценивает противотуберкулезный потенциал 2-нитроимидазола в условиях in vitro в отношении М. tuberculosis во внутриклеточной среде клеточной линии человеческих моноцитов ТНР-1.

Кроме того, глутаминсинтетаза (glutamine synthetase, GS), другой фермент нитратного метаболического пути, как известно, превращает аммиак и глутамат в глутамин, который является единственным известным путем использования аммиака в МТВ, и было обнаружено, что она важна для синтеза поли L-глутамата/глутамина при формировании клеточной стенки.

Было обнаружено, что восстановление нитрата индуцируется при переходе активно растущих клеток в гипоксические условия. Нитрат используется в качестве альтернативного дыхательного субстрата для приема электронов в отсутствие O₂ в среде; тем не менее, не было проведено физиологическое исследование нитритредуктазы, которая обеспечивает метаболическую связь между нитратредуктазой (NarGHJI) и глутаминсинтетазой (GS), что могло бы помочь в понимании роли метаболизма нитрата на дормантной стадии. В то же время сообщалось, что GS играет важную роль в росте аэробных бактерий. Его роль в дормантных бактериях неизвестна. Сообщалось, что макрофаги-хозяева продуцируют NO и супероксид для уничтожения внутриклеточных бактерий, которые, по-видимому, объединяются и перегруппировываются, образуя нитрат внутри инфицированных макрофагов. Если гипоксия не достигается, этот нитрат не требуется в качестве дыхательного субстрата или в качестве источника азота для выживания в среде хозяина. Фактически функциональная роль нитратного метаболического пути Mycobacterium tuberculosis при выживании в макрофагах-хозяевах остается неисследованной до сих пор. Представленные оценки чистого синтеза нитратов тканями млекопитающих сильно различаются и варьируют от 0,15 до 1 мМ в день (Kelm М. (1999) Biochim. Biophys. Acta 1411: 273-289). В ткани нитрат, в основном, является продуктом спонтанной деградации оксида азота. Оксид азота, напротив, образуется ферментативным путем благодаря трем различным синтетазам оксида азота (Stuehr DJ. 1999. Biochim. Biophys. Acta 1411: 217-230). Индуцибельная синтетаза оксида азота экспрессируется в ответ на воспалительные и провоспалительные медиаторы (Bogdan С, et. al. (2000) Curr. Opin. Immunol. 12: 64-76). Большое число клеток, в том числе гепатоциты, могут быть индуцированы для синтеза оксида азота (Brown GC.(1999) Biochim. Biophys. Acta 1411:351-369). Значительные количества нитрата обнаружены в моче мышей, инфицированных бактериями, что подтверждает, что нитрат имеется в почках, особенно у животных, перенесших воспалительный процесс (Flesch IE, et. Al/ (1991) Infect. Immun. 59: 3213-3218). Несмотря на то, что нитрит в образцах мочи используется для выявления UTI-инфекции (инфекции мочевыделительного тракта), нет никаких сообщений об использовании нитрата или нитрита для обнаружения ТВ.

Широко известно, что латентные микобактерии туберкулеза присутствуют в гранулемных структурах у зараженных людей. Неожиданно модель Корнелла дормантной стадии, индуцированной лекарственными препаратами, подтвердила, что наличие бактерий у животного-хозяина индуцирует латентность, и эти клетки повторно активируются в активно растущую стадию, как только препараты снимаются с приема. Хорошо известно, что в присутствии даже следовых количеств нитрата/нитрита выживание бактерий становится зависимым от его использования в качестве альтернативного акцептора электронов в условиях гипоксии. Но все еще остается вопрос в аспекте выживания Mycobacterium tuberculosis в период их перехода из стадии активного роста в дормантную стадию с помощью этой очень слабой доставки нитрата в труднодоступное место в организме человека. На этой стадии стало неожиданным, что обнаружение клеток Mycobacterium tuberculosis возможно с еще более низкого превращения этого низкого уровня нитратов в биологических жидкостях. Возникает также вопрос о том, как эти латентные бактерии повторно активируются так легко в отличие от нелатентных бактерий, проживающих в нашем организме в нормальных условиях. Помимо решения проблемы, связанной с латентностью бактерий, а также несостоятельности существующих способов скрининга в выявлении латентной стадии, имеется настоятельная потребность в конкретных антимикобактериальных лекарственных препаратах для создания мишени лекарственного препарата, которая могла бы дополнительно функционировать как биомаркер для выявления ингибитора Mycobacterium tuberculosis в активной стадии и дормантной стадии.

Сущность изобретения

Соответственно, данное изобретение предусматривает ферменты нитратного метаболического пути, включая нитратредуктазу (narG), нитритредуктазу (MRA_0261) и глутаминсинтетазу (glnA1) в качестве белков-мишеней лекарственных препаратов, направленных против дормантной стадии Mycobacterium tuberculosis (МТВ) в аэробных условиях, в дормантной стадии, индуцированной гипоксией, и в макрофагах клеточной линии человеческой острой моноцитарной лейкемии Thp1.

В другом аспекте данное изобретение предусматривает фермент нитратного метаболического пути, в частности функциональную нитритредуктазу, в качестве потенциальной мишени лекарственного препарата, направленного против дормантной стадии Mycobacterium tuberculosis в аэробных условиях, в дормантной стадии, индуцированной гипоксией, и в макрофагах клеточной линии человеческой острой моноцитарной лейкемии Thp1, для разработки противотуберкулезных лекарственных средств.

В предпочтительном аспекте данное изобретение предусматривает способ обнаружения нитрита в биологических жидкостях от больных туберкулезом в качестве потенциального диагностического инструмента для диагностики различных стадий туберкулезной инфекции у людей.

Краткое описание графических материалов

Фиг. 1 показывает рост М. tuberculosis и восстановление ими нитрата/нитрита в аэробных условиях и в дормантной культуре Уэйна. (а) Рост в аэробных условиях (закрашенная линия) и модель Уэйна (незакрашенная линия) в минимальной среде в присутствии нитрата и нитрита в качестве единственного источника азота. (b) Восстановление нитрита в аэробных условиях () и в культуре согласно модели Уэйна () измеряли в одинаковых условиях, как описано в разделе "Материалы и методы". Рост бактерий в присутствии нитрата и его восстановление в аэробных условиях () и в культуре согласно модели Уэйна () приняты в качестве положительного контроля. Результаты представляют собой среднее значение из трех одинаковых экспериментов ±SD (стандартное отклонение).

Фиг. 2 показывает экспрессию генов Mycobacterium tuberculosis, участвующих в метаболизме нитрата в аэробных условиях и в модели Уэйна в присутствии различных источников азота. кДНК получали из тотальной РНК, выделенной из бактерий, выращенных в присутствии нитрита/нитрата/аммиака/аспарагина по отдельности как в аэробных (+О₂), так и в анаэробных (-O₂) условиях, как описано в разделе "Материалы и методы". кДНК использовали в качестве матриц для ПЦР-амплификации, которую проводили с использованием праймеров, специфичных для генов narG (нитратредуктазы), nirB (нитритредуктазы) и glnA1 (глутаминсинтетазы), и амплифицированные продукты приведены после электрофореза на агарозном геле. Дорожка (-) показывает отрицательный контроль, в который не добавляли кДНК, а М представляет собой маркер 100bp (Invitogen).

Фиг. 3 показывает анализ экспрессии генов nirB, narG и narK2 путем ПЦР в реальном времени в различных условиях. кДНК получали из культуры М. tuberculosis, выращенной в аэробных условиях (+O₂), анаэробных условиях (-O₂) и на модели инфицированных макрофагов (МФ). кДНК использовали для анализа путем ПЦР в реальном времени, которую проводили с помощью SYBR Green и праймера, специфического для гена. Относительный уровень транскриптов показан как кратная разница по сравнению с уровнем, полученным в аэробных условиях, а в качестве внутреннего контроля использован ген 16S. Результат представляет собой среднее значение из трех одинаковых экспериментов ±SD.

Фиг. 4 показывает воздействие п-гидроксимеркурий-бензоата (р-НМВ) на жизнеспособность активных и дормантных бактерий, растущих в минимальной среде, содержащей нитрит или аммиак в качестве единственного источника азота. Темные столбцы представляют аэробные условия без ингибитора, заштрихованные столбцы представляют аэробные условия с р-НМВ (100 мкм), светлые столбцы представляют анаэробное дормантное состояние без ингибитора, крестообразно заштрихованные столбцы представляют анаэробное дормантное состояние с ингибитором.

Фиг. 5 показывает влияние ингибирования пути восстановления нитратов на рост и выживание М. tuberculosis в макрофагах ТНР-1. В момент инокуляции добавляли 100 мкМ азида в качестве ингибитора нитратредуктазы, р-НМВ в качестве ингибитора нитритредуктазы и L-MSO в качестве ингибитора глутаминсинтетазы соответственно, и воздействие на рост оценивали по лизису макрофагов ТНР-1 на 10-й день PI, число KOE сравнивали с контролем (без какого-либо ингибитора). Эксперименты проводили три раза, результаты являются средним значением ±SD.

Фиг. 6 показывает влияние ингибитора р-НМВ на макрофаги ТНР-1. Контрольные макрофаги (В) Ингибитор (макрофаги, обработанные ингибитором р-НМВ) после окрашивания DAPI-красителем.

Подробное описание изобретения

Далее изобретение будет подробно описано в связи с определенными предпочтительными и возможными воплощениями, так что их различные аспекты могут стать полностью понятными и оцененными. Описанные воплощения не являются ограничивающими или сдерживающими объем изобретения.

Mycobacterium tuberculosis (МТВ) могут использовать нитрат в качестве источника азота в процессе их роста в условиях in vitro и in vivo. Нитрат восстанавливается до нитрита, а он затем преобразуется в аммиак с помощью ферментов нитратредуктазы и нитритредуктазы соответственно. Нитратредуктаза (NarGHJI) является хорошо изученным ферментом, и его роль в качестве части альтернативного дыхательного механизма в МТВ в условиях in vitro устанавливается, но подобная его роль в макрофагах совершенно неизвестна. Аналогичным образом, роль нитритредуктазы (NirBD) для Mycobacterium tuberculosis на дормантной стадии, индуцированной гипоксией (модель Уэйна), и в макрофагах ТНР-1 неизвестна до сих пор,. Поэтому автор данного изобретения исследовал применение нитритредуктазы, которая является метаболическим звеном между нитратредуктазой (NarGHJI) и глутаминсинтетазой (GS) и может помочь в понимании роли метаболизма нитрита на дормантной стадии, и которая может быть использована в качестве потенциальной мишени лекарственного препарата или биомаркера для разработки протокола противотуберкулезного скрининга.

Авторы выяснили, что в геноме Mycobacterium tuberculosis присутствует ген, возможно кодирующий фермент нитритредуктазу (ЕС 1.7.1.4), который состоит из двух субъединиц nirB (MRA_0261) и nirD (MRA_0262). Эта нитритредуктаза является зависимой от NADH, который выступает в качестве источника шести электронов, необходимых для восстановления нитрита в аммиак, подобно тому, что сообщалось для цитоплазматической нитритредуктазы Е. coli (NirBD).

Нитритредуктаза (NirBD) является важным функциональным ферментом азотного метаболического пути, который преобразует нитрит в аммиак. Несмотря на наличие функционального фермента нитритредуктазы высвобождение нитрита в среду является загадкой. Было предположение, что нитрит, сформированный таким образом, высвобождается во внеклеточную среду из-за нефункциональной нитритредуктазы, чтобы преодолеть возможное токсическое действие нитрита. Если нитритредуктаза действительно является нефункциональной, то количество использованного нитрата должно сбалансировать высвобождение нитрита в среду. Для того чтобы стать мишенью лекарственного препарата, помимо существования, белок должен соответствовать другим определенным критериям. Наши исследования ясно показали, что ингибитор фермента влияет на жизнеспособность бактерий только при гипоксии, а также в макрофагах. Это наиболее важный аспект в назначении nirB мишенью лекарственного препарата, потому что лекарственные препараты также являются ингибиторами, и они должны работать в комплексных жидкостях организма, где все другие источники азота будут доступны в изобилии. Повышенное превращение нитрата в нитрит на дормантной стадии, индуцированной гипоксией, также индуцирует экспрессию нитритредуктазы в Mycobacterium tuberculosis в условиях in vitro, что подразумевает его важность во время этого перехода в нереплицирующуюся дормантную стадию, что подтверждает, что он является потенциальной мишенью противотуберкулезного препарата.

Таким образом, в одном воплощении данное изобретение относится к нитритредуктазе в качестве потенциальной мишени лекарственного препарата против активной стадии и дормантной стадии Mycobacterium tuberculosis (МТВ) в аэробных условиях, на дормантной стадии, индуцированной гипоксией, и в макрофагах клеточной линии острой моноцитарной лейкемии человека Thp1.

В одном воплощении данного изобретения предложен способ скрининга ингибиторов нитритредуктазы, которые могут быть использованы в качестве противотуберкулезного препарата, включающий: инфицирование культуры макрофагов Thp1 микобактериями туберкулеза; промывание культуры инфицированных макрофагов 1× раствором PBS с последующим добавлением свежей среды (MEM), содержащей 50 мМ нитрата натрия; добавление 2,5 мкл ингибиторов в DMSO наряду со стандартными ингибиторами narG, nirB и glnA1 в их соответствующей IC90 в культуру инфицированных макрофагов на день 0 и день 5 соответственно, и инкубацию планшета до дня 8; и оценку уровня аммиака/нитрита в культуральной среде для определения числа жизнеспособных клеток.

В одном воплощении данного изобретения предложен способ скрининга ингибиторов нитритредуктазы, которые могут быть использованы в качестве противотуберкулезного препарата, включающий: инфицирование культуры макрофагов Thp1 микобактериями туберкулеза; промывание культуры инфицированных макрофагов 1× раствором PBS с последующим добавлением свежей среды (MEM), содержащей 50 мМ нитрата натрия; добавление 2,5 мкл ингибиторов в DMSO наряду со стандартными ингибиторами narG, nirB и glnA1 в их соответствующей IC90 в культуру инфицированных макрофагов на день 0 и день 5 соответственно, и инкубацию планшета до дня 8; и оценку уровня аммиака/нитрита в культуральной среде для определения числа жизнеспособных клеток, где ингибиторы выбраны из группы, состоящей из ферментов, принадлежащих к нитратному метаболическому пути, которые убивают дормантные/латентные бактерии Mycobacterium tuberculosis.

В другом воплощении данного изобретения предложен способ скрининга ингибиторов нитритредуктазы, которые могут быть использованы в качестве противотуберкулезного препарата, включающий: инфицирование культуры макрофагов Thp1 микобактериями туберкулеза; промывание культуры инфицированных макрофагов 1× раствором PBS с последующим добавлением свежей среды (MEM), содержащей 50 мМ нитрата натрия; добавлением 2,5 мкл ингибиторов в DMSO наряду со стандартными ингибиторами narG, nirB и glnA1 в их соответствующей IC90 в культуру инфицированных макрофагов на день 0 и день 5 соответственно, и инкубацию планшета до дня 8; и оценку уровня аммиака/нитрита в культуральной среде для определения числа жизнеспособных клеток, где ингибиторы выбраны из группы, состоящей из рифампицина, пентахлорфенола, стрептомицина, изониазида, этамбутола, пиразинамида.

В еще одном воплощения данного изобретения предложен способ скрининга ингибиторов нитритредуктазы, которые могут быть использованы в качестве противотуберкулезного препарата, включающий: инфицирование культуры макрофагов Thp1 микобактериями туберкулеза; промывание культуры инфицированных макрофагов 1× раствором PBS с последующим добавлением свежей среды (MEM), содержащей 50 мМ нитрата натрия; добавлением 2,5 мкл ингибиторов в DMSO наряду со стандартными ингибиторами narG, nirB и glnA1 в их соответствующей IC90 в культуру инфицированных макрофагов на день 0 и день 5 соответственно, и инкубацию планшета до дня 8; и оценку уровня аммиака/нитрита в культуральной среде для определения числа жизнеспособных клеток, где ингибиторы направлены против активной и дормантной стадии Mycobacterium tuberculosis (МТВ).

В еще одном воплощении данного изобретения предложен способ скрининга ингибиторов нитритредуктазы, которые могут быть использованы в качестве противотуберкулезного препарата, включающий: инфицирование культуры макрофагов Thp1 микобактериями туберкулеза; промывание культуры инфицированных макрофагов 1× раствором PBS с последующим добавлением свежей среды (MEM), содержащей 50 мМ нитрата натрия; добавлением 2,5 мкл ингибиторов в DMSO наряду со стандартными ингибиторами narG, nirB и glnA1 в их соответствующей IC90 в культуру инфицированных макрофагов на день 0 и день 5 соответственно, и инкубацию планшета до дня 8; и оценку уровня аммиака/нитрита в культуральной среде для определения числа жизнеспособных клеток, где бактерии находятся в аэробных условиях, на дормантной стадии, индуцированной гипоксией, и в макрофагах клеточной линии острой моноцитарной лейкемии человека Thp1.

Воплощение данного изобретения предусматривает применение ингибиторов нитритредуктазы в качестве лекарственного препарата, нацеленного против Mycobacterium tuberculosis (МТВ), в способе скрининга ингибиторов нитритредуктазы, которые могут быть использованы в качестве противотуберкулезного препарата, включающем: инфицирование культуры макрофагов Thp1 микобактериями туберкулеза; промывание культуры инфицированных макрофагов 1× раствором PBS с последующим добавлением свежей среды (MEM), содержащей 50 мМ нитрата натрия; добавлением 2,5 мкл ингибиторов в DMSO наряду со стандартными ингибиторами narG, nirB и glnA1 в их соответствующей IC90 в культуру инфицированных макрофагов на день 0 и день 5 соответственно, и инкубацию планшета до дня 8; и оценку уровня аммиака/нитрита в культуральной среде для определения числа жизнеспособных клеток.

В одном воплощении данного изобретения предусмотрен способ оценки тяжести туберкулеза у людей, включающий: получение биологической жидкости от субъекта; добавление реагентов А и В в образец, полученный на первом этапе; определение интенсивности окрашивания раствора, полученного на втором этапе, где пурпурное окрашивание является показателем наибольшей тяжести заболевания, а бледно-розовое - наименьшей; и определение титра бактерий, присутствующих в образце, полученном на втором этапе, где уровень окрашивания определяется путем сравнения с цветовыми полосками или стандартными цветовыми кодами.

В еще одном воплощении данного изобретения предусмотрен способ оценки тяжести туберкулеза у людей, включающий: получение биологической жидкости от субъекта; добавление реагентов А и В в образец, полученный на первом этапе; определение интенсивности окрашивания раствора, полученного на втором этапе, где пурпурное окрашивание является показателем наибольшей тяжести заболевания, а бледно-розовое - наименьшей; и определение титра бактерий, присутствующих в образце, полученном на втором этапе, где уровень окрашивания определяется путем сравнения с цветовыми полосками или стандартными цветовыми кодами, где бактерии обнаруживают в клиническом образце, содержащем биологическую жидкость, выбранную из группы, состоящей из мокроты, мочи, крови и т.д.

В еще одном воплощении данного изобретения предусмотрен способ оценки тяжести туберкулеза у людей, включающий: получение биологической жидкости от субъекта; добавление реагентов А и В в образец, полученный на первом этапе; определение интенсивности окрашивания раствора, полученного на втором этапе, где пурпурное окрашивание является показателем наибольшей тяжести заболевания, а бледно-розовое - наименьшей; и определение титра бактерий, присутствующих в образце, полученном на втором этапе, где уровень окрашивания определяется путем сравнения с цветовыми полосками или стандартными цветовыми кодами, где реагент А представляет собой сульфаниловую кислоту.

В другом воплощении данного изобретения предусмотрен способ оценки тяжести туберкулеза у людей, включающий: получение биологической жидкости от субъекта; добавление реагентов А и В в образец, полученный на первом этапе; определение интенсивности окрашивания раствора, полученного на втором этапе, где пурпурное окрашивание является показателем наибольшей тяжести заболевания, а бледно-розовое - наименьшей; и определение титра бактерий, присутствующих в образце, полученном на втором этапе, где уровень окрашивания определяется путем сравнения с цветовыми полосками или стандартными цветовыми кодами, где реагент В представляет собой NEDD.

В одном воплощении данного изобретения предложен диагностический набор для выявления заболевания Mycobacterium tuberculosis, включающий реагенты сульфаниловую кислоту и NEDD вместе с руководством по применению и необязательно с добавками и носителями.

Другое воплощение данного изобретения относится к применению диагностического набора для выявления заболевания Mycobacterium tuberculosis, включающего реагенты сульфаниловую кислоту и NEDD вместе с руководством по применению и, возможно, вместе с добавками и носителями, для определения степени тяжести заболевания Mycobacterium tuberculosis.

Чтобы охарактеризовать нитритредуктазу (NirBD), были проведены исследования гена nirB в Mycobacterium tuberculosis, выращенных в различных условиях. Mycobacterium tuberculosis восстанавливает нитрит в аэробных и дормантных условиях благодаря наличию функциональных генов nirB. В дормантном состоянии, индуцированном гипоксией in vitro, экспрессия нитритредуктазы увеличивается на уровне транскриптов и белков в 32 и 4 раза соответственно, а в инфицированных макрофагах наблюдается 10-кратное увеличение экспрессии гена по сравнению с аэробными условиями.

Для подтверждения экспрессии гена нитритредуктазы на уровне транскрипта выполняли RT-PCR (ОТ-ПЦР) с использованием кДНК, синтезированной из тотальной РНК, выделенной из бактерий, выращенных в различных источниках азота (фиг. 3). Результат RT-PCR показывает, что гены нитратредуктазы MRA_1172 (narG), нитритредуктазы MRA_261 (nirB) и глутаминсинтетазы MRA_2230 (glnA1) экспрессируются, когда в качестве единственного источника азота был использован нитрат, а гены нитритредуктазы MRA_261 (nirB) и глутаминсинтетазы MRA_2230 (glnA1) индуцируются, в частности, в присутствии нитрита в качестве источника азота.

Культура, выбранная для цели данного изобретения, представляет собой культуру Mycobacterium tuberculosis (АТСС 25177), полученную из коллекции Microbial Type Culture Collection (МТСС; Чандигарх, Индия). Mycobacterium tuberculosis могут расти в нитрате в качестве единственного источника азота как в аэробных, так и в анаэробных условиях, восстанавливая его до нитрита с помощью функциональной нитратредуктазы. Таким образом, данное изобретение раскрывает изучение использования нитрита с течением времени в аэробных и анаэробных условиях микобактериями туберкулеза, выращенными с нитратом в качестве единственного источника азота (10 мМ), как показано в таблице 1.

В одном воплощении данное изобретение относится к ингибиторам фермента, принадлежащего к нитратному метаболическому пути, которые убивают дормантные/латентные бактерии Mycobacterium tuberculosis.

Клеточную линию ТНР-1 (АТСС® кат.№TIB-202™) поддерживают в колбе для культивирования ткани объемом 25 см², содержащей клеточную культуральную среду MEM (минимальную поддерживающую среду) с 10% инактивированной нагреванием FBS. Клетки ТНР-1 (5×10⁴ клеток/мл) обрабатывают 100 нМ форболмиристатацетатом в культуральной колбе в течение 24 часов, чтобы преобразовать моноциты в макрофаги. Для инфицирования эти макрофагальные клетки инкубируют в течение 12 ч с Mycobacterium tuberculosis с множественностью инфекции (multiplicity of infection, MOI) 1:100.

В одном воплощении данное изобретение предусматривает п-гидроксимеркурий-бензоат в качестве ингибитора nirB и влияние ингибитора nirB на выживание Mycobacterium tuberculosis в макрофагальных клетках-хозяевах во время инфекции. Применение ингибитора nirB снижает бактериальное число примерно на 2 порядка KOE в условиях in vitro и ex vivo, четко обозначая важную роль нитритредуктазы в выживании бактерий в различных средах.

В еще одном воплощении данное изобретение предусматривает оценку цитотоксичности ингибитора в отношении макрофагов клеточной линии ТНР-1.

В другом воплощении данное изобретение предусматривает флуоресцентное микроскопическое исследование ТНР-1 в присутствии ингибитора.

В одном воплощении данное изобретение предусматривает ингибиторы ферментов, принадлежащих к нитратному метаболическому пути, которые могут эффективно убивать дормантные/латентные бактерии Mycobacterium tuberculosis в хозяйской системе. Ингибиторы нитратредуктазы, нитритредуктазы и глутаминсинтетазы также воздействуют на жизнеспособность бактерий в условиях индуцированной гипоксией дормантной культуры в присутствии соответствующих метаболитов в среде. Характер ингибирования ясно показывает, что эти ингибиторы оказывают свое ингибирующее действие аналогично гипоксическим культурам клеток Mycobacterium tuberculosis. Характер ингибирования внутриклеточных бактерий также очень похож на то, когда макрофаги заполнены бактериями.

В еще одном воплощения данное изобретение относится к способу обнаружения нитрита в клинических образцах, полученных от пациентов с ТВ, таких как образец мокроты, в качестве потенциального инструмента для диагностики туберкулеза у людей.

В другом воплощении данное изобретение относится к применению биологических жидкостей для обнаружения нитрита в клиническом образце, который коррелирует с тяжестью заболевания. Реагенты А и В используются для развития окрашивания, которое пропорционально нитриту, присутствующему в клинических образцах. Интенсивность окрашивания, развившегося в результате добавления реагентов А и В, пропорциональна бактериальной нагрузке у пациентов. С увеличением концентрации нитрита в образце окрашивание развивается от розоватого до розового, затем фиолетового и пурпурного. Образцы мокроты, собранные от пациентов, умерших из-за неудачной диагностики туберкулеза, анализировали с помощью использующихся в настоящее время способов: а) микроскопического обнаружения кислотоустойчивых микобактерий и б) рентгенологического анализа грудной клетки. Весь эксперимент был проведен в больнице Aundh ТВ Hospital, Пуна, а также в больнице Medipoint Hospital, Пуна. Таким образом, мы могли соответствующим образом определить пурпурное окрашивание как показатель максимальной тяжести заболевания, а бледно-розовое окрашивание как показатель минимальной тяжести заболевания.

В другом воплощении данное изобретение раскрывает, что процедура оценки нитрита является гораздо более хорошим способом, чем по меньшей мере рентгенография грудной клетки и микроскопия кислотоустойчивых микобактерий, потому что способ оценки нитрита помогает выявить в два раза больше пациентов с ТВ, чем рентгенография и микроскопия кислотоустойчивых микобактерий, проведенные совместно. Некоторые из образцов, в которых развивалось фиолетовое/пурпурное окрашивание при воздействии нитритных реагентов (А и В), были неожиданно идентифицированы как отрицательные при микроскопическом способе, в результате пациенты умирали в течение нескольких дней.

В еще одном воплощении данное изобретение раскрывает, что нитрит одинаково чувствителен к бактериям с лекарственной устойчивостью.

В другом воплощении данное изобретение раскрывает, что данное определение нитрита в образце мокроты является очень надежным и простым для исполнения без необходимости каких-либо сложных инструментов в лаборатории. Мокрота является гетерогенной массой, из которой для микроскопического исследования может быть использована только относительно твердая часть, в то время как нитритный реагент может быть применен к любой части мокроты, а также ко всему содержимому в целях анализа. Окрашивание развивается в течение 30 секунд и сохраняется в течение нескольких часов.

В другом воплощении данное изобретение раскрывает, что данное определение нитрита в образце мокроты не требует никакого опыта в проведении этого анализа, тогда как другие процедуры требуют значительного опыта в соответствующей области применения. Реагенты (А и В) являются дешевыми химическими веществами и легко доступны всюду.

В другом воплощении данное изобретение раскрывает, что образцы, собранные утром, демонстрируют более сильное окрашивание при обнаружении нитрита, чем образцы, собранные в вечернее время.

Соответственно, данное изобретение предусматривает быстрый, простой и экономически эффективный способ обнаружения нитрита в мокроте пациентов с ТВ в качестве потенциальной диагностики туберкулеза у людей. Анализ имеет следующие преимущества:

i) Анализ требует добавления к клиническим образцам реагентов А и В, которые легко доступны при минимальных затратах.

ii) Добавление реагентов, а также обнаружение окрашивания не требует каких-либо сложных инструментов.

iii) Интенсивность окрашивания представляет уровень инфицирования Mycobacterium tuberculosis у пациентов.

iv) Пациенты с лекарственной устойчивостью одинаково отвечают на реагенты для обнаружения/диагностики.

v) Окрашивание развивается очень быстро и является легко различимым, таким образом, может быть использовано в удаленных областях, где не доступно оборудование.

vi) Другие реагенты, такие как серная кислота и сульфат железа, также могут быть использованы для обнаружения нитрита в клинических образцах.

vii) Способ является очень надежным и обнаруживает ТВ в два раза чаще, чем рентгенография грудной клетки и микроскопия кислотоустойчивых бактерий, проведенные совместно. Большинство ложно положительных и отрицательных образцов также были обнаружены с помощью нашего способа обнаружения нитрита.

viii) Нитрит также может быть обнаружен с помощью чувствительных/специфических электродов или полосок, имеющихся в продаже, для обнаружения нитрита в жидких образцах.

ix) Утренние образцы обеспечивают лучшие результаты, чем образцы, собранные в вечернее время.

Таким образом, человеческие клинические образцы, такие как образцы мокроты, могут быть использованы для обнаружения МТВ у людей. Некоторые из ложно положительных при микроскопии образцов также могут быть идентифицированы с помощью данного способа.

Данное изобретение демонстрирует, что нитрит поддерживает рост Mycobacterium tuberculosis в культуре in vitro, и экспрессия гена nirB (который отвечает за восстановление нитрита) может быть индуцирована в присутствии нитрата или нитрита в качестве единственного источника азота в аэробных и анаэробных условиях. Кроме того, повышенная экспрессия гена nirB в индуцированной гипоксией дормантной культуре и в инфицированных макрофагах наряду со снижением выживаемости бактерий в присутствии ингибитора NirBD показывает важную роль нитритредуктазы в выживаемости бактерий. Ингибитор нитритредуктазы, такой как р-НМВ, способен убивать дормантные бактерии in vitro в условиях гипоксической культуры, а также в макрофагах. Кроме того, экспрессия гена нитритредуктазы повышается в условиях гипоксии в присутствии нитрата и нитрита в среде, а также в инфицированных макрофагах. Тем не менее, экспрессия гена нитритредуктазы не повышается, когда среда дополнена другими источниками азота, тогда как внешнее добавление нитрита в культуру не требуется, чтобы индуцировать нитритредуктазу внутриклеточных бактерий в инфицированных макрофагах.

Примеры

Следующие примеры даны в качестве иллюстраций и не должны быть истолкованы как ограничивающие объем данного изобретения.

Пример 1

а. Реагенты

Сульфаниловая кислота, N-(1-нафтил)этилендиамина дигидрохлорид (NEDD) были приобретены у Merck (Индия). Основа бульона Дюбо и альбуминовая добавка Дюбо были приобретены у Difco (США). Стандартные стерильные плоскодонные 96-луночные планшеты были приобретены у Tarsons (Индия). Фетальная бычья сыворотка (FBS) и минимальная поддерживающая среда (MEM; без фенолового красного) были приобретены у GIBCO Biosciences.

b. Бактериальные штаммы, химические вещества и среды

Штамм Mycobacterium tuberculosis H37Ra (АТСС 25177) был получен от IMTECH, Чандигарх, Индия. Химические соединения приобретены у Sigma, США, если не указано иное. Для наших исследований на протяжении всей работы мы использовали оговоренную среду, содержащую 0,5 г KH₂PO₄, 0,25 г натрия цитрат, 60 мг MgSO₄, 2 мМ нитрита и 2 мл глицерина в 100 мл дистиллированной воды при рН 6,6±0,2. Стоковые культуры хранили при -70°С и субкультивировали в жидкой среде до инокуляции в экспериментальную культуру.

c. Культивирование аэробных и дормантных бактерий

Для аэробного культивирования бактериальные культуры выращивали в 30 мл оговоренной среды в колбе объемом 100 мл после добавления инокулята в количестве 105 клеток на мл. Затем колбу выдерживали в аэробных условиях во встряхиваемом инкубаторе (Thermo Electron Corporation Model 481) со скоростью 150 об/мин и при температуре 37°С.

Для культивирования анаэробных дормантных бактерий модель Уэйна 0,5 HSR (Head Space Ratio) вводили в 20×125 мм пробирку общим объемом 25,5 мл. Инокуляцию проводили в количестве примерно 10⁵ клеток на мл путем разбавления культуры до А₆₂₀ 0,008. После помещения 8 мм магнитной мешалки пробирку герметично закрывали резиновой пробкой. Культуру осторожно перемешивали со скоростью 100 об/мин с помощью магнитной перемешивающей платформы. Когда клетки начинали расти, доступный кислород в герметизированной пробирке постепенно истощался, создавая гипоксические условия, которые приводили к медленному сдвигу бактерий в дормантную фазу. Жизнеспособные клетки из аэробных и анаэробных культур подсчитывали на твердой агаровой среде, как описано ранее. [Wayne LG, Hayes LG (1996) An in vitro model for sequential study of shiftdown of Mycobacterium tuberculosis through two stages of non-replicating persistence. Infect Immun 64:2062-2069].

Пример 2

Оценка нитратов и нитритов в жидкой культуре

Концентрацию нитрата в культуре определяли с помощью способа, основанного на нитровании салициловой кислоты. Вкратце, в 50 мкл культуры добавляли 200 мкл 5% раствора салициловой кислоты, приготовленной в конц. серной кислоте. Раствор инкубировали в течение 20 мин и добавляли 4,75 мл 2 н раствора гидроксида натрия для развития желтого окрашивания. Абсорбцию в исследуемом образце регистрировали при 410 нм и определяли концентрацию нитрата путем сравнения со стандартной кривой нитрата.

Концентрацию нитрита в цельной клеточной культуре оценивали способом Грисса. Вкратце, в 1 мл культуры добавляли 1 мл 1% сульфаниловой кислоты (приготовленной в 20% HCl) и инкубировали в течение 15 минут перед добавлением 1 мл 1% раствора нафтилендиамина дигидрохлорида (NEDD) (приготовленного в DW). Пробирку инкубировали в течение 15 мин для развития розового окрашивания. Затем измеряли абсорбцию при 540 нм и рассчитывали концентрацию нитрита с помощью стандартной кривой нитрита.

Для обнаружения нитрита в образцах мокроты один и тот же способ применяли в двух разных форматах. В первом формате 0,5 мл образца мокроты (обычно смешанной со слюной в различных пропорциях) отбирали в пробирки типа Эппендорф, хорошо перемешивали с 0,5 мл реагента А и инкубировали в течение 15 минут при комнатной температуре. Затем добавляли 0,5 мл реагента В, хорошо перемешивали, инкубировали в течение 15 минут для полного развития окрашивания.

Во втором формате реагент А и В добавляли в соответствии с инструкциями, упомянутыми выше, непосредственно в сосуды для сбора образцов. Развитие окрашивания оценивали визуально и сравнивали с параллельной серией данных, полученных из рентгенографии грудной клетки и микроскопии кислотоустойчивых бактерий той же серии образцов.

Пример 3

Поддержание моноцитов ТНР-1 и инфицирование их микобактериями туберкулеза

Клеточную линию ТНР-1 поддерживали, регулярно субкультивировали и инфицировали М. tb следующим образом. Клеточную линию ТНР-1 (АТСС® кат. № TIB-202™) поддерживали в колбе для культивирования ткани объемом 25 см², содержащей клеточную культуральную среду МЕМ с 10% инактивированной нагреванием FBS. Клетки ТНР-1 (5×10⁴ клеток/мл) обрабатывали 100 нМ форболмиристатацетата в культуральной колбе в течение 24 часов, чтобы преобразовать моноциты в макрофаги. Для инфицирования эти макрофагальные клетки инкубировали в течение 12 ч с МТВ с множественностью инфекции (MOI) 1:100.

Пример 4

Количественная оценка уровней мРНК

Для выделения тотальной РНК из аэробной культуры, индуцированной гипоксией дормантной культуры и бактерий, живущих в макрофагах, применяли сферопластный способ. Соответственно, раствор сферопластов добавляли к аэробно растущим бактериям (OD₆₂₀ ~ 1,0), к культуре согласно модели Уэйна 0,5 HSR на 7-й день и к макрофагам на 5-й день после инфицирования (post infection, PI). Обработанные клетки использовали для выделения тотальной РНК с помощью реагента Trizol. Тотальную РНК, выделенную из выращенных in vitro и ex vivo микобактерий, обрабатывали ДНКазой I (Sigma) и инкубировали при 70°С в соответствии с инструкцией изготовителя. Обработанную ДНКазой I тотальную РНК использовали для синтеза кДНК с помощью случайных праймеров и обратной транскриптазы Enhanced Avian Reverse Transcriptase, предоставленной в наборе "First Strand cDNA Synthesis Kit" (Sigma), при 25°C в течение 10 минут с последующей инкубацией при 45°С в течение 50 минут.Полученную кДНК использовали в качестве матрицы для амплификации путем ПЦР или ПЦР в режиме реального времени.

ПЦР проводили в соответствии с инструкцией изготовителя с помощью полимеразы Taq DNA polymerase, представленной в Ha6ope"PCR Core Kit" (Sigma), в общем объеме 50 мкл. Амплифицированный ПЦР-продукт вначале анализировали в 2% агарозном геле, содержащем 1% (объем/объем) красителя SafeView, а затем использовали программное обеспечение NCBI Blast после секвенирования нуклеотидной последовательности отдельного ПЦР-продукта.

Количественную ПЦР в режиме реального времени проводили с помощью набора Brilliant SYBR green QPCR Master Mix (Sigma, США). Реакции проводили в объеме 25 мкл, и смеси содержали 0,05 мкМ концентрации прямого и обратного праймеров, 12,5 мкл 2× реакционной смеси и 2,5 мкл кДНК. В каждую реакцию были включены контроли без кДНК-матрицы. Внутренним контролем для каждой реакции была амплификация гена 16S. Параметры ПЦР были следующими: (i) этап начальной денатурации - 2 мин при 95°С; (ii) 40 циклов, где один цикл включает 30 сек при 95°С, 30 сек при соответствующей температуре отжига и 30 сек при 72°С для элонгации (iii). Заключительный этап элонгации продолжался 7 мин при 72°С. Затем проводили анализ кривой плавления. Все образцы подвергали электрофорезу в 2% агарозном геле, содержащем 1% (объем/объем) красителя SafeView, чтобы убедиться, что образовывалась только одна полоса. Каждый эксперимент проводили три раза с использованием независимого образца РНК, выделенного в аналогичных условиях.

Пример 5

Получение экстракта клеток и анализ Nir

Для ферментного анализа нитритредуктазы раствор сферопластов добавляли к аэробно растущей культуре микобактерий (OD₆₂₀ ~ 1,0) и в 7-дневную гипоксическую культуру Уэйна. После инкубации в течение 1 ч бактериальные клетки осаждали путем центрифугирования при 10000 об/мин в течение 5 мин при 4°С. Осадки дважды промывали калий-фосфатным буфером (50 мМ, рН 6,6±0,2) и ресуспендировали в калий-фосфатном буфере (50 мМ, pH 7,0), содержащем ингибитор протеазы (Protease cocktail, Sigma). Полученную смесь обрабатывали ультразвуком на водяной бане в течение 5 мин при 50 кГц. Лизат получали после удаления неразрушенных клеток в виде осадка путем центрифугирования при 10000 об/мин в течение 5 мин при 4°С. Лизат отделяли в другую пробирку и ультрацентрифугировали при 100000 об/мин в течение 1 часа при 4°С. После центрифугирования супернатант снова отделяли в другую пробирку, а осадок, включающий мембранную фракцию, ресуспендировали в калий-фосфатном буфере, содержащем ингибитор протеазы. После определения концентрации общего белка в супернатанте и мембранных фракциях с помощью метода Бредфорда проводили анализ нитритредуктазы, описанный в Snell et al. [Bradford ММ (1976) A rapid and sensitive for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem 72:248-254; Sengupta S, Melkote S, Shaila MS, Rao GR (1996) Purification and characterization of assimilatory nitrite reductase from Candida utilis. Biochem J 317:147-15].

Пример 6

Флуоресцентное микроскопическое исследование

Макрофагальные клетки ТНР-1 выращивали на покровном стекле в 8-луночных микропланшетах и дважды промывали охлажденным метанолом, а затем окрашивали 4',6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI) в конечной концентрации 300 нМ. Макрофагальные клетки инкубировали в течение 15 мин при комнатной температуре в темноте. После инкубации клетки три раза промывали дистиллированной водой и анализировали на флуоресцентном микроскопе (модель Leitz Wetzlar, Германия) с длинами волн возбуждения и эмиссии 350 нм и 450 нм (400×) с использованием "А"-фильтра.

Результаты

1. Анализ усвоения нитрита микобактериями туберкулеза в аэробных и анаэробных условиях в присутствии нитрата в качестве единственного источника азота

Для анализа усвоения нитрита МТВ выращивали в культуральной среде, содержащей нитрат (10 мМ) в качестве единственного источника азота, как в аэробных, так и в анаэробных условиях. Было проведено исследование использования нитрата и высвобождения нитрита в среду с течением времени, и результаты приведены в таблице 1 ниже.

Таблица 1: Сравнительное использование нитрата и высвобождение нитрита в среду микобактериями туберкулеза, выращенными в среде М. pheli, содержащей нитрат (10 мМ) в качестве единственного источника азота, как в аэробных, так и в анаэробных условиях.

Таблица 1 показывает, что в период активного роста в аэробных условиях Mycobacterium tuberculosis используют более 7 мМ нитрита, в то время как в анаэробных условиях используется примерно 3,5 мМ. Это первоначальное исследование ясно показывает, что значительное количество использования нитрита происходит как в аэробных, так и в анаэробных условиях, что может быть обусловлено функциональной нитритредуктазой, индуцированной в присутствии нитрита. Следовательно, Mycobacterium tuberculosis могут расти в нитрите в различных условиях.

2. Рост Mycobacterium tuberculosis в аэробных и анаэробных условиях в присутствии нитрита/нитрата в качестве единственного источника азота

Бактерии Mycobacterium tuberculosis выращивали в оговоренной среде с нитритом (2 мМ) в качестве единственного источника азота (фиг. 1а). Было отмечено, что бактерии хорошо росли в нитрите, и их плотность при OD₆₂₀ достигала примерно 1,4 на 10-й день, что сравнимо с кривой роста в нитрате (10 мМ). Нитрат-зависимый рост был положительным контролем в данном исследовании. Усвоение нитрита наблюдали с течением времени, и примерно 1 мМ нитрита было использовано к 10-му дню (фиг. 1b). Результаты подтверждают, что нитрит поддерживает рост и его использование в течение МТВ в аэробных условиях подобно нитрату.

Кроме того, в другом эксперименте бактерии выращивали в условиях согласно модели Уэйна, индуцированной гипоксией, в присутствии нитрита в качестве единственного источника азота. Кривая роста бактерий ясно указывает на характерные этапы NRP-1 и NRP-2, которые являются отличительным признаком достижения дормантной стадии в культуре Уэйна. Первоначальный рост наблюдался в присутствии нитрита до 5-го дня, после чего рост останавливался, и, наконец, постоянная плотность примерно 0,5 при OD₆₂₀ сохранялась до окончания эксперимента, как предполагал Уэйн. Отмечено, что нитрит медленно использовался микобактериями туберкулеза в модели Уэйна 0,5 HSR, и использование нитрита было непрерывным даже на стадии NRP-2 их роста, когда рост бактерий останавливался. Это указывает на то, что нитрит также может выступать в качестве альтернативного акцептора электронов в отсутствие кислорода и нитрата. Скорость использования нитрита была примерно в 2 раза выше у активно растущей культуры по сравнению с дормантной культурой, что может быть следствием низкого числа клеток или прекращения их роста в культуре Уэйна 0,5 HSR.

3. Сравнительный анализ оперона бактериальной нитритредуктазы

Для обзора различных метаболических генов, локализованных в определенном опероне, проводили анализ оперона нитритредуктазы Mycobacterium tuberculosis с использованием программного обеспечения DOOR (Database of prOkaryotic OpeRons, csbl1.bmb.uga.edu/OperonDB/. Было отмечено, что субъединицы нитритредуктазы nirB (большая, MRA_0261) и nirD (меньшая, MRA_0262) были локализованы в одном и том же опероне (ID 336089). Открытые рамки считывания (open reading frame, ORF) генов nirB и nirD показали, что стоп-кодон субъединицы nirB перекрывается со старт-кодоном субъединицы nirD, что указывает на то, что обе субъединицы были синтезированы в виде единой транскрипционной единицы подобно нитритредуктазам других прокариотов, таких как Е. coli, Bacillus subtilis (фиг. 2). Также последовательность гена nirB МТВ H37Ra демонстрирует сходство более 35% на уровне последовательности белка с другими прокариотами, у которых нитритредуктаза (nirB) хорошо охарактеризована. Аминокислотная последовательность NirB на 100% идентична вирулентному штамму М. tb H37Rv, и на 97% и 77% идентична бактериям М. bovis BCG и М. smegmatis соответственно (таблица 2).

Другой оперон (ID 3306091) под названием "оперон уропорфириногена", локализованный рядом с опероном нитритредуктазы, состоит из двух гипотетических белков (MRA_0266, MRA_267) и бифункциональной уропорфириноген-III-синтетазы (MRA_0268). Предположительно, оперон уропорфириногена и оперон нитритредуктазы совместно транскрибируются в виде уропорфириноген-синтетазного фермента, ответственного за синтез железосерного кластера в функциональной нитритредуктазе [Shao Z, Gao J, Ding X, Wang J, Chiao J, Zhao G(2011). Identification and functional analysis of a nitrate assimilation operon nasACKBDEF from Amycolatopsis mediterranei U32. Arch Microbiol 193:463-477. Layer G, Reichelt J, Jahn D, Heinz DW (2010) Structure and function of enzymes in heme biosynthesis. Protein Sci 19:1137-1161].

4. Исследования с помощью ПЦР с обратной транскрипцией (RT-PCR)

Чтобы подтвердить экспрессию гена нитритредуктазы на уровне транскриптов, проводили ОТ-ПЦР с использованием кДНК, синтезированной из тотальной РНК, выделенной из бактерий, выращенных в разных источниках азота (фиг. 3). Для исследования дифференциальной экспрессии были сконструированы специфические праймеры для гена нитритредуктазы. (Последовательности праймеров и условия амплификации ПЦР указаны в таблице 3). Результат ОТ-ПЦР показывает, что гены нитратредуктазы MRA_1172 (narG), нитритредуктазы MRA_261 (nirB) и глутаминсинтетазы MRA_2230 были экспрессированы (glnA1), когда в качестве единственного источника азота использовался нитрат, а гены nirB и glnA1 экспрессировались, когда источником азота был нитрит. В присутствии аммиака экспрессировался glnA1. Гены метаболизма нитрата не экспрессировались в аспарагине, что подтверждает, что метаболизм аспарагина не перекрывается с нитратным метаболическим путем. Каждый из ПЦР-продуктов подтверждал амплификацию конкретного гена после сопоставления полученной нуклеотидной последовательности с последовательностью, доступной в базе данных NCBI. Таким образом, результат показал, что ген nirB представляет нитритредуктазу, и его экспрессия индуцируется специфически в присутствии нитрита. Кроме того, нитритредуктаза является частью функционально активного нитратного метаболического пути в Mycobacterium tuberculosis. Интересно, что экспрессия всех трех ферментов в нитратном метаболическом пути контролируется их субстратами.

5. Количественный анализ экспрессии nirB на уровне транскриптов ПЦР в режиме реального времени использовали для измерения уровня транскриптов гена nirB в аэробных условиях, в гипоксических условиях и в модели инфицированных макрофагов (фиг. 4). Было отмечено, что уровень экспрессии nirB в бактериях в гипоксических условиях примерно в 32 раза, а в модели инфицированных макрофагов примерно 10 раз выше, чем в бактериях в аэробных условиях. Экспрессию генов narG и narK2 использовали в качестве положительных контролей в данном исследовании [Sohaskey CD, Wayne LG (2003). Role of narK2X and narGHJI in Hypoxia upregulation of Nitrate Reduction by Mycobacterium tuberculosis. J Bacteriol 185:7247-7256]. Результаты ясно показывают, что нитритредуктаза играет важную роль в гипоксических условиях in vitro, и бактерии зависят от nirB при их выживании в дормантный период. Данные, полученные для макрофагов, также подтверждают, что nirB играет важную роль в выживании бактерий в клетках-хозяевах.

6. Ферментативная активность белка NirBD

Активность фермента нитритредуктазы количественно оценивали в бактериях МТВ в различных условиях (таблица 4). Результат показывает, что удельная активность нитритредуктазы возрастает примерно в 4 раза в гипоксических клетках по сравнению с клетками, выращенными в аэробных условиях. Нитратредуктаза выбрана в качестве фермента-маркера, чтобы подтвердить эффективное фракционирование клеток. Активность NarGHJI наблюдалась только в мембранной фракции при сравнении с цитоплазматической фракцией, в то время как активность нитратредуктазы оставалась одинаковой в аэробных/гипоксических условиях, что согласуется с предыдущими сообщениями [Sohaskey CD, Wayne LG (2003) Role of narK2X and narGHJI in Hypoxia upregulation of Nitrate Reduction by Mycobacterium tuberculosis. J Bacteriol 185:7247-7256]. Кроме того, в качестве отрицательного контроля были взяты клетки, выращенные в присутствии аммиака, в которых не было обнаружено заметной активности NirBD ни при аэробном, ни при анаэробном культивировании (данные не показаны). Интересно, что ферментативная активность была обнаружена в цитоплазматической фракции бактерий, что аналогично результатам, полученным для других организмов, таких как Е. coli [Clegg S, Yu F, Griffiths L, Cole JA (2002). The roles of the polytopic membrane proteins NarK, NarU and NirC in Escherichia coli K-12: two nitrate and three nitrite transporters. Mol Microbiol 44:143-15527]. Кроме того, повышенная удельная активность NirBD в гипоксических условиях также поддерживает повышенный уровень мРНК nirB на уровне транскриптов.

Клетки МТВ выращивали в присутствии нитрита/нитрата в качестве источника азота в среде М. pheli и удельную ферментативную активность измеряли на середине логарифмической фазы аэробной культуры (+O₂) и семидневной культуры согласно модели Уэйна, индуцированной гипоксией (-O₂), после лизиса клеток с помощью сферопластного способа, как описано в разделе "Материалы и методы". Общий белок количественно оценивали методом Брэдфорда с использованием BSA в качестве стандартного белка.

* Одну единицу удельной активности фермента определяли как 1 мкМ NO₂^- (мкМ), образованного или использованного в ходе ферментного анализа NR или NirB в минуту на 1 мг общего белка.

7. Влияние ингибитора нитритредуктазы [пара-гидроксимеркурий-бензоата (р-НМВ)] на бактерии, выращенные в аэробных условиях, в анаэробных условиях и в макрофагах ТНР-1

Ингибитор пара-гидроксимеркурий-бензоат (р-НМВ) добавляли в конечной концентрации 100 мкМ (приготовленный в DW) в момент инокуляции культур, и на 10-й день проводили подсчет клеток. Было отмечено, что р-НМВ убивает бактерии, выращенные в нитрите в качестве единственного источника азота, в аэробных условиях и в дормантной культуре 0,5 HSR Уэйна (фиг. 5). Число клеток уменьшалось примерно на 2,5 порядка по сравнению с бактериями, выращенными в аммиаке, где в присутствии р-НМВ ингибирование не наблюдалось. Результаты показывают, что р-НМВ специфически ингибирует нитритредуктазу и блокирует нитратный метаболический путь, который является эффективным как в аэробных условиях, так и в дормантных условиях, индуцированных гипоксией (фиг. 5).

Кроме того, в нулевой день после инфицирования (PI) отдельно добавляли ингибитор р-НМВ для ферментов нитратредуктазы, нитритредуктазы и глутаминсинтетазы, и на 10-й день PI подсчитывали клетки (фиг. 6). р-НМВ уменьшает число внутриклеточных бактерий примерно на 2 порядка по сравнению с контролем (без ингибитора). Азид и L-метионин-сульфоксимин (L-MSO), которые являются специфическими ингибиторами нитратредуктазы и глутаминсинтетазы соответственно, показали уменьшение числа жизнеспособных клеток примерно на 1,5 и 2,5 порядка по сравнению с контролем. Исследование показало, что нитритредуктаза является столь же важным ферментом для выживания бактерий в макрофагах, как нитратредуктаза и глутаминсинтетаза.

8. Цитотоксический эффект пара-гидроксимеркурий-бензоата (р-НМВ) на макрофаги ТНР-1

Чтобы исследовать воздействие ингибитора р-НМВ на состояние макрофагальных клеток-хозяев ТНР-1, прежде чем рассматривать эффективное и специфическое ингибирование им бактерий в моделях инфицированных макрофагов, флуоресцентное микроскопическое изображение клеток ТНР-1, обработанных р-НМВ (100 мкМ), сравнивали с необработанным контролем после окрашивания с помощью DAPI (4',6-диамидино-2-фенилиндола). Флуоресцентные изображения получали на 10-й день обработки ингибитором. Результаты показали, что целостность и компактность ядерной структуры была аналогична нормальным клеткам, указывая на здоровое состояние клеток-хозяев аналогично необработанным контрольным клеткам. Это исследование указывает на специфическое действие ингибитора на микобактерий, растущие в макрофагах, без каких-либо цитотоксических воздействий на макрофаги.

9. Оценка и стандартизация различных способов анализа использования нитрита в качестве биомаркера в различных образцах от пациентов в моделируемой среде для обнаружения и оценки туберкулезных бактерий в человеческих образцах

Кислотоустойчивые бактерии в мокроте являются основным используемым диагностическим инструментом для быстрого выявления случаев ТВ, тем не менее, при диагностике на основе окрашивания в мазке кислотоустойчивых бактерий можно пропустить половину случаев при первом представлении (Seema Irfan, Rumina Hasan, Akber Kanji, Qaiser Hassan, Iqbal Azam (2008), Infectious Diseases Journal of Pakistan, 17 (01); 10-13). Есть отчеты, которые подтверждают, что общая диагностическая чувствительность прямой окраски мазка по Цилю-Нильсену остается разочаровывающей в районах с ограниченными ресурсами (David Wilkinson and A. Wim Sturm (1997). Trans. Royal Soc. Exp. Med. Hyg. 91 (4); 420-421). Первоначально образцы крови и мочи собирали из больниц, чтобы провести исследования для обнаружения присутствия нитрита в клинических образцах.

А. Образцы крови, собранные из больницы Medipoint в Aundh, Пуна, Индия (проанализированы в июле-августе 2012)

1) Свежий образец крови: из вены в пробирку (без коагулянта) Обоснование: Нитрит может быть нестабильным в крови Анализируемые образцы: 2 (одинаковые условия)

Итог: не подходит, поскольку коагуляция и ненадлежащий осадок, состоящий из дебриса RBC (красных кровяных клеток), мешают определению окрашивания.

2) образцы крови из больниц, собранные с различными коагулянтами или без них (с крышками с цветовой кодировкой)

Обоснование: Различные коагулянты могут по-разному взаимодействовать с реагентами для обнаружения окрашивания

Анализируемые образцы: 5 (1 образец каждого из цветовых кодов, фиолетовая крышка, 2 образца)

Анализируемые параметры: 4 различных цветовых кода для крышек, естественный осадок RBC против центрифугирования, с нитритом или без нитрита, порядок добавления реагентов А и В с центрифугированием и без центрифугирования между ними.

Общее число анализов: 14

Результат: Красная крышка или фиолетовая крышка должны быть оптимизированы, другие бесполезны.

3) Образцы крови из больницы, собранные с различными коагулянтами или без них (только красные и фиолетовые крышки)

Анализируемые образцы: 4 (2 для каждого цвета крышки)

Анализируемые параметры: с нитритом или без нитрита, добавление А с последующим центрифугированием, совместное добавление А и В с последующим центрифугированием.

Общее число анализов: 16

Результат: Кровь, собранная в пробирку с фиолетовой крышкой, дает лучшее обнаружение окрашивания, если центрифугирование выполняется после добавления А

4) Образцы крови из больницы, собранные в пробирки с фиолетовыми крышками

Анализируемые образцы: 1

Анализируемые параметры: с нитритом или без нитрита, использование 1× объема А и В против использования 4× объема А и В

Общее число анализов: 8

Результат: Лучший протокол для лучшего обнаружения окрашивания представляет собой:

Добавить 4× объем А, инкубировать в течение 5 минут, центрифугировать

Добавить В, снова центрифугировать, проверить супернатант на окрашивание.

5) Образцы крови из больницы, собранные в пробирки с фиолетовыми крышками

Анализируемые образцы: 2

Анализируемые параметры: с нитритом или без нитрита, инкубация с А в течение 15 минут, 30 минут, 1 часа и 2 часов

Общее число анализов: 16

Обоснование: Добавление А замораживает нитрит, так что если А добавлять сразу и центрифугировать в течение некоторого времени, он имитирует условия, когда образец должен быть транспортирован (из больниц, не имеющих возможности центрифугировать) на расстояние от 15 мин до 2 ч для дальнейшего анализа.

Результаты: Сроки добавления В не имеют большого влияния, и если нитрит присутствует, то образец от пациента может быть проанализирован безопасно даже после транспортировки.

Резюме протоколов анализа образцов крови:

Общее число анализов:: 56

Заключение: Если кровь собирают в пробирку с EDTA, то реагенты А и В могут обнаружить 80 мкМ нитрита в крови, обогащенной нитритом (после сбора), и стандартизованным способом является способ №5.

В. Образцы мочи (проанализированы в июле-декабре 2012)

1) Образцы мочи из больницы

Анализируемые образцы: 2

1 положительный на UTI, 1 отрицательный, необходимо обогащение нитритом для наблюдения окрашивания, отрицательный образец стал глубоко синим на следующий день

2) Образцы мочи из больницы

Анализируемые образцы: 5

Все - отрицательные, стали синими с различными оттенками на следующий день

3) Образцы мочи из больницы

Анализируемые образцы: 2

1 положительный на UTI, 1 отрицательный, необходимо обогащение нитритом для наблюдения окрашивания

4) образец мочи пациента с UTI из больницы

Анализируемые образцы: 1

Окрашивания нет

Резюме:

Общее число анализов = 10

Заключение: вероятно, нужно истинная культура от положительных пациентов для правильной оценки этих образцов.

С. Образцы мокроты

Образцы мокроты собирали в больнице Pune Chest, Aundh. Все образцы были собраны на основании наличия в истории болезни а) кашля в течение длительного периода, Ь) потери веса и с) нечувствительности к стандартным антибиотикам. В больнице Pune Chest Hospital, Aundh, Пуна, все пациенты были обследованы путем рентгенографии грудной клетки, а также микроскопии мокроты на наличие кислотоустойчивых бактерий в мазках. Микроскопические данные также предоставлены в стандартных форматах следующим образом:

- 0 кислотоустойчивых бактерий в 100 полях, что означает: отрицательный

- 1-9 кислотоустойчивых бактерий в 100 полях, что означает: фактическое число бактерий, всего найденных в мазке

- 10-99 кислотоустойчивых бактерий в 100 полях: 1+

- 1-10 кислотоустойчивых бактерий на 1 поле в 50 полях: 2+

- >10 кислотоустойчивых бактерий на 1 поле в 20 полях: 3+

Все анализы образцов мокроты были сделаны с использованием образцов от пациентов с подозрением на ТВ, собранных в больнице. Результат показан в таблице 4.

Таблица 5

Было использовано два способа:

i) 100 мкл мокроты переносили в небольшую пробирку типа Эппендорф и добавляли реагенты А и В (по аналогии со способами, используемыми для анализа крови и мочи и подробно описанными ранее).

ii) Реагенты А и В последовательно добавляли в пробирки, содержащие мокроту от пациентов.

iii) Окрашивание контролировали, а также регистрировали, делая фотографии с помощью цифровой камеры. Таким образом, регистрировали фактический цвет реакционной смеси.

iv) Окрашивание анализировали относительно параллельного набора данных (рентгенографии грудной клетки и микроскопии кислотоустойчивых бактерий), полученных компетентными специалистами больницы для тех же пациентов.

D. Выявление подходящего образца для диагностического исследования ТВ

Как правило, пациентов с кашлем, продолжающимся 3 недели или дольше, потерей веса и отсутствием ответа на антибиотики, подвергали скринингу путем рентгенографии грудной клетки, а также микроскопии образцов мокроты. В ходе анализа нитрита в образцах мокроты от этих пациентов, предположительно больных туберкулезом, было установлено, что образцы крови от этих же пациентов редко забираются. Тем не менее, от одного пациента были получены и кровь, и мокрота. Анализ мокроты был положительным, анализ крови был отрицательным.

Вывод: для анализа случаев туберкулеза легких должна быть использована мокрота.

E. Протокол анализа мокроты Таблица 5

Всего 101 образец был проанализирован с помощью данного способа, из них 66 в двух экземплярах и 2 образца повторялись. 49 результатов сопоставляли с данными AFB, 24 из которых были положительными, а 21 были отрицательными. 4 из них, которые были от умерших пациентов, демонстрировали фиолетовое/темно-розовое окрашивание после добавления реагента в образец мокроты, что явно указывало на высокую бактериальную нагрузку в организме пациента. Один из них содержал MDR-бактерии.

Из 21 пациента с отрицательными образцами 4 были выписаны (1 DAMA, 3 были РТВ, 1 был AFB(+) при повторе), 2 получали лечение в течение почти 3-5 мес.

Из 101 случая 3 образца мокроты были оценены как просто положительные.

Результат ясно показывает, что в 22 случаях из 102 были получены отрицательные результаты как при микроскопии, так и при обнаружении нитрита.

Из 102 образцов 20 получили оценку 1+ при микроскопии, но при обнаружении нитрита 4 случая оказались отрицательными, 4 развивали бледно-розовое окрашивание, 5 - розовое, 4 - темно-фиолетовое (2 умерли), 3 - пурпурное.

Только 2 образца при микроскопии были оценены как 2+, но были оценены как отрицательные согласно нашему способу.

6 образцов были оценены как 3+, 2 были без окрашивания и по одному каждого из светло-розового, бледно-розового, розового, фиолетового и пурпурного окрашивания.

Наиболее интересно, что 41 AFB-отрицательный образец был положительным согласно данному способу. 1 из пациентов умер, и его образец дал фиолетовое окрашивание, как и несущий высокую бактериальную нагрузку. Большинство из них этих пациентов были диагностированы как РТВ-положительные по рентгенографии грудной клетки.

11 AFB-положительных образцов были определены как отрицательные согласно нашему способу. Из них 1 пациент умерший, а 3 пациента поступившие, 1 является носителем MDR ТВ.

Было обнаружено, что утренние образцы развивают относительно лучшее окрашивание по сравнению с вечерними образцами мокроты.

В целом, было обнаружено, что интенсивность окрашивания при обнаружении нитрита в образцах мокроты хорошо коррелирует с тяжестью заболевания. Тем не менее, производительность так называемых стандартных способов остается разочаровывающей, особенно при проведении этого исследования в больнице Pune Chest Hospital, Aundh.

Результаты анализов мокроты приведены ниже:

Сокращения

Вывод

1. Из 102 образцов результаты по 42 не совпадают.

2. Из 102 образцов результаты по 49 образцам совпадают с микроскопическими данными, а 2 образца были повторным анализом одного и того же пациента.

3. Число положительных образцов (68), обнаруженных нашим способом, почти вдвое больше, чем число обнаруженных микроскопическим способом (37), но 11 из них не совпадают.

4. Слюна является предпочтительной.

5. MDR также окрашивается.

6. Смерть пациентов больше связана с темно-фиолетовым/пурпурным окрашиванием, которое ясно показывает, что пациенты сильно инфицированы бактериями.

7. Добавление реагентов в емкости для сбора мокроты является более простым и надежным.

Преимущества

1. Данный способ облегчает выявление ингибиторов активной и дормантной стадии Mycobacterium tuberculosis.

2. Данный способ диагностики является эффективным способом обнаружения увеличения или уменьшения числа бактерий даже после начала лечения.

3. Было обнаружено, что интенсивность окрашивания при обнаружении нитрита в образцах мокроты хорошо коррелирует с тяжестью заболевания.

4. Выявленный лекарственный препарат будет работать на бактериях, присутствующих в комплексной среде, такой биологические жидкости, где будут присутствовать все источники N2, и ингибитор будет уничтожать их. Таким образом, подтверждено его значение в макрофагах или организме человека. Мы показали, что ингибитор нитритредуктазы работает в макрофагах.

5. Данный способ позволяет сделать выводы об активности нитритредуктазы в условиях гипоксии, 2) в макрофагах и 3) и наблюдаемом ингибировании только в гипоксических условиях, а также в макрофагах на стадии усиленного роста.

1. Способ определения тяжести туберкулеза у людей, включающий:

a) получение образца биологической жидкости от указанного субъекта;

b) добавление реагентов А и В в образец, полученный на этапе (а), с получением раствора и определение интенсивности окрашивания указанного раствора, где пурпурное окрашивание является показателем наибольшей тяжести заболевания, а бледно-розовое - наименьшей,

где реагент А представляет собой сульфаниловую кислоту и реагент В представляет собой N-(1-нафтил)этилендиамина дигидрохлорид (NEDD).

2. Способ по п. 1, в котором биологическая жидкость представляет собой мокроту, мочу или кровь.

3. Диагностический набор для обнаружения туберкулеза, включающий реагенты А и В, где реагент А представляет собой сульфаниловую кислоту и реагент В представляет собой N-(1-нафтил)этилендиамина дигидрохлорид (NEDD), вместе с руководством по применению и необязательно с добавками и носителями.

4. Применение диагностического набора по п. 3 для определения степени тяжести туберкулеза.