Vegf-нейтрализующие пролекарства для лечения офтальмологических заболеваний

Изобретение относится к медицине, а именно к офтальмологии и онкологии, и может быть использовано для лечения болезней, связанных с глазной неоваскуляризацией. Для этого вводят фармацевтическую композицию, предназначенную для внутриглазного введения путем внутриглазной инъекции. Указанная композиция содержит один или более фармацевтически приемлемых эксципиентов и связанное с носителем VEGF-нейтрализующее пролекарство. Причем связанное с носителем пролекарство содержит ковалентно связанный VEGF-нейтрализующий биологически активный фрагмент, фрагмент обратимого линкера пролекарства и группу носителя, представляющего собой биоразлагаемый гидрогель, выбранный из группы, состоящей из гидрогелей на основе ПЭГ и гиалуроновой кислоты. VEGF-нейтрализующий биологически активный фрагмент обратимо связан с носителем через фрагмент обратимого линкера пролекарства. Изобретение обеспечивает увеличение витреального периода полураспада VEGF-нейтрализующего пролекарства по сравнению с несвязанным VEGF-нейтрализующим биологически активным фрагментом. 18 з.п. ф-лы, 3 табл., 46 пр.

 

Настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям для применения в способе лечения одного или более офтальмологических заболеваний.

Главной причиной слепоты является неспособность лечения в достаточной степени определенных заболеваний глаз. Главным ограничением является отсутствие подходящих средств введения лекарственных средств или терапевтических агентов в глаза и поддержания этих лекарственных средств или терапевтических агентов при терапевтически эффективной концентрации в глазах в течение необходимого периода времени. Системное введение не может быть идеальным решением, потому что часто требуются неприемлемо высокие уровни системного дозирования для достижения эффективных внутриглазных концентраций, что сопровождается увеличенной частотой возникновения недопустимых побочных эффектов лекарственных средств. Простая глазная инсталляция или нанесение во многих случаях не является приемлемой альтернативой, потому что лекарственное средство может быстро вымываться слезами или извлекаться из глаза в общий кровоток. Местная терапия глазными каплями ограничивается плохой абсорбцией, необходимостью частого и/или постоянного дозирования в течение периода, который исчисляется от дней до лет, быстрым обновлением внутриглазной жидкости, образованием и движением слезной пленки и другими причинами, которые могут приводить к эффективному удалению терапевтических средств задолго до завершения терапии или доставки надлежащей дозы.

Преимущество внутриглазных инъекций состоит в том, что они могут обеспечить усиленную биодоступность к целевому месту (например, сетчатке) в глазах, относительно других механизмов доставки, таких как местная доставка. Однако они также имеют недостатки, и может возникать множество различных осложнений. Например, внутриглазные инъекции могут привести к доставке нежелательно высоких концентраций терапевтического средства в целевое место или в другое место, в частности, когда лекарственное средство является относительно растворимым. Кроме того, внутриглазные инъекции являются весьма неприятными для пациента. Кроме того, внутриглазная инъекция сама по себе может вызывать осложнения, такие как эндофтальмит и отслоение сетчатки, весьма желательно обеспечить наиболее длительные по возможности периоды между инъекциями, при остаточных терапевтических уровнях лекарственного средства в глазах.

В дополнение к указанному выше, терапевтические средства, доставляемые внутриглазными инъекциями, могут не иметь продолжительного действия, так как средства часто могут быстро распространятся внутри глаза после инъекции. Такое отсутствие продолжительного действия особенно нежелательно, так как может привести к необходимости более частого введения инъекций. Ранибизумаб и пегаптаниб, например, вводятся пациенту путем внутриглазной инъекции каждые 4 и 6 недель, соответственно, что является весьма нежелательным по ощущениям для пациента.

Таким образом, обще признано в области офтальмологии преимущество композиций с более длительной продолжительностью действия. Они являются предпочтительными с точки зрения лечения пациентов и здоровья глаз благодаря обеспечению продолжительной доставки терапевтических средств в глаза при минимизации проблем, связанных со сложностями для пациентов в связи с предписанными терапевтическими режимами лечения.

Экспрессия васкулярного эндотелиального фактора роста (VEGF), сигнального белка, продуцируемого клетками, которые стимулируют образование и развитие сосудов и ангиогенез, играет важную роль в различных офтальмологических заболеваниях, как например при определенных формах дегенерации желтого пятна и ретинопатии.

Различные медикаменты для лечения таких офтальмологических заболеваний присутствуют на рынке, такие как ранибизумаб, афлиберцепт и пегаптаниб. Применение пациентом осуществляется посредством внутриглазных инъекций каждые 4 и 8 недель.

В виду вышесказанного, существует потребность в обеспечении формы введения, которая преодолевает указанные недостатки, по меньшей мере частично.

Эта задача решается фармацевтической композицией, содержащей один или более фармацевтически приемлемых эксципиентов и VEGF-нейтрализующее пролекарство, где пролекарство содержит ковалентно связанную VEGF-нейтрализующую биологически активную составляющую, для применения в способе лечения одного или более офтальмологических заболеваний.

Применяемые в настоящей заявке термины имеют следующие значения

Как применяется в настоящей заявке, термин "VEGF-нейтрализующее лекарственное средство" означает лекарственное средство, которое проявляет его фармацевтический эффект путем нейтрализации действия васкулярного эндотелиального фактора роста (VEGF). Действие VEGF может быть нейтрализовано путем связывания рецептора VEGF или связывания с VEGF самим по себе, таким образом, путем блокирования или уменьшения эффективного связывания VEGF с его рецептором. Альтернативно, нейтрализующий эффект может быть достигнут путем ингибирования экспрессии и продуцирования VEGF, или препятствия им, или препятствия VEGF сигнализации.

Как применяется в настоящей заявке, термин "гидрогель" означает гидрофильную или амфифильную полимерную сеть, состоящую из гомополимеров или сополимеров, которые являются нерастворимыми благодаря присутствию ковалентных химических связей. Поперечно-сшивающие агенты обеспечивают структуру сети и механическую прочность. Гидрогели показывают термодинамическую совместимость с водой, что позволяет им разбухать в водной среде.

Как применяется в настоящей заявке, термин "реагент" означает химическое соединение, которое содержит функциональную группу для реакции с другой функциональной группой.

Как применяется в настоящей заявке, термин "реагент основной цепи" означает реагент, который подходит в качестве исходного вещества для образования гидрогелей. Как применяется в настоящей заявке, реагент основной цепи предпочтительно не содержит биоразлагаемые связи.

Как применяется в настоящей заявке, термин "поперечно-сшивающий реагент" означает линейный или разветвленный реагент, который подходит в качестве исходного вещества для сшивания реагентов основной цепи. Предпочтительно, поперечно-сшивающий реагент представляет собой линейное химическое соединение. Поперечно-сшивающий реагент содержит по меньшей мере одну биоразлагаемую связь.

Как применяется в настоящей заявке, термин "составляющая" означает часть молекулы, у которой отсутствует один или более атомов по сравнению с соответствующим реагентом. Если, например, реагент формулы "Н-Х-Н" реагирует с другим реагентом и становится частью продукта реакции, соответствующая составляющая продукта реакции имеет структуру "Н-Х-" или "-Х-", тогда как каждая "-" показывает присоединение к другой составляющей.

Соответственно, фраза "в связанной форме", как применяется, относится к соответствующей составляющей реагента, т.е. "лизин в связанной форме" относится к составляющей лизина, у которой отсутствует один или более атомов реагента лизина и которая является частью молекулы.

Как применяется в настоящей заявке, термин "функциональная группа" означает группу атомов, которая может реагировать с другими функциональными группами. Функциональные группы включают, но без ограничения к этому, следующие группы: карбоновая кислота (-(С=O)ОН), первичный или вторичный амин (-NH₂, -NH-), малеимид, тиол (-SH), сульфоновая кислота (-(O=S=O)OH), карбонат, карбамат (-O(C=O)N<), гидрокси (-ОН), альдегид (-(С=O)Н), кетон (-(С=O)-), гидразин (>N-N<), изоцианат, изотиоцианат, фосфорная кислота (-O(Р=O)ОНОН), фосфоновая кислота (-O(Р=O)ОНН), галоацетил, алкилгалогенид, акрилоил, арилфторид, гидроксиламин, дисульфид, винилсульфон, винилкетон, диазоалкан, оксиран и азиридин.

Если функциональная группа связывается с другой функциональной группой, то полученная структура обозначается как «связь». Например, реакция аминогруппы с карбоксильной группой приводит к амидной связи.

Как применяется в настоящей заявке, термин "активированная функциональная группа" означает функциональную группу, которая связана с активирующей группой. Предпочтительные активированные функциональные группы включают, но без ограничения к этому, активированные сложноэфирные группы, активированные карбаматные группы, активированные карбонатные группы и активированные тиокарбонатные группы.

Как применяется в настоящей заявке, термин "блокирующая группа" означает составляющую, которая является необратимо, т.е. перманентно, связанной с функциональной группой, чтобы исключить возможность ее реакции с функциональной группой других реагентов или составляющих.

Как применяется в настоящей заявке, термин "полимер" означает молекулу, содержащую повторяющиеся структурные единицы, т.е. мономеры, соединенные химическими связями линейным, кольцевым, разветвленным, поперечно-сшитым или дендримерным путем или их комбинацией, которые могут быть синтетического или биологического происхождения или комбинацией обоих. Понятно, что полимер может также содержать, например, функциональные группы или защитные составляющие. Предпочтительно, полимер имеет молекулярную массу по меньшей мере 0.5 кДа, например, молекулярную массу по меньшей мере 1 кДа, молекулярную массу по меньшей мере 2 кДа, молекулярную массу по меньшей мере 3 кДа или молекулярную массу по меньшей мере 5 кДа.

Как применяется в настоящей заявке, термин "полимерный" означает реагент или составляющую, содержащую один или более полимеров.

Как применяется в настоящей заявке, термин "среднечисловая молекулярная масса" означает обычные арифметические значения молекулярных масс отдельных полимеров. Специалисту в данной области техники понятно, продукты полимеризации, полученные в результате реакции полимеризации, не имеют одинаковую молекулярную массу, а скорее показывают распределение молекулярной массы. Следовательно, диапазоны молекулярной массы, молекулярные массы, диапазоны числа мономеров в полимере и количества мономеров в полимере, как применяется в настоящей заявке, относятся среднечисловой молекулярной массе и среднему числу мономеров.

Как применяется в настоящей заявке, термин "полимеризация" означает процесс реакции мономерных или макромономерных реагентов в ходе химической реакции полимерных цепей или сетей, включая, но без ограничения к этому, гидрогели.

Как применяется в настоящей заявке, термин "макромономер" означает молекулу, которая была получена в ходе полимеризации мономерных реагентов.

Как применяется в настоящей заявке, термин "конденсационная полимеризация" или "реакция конденсации" означает химическую реакцию, в которой функциональные группы двух реагентов реагируют с образованием одной молекулы, т.е. продукта реакции, и низкомолекулярная молекула, например, вода, выделяется.

Как применяется в настоящей заявке, термин "суспензионная полимеризация" означает гомогенную и/или двухфазную реакцию полимеризации, где мономерные реагенты растворяются в первом растворителе, образующем дисперсную фазу, которая эмульгируется во втором растворителе, образующем непрерывную фазу. Согласно настоящему изобретению мономерными реагентами являются по меньшей мере один реагент основной цепи и по меньшей мере один поперечно-сшивающий реагент. Как первый растворитель, так и мономерные реагенты являются не растворимыми во втором растворителе. Такая эмульсия образуется путем перемешивания, встряхивания, обработки ультразвуком или Microsieve™ эмульгирования, более предпочтительно путем перемешивания или Microsieve™ эмульгирования и более предпочтительно путем перемешивания. Эта эмульсия стабилизируется путем соответствующего эмульгатора. Эта полимеризация инициируется путем добавления основания в качестве инициатора, которое растворимо в первом растворителе. Подходящее общеизвестное основание, подходящее в качестве инициатора, может быть третичным основанием, таким как тетраметилэтилендиамин (TMEDA).

Как применяется в настоящей заявке, термин "инертная" относится к составляющей, которая не является химически реакционноспособной, т.е. она не реагирует не с другими составляющими или реагентами. Специалистам в данной области техники понятно, что термин "инертная" не исключает присутствие функциональных групп как таковых, но понятно, что функциональные группы, потенциально присутствующие в инертной составляющей, не реагируют с функциональными группами функциональными группами составляющих/реагентов, введенных в контакт с инертной составляющей, в, например, последующих реакциях. В частности, инертная составляющая Z не реагирует с A^x0 или A^x2 или с функциональными группами, присутствующими, например, в реагентах обратимого линкера пролекарства, лекарственных средствах, в реагентах конъюгатах составляющая обратимого линкера пролекарства-биологически активная составляющая или спейсерных реагентах, которые могут быть ковалентно конъюгированы с гидрогелем согласно настоящему изобретению с получением гидрогель-связанного пролекарства согласно настоящему изобретению.

Как применяется в настоящей заявке, термин "не смешивающийся" означает свойство, когда два вещества не способны объединятся с образованием гомогенной смеси.

Как применяется в настоящей заявке, термин "полиамин" означает реагент или составляющую, содержащую более одного амина (-NH- и/или -NH₂), например, от 2 до 64 аминов, от 4 до 48 аминов, от 6 до 32 аминов, от 8 до 24 аминов или от 10 до 16 аминов. Особенно предпочтительные полиамины содержат от 2 до 32 аминов.

Как применяется в настоящей заявке, термин "ПЭГ-основные, содержащие по меньшей мере Х% ПЭГ" в отношении составляющей или реагента означает, что указанная составляющая или реагент содержит по меньшей мере Х% (мас./мас.) единиц этиленгликоля (-CH₂CH₂O-), где единицы этиленгликоля могут быть расположены блочным образом, чередующимся образом или могут быть расположены случайным образом внутри составляющей или реагента, и предпочтительно все единицы этиленгликоля указанной составляющей или реагента присутствуют в одном блоке; оставшимся массовым процентом ПЭГ-основной составляющей или реагента являются другие составляющие, особенно выбранные из следующих заместителей и связей:

- C_1-50 алкила, С_2-50 алкенила, C_2-50 алкинила, С_3-10 циклоалкила, 4-7-членного гетероциклила, 8-11-членного гетеробициклила, фенила; нафтила; инденила; инданила; и тетралинила; и

- связей, выбранных из группы, состоящей из

где

пунктирные линии означают присоединение к остальной части составляющей или реагента, и

R¹ и R^1a независимо друг от друга выбираются Н и C_1-6 алкила.

Как применяется в настоящей заявке, термин "С_1-4 алкил" сам по себе или в комбинации означает неразветвленную или разветвленную алкильную группу, имеющую от 1 до 4 атомов углерода. Если присутствует в конце молекулы, примеры неразветвленных и разветвленных С_1-4 алкильных групп представляют собой метил, этил, н-пропил, изопропил, н-бутил, изобутил, втор.-бутил и трет.-бутил. Когда две составляющие молекулы связаны C_1-4 алкильной группой, тогда примерами таких С_1-4 алкильных групп являются -СН₂-, CH₂CH₂, -СН(СН₃)-, -СН₂-СН₂-СН₂-, CH(С₂Н₅)-, -С(СН₃)₂-, -СН₂-СН₂-СН₂-СН₂-, и СН₂-СН₂-СН₂(СН₃)-. Каждый атом водорода С_1-4 алкильной группы может быть замещен заместителем, как указано далее.

Как применяется в настоящей заявке, термин "C_1-6 алкил" сам по себе или в комбинации означает неразветвленную или разветвленную алкильную группу, имеющую от 1 до 6 атомов углерода. Если присутствует в конце молекулы, примеры неразветвленных и разветвленных C_1-6 алкильных групп представляют собой метил, этил, н-пропил, изопропил, н-бутил, изобутил, втор.-бутил, трет.-бутил, н-пентил, 2-метилбутил, 2,2-диметилпропил, н-гексил, 2-метилпентил, 3-метилпентил, 2,2-диметилбутил, 2,3-диметилбутил и 3,3-диметилпропил. Когда две составляющие молекулы связаны C_1-6 алкильной группой, тогда примерами таких C_1-6 алкильных групп являются -СН₂-, -СН₂-СН₂-, -СН(СН₃)-, -СН₂-СН₂-СН₂-, -СН(С₂Н₅)- и С(СН₃)₂-. Каждый атом водорода C_1-6 алкильной группы может быть замещен заместителем, как указано далее.

Соответственно, как применяется в настоящей заявке, термин "C_1-20 алкила" сам по себе или в комбинации означает неразветвленную или разветвленную алкильную группу, имеющую от 1 до 20 атомов углерода. Термин "C_8-18 алкил" сам по себе или в комбинации означает неразветвленную или разветвленную алкильную группу, имеющую от 8 до 18 атомов углерода. Соответственно, как применяется в настоящей заявке, термин "С_1-50 алкил" сам по себе или в комбинации означает неразветвленную или разветвленную алкильную группу, имеющую от 1 до 50 атомов углерода. Каждый атом водорода С_1-20 алкильной группы, C_8-18 алкильной группы и С_1-50 алкильной группы может быть замещен заместителем. В каждом случае алкильная группа может присутствовать в конце молекулы, или две составляющие молекулы могут быть связаны алкильной группой.

Как применяется в настоящей заявке, термин "С_2-6 алкенил" сам по себе или в комбинации означает неразветвленную или разветвленную углеводородную составляющую, содержащую по меньшей мере одну углерод-углеродную двойную связь, имеющую от 2 до 6 атомов углерода. Если присутствует в конце молекулы, примерами являются -СН=СН₂, -СН=СН-СН₃, СН₂-СН=СН₂, СН=СНСН₂-СН₃ и -СН=СН-СН=СН₂. Когда две составляющие молекулы связаны С_2-6 алкенильной группой, тогда примером такого C_2-6 алкенила является -СН=СН-. Каждый атом водорода С_2-6 алкенильной группы может быть замещен заместителем, как указано далее. Необязательно, одна или более тройных связей могут встречаться.

Соответственно, как применяется в настоящей заявке, термин "C_2-20 алкенил" сам по себе или в комбинации означает неразветвленный или разветвленный углеводородный остаток, содержащий по меньшей мере одну углерод-углеродную двойную связь, имеющий от 2 до 20 атомов углерода. Термин "С_2-50 алкенил" сам по себе или в комбинации означает неразветвленный или разветвленный углеводородный остаток, содержащий по меньшей мере одну углерод-углеродную двойную связь, имеющий от 2 до 50 атомов углерода. Если присутствует в конце молекулы, примерами являются СН=СН₂, -СН=СН-СН₃, -СН₂-СН=СН₂, СН=СНСН₂-СН₃ и СН=СН-СН=СН₂. Когда две составляющие молекулы связаны алкенильной группой, тогда примером является, например, -СН=СН-. Каждый атом водорода C_2-20 алкенильной или C_2-50 алкенильной группы может быть замещен заместителем, как указано далее. Необязательно, одна или более тройных связей могут встречаться.

Как применяется в настоящей заявке, термин "С_2-6 алкинил" сам по себе или в комбинации означает неразветвленный или разветвленный углеводородный остаток, содержащий по меньшей мере одну углерод-углеродную тройную связь, имеющий от 2 до 6 атомов углерода. Если присутствует в конце молекулы, примерами являются -С≡СН, -CH₂-С≡СН, СН₂СН₂-С≡СН и СН₂-С≡С-СН₃. Когда две составляющие молекулы связаны алкинильной группой, тогда примером является: -С≡С-. Каждый атом водорода С_2-6 алкинильной группы может быть замещен заместителем, как указано далее. Необязательно, одна или более двойных связей могут встречаться.

Соответственно, как применяется в настоящей заявке, термин "C_2-20 алкинил" сам по себе или в комбинации означает неразветвленный или разветвленный углеводородный остаток, содержащий по меньшей мере одну углерод-углеродную тройную связь, имеющий от 2 до 20 атомов углерода, и "C_2-50 алкинила" сам по себе или в комбинации означает неразветвленный или разветвленный углеводородный остаток, содержащий по меньшей мере одну углерод-углеродную тройную связь, имеющий от 2 до 50 атомов углерода. Если присутствует в конце молекулы, примерами являются -С≡СН, СН₂-С≡СН, СН₂-СН₂-С≡СН и СН₂-С≡С-СН₃. Когда две составляющие молекулы связаны алкинильной группой, тогда примером является, -С≡С-. Каждый атом водорода С_2-50 алкинильной или С_2-50 алкинильной группы может быть замещен заместителем, как указано далее. Необязательно, одна или более двойных связей могут встречаться.

Как применяется в настоящей заявке, термины "С_3-7 циклоалкил" или "С_3-7 циклоалкильное кольцо" означает циклическую алкильную цепь, имеющую от 3 до 7 атомов углерода, которая может быть насыщенной или ненасыщенной, например, циклопропил, циклобутил, циклопентил, циклогексил, циклогексенил, циклогептил. Каждый атом водорода циклоалкила может быть замещен заместителем, как указано далее. Термин "С_3-7 циклоалкил" или "С_3-7 циклоалкильное кольцо" также включает мостиковые бициклы подобные норборану или норбонену. Соответственно, "С_3-5 циклоалкил" означает циклоалкил, имеющий от 3 до 5 атомов углерода, и "С_3-10 циклоалкил" означает циклоалкил, имеющую от 3 до 10 атомов углерода.

Соответственно, как применяется в настоящей заявке, термин "С_3-10 циклоалкил" означает карбоциклическую кольцевую систему, имеющую от 3 до 10 атомов углерода, которая может быть насыщенной или ненасыщенной, например, циклопропил, циклобутил, циклопентил, циклогексил, циклогексенил, циклогептил, циклооктил, циклононил, циклодецил. Термин "С_3-10 циклоалкил" также включает по меньшей мере частично насыщенные карбомоно- и -бициклы.

Как применяется в настоящей заявке, термин "галоген" означает фтор, хлор, бром или йод. Особенно предпочтительным является фтор или хлор.

Как применяется в настоящей заявке, термин "4-7-членный гетероциклил" или "4-7-членный гетероцикл" означает цикл, имеющий 4, 5, 6 или 7 атомов в цикле, который может содержать до максимального числа двойных связей (ароматическое или неароматическое кольцо, полностью, частично или ненасыщенное), где от по меньшей мере одного атома в цикле до 4 атомов в цикле заменены на гетероатом, выбранный из группы, состоящей из серы (включая -S(O)-, -S(O)2-), кислорода и азота (включая =N(O)-), и где цикл связан с остальной частью молекулы через атом углерода или азота. Примерами 4-7-членных гетероциклов являются азетидин, оксетан, тиетан, фуран, тиофен, пиррол, пирролин, имидазол, имидазолин, пиразол, пиразолин, оксазол, оксазолин, изоксазол, изоксазолин, тиазол, тиазолин, изотиазол, изотиазолин, тиадиазол, тиадиазолин, тетрагидрофуран, тетрагидротиофен, пирролидин, имидазолидин, пиразолидин, оксазолидин, изоксазолидин, тиазолидин, изотиазолидин, тиадиазолидин, сульфолан, пиран, дигидропиран, тетрагидропиран, имидазолидин, пиридин, пиридазин, пиразин, пиримидин, пиперазин, пиперидин, морфолин, тетразол, тризол, тризолидин, тетразолидин, диазепан, азепин или гомопиперазин. Каждый атом водорода 4-7-членного гетероциклила или 4-7-членной гетероциклической группы может быть замещен заместителем, как указано далее.

Как применяется в настоящей заявке, термин "8-11-членный гетеробициклил" или "8-11-членный гетеробицикл" означает гетероциклическую систему из двух циклов, содержащую от 8 до 11 атомов в цикле, в которой по меньшей мере один атом в цикле является общим для обоих циклов, и которая может содержать до максимального числа двойных связей (ароматическое или неароматическое кольцо, полностью, частично или ненасыщенное) где от по меньшей мере одного атома в цикле до 6 атомов в цикле заменены на гетероатом, выбранный из группы, состоящей из серы (включая -S(O)-, -S(O)2-), кислорода и азота (включая =N(O)-), и где цикл связан с остальной частью молекулы через атом углерода или азота. Примерами 8-11-членных гетеробициклов являются индол, индолин, бензофуран, бензотиофен, бензоксазол, бензизоксазол, бензотиазол, бензизотиазол, бензимидазол, бензимидазолин, хинолин, хиназолин, дигидрохиназолин, хинолин, дигидрохинолин, тетрагидрохинолин, декагидрохинолин, изохинолин, декагидроизохинолин, тетрагидроизохинолин, дигидроизохинолин, бензазепин, пурин или птеридин. Термин 8-11-членный гетеробицикл также включает спиро-структуры из двух циклов, такие как 1,4-диокса-8-азаспиро[4.5]декан или мостиковые гетероциклы, такие как 8-аза-бицикло[3.2.1]октан. Каждый атом водорода 8-11-членного гетеробициклила или 8-11-членного гетеробицикла может быть замещен заместителем, как указано далее.

Термин "замещенный" означает, что один или более -Н атомов молекулы или составляющей замещены другим атомом или группой атомов, которые обозначаются как "заместители". Подходящие заместители выбираются из группы, состоящей из галогена; CN; COOR⁹; OR⁹; C(O)R⁹; C(O)N(R⁹R^9a); S(O)₂N(R⁹R^9a); S(O)N(R⁹R^9a); S(O)₂R⁹; S(O)R⁹; N(R⁹)S(O)₂N(R^9aR^9b); SR⁹; N(R⁹R^9a); NO₂; OC(O)R⁹; N(R⁹)C(O)R^9a; N(R⁹)S(O)₂R^9a; N(R⁹)S(O)R^9a; N(R⁹)C(O)OR^9a; N(R⁹)C(O)N(R^9aR^9b); OC(O)N(R⁹R^9a); T; C_1-50 алкила; C_2-50 алкенила; или C_2-50 алкинила, где Т; C_1-50 алкил; C_2-50 алкенил; и C_2-50 алкинил необязательно замещены одной или более группами R¹⁰, которые являются одинаковыми или различными, и где C_1-50 алкил; C_2-50 алкенил; и C_2-50 алкинил необязательно прерываются одной или более группами, выбранными из группы, состоящей из Т, -С(O)O-; -O-; -С(O)-; -C(O)N(R¹¹)-; -S(O)₂N(R¹¹)-; -S(O)N(R¹¹)-; -S(O)₂-; -S(O)-; -N(R¹¹)S(O)₂N(R^11a)-; -S-; -N(R¹¹)-; -OC(O)R¹¹; -N(R¹¹)C(O)-; -N(R¹¹)S(O)₂-; -N(R¹¹)S(O)-; -N(R¹¹)C(O)O-; -N(R¹¹)C(O)N(R^11a)-; и -OC(O)N(R¹¹R^11a);

где

R⁹, R^9a, R^9b независимо выбираются из группы, состоящей из Н; Т; и С_1-50 алкила; C_2-50 алкенила; или C_2-50 алкинила, где Т; C_1-50 алкил; C_2-50 алкенил; и C_2-50 алкинил необязательно замещены одной или более группами R¹⁰, которые являются одинаковыми или различными, и где C_1-50 алкил; C_2-50 алкенил; и C_2-50 алкинил необязательно прерываются одной или более группами, выбранными из группы, состоящей из Т, -С(O)O-; -O-; -С(O)-; -C(O)N(R¹¹)-; -S(O)₂N(R¹¹)-; -S(O)N(R¹¹)-; -S(O)₂-; -S(O)-; -N(R¹¹)S(O)₂N(R^11a)-; -S-; -N(R¹¹)-; -OC(O)R¹¹; -N(R¹¹)C(O)-; -N(R¹¹)S(O)₂-; -N(R¹¹)S(O)-; -N(R¹¹)C(O)O-; -N(R¹¹)C(O)N(R^11a)-; и -OC(O)N(R¹¹R^11a);

Т выбирается из группы, состоящей из фенила; нафтила; инденила; инданила; тетралинила; С_3-10 циклоалкила; 4-7 членного гетероциклила; или 8-11-членного гетеробициклила, где Т необязательно замещен одной или более группами R¹⁰, которые являются одинаковыми или различными;

R¹⁰ представляет собой галоген; CN; оксо (=O); COOR¹²; OR¹²; C(O)R¹²; C(O)N(R¹²R^12a); S(O)₂N(R¹²R^12a); S(O)N(R¹²R^12a); S(O)₂R¹²; S(O)R¹²; N(R¹²)S(O)₂N(R^12aR^12b); SR¹²; N(R¹²R^12a); NO₂; OC(O)R¹²; N(R¹²)C(O)R^12a; N(R¹²)S(O)₂R^12a; N(R¹²)S(O)R^12a; N(R¹²)C(O)OR^12a; N(R¹²)C(O)N(R^12aR^12b); OC(O)N(R¹²R^12a); или C_1-6 алкил, где C_1-6 алкил необязательно замещен одной или более группами галогена, которые являются одинаковыми или различными;

R¹¹, R^11a, R¹², R^12a, R^12b независимо выбираются из группы, состоящей из Н; или C_1-6 алкила, где C_1-6 алкил необязательно замещен одной или более группами галогена, которые являются одинаковыми или различными.

В одном варианте выполнения настоящего изобретения R⁹, R^9a, R^9b могут независимо друг от друга представлять собой Н.

В одном варианте выполнения настоящего изобретения R¹⁰ представляет собой С_1-6 алкил.

В одном варианте выполнения настоящего изобретения Т представляет собой фенил.

Как применяется в настоящей заявке, термин "прерывается" означает, что между двумя атомами углерода или в конце углеродной цепи между соответствующим атомом углерода и атомом водорода вставлен один или более атомов.

Как применяется в настоящей заявке, термин "пролекарство" означает соединение, которое подвергается биотрансформации перед проявлением его фармакологических эффектов. Пролекарства могут, таким образом, рассматриваться как биологически активные составляющие, связанные с специализированными нетоксичными защитными группами, применяемыми временным образом, для изменения или уменьшения нежелательных свойств в родоначальной молекуле. К этому также относится усиление желательных свойств лекарственного средства и подавление нежелательных свойств.

Как применяется в настоящей заявке, термин "пролекарство, связанное с носителем" означает пролекарство, которое содержит временную связь биологически активной составляющей с временной группой носителя, которая обеспечивает улучшенные физио-химические или фармакокинитические свойства, и которая может быть легко удалена in vivo, как правило, путем гидролитического расщепления. При введении таких пролекарств, связанных с носителем, млекопитающему, предпочтительно человеку, молекулы лекарственного средства высвобождаются. Соответственно, пролекарство, связанное с носителем, содержит биологически активную составляющую, составляющую обратимого линкера пролекартва и группу носителя, где биологически активная составляющая обратимо соединяется с группой носителя через обратимый линкер пролекарства. Понятно, что биологически активная составляющая обратимо и ковалентно связана с обратимым линкером пролекарства, где обратимый линкер пролекарства ковалентно связан с группой носителя. Предпочтительно, связью между обратимым линкером пролекарства и группой носителя является стабильная ковалентная связь.

Как применяется в настоящей заявке, термин "составляющая обратимого линкера пролекарства" означает составляющую, которая на одном ее конце присоединена к биологически активной составляющей D, т.е. VEGF-нейтрализующе биологически активной составляющей, через обратимую связь, и на другом ее конце присоединена к носителю через перманентную связь, таким образом, связывая VEGF-нейтрализующую биологически активную составляющую с носителем. Такие обратимые линкеры пролекарств являются неферментативно гидролитически расщепляемыми, т.е. расщепляемыми при физиологических условиях (водный буфер при рН 7.4, 37°С) с периодом полураспада в интервале, например, от одного часа до двенадцати месяцев. Обратимыми связями являются, например, аконитилы, ацетали, амиды, ангидриды карбоновых кислот, сложные эфиры, имины, гидразоны, амиды малеиновой кислоты, сложные ортоэфиры, фосфамиды, сложные фосфоэфиры, фосфосилиловые сложные эфиры, силиловые сложные эфиры, сложные эфиры сульфоновых кислот, ароматические карбаматы и их комбинации.

Напротив, "перманентная связь" является неферментативно гидролитически расщепляемой при физиологических условиях (водный буфер при рН 7.4, 37°С) с периодом полураспада боле двенадцати месяцев.

Как применяется в настоящей заявке, термин "бесследный линкер пролекарства" означает обратимый линкер пролекарства, который при расщепление, высвобождает лекарственное средство в его свободной форме. Как применяется в настоящей заявке, термин "свободная форма" лекарственного средства означает лекарственное средство в его немодифицированной фармакологически активной форме.

Как применяется в настоящей заявке, термин "пептид" означает короткий полимер аминокислотных мономеров, связанных пептидными связями. Термин "полипептид" означает пептид, содержащий до и включающий 50 аминокислотных мономеров. Термин "белок" означает пептид из более чем 50 аминокислотных мономеров.

Как применяется в настоящей заявке, термин "фармацевтическая композиция" означает один или более активных ингредиентов, и один или более инертных ингредиентов, а также любой продукт, который образуется из, непосредственно или косвенно, комбинации, комплексообразования или агрегации любых двух или более ингредиентов или из диссоциации одного или более ингредиентов или из других типов реакций или взаимодействий одного или более ингредиентов. Соответственно, фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению охватывают любую композицию, полученную путем смешивания VEGF-нейтрализующего пролекарства и одного или более фармацевтически приемлемых эксципиентов.

Как применяется в настоящей заявке, термин "эксципиент" относится к разбавителю, вспомогательному средству или носителю, совместно с которым вводится терапевтическое средство, т.е. VEGF-нейтрализующее пролекарство. Таким фармацевтическим эксципиентом может быть вода; масла и жидкости нефтяного, животного, растительного или синтетического происхождения, включая, но без ограничено к этому, арахисовое масло, соевое масло, минеральное масло, сезамовое масло и т.п.; крахмал, глюкозу, лактозу, сахарозу, маннит, трегалозу, желатин, солод, рис, муку, мел, силикагель, стеарат натрия, глицерин моностеарат, тальк, хлорид натрия, сухое молоко, глицерин, пропилен, гликоль, этанол, ацетат, сукцинат, tris, карбонат, фосфат; HEPES (4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфокислота), MES (2-(N-морфолин)этансульфокислота) или может содержать детергенты, такие как Tween, полоксамеры, полоксамины, CHAPS, Igepal, или аминокислоты, такие как, например, глицин, лизин или гистидин; триглицериды; маннит; лактозу; крахмал; стеарат магния; саххарин натрия; целлюлозу; и карбонат магния. Примеры подходящих фармацевтических эксципиентов описываются в "Remington's Pharmaceutical Sciences" by E.W. Martin. Композиция должна подходить для способа введения.

Как применяется в настоящей заявке, термин "фармацевтически приемлемый" означает, что молекула или реагент одобрена соответствующим органом, таким как ЕМА (Европа) и/или FDA (США) и/или любым другим национальным регулирующим органом, для применения млекопитающими, предпочтительно людьми.

Как применяется в настоящей заявке, термин "внутриглазная инъекция" означает инъекцию в внутриглазную жидкость (переднюю или заднюю камеру глаза), стекловидное тело, линзы или супрахориоидальное пространство глаза.

В общим, термин "содержит" или "содержащий" также охватывает "состоит из" или "состоящий из".

Как применяется в настоящей заявке, термин "модуляторы активности белка X" относится к молекулам, которые являются агонистами, антагонистами или иными нейтрализаторами или усилителями активности белка X.

Настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей один или более фармацевтически приемлемых эксципиентов и VEGF-нейтрализующее пролекарство, причем пролекарство содержит ковалентно связанную VEGF-нейтрализующую биологически активную составляющую, например, для применения в способе лечения одного или более офтальмологических заболеваний.

В предпочтительном варианте выполнения настоящего изобретения фармацевтическая композиция, содержащая VEGF-нейтрализующее пролекарство, вводится внутриглазным образом, предпочтительно путем внутриглазной инъекции.

В предпочтительном варианте выполнения настоящего изобретения период времени между двумя внутриглазными инъекциями VEGF-нейтрализующего пролекарства составляет по меньшей мере один месяц, например, период времени между двумя внутриглазными введениями VEGF-нейтрализующего пролекарства составляет по меньшей мере один месяц, или по меньшей мере пять недель, или по меньшей мере шесть недель, или по меньшей мере восемь недель, или по меньшей мере десять недель, или по меньшей мере двенадцать недель, или по меньшей мере шестнадцать недель, или по меньшей мере двадцать недель, или по меньшей мере двадцать четыре недели, или по меньшей мере двадцать восемь недель, или по меньшей мере тридцать две недели, или по меньшей мере тридцать шесть недель, или по меньшей мере сорок недель, или по меньшей мере сорок четыре недели, или по меньшей мере сорок восемь недель. Максимальный период между двумя внутриглазными введениями предпочтительно составляет не более четырех лет, т.е. не более трех лет, не более двух лет, или не более одного года. Предпочтительно, фармацевтическая композиция, содержащая VEGF-нейтрализующее пролекарство, вводится каждые два-двенадцать месяцев, более предпочтительно каждые четыре-десять месяцев и наиболее предпочтительно каждые шесть месяцев.

Таким образом, предпочтительным вариантом выполнения настоящего изобретения является фармацевтическая композиция, где пролекарство, содержащееся в фармацевтической композиции, имеет концентрацию от 5 до 200 мг пролекарства/мл фармацевтической композиции, например, концентрацию от 5 до 180 мг пролекарства/мл фармацевтической композиции, концентрацию от 10 до 170 мг пролекарства/мл фармацевтической композиции, концентрацию от 15 до 160 мг пролекарства/мл фармацевтической композиции, концентрацию от 20 до 150 мг пролекарства/мл фармацевтической композиции, концентрацию от 25 до 140 мг пролекарства/мл фармацевтической композиции, концентрацию от 30 до 130 мг пролекарства/мл фармацевтической композиции, концентрацию от 40 до 120 мг пролекарства/мл фармацевтической композиции, концентрацию от 50 до 110 мг пролекарства/мл фармацевтической композиции или концентрацию от 60 до 100 мг пролекарства/мл фармацевтической композиции.

В одном варианте выполнения настоящего изобретения фармацевтическая композиция содержит от 5 до 80 масс. процентов VEGF-нейтрализующей биологически активной составляющей на основе общей массы пролекарства, например, от 10 до 70 масс. процентов VEGF-нейтрализующей биологически активной составляющей на основе общей массы пролекарства, от 15 до 65 масс. процентов VEGF-нейтрализующей биологически активной составляющей на основе общей массы пролекарства, от 20 до 65 масс. процентов VEGF-нейтрализующей биологически активной составляющей на основе общей массы пролекарства, или от 30 до 65 масс. процентов VEGF-нейтрализующей биологически активной составляющей на основе общей массы пролекарства.

В одном варианте выполнения настоящего изобретения инъекция осуществляется при объеме инъекции в интервале от 10 до 200 мкл, например, в интервале от 15 до 150 мкл, в интервале от 20 до 100 мкл, в интервале от 30 до 80 мкл, или в интервале от 40 до 70 мкл. Предпочтительно, объем инъекции составляет 50 мкл.

VEGF-нейтрализующее пролекарство предпочтительно представляет собой пролекарство, связанное с носителем.

В VEGF-нейтрализующих пролекарствах присутствую различные стехиометрические количества лекарственно средства и носителя.

В одном варианте выполнения настоящего изобретения одна VEGF-нейтрализующая биологически активная составляющая соединена через одну составляющую обратимого линкера пролекарства с одной составляющей носителя. Присоединение VEGF-нейтрализующей биологически активной составляющей к составляющей обратимого линкера пролекарства происходит через функциональную группу соответствующего лекарственного средства. При необходимости присутствует спейсерная составляющая между составляющей носителя и составляющей обратимого линкера пролекарства.

В другом варианте выполнения настоящего изобретения, VEGF-нейтрализующая биологически активная составляющая соединена с более чем одной составляющей обратимого линкера пролекарства через более чем одну функциональную группу VEGF-нейтрализующей биологически активной составляющей. Каждая из более чем одной составляющих обратимого линкера пролекарства соединены с различными составляющими носителя, при необходимости через спейсерную составляющую. Поэтому, в этом варианте выполнения настоящего изобретения VEGF-нейтрализующая биологически активная составляющая соединена с более чем одной составляющей носителя.

В другом варианте выполнения настоящего изобретения, одна составляющая носителя соединена с более чем одной составляющей обратимого линкера пролекарства, либо напрямую, либо через необязательную спейсерную составляющую. Каждая из составляющих обратимого линкера пролекарства соединена с одной или более, предпочтительно с одной, VEGF-нейтрализующей биологически активной составляющей.

В одном варианте выполнения настоящего изобретения носителем является растворимый носитель. Предпочтительно, растворимый носитель содержит по меньшей мере один полимер, выбранный из группы полимеров, содержащей поли(акриловые кислоты), поли(акрилаты), поли(акриламиды), поли(акрилокси) полимеры, поли(амиды), поли(амидоамины), поли(аминокислоты), поли(ангидриды), поли(аспартамиды), поли(масляные кислоты), поли(гликолевые кислоты), полибутилен терефталаты, поли(капролактоны), поли(карбонаты), поли(цианоакрилаты), поли(диметилакриламиды), поли(сложные эфиры), поли(этилены), поли(алкиленгликоли), поли(этиленоксиды), поли(этилфосфаты), поли(этилоксазолины), поли(гликолиевые кислоты), поли(гидроксиэтилакрилаты), поли(гидроксиэтил-оксазолины), поли(гидроксиметакрилаты), поли(гидроксипропилметакриламиды), поли(гидроксипропилметакрилаты), поли(гидроксипропилоксазолины), поли(иминокарбонаты), поли(молочные кислоты), со(поли)меры молочные и гликолиевых кислот, поли(метакриламиды), поли(метакрилаты), поли(метилоксазолины), поли(органофосфазены), поли(сложные ортоэфиры), поли(оксазолины), поли(пропиленгликоли), поли(силоксаны), поли(уретаны), поли(виниловые спирты), поли(виниламин), поли(винилметиловые простые эфиры), поли(винилпирролидоны), силиконы, рибонуклеиновые кислоты, дезоксинуклеиновые кислоты, альбумины, антитела и их фрагменты, белки плазмы крови, коллагены, эластин, фасцин, фибрин, кератины, полиаспартат, полиглутамат, проламины, трансферрины, цитохромы, флавопротеин, гликопротеины, гемопротеины, липопротеины, металлопротеины, фитохромы, фосфопротеины, опсины, агар, агарозу, альгинат, арабиназы, арабиногалактаны, каррагенан, целлюлозу, карбометилцеллюлозу, гидроксипропилметилцеллюлозы и другие полимеры на основе углеводов, схитозаны, декстраны, декстрины, желатины, гиалуроновые кислоты и их производные, маннаны, пектины, рамногалактуронаны, крахмалы, гидроксиалкилкрахмалы, ксилан и их сополимеры и функционализированные производные.

В другом варианте выполнения настоящего изобретения носителем является нерастворимый носитель, более предпочтительно носителем пролекарства, связанного с носителем, является гидрогель.

Предпочтительно, гидрогелем VEGF-нейтрализующего пролекарства является биоразлагаемый гидрогель.

Гидрогель содержит по меньшей мере один полимер, который выбирается из группы полимеров, содержащей поли(акриловые кислоты), поли(акрилаты), поли(акриламиды), поли(акрилокси) полимеры, поли(амиды), поли(амидоамины), поли(аминокислоты), поли(ангидриды), поли(аспартамиды), поли(масляные кислоты), поли(гликолевые кислоты), полибутилен терефталаты, поли(капролактоны), поли(карбонаты), поли(пианоакрилаты), поли(диметилакриламиды), поли(сложные эфиры), поли(этилены), поли(алкиленгликоли), поли(этиленоксиды), поли(этилфосфаты), поли(этилоксазолины), поли(гликолиевые кислоты), поли(гидроксиэтилакрилаты), поли(гидроксиэтил-оксазолины), поли(гидроксиметакрилаты), поли(гидроксипропилметакриламиды), поли(гидроксипропилметакрилаты), поли(гидроксипропилоксазолины), поли(иминокарбонаты), поли(молочные кислоты), со(поли)меры молочные и гликолиевых кислот, поли(метакриламиды), поли(метакрилаты), поли(метилоксазолины), поли(органофосфазены), поли(сложные ортоэфиры), поли(оксазолины), поли(пропиленгликоли), поли(силоксаны), поли(уретаны), поли(виниловые спирты), поли(виниламин), поли(винилметиловые простые эфиры), поли(винилпирролидоны), силиконы, рибонуклеиновые кислоты, дезоксинуклеиновые кислоты, альбумины, антитела и их фрагменты, белки плазмы крови, коллагены, эластин, фасцин, фибрин, кератины, полиаспартат, полиглутамат, проламины, трансферрины, цитохромы, флавопротеин, гликопротеины, гемопротеины, липопротеины, металлопротеины, фитохромы, фосфопротеины, опсины, агар, агарозу, альгинат, арабиназы, арабиногалактаны, каррагенан, целлюлозу, карбометилцеллюлозу, гидроксипропилметилцеллюлозы и другие полимеры на основе углеводов, схитозаны, декстраны, декстрины, желатины, гиалуроновые кислоты и их производные, маннаны, пектины, рамногалактуронаны, крахмалы, гидроксиалкилкрахмалы, ксилан и их сополимеры и функционализированные производные.

Предпочтительно, гидрогелем VEGF-нейтрализующего пролекарства является биоразлагаемый гидрогель на основе поли(этиленгликоля) (ПЭГ), содержащий по меньшей мере 10% ПЭГ, более предпочтительно, содержащий по меньшей мере 20% ПЭГ и наиболее предпочтительно 30% ПЭГ.

Гидрогель VEGF-нейтрализующего пролекарства представляет собой формованного изделия, предпочтительно в форме микрочастиц. Более предпочтительно, гидрогель находится в форме шариков микрочастиц. Даже более предпочтительно, такие шарики микрочастиц имеют диаметр от 1 до 1000 мкм, более предпочтительно от 5 до 500 мкм, более предпочтительно от 10 до 100 мкм, более предпочтительно от 20 до 100 мкм, и даже более предпочтительно от 20 до 80 мкм. Диаметры шариков измеряют, когда шарики микрочастиц суспендированы в изотоническом водном буфере.

Гидрогелем VEGF-нейтрализующего пролекарства предпочтительно является гидрогель, описанный в WO 2006/003014 A2 и WO 2011/012715 A1, которые включены в настоящую заявку в полном объеме посредством ссылки.

Даже более предпочтительно, гидрогелем VEGF-нейтрализующего пролекарства является гидрогель, получаемый способом, включающим стадии

(а) обеспечения смеси, содержащей

(a-i) по меньшей мере один реагент основной цепи, где по меньшей мере один реагент основной цепи имеет молекулярную массу в интервале от 1 до 100 кДа, и содержит по меньшей мере три амина (-NH₂ и/или -NH-);

(a-ii) по меньшей мере один поперечно-сшивающий реагент, где по меньшей мере один поперечно-сшивающий реагент имеет молекулярную массу в интервале от 6 до 40 кДа, и где по меньшей мере один поперечно-сшивающий реагент содержит

(i) по меньшей мере две карбонилокси группы (-(С=O)-O- или -O-(С=O)-), и дополнительно

(ii) по меньшей мере две активированные функциональные концевые группы, выбранные из группы, состоящей из активированных сложноэфирных групп, активированных карбаматных групп, активированных карбонатных групп и активированных тиокарбонатных групп,

и является основанным на ПЭГ, содержащим по меньшей мере 70% ПЭГ; и

(a-iii) первый растворитель и по меньшей мере второй растворитель, где второй растворитель является несмешиваемым с первым растворителем,

в массовом отношении по меньшей мере одного реагента основной цепи к по меньшей мере одному поперечно-сшивающему реагенту в интервале от 1:99 до 99:1; и

(b) полимеризации смеси со стадии (а) путем суспензионной полимеризации в гидрогель,

(c) при необходимости обработки гидрогеля.

Смесь со стадии (а) содержит первый растворитель и по меньшей мере второй растворитель. Указанный первый растворитель предпочтительно выбирается из группы, состоящей из дихлорметана, хлороформа, тетрагидрофурана, этилацетата, диметилформамида, ацетонитрила, диметилсульфоксида, пропиленкарбоната, N-метилпирролидона, метанола, этанола, изопропанола и воды и их смесей.

По меньшей мере один реагент основной цепи и по меньшей мере один поперечно-сшивающий реагент растворяются в первом растворителе, т.е. дисперной фазе полимеризационной суспензии. В одном варианте выполнения настоящего изобретения реагент основной цепи и поперечно-сшивающий реагент растворяются по отдельности, т.е. в различных контейнерах, с применением либо одинаковых, либо различных растворителей, и предпочтительно с применением одного и того же растворителя для обоих реагентов. В другом варианте выполнения настоящего изобретения, реагент основной цепи и поперечно-сшивающий реагент растворяются вместе, т.е. в одном контейнере с применением одного и того же растворителя.

Подходящим растворителем для реагента основной цепи является органический растворитель. Предпочтительно, растворитель выбирается из группы, состоящей из дихлорметана, хлороформа, тетрагидрофурана, этилацетата, диметилформамида, ацетонитрила, диметилсульфоксида, пропиленкарбоната, N-метилпирролидона, метанола, этанола, изопропанола и воды и их смесей. Более предпочтительно, реагент основной цепи растворяется в растворителе, выбранном из группы, состоящей из ацетонитрила, диметилсульфоксида, метанола или их смесей. Наиболее предпочтительно, реагент основной цепи растворяется в диметилсульфоксиде.

В одном варианте выполнения настоящего изобретения реагент основной цепи растворяется в растворителе при концентрации в интервале от 1 до 300 мг/мл, более предпочтительно от 5 до 60 мг/мл и наиболее предпочтительно от 10 до 40 мг/мл.

Подходящим растворителем для поперечно-сшивающего реагента является органический растворитель. Предпочтительно, растворитель выбирается из группы, состоящей из дихлорметана, хлороформа, тетрагидрофурана, этилацетата, диметилформамида, ацетонитрила, диметилсульфоксида, пропиленкарбоната, N-метилпирролидона, метанола, этанола, изопропанола, воды или их смесей. Более предпочтительно, поперечно-сшивающий реагент растворяется в растворителе, выбранном из группы, состоящей из диметилформамида, ацетонитрила, диметилсульфоксида, метанола или их смесей. Наиболее предпочтительно, поперечно-сшивающий реагент растворяется в диметилсульфоксиде.

В одном варианте выполнения настоящего изобретения поперечно-сшивающий реагент растворяется в растворителе при концентрации в интервале от 5 до 500 мг/мл, более предпочтительно от 25 до 300 мг/мл и наиболее предпочтительно от 50 до 200 мг/мл.

По меньшей мере один реагент основной цепи и по меньшей мере один поперечно-сшивающий реагент смешиваются в массовом отношении в интервале от 1:99 до 99:1, например, в отношении в интервале от 2:98 до 90:10, в массовом отношении в интервале от 3:97 до 88:12, в массовом отношении в интервале от 3:96 до 85:15, в массовом отношении в интервале от 2:98 до 90:10 и в массовом отношении в интервале от 5:95 до 80:20; особенно предпочтительно в массовом отношении от 5:95 до 80:20, где первое число относится к реагенту основной цепи и второе число относится поперечно-сшивающему реагенту.

Предпочтительно, отношения выбираются таким образом, что смесь со стадии (а) содержит мольный избыток аминных групп из реагента основной цепи по сравнению с активированными функциональными концевыми группами сшивающего реагента. Соответственно, гидрогель, полученный способом согласно настоящему изобретению, имеет свободные аминные группы, которые могут применяться для связывания реагента линкера пролекарства с гидрогелем, либо напрямую, либо через спейсерную составляющую.

По меньшей мере один второй растворитель, т.е. непрерывная фаза полимеризационной суспензии, представляет собой предпочтительно органический растворитель, более предпочтительно органический растворитель, выбранный из группы, состоящей из линейных, разветвленных или циклических С_5-30 алканов; линейных, разветвленных или циклических C_5-30 алкенов; линейных, разветвленных или циклических C_5-30 алкинов; линейных или циклических поли(диметилсилоксанов); ароматических С_6-20 углеводородов; и их смесей. Даже более предпочтительно, по меньшей мере второй растворитель выбирается из группы, состоящей из линейных, разветвленных или циклических С_5-16 алкенов; толуола; ксилола; мезитилена; гексаметилдисилоксана; или их смесей. Наиболее предпочтительно, по меньшей мере второй растворитель выбирается из группы, состоящей из линейных C_7-11 алканов, таких как гептан, октан, нонан, декан и ундецен.

Предпочтительно, смесь со стадии (а) дополнительно содержит детергент. Предпочтительными детергентами являются Cithrol DPHS, Hypermer 70A, Hypermer B246, Hypermer 1599A, Hypermer 2296 или Hypermer 1083. Наиболее предпочтительным является Cithrol DPHS.

Предпочтительно, детергент имеет концентрацию от 0.1 г до 100 г на 1 л всей смеси, т.е. дисперсной фазы и непрерывной фазы вместе. Более предпочтительно, детергент имеет концентрацию от 0.5 г до 10 г на 1 л всей смеси, и наиболее предпочтительно, детергент имеет концентрацию от 0.5 г до 5 г на 1 л всей смеси.

Предпочтительно, смесь со стадии (а) представляет собой эмульсию.

Полимеризация на стадии (b) инициируется путем добавления основания. Предпочтительно, основание представляет собой ненуклеофильное основание, растворимое в алканах, более предпочтительно основание выбирается из N,N,N',N'-тетраметилэтилендиамина (TMEDA), 1,4-диметилпиперазина, 4-метилморфолина, 4-этилморфолина, 1,4-диазабицикло[2.2.2]октана, 1,1,4,7,10,10-гексаметилтриэтилентетрамина, 1,4,7-триметил-1,4,7-триазациклононана, трис[2-(диметиламино)этил]амина, триэтиламина, диизопропилэтиламина (DIPEA), триметиламина, N,N-диметилэтиламина, N,N,N',N'-тетраметил-1,6-гександиамина, N,N,N',N'',N''-пентаметилдиэтилентриамина, 1,8-диазабицикло[5.4.0]ундец-7-ена, 1,5-диазабицикло[4.3.0]нон-5-ена, и гексаметилентетрамина. Даже более предпочтительно, основание выбирается из TMEDA, 1,4-диметилпиперазина, 4-метилморфолина, 4-этилморфолина, 1,4-диазабицикло[2.2.2]октана, 1,1,4,7,10,10-гексаметилтриэтилентетрамина, 1,4,7-триметил-1,4,7-триазациклононана, трис[2-(диметиламино)этил]амина, 1,8-диазабицикло[5.4.0]ундец-7-ена, 1,5-диазабицикло[4.3.0]нон-5-ена, и гексаметилентетрамина. Наиболее предпочтительно, основанием является TMEDA.

Основание добавляется к смеси со стадии (а) в количестве 1-500 эквивалентов на активированную функциональную концевую группу в смеси, предпочтительно в количестве 5-50 эквивалентов, более предпочтительно в количестве 5-25 эквивалентов и наиболее предпочтительно в количестве 10 эквивалентов.

На стадии (b) способа, полимеризация гидрогеля согласно настоящему изобретению представляет собой реакцию конденсации, которая предпочтительно осуществляется в условиях перемешивания смеси со стадии (а). Предпочтительно, окружная скорость (окружная скорость = π × скорость вращения мешалки × диаметр мешалки) находится в интервале от 0.2 до 10 метров в секунду (м/с), более предпочтительно от 0.5 до 4 м/с и наиболее предпочтительно от 1 до 2 м/с.

В предпочтительном варианте выполнения стадии (b), реакция полимеризации осуществляется в цилиндрическом сосуде, оборудованном перегородками. Отношение диаметра к высоте сосуда может находиться в интервале от 4:1 до 1:2, более предпочтительно отношение диаметра к высоте сосуда находится в интервале от 2:1 до 1:1.

Предпочтительно, реакционный сосуд оборудован мешалкой с осевым потоком, выбранной из группы, состоящей из мешалки с наклонными лопастями, пропеллерной мешалки типа гребного винта или Lightnin А-310. Более предпочтительно, мешалка представляет собой мешалку с наклонными лопастями.

Стадия (b) может осуществляться при широком диапазоне температур, предпочтительно при температуре 10°С до 100 С°, более предпочтительно при температуре от 0°С до 80°С, даже более предпочтительно при температуре от 10°С до 50°С и наиболее предпочтительно при температуре окружающей среды. "Температура окружающей среды" относится к стандартной температуре в лаборатории и предпочтительно означает температуру в интервале от 17 до 25°С.

Предпочтительно, гидрогель, полученный в результате полимеризации, представляет собой формованное изделие, такое как покрытие, ячейка, стент, наночастица или микрочастица. Более предпочтительно, гидрогель находится в форме шариков микрочастиц, имеющих диаметр от 1 до 500 микрометров, более предпочтительно с диаметром от 10 до 300 микрометров, даже более предпочтительно с диаметром от 20 до 150 микрометров и наиболее предпочтительно с диаметром от 30 до 130 микрометров. Вышеуказанные диаметры измеряются, когда микрочастицы гидрогель полностью гидратированы в воде.

Необязательная стадия (с) содержит одну или более следующих стадий:

(с1) удаление избытка жидкости из реакции полимеризации,

(с2) промывка гидрогеля для удаления растворителей, применяемых в ходе полимеризации,

(с3) перенос гидрогеля в буферный раствор,

(с4) фракционирование/просеивание по размеру гидрогеля,

(с5) перенос гидрогеля в контейнер,

(с6) сушка гидрогеля,

(с7) перенос гидрогеля в конкретный растворитель, подходящий для стерилизации, и

(с8) стерилизация гидрогеля, предпочтительно путем гамма-облучения

Предпочтительно, стадия (с) содержит все следующие стадии

(с1) удаление избытка жидкости из реакции полимеризации,

(с2) промывка гидрогеля для удаления растворителей, применяемых в ходе полимеризации,

(с3) перенос гидрогеля в буферный раствор,

(с4) фракционирование/просеивание по размеру гидрогеля,

(с5) перенос гидрогеля в контейнер,

(с7) перенос гидрогеля в конкретный растворитель, подходящий для стерилизации, и

(с8) стерилизация гидрогеля, предпочтительно путем гамма-облучения.

По меньшей мере один реагент основной цепи имеет молекулярную массу в интервале от 1 до 100 кДа, предпочтительно от 2 до 50 кДа, более предпочтительно от 5 до 30 кДа, даже более предпочтительно от 5 до 25 кДа и наиболее предпочтительно от 5 до 15 кДа.

Предпочтительно, реагент основной цепи является основанным на ПЭГ, содержащим по меньшей мере 10% ПЭГ, более предпочтительно содержащим по меньшей мере 20% ПЭГ, даже более предпочтительно содержащим по меньшей мере 30% ПЭГ и наиболее предпочтительно содержащим по меньшей мере 40% ПЭГ.

В одном варианте выполнения настоящего изобретения реагент основной цепи присутствует в форме его кислотной соли, предпочтительно в форме кислотно-аддитивной соли. Подходящие кислотно-аддитивные соли образуются из кислот, которые образуют нетоксичные соли. Примеры включают, но без ограничения к этому, ацетат, аспартат, бензоат, бензилат, бикарбонат, карбонат, бисульфат, сульфат, борат, камсилат, цитрат, эдисилат, эсилат, формиат, фумарат, глюцептат, глюконат, глюкуронат, гексафторфосфат, гибензат, гидрохлорид, гидробромид, гидроиодид, изетионат, лактат, малат, малеат, малонат, мезилат, метилсульфат, нафтилат, никотинат, нитрат, оротат, оксалат, пальмитат, памоат, фосфат, гидрофосфат, дигидрофосфат, сахарат, стеарат, сукцинат, тартрат и тозилат. Особенно предпочтительно реагент основной цепи присутствует в форме его гидрохлоридной соли.

В одном варианте выполнения настоящего изобретения, по меньшей мере один реагент основной цепи выбирается из группы, состоящей из

соединения формулы (I)

где

В представляет собой разветвляющееся ядро,

SP представляет собой спейсерную составляющую, выбранную из группы, состоящей из C_1-6 алкила, C_2-6 алкенила и С_2-6 алкинила,

Р представляет собой полимерную цепь, основанную на ПЭГ, содержащую по меньшей мере 80% ПЭГ, предпочтительно по меньшей мере 85% ПЭГ, более предпочтительно по меньшей мере 90% ПЭГ и наиболее предпочтительно по меньшей мере 95% ПЭГ,

Hyp¹ представляет собой составляющую, содержащую амин (-NH₂ и/или -NH-) или полиамин, содержащий по меньшей мере два амина (-NH₂ и/или -NH-),

х равно целому числу от 3 до 16,

х1, х2 независимо друг от друга равны 0 или 1, при условии что х1 равно 0, если х2 равно 0,

А⁰, А¹, А² независимо друг от друга выбираются из группы, состоящей из

где R¹ и R^1a независимо друг от друга выбираются из Н и C_1-6 алкила;

соединения формулы (II)

где

Р определено выше для соединения формулы (I),

Hyp², Hyp³ независимо друг от друга представляют собой полиамин, содержащий по меньшей мере два амина (-NH₂ и/или -NH-), и

А³ и А⁴ независимо выбираются из группы, состоящей из

где R¹ и R^1a независимо друг от друга выбираются из Н и C_1-6 алкила;

соединения формулы (III)

где

P¹ представляет собой полимерную цепь, основанную на ПЭГ, содержащую по меньшей мере 80% ПЭГ, предпочтительно по меньшей мере 85% ПЭГ, более предпочтительно по меньшей мере 90% ПЭГ и наиболее предпочтительно по меньшей мере 95% ПЭГ,

Hyp⁴ представляет собой полиамин, содержащий по меньшей мере три амина (-NH₂ и/или NH), и

А⁵ выбирается из группы, состоящей из

где R¹ и R^1a независимо друг от друга выбираются из Н и C_1-6 алкила;

и

соединения формулы (IV),

где

Hyp⁵ представляет собой полиамин, содержащий по меньшей мере три амина (-NH₂ и/или NH), и

А⁶ выбирается из группы, состоящей из

где R¹ и R^1a независимо друг от друга выбираются из Н и C_1-6 алкила; и

Т¹ выбирается из группы, состоящей из C_1-50 алкила, С_2-50 алкенила или С_2-50 алкинила, фрагмент которых необязательно прерывается одной или более группами, выбранными из -NH-, -N(C_1-4 алкила)-, -O-, -S-, -С(O)-, -C(O)NH-, -C(O)N(C_1-4алкил)-, -О-С(О)-, -S(O)-, -S(O)₂-, 4-7-членного гетероциклила, фенила или нафтила.

В следующих частях термин "Hyp^x" относится к Нур¹, Hyp², Hyp³, Hyp⁴ и Hyp⁵ в общем.

Предпочтительно, реагент основной цепи представляет собой соединение формулы (I), (II) или (III), более предпочтительно реагент основной цепи представляет собой соединение формулы (I) или (III), и наиболее предпочтительно реагент основной цепи представляет собой соединение формулы (I).

В предпочтительном варианте выполнения настоящего изобретения, в соединении формулы (I), х равно 4, 6 или 8. Предпочтительно, в соединении формулы (I) x равно 4 или 8, наиболее предпочтительно, х равно 4.

В предпочтительном варианте выполнения настоящего изобретения в соединениях формулы (I) - (IV), А⁰, А¹, А², А³, А⁴, А⁵ и А⁶ выбираются из группы, включающей

Предпочтительно, в соединении формулы (I), А⁰ представляет собой

Предпочтительно, в соединении формулы (I), А¹ представляет собой

Предпочтительно, в соединении формулы (I), А² представляет собой

Предпочтительно, в соединении формулы (II), А³ представляет собой

и А⁴ представляет собой

Предпочтительно, в соединении формулы (III), А⁵ представляет собой

Предпочтительно, в соединении формулы (IV), А⁶ представляет собой

Предпочтительно, в соединении формулы (IV), Т¹ выбирается из Н и C_1-6 алкила.

В одном варианте выполнения настоящего изобретения, в соединении формулы (I), разветвляющееся ядро В выбирается из следующих структур:

где

пунктирные линии означают присоединение к А⁰ или, если х1 и х2 оба равны 0, к А¹,

t равно 1 или 2; предпочтительно t равно 1,

v равно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 или 14; предпочтительно, v равно 2, 3, 4, 5, 6; более предпочтительно, v равно 2, 4 или 6; наиболее предпочтительно, v равно 2.

В предпочтительном варианте выполнения настоящего изобретения, В имеет структуру формулы (a-i), (a-ii), (a-iii), (a-iv), (a-v), (a-vi), (a-vii), (a-viii), (a-ix), (a-x), (a-xiv), (a-xv) или (a-xvi). Более предпочтительно, В имеет структуру формулы (а-iii), (a-iv), (a-v), (a-vi), (a-vii), (a-viii), (a-ix), (a-x) или (a-iv). Наиболее предпочтительно, В имеет структуру формулы (a-xiv).

Предпочтительный вариант выполнения настоящего изобретения представляет собой комбинацию В и А⁰, или, если х1 и х2 оба равны 0, предпочтительный комбинацию В и А¹, которая выбирается из следующих структур:

где

пунктирные линии означают присоединение к SP или, если х1 и х2 оба равны 0, к Р.

Более предпочтительно, комбинация В и А⁰ или, если х1 и х2 оба равны 0, комбинация В и А¹, имеет структуру формулы (b-i), (b-iv), (b-vi) или (b-viii) и наиболее предпочтительно имеет структуру формулы (b-i).

В одном варианте выполнения настоящего изобретения, х1 и х2 в формуле (I) равны 0.

В одном варианте выполнения настоящего изобретения, полимерная цепь Р, основанная на ПЭГ, имеет молекулярную массу от 0.3 кДа до 40 кДа; например, от 0.4 до 35 кДа, от 0.6 до 38 кДа, от 0.8 до 30 кДа, от 1 до 25 кДа, от 1 до 15 кДа или от 1 до 10 кДа. Наиболее предпочтительно Р имеет молекулярную массу от 1 до 10 кДа.

В одном варианте выполнения настоящего изобретения, полимерная цепь Р¹, основанная на ПЭГ, имеет молекулярную массу от 0.3 кДа до 40 кДа; например, от 0.4 до 35 кДа, от 0.6 до 38 кДа, от 0.8 до 30 кДа, от 1 до 25 кДа, от 1 до 15 кДа или от 1 до 10 кДа. Наиболее предпочтительно Р¹ имеет молекулярную массу от 1 до 10 кДа.

В одном варианте выполнения настоящего изобретения, в соединениях формулы (I) или (II), Р имеет структуру формулы (c-i):

де n находится в интервале от 6 до 900, более предпочтительно n находится в интервале от 20 до 700 и наиболее предпочтительно n находится в интервале от 20 до 250.

В одном варианте выполнения настоящего изобретения, в соединениях формулы (III), Р¹ имеет структуру формулы (c-ii):

где

n находится в интервале от 6 до 900, более предпочтительно n находится в интервале от 20 до 700 и наиболее предпочтительно n находится в интервале от 20 до 250;

Т⁰ выбирается из группы, состоящей из C_1-6 алкила, С_2-6 алкенила и C_2-6 алкинила, которые необязательно прерываются одной или более группами, выбранными из -NH-, -N(C_1-4 алкила)-, -O-, -S-, -С(O)-, -C(O)NH-, -C(O)N(C_1-4 алкила)-, -О-С(О)-, -S(O)- или S(O)₂.

В одном варианте выполнения настоящего изобретения, в соединениях формулы (I) - (IV), составляющая Hyp^x представляет собой полиамин и предпочтительно содержит в связанной форме и, когда применяется, в R- и/или S-конфигурации, составляющую формул (d-i), (d-ii), (d-iii) и/или (d-iv):

где

z1, z2, z3, z4, z5, z6 независимо друг от друга равны 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8.

Более предпочтительно. Hyp^x содержит в связанной форме и в R- и/или S-конфигурации лизин, орнитин, диаминопропионовую кислоту и/или диаминомасляную кислоту. Наиболее предпочтительно. Hyp^x содержит в связанной форме и в R- и/или S-конфигурации лизин.

Hyp^x имеет молекулярную массу от 40 Да до 30 кДа, предпочтительно от 0.3 кДа до 25 кДа, более предпочтительно от 0.5 кДа до 20 кДа, даже более предпочтительно от 1 кДа до 20 кДа и наиболее предпочтительно от 2 кДа до 15 кДа.

Hyp^x предпочтительно выбирается из группы, состоящей из

составляющей формулы (e-i)

где

р1 равно целому числу от 1 до 5, предпочтительно р1 равно 4, и

пунктирная линия показывает присоединение к А², если реагент основной цепи имеет структуру формулы (I), и к А³ или А⁴, если реагент основной цепи имеет структуру формулы (II);

составляющей формулы (e-ii)

где

р2, р3 и р4 являются одинаковыми или различными и каждый независимо выбирается из целого числа от 1 до 5, предпочтительно р2, р3 и р4 равны 4, и

пунктирная линия показывает присоединение к А², если реагент основной цепи имеет структуру формулы (I), к А³ или А⁴, если реагент основной цепи имеет структуру формулы (II), к А⁵, если реагент основной цепи имеет структуру формулы (III), и к А⁶, если реагент основной цепи имеет структуру формулы (IV);

составляющей формулы (е-iii)

где

р5 - p11 являются одинаковыми или различными и каждый независимо выбирается из целого числа от 1 до 5, предпочтительно р5 - р11 равны 4, и

пунктирная линия показывает присоединение к А², если реагент основной цепи имеет формулу (I), к А³ или А⁴, если реагент основной цепи имеет формулу (II), к А⁵, если реагент основной цепи имеет формулу (III), и к А⁶, если реагент основной цепи имеет формулу (IV);

составляющей формулы (e-iv)

где

p12 - р26 являются одинаковыми или различными и каждый независимо выбирается из целого числа от 1 до 5, предпочтительно р12 - р26 равны 4, и

пунктирная линия показывает присоединение к А², если реагент основной цепи имеет структуру формулы (I), к А³ или А⁴, если реагент основной цепи имеет структуру формулы (II), к А⁵, если реагент основной цепи имеет структуру формулы (III), и к А⁶, если реагент основной цепи имеет структуру формулы (IV);

составляющей формулы (e-v)

где

р27 и р28 являются одинаковыми или различными и каждый независимо представляет собой целое число от 1 до 5, предпочтительно р27 и р28 равны 4,

q равно целому числу от 1 до 8, предпочтительно q равно 2 или 6, и наиболее предпочтительно q равно 6, и

пунктирная линия показывает присоединение к А², если реагент основной цепи имеет структуру формулы (I), к А³ или А⁴, если реагент основной цепи имеет структуру формулы (II), к А⁵, если реагент основной цепи имеет структуру формулы (III), и к А⁶, если реагент основной цепи имеет структуру формулы (IV);

составляющей формулы (e-vi)

где

р29 и р30 являются одинаковыми или различными и каждый независимо представляет собой целое число от 2 до 5, предпочтительно р29 и р30 равны 3, и

пунктирная линия показывает присоединение к А², если реагент основной цепи имеет структуру формулы (I), к А³ или А⁴, если реагент основной цепи имеет структуру формулы (II), к А⁵, если реагент основной цепи имеет структуру формулы (III), и к А⁶, если реагент основной цепи имеет структуру формулы (IV);

составляющей формулы (e-vii)

где

р31 - р36 являются одинаковыми или различными и каждый независимо выбирается из целого числа от 2 до 5, предпочтительно р31 - р36 равны 3, и

пунктирная линия показывает присоединение к А², если реагент основной цепи имеет структуру формулы (I), к А³ или А⁴, если реагент основной цепи имеет структуру формулы (II), к А⁵, если реагент основной цепи имеет структуру формулы (III), и к А⁶, если реагент основной цепи имеет структуру формулы (IV);

составляющей формулы (e-viii)

где

р37 - р50 являются одинаковыми или различными и каждый независимо выбирается из целого числа от 2 до 5, предпочтительно р37 - р50 равны 3, и

пунктирная линия показывает присоединение к А², если реагент основной цепи имеет структуру формулы (I), к А³ или А⁴, если реагент основной цепи имеет структуру формулы (II), к А⁵, если реагент основной цепи имеет структуру формулы (III), и к А⁶, если реагент основной цепи имеет структуру формулы (IV); и

составляющей формулы (e-ix):

где

р51 - р80 являются одинаковыми или различными и каждый независимо выбирается из целого числа от 2 до 5, предпочтительно р51 - р80 равны 3, и

пунктирная линия показывает присоединение к А², если реагент основной цепи имеет структуру формулы (I), к А³ или А⁴, если реагент основной цепи имеет структуру формулы (II), к А⁵, если реагент основной цепи имеет структуру формулы (III), и к А⁶, если реагент основной цепи имеет структуру формулы (IV); и

где составляющие (e-i) - (e-v) могут при каждом хиральном центре иметь R- или S-конфигурацию, предпочтительно, все хиральные центры составляющей (e-i) -(e-v) находятся в одинаковой конфигурации.

Предпочтительно, Hyp^x имеет структуру формулы (e-i), (e-ii), (e-iii), (e-iv), (e-vi), (e-vii), (e-viii) или (e-ix). Более предпочтительно. Hyp^x имеет структуру формулы (e-ii), (e-iii), (e-iv), (e-vii), (e-viii) или (e-ix), даже более предпочтительно Hyp^x имеет структуру формулы (e-ii), (e-iii), (e-vii) или (e-viii), и наиболее предпочтительно Hyp^x имеет структуру формулы (e-iii).

Если реагент основной цепи имеет структуру формулы (I), предпочтительный составляющая - А² - Нур¹ представляет собой составляющую формулы

где

пунктирная линия показывает присоединение к Р; и

Е¹ выбирается из формул (e-i) - (e-ix).

Если реагент основной цепи имеет структуру формулы (II), предпочтительная составляющая Hyp² - А³ - представляет собой составляющую формулы

где

пунктирная линия показывает присоединение к Р; и

Е¹ выбирается из формул (e-i) - (e-ix);

и предпочтительная составляющая - А⁴ - Hyp³ представляет собой составляющую формулы

где

пунктирная линия показывает присоединение к Р; и

Е¹ выбирается из формул (e-i) - (e-ix).

Если реагент основной цепи имеет структуру формулы (III), предпочтительная составляющая - А⁵ - Hyp⁴ представляет собой составляющую формулы

где

пунктирная линия показывает присоединение к Р¹; и

Е¹ выбирается из формул (e-i) - (e-ix).

Более предпочтительно, реагент основной цепи имеет структуру формулы (I), и В имеет структуру формулы (a-xiv).

Даже более предпочтительно, реагент основной цепи имеет структуру формулы (I), В имеет структуру формулы (a-xiv), х1 и х2 равны 0, и А¹ представляет собой -O-.

Даже более предпочтительно, реагент основной цепи имеет структуру формулы (I), В имеет структуру формулы (a-xiv), А¹ представляет собой -O-, и Р имеет структуру формулы (c-i).

Даже более предпочтительно, реагент основной цепи имеет формулу (I), В имеет формулу (a-xiv), х1 и х2 равны 0, А¹ представляет собой -O-, Р имеет формулу (с-i), А² представляет собой -NH-(C=O)-, и Hyp¹ имеет формулу (e-iii).

Наиболее предпочтительно, реагент основной цепи имеет следующую формулу:

где

n находится в интервале от 10 до 40, предпочтительно от 10 до 30, более предпочтительно от 10 до 20.

В равной степени предпочтительно, n находится в интервале от 20 до 30 кДа, и наиболее предпочтительно n равно 28.

SP формулы (I) представляет собой спейсерную составляющую, выбранную из группы, состоящей из C_1-6 алкила, С_2-6 алкенила и С_2-6 алкинила, предпочтительно SP представляет собой -CH₂-, -CH₂-CH₂-, -СН(СН₃)-, -СН₂-CH₂-CH₂-, CH(C₂H₅)-, С(СН₃)₂-, -СН=СН- или -СН=СН-, наиболее предпочтительно SP представляет собой -СН₂-, -CH₂-CH₂- или -СН=СН-.

По меньшей мере один поперечно-сшивающий реагент содержит по меньшей мере две карбонилокси группы (-(С=O)-O- или -O-(С=O)-), которые представляют собой биоразлагаемые связи. Эти биоразлагаемые связи необходимы для получения биоразлагаемого гидрогеля. Кроме того, по меньшей мере один поперечно-сшивающий реагент содержит по меньшей мере две активированные функциональные концевые группы, которые в ходе полимеризации на стадии (b) реагируют с аминами по меньшей мере одного реагента основной цепи.

Поперечно-сшивающий реагент имеет молекулярную массу в интервале от 6 до 40 кДа, более предпочтительно в интервале от 6 до 30 кДа, даже более предпочтительно в интервале от 6 до 20 кДа, даже более предпочтительно в интервале от 6 до 15 кДа и наиболее предпочтительно в интервале от 6 от 10 кДа.

Поперечно-сшивающий реагент содержит по меньшей мере две активированные функциональные концевые группы, выбранные из группы, содержащей активированные сложноэфирные группы, активированные карбаматные группы, активированные карбонатные группы и активированные тиокарбонатные группы, которые в ходе полимеризации реагируют с аминными группами реагентов основной цепи, образую амидные связи, т.е. составляющая основной цепи и поперечно-сшивающая составляющая предпочтительно соединены амидной связью.

В одном предпочтительном варианте выполнения настоящего изобретения, поперечно-сшивающий реагент представляет собой соединение формулы (V-I):

где

каждый D¹, D², D³ и D⁴ являются одинаковыми или различными, и каждый независимо друг от друга выбирается из группы, включающей -O-, -NR⁵-, -S- и CR⁶R^6a-;

каждый R¹, R^1a, R², R^2a, R³, R^3a, R⁴, R^4a, R⁶ и R^6a являются одинаковыми или различными, и каждый независимо друг от друга выбирается из группы, включающей -Н, OR⁷, -NR⁷R^7a, -SR⁷ и C_1-6 алкил; необязательно, каждая пара (пары) R¹/R², R³/R⁴, R^1a/R^2a и R^3a/R^4a может (могут) независимо образовывать химическую связь, и/или каждая из пар R¹/R^1a, R²/R^2a, R³/R^3a, R⁴/R^4a, R⁶/R^6a, R¹/R², R³/R⁴, R^1a/R^2a и R^3a/R^4a независимо друг от друга соединяется вместе с атомом, к которому она присоединена, с образованием С_3-8 циклоалкила или с образованием кольца А, или соединяется вместе с атомом, к которому они присоединены, с образованием 4-7-членного гетероциклила или 8-11-членного гетеробициклила или адамантила;

каждый R⁵ независимо выбирается из -Н и C_1-6 алкила; необязательно, каждая из пар R¹/R⁵, R²/R⁵, R³/R⁵, R⁴/R⁵ и R⁵/R⁶ может независимо образовывать химическую связь и/или соединяется вместе с атомом, к которому она присоединена, с образованием 4-7-членного гетероциклила или 8-11-членного гетеробициклила;

каждый R⁷, R^7a независимо выбирается из Н и C_1-6 алкила;

А выбирается из группы, состоящей из инденила, инданила и тетралинила;

Р² представляет собой

m находится в интервале от 120 до 920, предпочтительно от 120 до 460 и более предпочтительно от 120 до 230;

r1, r2, r7, r8 независимо равны 0 или 1;

r3, r6 независимо равны 0, 1, 2, 3 или 4;

r4, r5 независимо равны 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10;

s1, s2 независимо равны 1, 2, 3, 4, 5 или 6;

Y¹, Y² являются одинаковыми или различными, и каждая независимо друг от друга выбирается из формул (f-i) - (f-vi):

где

пунктирные линии означают присоединение к остальной части молекулы,

b равно 1, 2, 3 или 4

X^H представляет собой Cl, Br, I или F.

Предпочтительно, поперечно-сшивающий реагент представляет собой соединение формулы (V-II):

где

D¹, D², D³ и D⁴ являются одинаковыми или различными, и каждый независимо друг от друга выбирается из группы, включающей О, NR⁵, S и CR⁵R^5a;

R¹, R^1a, R², R^2a, R³, R^3a, R⁴, R^4a, R⁵ и R^5a являются одинаковыми или различными, и каждый независимо друг от друга выбирается из группы, включающей Н и C_1-6 алкил; необязательно, одна или более пар R¹/R^1a, R²/R^2a, R³/R^3a, R⁴/R^4a, R¹/R², R³/R⁴, R^1a/R^2a, и R^3a/R^4a образуют химическую связь или соединяются вместе с атомом, к которому они присоединены, с образованием С_3-8 циклоалкила или с образованием кольца А, или соединяются вместе с атомом, к которому они присоединены, с образованием 4-7-членного гетероциклила или 8-11-членного гетеробициклила или адамантил;

А выбирается из группы, состоящей из фенила, нафтила, инденила, инданила и тетралинила;

Р² представляет собой

m находится в интервале от 120 до 920, предпочтительно от 120 до 460 и более предпочтительно от 120 до 230;

r1, r2, r7, r8 независимо равно 0 или 1;

r3, r6 независимо равно 0, 1, 2, 3 или 4;

r4, r5 независимо равно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10;

s1, s2 независимо равно 1, 2, 3, 4, 5 или 6;

Y¹, Y² являются одинаковыми или различными, и каждая независимо друг от друга выбирается из формул (f-i) - (f-vi):

где

пунктирные линии означают присоединение к остальной части молекулы,

b равно 1, 2, 3 или 4

X^H представляет собой Cl, Br, I или F.

Понимается, что составляющие

и

представляют собой по меньшей мере две активированные функциональные концевые группы.

Предпочтительно, Y¹ и Y² формулы (V-I) и (V-II) имеют структуру формулы (f-i), (f-ii) или (f-v). Более предпочтительно, Y¹ и Y² имеют структуру формулы (f-i) или (f-ii) и наиболее предпочтительно, Y¹ и Y² имеют структуру формулы (f-i).

Предпочтительно, обе составляющие Y¹ и Y² формулы (V-I) и (V-II) имеют одинаковую структуру. Более предпочтительно, обе составляющие Y¹ и Y² имеют структуру формулы (f-i).

Предпочтительно, r1 формулы (V-I) и (V-II) равно 0.

Предпочтительно, r1 и s1 формулы (V-I) и (V-II) оба равны 0.

Предпочтительно, одна или более пар R¹/R^1a, R²/R^2a, R³/R^3a, R⁴/R^4a, R¹/R², R³/R⁴, R^1a/R^2a, и R^3a/R^4a формулы (V-I) и (V-II) образуют химическую связь или соединяются вместе с атомом, к которому они присоединены, с образованием С_3-8 циклоалкила или кольца А.

Предпочтительно, одна или более пар R¹/R², R^1a/R^2a, R³/R⁴, R^3a/R^4a формулы (V-I) и (V-II) соединяются вместе с атомом, к которому они присоединены, с образованием 4-7-членного гетероциклила или 8-11-членного гетеробициклила.

Предпочтительно, поперечно-сшивающий реагент формулы (V-I) и (V-II) является симметричным, т.е. составляющая

имеет такую же структуру, что и составляющая

В одном предпочтительном варианте выполнения настоящего изобретения s1, s2, r1 и r8 формулы (V-I) и (V-II) равны 0.

В другом предпочтительном варианте выполнения настоящего изобретения s1, s2, r1 и r8 формулы (V-I) и (V-II) равны 0, и r4 формулы (V-I) и (V-II) и r5 равны 1.

Предпочтительными поперечно-сшивающими реагентами являются поперечно-сшивающие реагенты формул (V-I) - (V-54):

где

каждый поперечно-сшивающий реагент может быть в форме его рацемической смеси, если применяется; и

m, Y¹ и Y² определено выше.

Даже более предпочтительными поперечно-сшивающими реагентами являются сшивающие реагенты формулы (Va-1) - (Va-54):

где

каждый поперечно-сшивающий реагент может быть в форме его рацемической смеси, если применяется; и

m, Y¹ и Y² определены выше.

Подобным образом, неожиданно было обнаружено, что чем меньше атомов присутствует между (С=O) карбонилокси группы и (С=O) соседнего активированного сложного эфира, активированного карбамата, активированного карбоната или активированного тиокарбамата, полученные гидрогели являются более устойчивыми к расщеплению, как например, более устойчивыми к расщеплению эстеразами.

Соответственно, поперечно-сшивающие реагенты V-11 - V-54, V-1, V-2, Va-11 - Va-54, Va-1 и Va-2 являются предпочтительными поперечно-сшивающими реагентами. Поперечно-сшивающие реагенты Va-11 - Va-54, Va-1 и Va-2 являются наиболее предпочтительными поперечно-сшивающими реагентами. Наиболее предпочтительным является поперечно-сшивающий реагент Va-14.

В другом варианте выполнения настоящего изобретения, поперечно-сшивающие реагенты V-1, V-2, V-5, V-6, V-7, V-8, V-9, V-10, V-11, V-12, V-13, V-14, V-15, V-16, V-17, V-18, V-19, V-20, V-21, V-22, V-23, V-24, V-25, V-26, V-27, V-28, V-29, V-30, V-31, V-32, V-33, V-34, V-35, V-36, V-37, V-38, V-39, V-40, V-41, V-42, V-43, V-44, V-45, V-46, V-47, V-48, V-49, V-50, V-51, V-52, V-53 и V-54 являются предпочтительными поперечно-сшивающими реагентами. Более предпочтительно, по меньшей мере один поперечно-сшивающий реагент имеет формулу V-5, V-6, V-7, V-8, V-9, V-10, V-14, V-22, V-23, V-43, V-44, V-45 или V-46, и наиболее предпочтительно, по меньшей мере один поперечно-сшивающий реагент имеет формулу V-5, V-6, V-9 или V-14.

В другом варианте выполнения настоящего изобретения, поперечно-сшивающие реагенты Va-1, Va-2, Va-5, Va-6, Va-7, Va-8, Va-9, Va-10, Va-11, Va-12, Va-13, Va-14, Va-15, Va-16, Va-17, Va-18, Va-19, Va-20, Va-21, Va-22, Va-23, Va-24, Va-25, Va-26, Va-27, Va-28, Va-29, Va-30, Va-31, Va-32, Va-33, Va-34, Va-35, Va-36, Va-37, Va-38, Va-39, Va-40, Va-41, Va-42, Va-43, Va-44, Va-45, Va-46, Va-47, Va-48, Va-49, Va-50, Va-51, Va-52, Va-53 и Va-54 являются даже более предпочтительными поперечно-сшивающими реагентами. Более предпочтительно, по меньшей мере один поперечно-сшивающий реагент имеет формулу Va-5, Va-6, Va-7, Va-8, Va-9, Va-10, Va-14, Va-22, Va-23, Va-43, Va-44, Va-45 или Va-46, и наиболее предпочтительно, по меньшей мере один поперечно-сшивающий реагент имеет формулу Va-5, Va-6, Va-9 или Va-14.

В другом варианте выполнения настоящего изобретения, поперечно-сшивающие реагенты Va-1, Va-2, Va-5, Va-6, Va-7, Va-8, Va-9, Va-10, Va-11, Va-12, Va-13, Va-14, Va-15, Va-16, Va-17, Va-18, Va-19, Va-20, Va-21, Va-22, Va-23, Va-24, Va-25, Va-26, Va-27, Va-28, Va-29, Va-30, Va-31, Va-32, Va-33, Va-34, Va-35, Va-36, Va-37, Va-38, Va-39, Va-40, Va-41, Va-42, Va-43, Va-44, Va-45, Va-46, Va-47, Va-48, Va-49, Va-50, Va-51, Va-52, Va-53 и Va-54 являются даже более предпочтительными поперечно-сшивающими реагентами. Более предпочтительно, по меньшей мере один поперечно-сшивающий реагент имеет Va-5, Va-6, Va-7, Va-8, Va-9, Va-10, Va-14, Va-22, Va-23, Va-43, Va-44, Va-45 или Va-46, или Va-46, и наиболее предпочтительно, по меньшей мере один поперечно-сшивающий реагент имеет формулу Va-5, Va-6, Va-9 или Va-14.

Предпочтительные варианты выполнения соединения формулы (V-I) и (V-II), как указано выше, относятся соответственно к предпочтительным соединениям формул (V-1) - (V-53).

Другим объектом настоящего изобретения является гидрогель, полученный способом согласно настоящему изобретению, как описано выше.

Гидрогель содержит от 0.01 до 1 ммоль/г первичной аминной группы (-NH₂), более предпочтительно, от 0.02 до 0.5 ммоль/г первичной аминной группы и наиболее предпочтительно от 0.05 до 0.3 ммоль/г первичной аминной группы. Термин "X ммоль/г первичной аминной группы" означает, что 1 г сухого гидрогеля содержит Х ммоль первичной аминной группы. Измерение содержания амина в гидрогеле осуществляется согласно Gude et al. (Letters in Peptide Science, 2002, 9(4): 203-206, который включен посредством ссылки в полном объеме) и также подробно описано в части «Примеры».

Предпочтительно, термин "сухой", как применяется в настоящей заявке, означает остаточное содержание воды, равное максимум 10%, предпочтительно менее 5% и более предпочтительно менее 2% (определено согласно Karl Fischer). Предпочтительным способом сушки является лиофилизация.

В одном варианте выполнения настоящего изобретения гидрогель VEGF-нейтрализующего пролекарства далее модифицируется перед тем, как обратимый линкер пролекарства-VEGF-нейтрализующая биологически активная составляющая конъюгируется с гидрогелем.

Предпочтительно, гидрогель модифицируется посредством способа, включающего стадии

(A) обеспечения гидрогеля, имеющего группы A^x0, где группы A^x0 являются одинаковыми или различными, предпочтительно одинаковыми, функциональными группами;

(B) при необходимости ковалентного конъюгирования спейсерного реагента формулы (VI)

где

SP² представляет собой С_1-50 алкил, С_2-50 алкенил или С_2-50 алкинил, где С_1-50 алкил, C₂₅₀ алкенил и С_2-50 алкинил необязательно прерывается одной или более группами, выбранными из группы, состоящей из -NH-, N(C₁₄ алкил)-, -O-, -S, -C(O)-, C(O)NH, -C(O)N(C_1-4 алкил)-, O-С(O)-, -S(O)-, -S(O)₂-, 4-7-членного гетероциклила, фенила и нафтила;

A^x1 представляет собой функциональную группу для реакции с группой A^x0 гидрогеля; и

A^x2 представляет собой функциональную группу;

с группой A^x0 гидрогеля со стадии (А); и

(С) реакции гидрогеля со стадии (А) или стадии (В) с реагентом формулы (VII)

где

A^x3 представляет собой функциональную группу; и

Z представляет собой инертную составляющую, имеющую молекулярную массу в интервале от 10 Да до 1000 кДа;

так что самое большее 99 мол.% A^x0 или A^x2 реагирует с A^x3.

Предпочтительно, A^x0 со стадии (А) выбирается из группы, состоящей из мелеимида, амина (-NH₂ или -NH-), гидроксила (ОН), карбоксила (-СООН) и активированного карбоксила (-COY¹, где Y¹ выбирается из формул (f-i) - (f-vi):

где

пунктирные линии показывают место присоединения к оставшейся части молекулы,

b представляет собой 1, 2, 3 или 4

X^H представляет собой Cl, Br, I или F.

Более предпочтительно A^x0 со стадии (А) представляет собой амин или малеимид.

Понятно, что функциональные группы A^x0 со стадии (А) соответствуют аминам по меньшей мере одного реагента основной цепи, если гидрогель VEGF-нейтрализующего пролекарства получают способом, как описано далее.

В предпочтительном варианте выполнения настоящего изобретения A^x0 со стадии (А) представляет собой амин, и A^x1 со стадии (В) представляет собой ClSO₂-, R¹(C=O)-, I-, Br-, Cl-, SCN-, CN-, O=C=N-, Y¹-(CO)-, Y¹(C=O)NH-, или Y¹-(С=O)-O-,

где

R¹ представляет собой Н, C_1-6 алкил, С_2-6 алкенил, С_2-6 алкинил, С_3-8 циклоалкил, 4-7-членный гетероциклил, 8-11-членный гетеробициклил, фенил, нафтил, инденил, инданил, или тетралинил; и

Y¹ выбирается из формул (f-i) - (f-vi):

где

пунктирные линии показывают присоединение к остальной части молекулы,

b равно 1, 2, 3 или 4,

X^H представляет собой Cl, Br, I, или F.

В другом предпочтительном варианте выполнения настоящего изобретения A^x0 со стадии (А) представляет собой гидроксильную группу (-ОН), и A^x1 со стадии (В) представляет собой O=C=N-, I-, Br-, SCN-, или Y¹(C=O)NH-,

где Y¹ выбирается из формул (f-i) - (f-vi):

где

пунктирные линии показывают присоединение к остальной части молекулы,

b равно 1, 2, 3 или 4,

X^H представляет собой Cl, Br, I, или F.

В другом предпочтительном варианте выполнения настоящего изобретения A^x0 со стадии (А) представляет собой карбоновую кислоту (-(С=O)ОН), и A^x1 со стадии (В) представляет собой первичный амин или вторичный амин.

В другом предпочтительном варианте выполнения настоящего изобретения A^x0 со стадии (А) представляет собой малеимид, и A^x1 со стадии (В) представляет собой тиол.

Более предпочтительно, A^x0 со стадии (А) представляет собой амин, A^x1 со стадии (В) представляет собой Y¹-(C=O)-, Y¹(C=O)NH, или Y¹(C=O)O-, и наиболее предпочтительно A^x0 со стадии (А) представляет собой амин, и A^x1 со стадии (В) представляет собой Y¹-(C=O)-.

A^x1 со стадии (В) необязательно может присутствовать в защищенной форме.

Подходящие активирующие реагенты для получения активированной карбоновой кислоты представляют собой, например, N,N'-дициклогексил-карбодиимид (DCC), 1-этил-3-карбодиимид (EDC), бензотриазол-1-ил-окситрипирролидинфосфония гексафторфосфат (PyBOP), бромтрипирролидинфосфония гексафторфосфат (PyBrOP), 1-циано-2-этокси-2-оксоэтилиденаминоокси)диметиламино-морфолино-карбения гексафторфосфат (COMU), 1-гидроксибензотриазол (НОВТ), 1-гидрокси-7-азабензотриазол (НОАТ), O-(6-хлорбензотриазол-1-ил)-N,N,N',N'-тетраметилурония гексафторфосфат (HCTU), 1-Н-бензотриазолий (HBTU), (O-(7-азабензотриазол-1-ил)-N,N,N',N'-тетраметилурония гексафторфосфат (HATU), и O-(бензотриазол-1-ил)-N,N,N',N'-тетраметилурония тетрафторборат (TBTU). Эти реагенты являются коммерчески доступными и хорошо известны специалистам в данной области техники.

Предпочтительно, A^x2 выбирается из группы, состоящей из малеимида, SH, NH₂, SeH, N₃, С≡СН, CR¹=CR^1aR^1b, ОН, (CH=X)-R¹, (C=O)-S-R¹, (C-O)H, NH-NH₂, O-NH₂, Ar-X⁰, Ar-Sb(R¹)(R^1a)(R^1b), Ar-B(OH)(OH), Br, I, Y¹-(C=O)-, Y¹(C=O)NH-, Y¹(C=O)O-,

,

и ; с необязательными защитными группами;

где

пунктирные линии показывают присоединение к SP²;

Х представляет собой О, S, или NH,

Х⁰ представляет собой -ОН, -NR¹R^1a, -SH, или -SeH,

X^H представляет собой Cl, Br, I или F;

Ar представляет собой фенил, нафтил, инденил, инданил, или тетралинил;

R¹, R^1a, R^1b каждый независимо друг от друга представляет собой Н, C_1-6 алкил, С_2-6 алкенил, С_2-6 алкинил, С_3-8 циклоалкил, 4-7-членный гетероциклил, 8-11-членный гетеробициклил, фенил, нафтил, инденил, инданил, или тетралинил; и

Y¹ выбирается из формул (f-i) - (f-vi):

где

пунктирные линии показывают присоединение к остальной части молекулы,

b равно 1, 2, 3 или 4,

X^H представляет собой Cl, Br, I, или F.

Более предпочтительно, A^x2 со стадии (В) представляет собой -NH₂, малеимид или тиол, и наиболее предпочтительно A^x2 со стадии (В) представляет собой малеимид. В равной степени предпочтительно, A^x2 со стадии (В) представляет собой тиол.

A^x2 со стадии (В) может необязательно присутствовать в защищенной форме.

Если гидрогель со стадии (А) ковалентно конъюгирован со спейсерной составляющей, полученный конъюгат гидрогель-спейсерная составляющая имеет формулу (VIII):

где

пунктирная линия показывает присоединение к гидрогелю со стадии (А);

A^y1 представляет собой связь, образованную между A^x0 и A^x1; и

SP² и A^x2 применяются как в формуле (VI).

Предпочтительно, A^y1 формулы (VIII) представляет собой стабильную связь.

Предпочтительно, A^y1 формулы (VIII) выбирается из группы, состоящей из

, и .

где.

пунктирные линии со звездочками показывают присоединение к гидрогелю; и

пунктирные линии без звездочек показывают присоединение к SP².

Подходящие условия реакции описаны в части «Примеры» и известны специалистам в данной области техники.

Стадия (В) способа осуществляется в присутствии основания. Подходящие основания включают стандартные неорганические или органические основания. Они предпочтительно включают гидриды, гидроксиды, амиды, алкоксиды, ацетаты, карбонаты или бикарбонаты щелочноземельных или щелочных металлов, такие как, например, гидрид натрия, амид натрия, метоксид натрия, этоксид натрия, трет.-бутоксид натрия, гидроксид натрия, гидроксид калия, гидроксид аммония, ацетат натрия, ацетат калия, ацетат кальция, ацетат аммония, карбонат натрия, карбонат калия, бикарбонат калия, бикарбонат натрия или карбонат аммония, и третичные амины, такие как триметиламин, триэтиламин, трибутиламин, N,N-диметиланилин, N,N-диметилбензиламин, пиридин, N-метилпиперидин, N-метилморфолин, N,N-диметиламинопиридин, диазабициклооктан (DABCO), диазабициклононен (DBN), N,N-диизопропилэтиламин (DIPEA), диазабициклоундецен (DBU) или коллидин.

Стадия (В) способа осуществляется в присутствии растворителя. Подходящие растворители для осуществления стадии (В) способа согласно изобретению включают органические растворители. Они предпочтительно включают воду и алифатические, алициклические или ароматические углеводороды, такие как, например, петролейный эфир, гексан, гептан, циклогексан, метилциклогексан, бензол, толуол, ксилол или декалин; галогенированные углеводороды, такие как, например, хлорбензол, дихлорбензол, дихлорметан, хлороформ, четыреххлористый углерод, дихлорэтан или трихлорэтан; спирты, такие как метанол, этанол, н- или изо-пропанол, н-, изо-, втор- или трет-бутанол, этандиол, пропан-1,2-диол, этоксиэтанол, метоксиэтанол, диэтиленгликоля монометиловый простой эфир, диметиловый простой эфир, диэтиленгликоль; ацетонитрил, N-метил-2-пирролидон (NMP), диметилформамид (DMF), диметилсульфоксид (DMSO), N,N-диметилацетамид, нитрометан, нитробензол, гексаметилфосфорамид (НМРТ), 1,3-диметил-2-имидазолидинон (DMI), 1,3-диметил-3,4,5,6-тетрагидро-2(1Н)-пиримидинон (DMPU), этилацетат, ацетон, бутанон; сложные эфиры, такие как диэтиловый простой эфир, диизопропиловый простой эфир, метил-трет-бутиловый простой эфир, метил-трет-амиловый простой эфир, диоксан, тетрагидрофуран, 1,2-диметоксиэтан, 1,2-диэтоксиэтан или анизол; или их смеси. Предпочтительно, растворитель выбирается из воды, ацетонитрила или N-метил-2-пирролидона.

Предпочтительно, A^x3 со стадии (С) выбирается из группы, состоящей из -SH, -NH₂, -SeH, -малеимида, С≡СН, -N₃, -CR¹=CR^1aR^1b, -(C=X)-R¹, -ОН, -(C=O)-S-R¹, -NH-NH₂, -O-NH₂, ArSn(R¹)(R^1a)(R^1b), -Ar-B(OH)(OH), -Ar-X⁰,

где

пунктирные линии показывают присоединение к Z;

Х представляет собой О, S, или NH,

X⁰ представляет собой -ОН, -NR¹R^1a, -SH, или -SeH;

R¹, R^1a, R^1b каждый независимо друг от друга представляет собой Н, C_1-6 алкил, C_1-6 алкенил, С_2-6 алкинил, С₃₈ циклоалкил, 4-7-членный гетероциклил, 8-11-членный гетеробициклил, фенил, нафтил, инденил, инданил, или тетралинил; и

Ar представляет собой фенил, нафтил, инденил, инданил, или тетралинил.

Y¹ представляет собой активированную карбоновую кислоту, активированный карбонат или активированный карбамат, предпочтительно Y¹ выбирается из формул (f-i) - (f-vi):

где

пунктирные линии показывают присоединение к остальной части молекулы,

b равно 1, 2, 3 или 4,

X^H представляет собой Cl, Br, I, или F

В предпочтительном варианте выполнения настоящего изобретения, Y¹ выбирается из формул (f-i) - (f-vi):

где

пунктирные линии, b и X^H применяются, как указано выше.

More предпочтительно, A^x3 со стадии (С) представляет собой -SH или -малеимид, и наиболее предпочтительно A^x3 со стадии (С) представляет собой -SH.

В другом предпочтительном варианте выполнения настоящего изобретения A^x3 имеет формулу (aI)

где

пунктирные линии показывают присоединение к Z формулы (VII);

PG⁰ представляет собой сера-активирующую составляющую; и

S представляет собой серу.

Предпочтительно, PG⁰ формулы (aI) выбирается из группы, состоящей из

где

пунктирные линии показывают присоединение к сере формулы (aI);

Ar представляет собой ароматическую составляющую, которая необязательно имеет заместители;

R⁰¹, R⁰², R⁰³, R⁰⁴ независимо друг от друга представляют собой химическую связь или представляют собой С_1-50 алкил; С_2-50 алкенил; или C_2-50 алкинил, где C_1-50 алкил; C_2-50 алкенил; и С_2-50 алкинил необязательно замещены одной или более группами R³, которые являются одинаковыми или различными, и где C_1-50 алкил; C_2-50 алкенил; и C_2-50 алкинил необязательно прерываются одной или более группами, выбранными из группы, состоящей из -Q-, -С(O)O-; -O-; -С(O)-; -C(O)N(R⁴)-; S(O)₂N(R⁴)-; S(O)N(R⁴)-; -S(O)₂-; -S(O)-; -N(R⁴)S(O)₂N(R^4a)-; -S-; N(R⁴)-; OC(O)R⁴; -N(R⁴)C(O)-; -N(R⁴)S(O)₂-; -N(R⁴)S(O)-; N(R⁴)C(O)O-; N(R⁴)C(O)N(R^4a)-; и -OC(O)N(R⁴R^4a);

Q выбирается из группы, состоящей из фенила; нафтила; инденила; инданила; тетралинила; С_3-10 циклоалкила; 4-7-членного гетероциклила; и 8-11-членного гетеробициклила, где Т необязательно замещен одной или более группами R³, которые являются одинаковыми или различными;

R³ представляет собой галоген; CN; оксо (=O); COOR⁵; OR⁵; C(O)R⁵; C(O)N(R⁵R^5a); S(O)₂N(R⁵R^5a); S(O)N(R⁵R^5a); S(O)₂R⁵; S(O)R⁵; N(R⁵)S(O)₂N(R^5aR^5b); SR⁵; N(R⁵R^5a); NO₂; OC(O)R⁵; N(R⁵)C(O)R^5a; N(R⁵)S(O)R^5a; N(R⁵)S(O)R^5a; N(R⁵)C(O)OR^5a; N(R⁵)C(O)N(R^5aR^5b); OC(O)N(R⁵R^5a); или С_1-6 алкил, где C_1-6 алкил необязательно замещен одной или более группами галоген, которые являются одинаковыми или различными; и

R⁴, R^4a, R⁵, R^5a, R^5b независимо выбираются из группы, состоящей из Н; или C_1-6 алкила, где C_1-6 алкил необязательно замещен одной или более группами галоген, которые являются одинаковыми или различными.

Предпочтительно, R⁰¹, R⁰³ и R⁰⁴ каждый независимо друг от друга представляет собой С_1-6 алкил.

Предпочтительно, R⁰² выбирается из Н и C_1-6 алкила.

Предпочтительно, Ar выбирается из группы, состоящей из

где

пунктирные линии показывают присоединение к остатку PG⁰ формулы (aI);

W независимо друг от друга представляют собой О, S, или N;

W' представляет собой N; и

где Ar необязательно замещен одним или более заместителями, независимо выбранными из группы, состоящей из NO₂, Cl и F.

Более предпочтительно, PG⁰ формулы (aI) выбирается из группы, состоящей из

где

пунктирные линии показывают присоединение к сере формулы (aI); и

Ar, R⁰¹, R⁰², R⁰³ и R⁰⁴ применяются, как показано выше.

Более предпочтительно, PG⁰ формулы (aI) представляет собой

где

пунктирные линии показывают присоединение к сере формулы (aI).

A^x3 со стадии (С) может необязательно присутствовать в защищенной форме.

Предпочтительные комбинации A^x2 со стадии (В) и A^x3 со стадии (С) приводятся далее:

где

X представляет собой О, S, или NH;

Х⁰ представляет собой -ОН, -NR¹R^1a, -SH, или -SeH;

R¹, R^1a, R^1b независимо друг от друга выбираются из группы, состоящей из Н, С_1-6 алкила, C_2-6 алкенила, C_2-6 алкинила, С_3-8 циклоалкила, 4-7-членного гетероциклила, 8-11-членного гетеробициклила, фенила, нафтила, инденила, инданила и тетралинила; и

Ar представляет собой фенил, нафтил, инденил, инданил, или тетралинил.

В другом предпочтительном варианте выполнения настоящего изобретения A^x2 представляет собой -SH, и A^x3 имеет формулу (aI), где PG⁰ имеет формулу (i), (ii), (iii), (iv), (v), (vi) или (viii). Более предпочтительно, PG⁰ формулы (aI) имеет формулу (i), (ii), (iii), (iv) или (v), и даже более предпочтительно, PG⁰ формулы (aI) имеет формулу (i). Наиболее предпочтительно, PG⁰ формулы (aI) имеет формулу

где

пунктирные линии показывают присоединение к сере формулы (aI).

В одном предпочтительном варианте выполнения настоящего изобретения, A^x2 со стадии (В) представляет собой амин, и A^x3 со стадии (С) представляет собой Y¹-(С=O)-, Y¹(С=O)NH-, или Y¹(С=O)O-, и наиболее предпочтительно A^x2 со стадии (В) представляет собой амин, и A^x3 со стадии (С) представляет собой Y¹-(C=O)-.

В другом предпочтительном варианте выполнения настоящего изобретения A^x2 со стадии (В) представляет собой малеимид, и A^x3 со стадии (С) представляет собой -SH.

В одном предпочтительном варианте выполнения настоящего изобретения необязательная стадия (В) пропускается, A^x0 со стадии (А) представляет собой амин, и A^x3 со стадии (С) представляет собой ClSO₂-, R¹(C=O)-, I-, Br-, Cl-, SCN-, CN-, O=C=N-, Y¹(С=O)-, Y¹-(C=O)NH-, или Y¹-(С=O)-O-,

где

R¹ представляет собой Н, C_1-6 алкил, C_2-6 алкенил, C_2-6 алкинил, С_3-8 циклоалкил, 4-7-членный гетероциклил, 8-11-членный гетеробициклил, фенил, нафтил, инденил, инданил, или тетралинил; и

Y¹ выбирается из формул (f-i) - (f-vi):

где

пунктирные линии показывают присоединение к остальной части молекулы,

b равно 1, 2, 3 или 4,

X^H представляет собой Cl, Br, I, или F.

В другом предпочтительном варианте выполнения настоящего изобретения необязательная стадия (В) пропускается. A^x0 со стадии (А) представляет собой гидроксильную группу (ОН), и A^x3 со стадии (С) представляет собой O=C=N-, I-, Br-, SCN-, или Y¹(С=O)NH-,

где Y¹ выбирается из формул (f-i) - (f-vi):

где

пунктирные линии показывают присоединение к остальной части молекулы,

b равно 1, 2, 3 или 4,

X^H представляет собой Cl, Br, I, или F.

В одном предпочтительном варианте выполнения настоящего изобретения необязательная стадия (В) пропускается. A^x0 со стадии (А) представляет собой карбоновую кислоту ((С=O)ОН), и A^x3 со стадии (С) представляет собой первичный амин или вторичный амин.

В одном предпочтительном варианте выполнения настоящего изобретения необязательная стадия (В) пропускается, A^x0 со стадии (А) представляет собой амин, и A^x3 со стадии (С) представляет собой Y¹-(С=O)-, Y¹(C=O)NH-, или Y¹(С=O)O:

В одном предпочтительном варианте выполнения настоящего изобретения необязательная стадия (В) пропускается, A^x0 со стадии (А) представляет собой малеимид, и A^x3 со стадии (С) представляет собой тиол.

В предпочтительном варианте выполнения настоящего изобретения необязательная стадия (В) пропускается, A^x0 со стадии (А) представляет собой амин, и A^x3 со стадии (С) представляет собой Y¹-(C=O)-.

В другом предпочтительном варианте выполнения настоящего изобретения необязательная стадия (b) пропускается. A^x0 представляет собой -SH, и A^x3 имеет формулу (aI), где PG⁰ имеет формулу (i), (ii), (iii), (iv), (v), (vi) или (viii). Более предпочтительно, PG⁰ формулы (aI) имеет формулу (i), (ii), (iii), (iv) или (v), и даже более предпочтительно, PG⁰ формулы (aI) имеет формулу (i). Наиболее предпочтительно, PG⁰ формулы (aI) имеет формулу

где

пунктирные линии показывают присоединение к сере формулы (aI).

Гидрогель, полученный на стадии (С), имеет структурные формулы (IXa) или (IXb):

где

пунктирная линия показывает присоединение к гидрогелю со стадии (А);

A^y0 представляет собой связь, образованную между A^x0 и A^x3;

A^y1 применяется, как в формуле (VIII);

A^y2 представляет собой связь, образованную между A^x2 и A^x3;

SP² применяется, как в формуле (VI); и

Z применяется, как в формуле (VII).

Предпочтительно, A^y0 со стадии (А) и A^y2 формулы (IXb) выбираются из группы, состоящей из амида, карбамата,

и ;

где

пунктирные линии, помеченные звездочками, показывают присоединение к гидрогелю или SP², соответственно; и

пунктирные линии без звездочек показывают присоединение к Z формулы (VII).

В одном варианте выполнения настоящего изобретения, Z со стадии (С) выбирается из группы, включающей C_1-50 алкил, C_2-50 алкенил, C_2-50 алкинил, С_3-10 циклоалкил, 4-7-членный гетероциклил, 8-11-членный гетеробициклил, фенил; нафтил; инденил; инданил; и тетралинил; где C₁₅₀ алкил, C_2-50 алкенил, С_2-50 алкинил, С_3-10 циклоалкил, 4-7-членный гетероциклил, 8-11-членный гетеробициклил, фенил; нафтил; инденил; инданил; и тетралинил необязательно замещены одним или более заместителями R¹⁰, которые являются одинаковыми или различными, и где C_1-50 алкил; C_2-50 алкенил; и C_2-50 алкинил необязательно прерываются одной или более группами, выбранными из группы, включающей Т, -С(O)O-; -O-; -С(O)-; C(O)N(R⁹)-; S(O)₂N(R⁹)-; -S(O)N(R⁹)-; -S(O)₂-; -S(O)-; -N(R⁹)S(O)₂N(R^9a)-; -S-; N(R⁹)-; OC(O)R⁹; -N(R⁹)C(O)-; -N(R⁹)S(O)₂-; -N(R⁹)S(О)-; -N(R⁹)C(O)O-; N(R⁹)C(O)N(R^9a)-; и -OC(O)N(R⁹R^9a);

где

R⁹, R^9a независимо выбираются из группы, состоящей из Н; Т; и С_1-50 алкила; C_2-50 алкенила; или C_2-50 алкинила, где Т; С_1-50 алкил; C_2-50 алкенил; и C_2-50 алкинил необязательно замещены одной или более группами R¹⁰, которые являются одинаковыми или различными, и где C_1-50 алкил; C_2-50 алкенил; и C_2-50 алкинил необязательно прерываются одной или более группами, выбранными из группы, состоящей из Т, -С(O)O-; -O-; -C(O)-;-C(O)N(R¹¹)-; S(O)₂N(R¹¹)-; -S(O)N(R¹¹)-; -S(O)₂-; -S(O)-; N(R¹¹)S(O)₂N(R^11a)-; -S-; -N(R¹¹)-; -OC(O)R¹¹; -N(R¹¹)C(O)-; -N(R¹¹)S(O)₂-; -N(R¹¹)S(O)-; -N(R¹¹)C(O)O-; N(R¹¹)C(O)N(R^11a)-; и -OC(O)N(R¹¹R^11a);

Т выбирается из группы, состоящей из фенила; нафтила; инденила; инданила; тетралинила; С_3-10 циклоалкила; 4-7 членного гетероциклила; или 8-11-членного гетеробициклила, где Т необязательно замещен одной или более группами R¹⁰, которые являются одинаковыми или различными;

R¹⁰ представляет собой галоген; CN; оксо (=O); COOR¹²; OR¹²; C(O)R¹²; С(О)N(R¹²R^12a); S(O)₂N(R¹²R^12a); S(O)N(R¹²R^12a); S(O)₂R¹²; S(O)R¹²; N(R¹²)S(O)₂N(R^12aR^12b); SR¹²; N(R¹²R^12a); NO₂; OC(O)R¹²; N(R¹²)C(O)R^12a; N(R¹²)S(O)₂R^12a; N(R¹²)S(O)R^12a; N(R¹²)C(O)OR^12a; N(R¹²)C(O)N(R^12aR^12b); OC(O)N(R¹²R^12a); или C_1-6 алкил, где C_1-6 алкил необязательно замещен одной или более группами галогена, которые являются одинаковыми или различными;

R¹¹, R^11a, R¹², R^12a, R^12b каждый независимо друг от друга выбирается из группы, состоящей из Н; или C_1-6 алкила, где C_1-6 алкил необязательно замещен одной или более группами галогена, которые являются одинаковыми или различными.

В другом варианте выполнения настоящего изобретения Z со стадии (С) представляет собой инертный полимер, имеющий молекулярную массу в интервале от 0.5 кДа до 1000 кДа, предпочтительно имеющий молекулярную массу в интервале от 0.5 до 500 кДа, более предпочтительно имеющий молекулярную массу в интервале от 0.75 до 250 кДа, даже более предпочтительно в интервале от 1 до 100 кДа, даже более предпочтительно в интервале от 5 до 60 кДа, даже более предпочтительно от 10 до 50, и наиболее предпочтительно Z имеет молекулярную массу 40 кДа.

Предпочтительно, Z со стадии (С) представляет собой инертный полимер, выбранный из группы, включающей 2-метакрилоил-оксиэтил фосфоил холины, поли(акриловые кислоты), поли(акрилаты), поли(акриламиды), поли(акрилокси) полимеры, поли(амиды), поли(амидоамины), поли(аминокислоты), поли(ангидриды), поли(аспартамиды), поли(масляные кислоты), поли(гликолевые кислоты), полибутилен терефталаты, поли(капролактоны), поли(карбонаты), поли(цианоакрилаты), поли(диметилакриламиды), поли(сложные эфиры), поли(этилены), поли(алкиленгликоли), поли(этиленоксиды), поли(этилфосфаты), поли(этилоксазолины), поли(гликолиевые кислоты), поли(гидроксиэтилакрилаты), поли(гидроксиэтил-оксазолины), поли(гидроксиметакрилаты), поли(гидроксипропилметакриламиды), поли(гидроксипропилметакрилаты), поли(гидроксипропилоксазолины), поли(иминокарбонаты), поли(молочные кислоты), со(поли)меры молочные и гликолиевых кислот, поли(метакриламиды), поли(метакрилаты), поли(метилоксазолины), поли(органофосфазены), поли(сложные ортоэфиры), поли(оксазолины), поли(пропиленгликоли), поли(силоксаны), поли(уретаны), поли(виниловые спирты), поли(виниламин), поли(винилметиловые простые эфиры), поли(винилпирролидоны), силиконы, целлюлозы, карбометилцеллюлозы, гидроксипропилметилцеллюлозы, хитины, хитозаны, декстраны, декстрины, желатины, гиалуроновые кислоты и производные, функционализированные гиалуроновые кислоты, маннаны, пектины, рамногалактуронаны, крахмалы, гидроксиалкилкрахмалы, гидроксиэтилкрахмалы и другие полимеры на основе углеводов, ксиланы, и их сополимеры.

В предпочтительном варианте выполнения настоящего изобретения Z со стадии (С) представляет собой инертный линейный или разветвленный полимер на основе ПЭГ, содержащий по меньшей мере 70% ПЭГ, или полимер на основе гиалуроновой кислоты, содержащий по меньшей мере 70% гиалуроновой кислоты. Более предпочтительно, Z со стадии (С) представляет собой инертный линейный или разветвленный полимер на основе ПЭГ, содержащий по меньшей мере 70% ПЭГ, даже более предпочтительно содержащий по меньшей мере 80% ПЭГ, и наиболее предпочтительно содержащий по меньшей мере 90% ПЭГ.

В другом предпочтительном варианте выполнения настоящего изобретения Z со стадии (С) представляет собой цвиттерионный полимер. Предпочтительно, такой цвиттерионный полимер содержит поли(аминокислоты) и/или пли(акрилаты). Применяемые в настоящей заявке термины "цвиттерион" и "цвиттерионный" относятся к нейтральной молекуле или составляющей с положительными и отрицательными зарядами при различных положениях внутри этой молекулы или составляющей одновременно.

Согласно Zhang et al. (Nature Biotechnology, 2013, volume 31, number 6, pages 553-557) гидрогели, изготовленные из цвиттерионных полимеров выдерживают реакцию на инородное тело.

Стадия (С) содержит реакцию гидрогеля со стадии (А) или стадии (В) с реагентом формулы (VII) таким образом, что не более 99 мол.% A^x0 или A^x2 реагирует с A^x3. Это может быть достигнуто, например, путем реакции самое большое 0.99 химических эквивалентов реагента формулы (VII) относительно A^x0 или A^x2 с гидрогелем со стадии (А) или (В).

Для того чтобы предотвратить реакцию более 0.99 химических эквивалентов, реагент формулы (VII) может применяться в количестве самое большее 0.99 химических эквивалентов относительно A^x0 или A^x2 или, альтернативно, скорость реакции контролируется, и реакция прерывается когда самое большее 0.99 химических эквивалентов относительно A^x0 или A^x2 прореагировало, особенно когда применяется более 0.99 химических эквивалентов. Понимается, что также благодаря физическим ограничениям, таким как стерические затруднения, гидрофобные свойства или другие характеристики инертной составляющей Z, не более 0.99 химических эквивалентов способны реагировать с A^x0 или A^x2, даже если более химических эквивалентов добавляется в реакцию.

Предпочтительно, стадия (С) содержит реакцию гидрогеля со стадии (А) или со стадии (В) с реагентом формулы (VII) таким образом, что не более 80 мол.% A^x0 или A^x2 реагирует с A^x3, даже более предпочтительно, так что не более 60 мол.% A^x0 или A^x2 реагирует с A^x3, даже более предпочтительно, так что не более 40 мол.% A^x0 или A^x2 реагирует с A^x3, даже более предпочтительно, так что не более 20 мол.% A^x0 или A^x2 реагирует с A^x3, и наиболее предпочтительно, так что не более 15 мол.% A^x0 или A^x2 реагирует с A^x3.

Это также может быть достигнуто, например, путем реакции самое большое 0.8, 0.6, 0.4, 0.2 или 0.15 химических эквивалентов реагента формулы (VII) относительно A^x0 или A^x2 с гидрогелем со стадии (А) или (В), соответственно.

Способы предотвращения реакции большего количества химических эквивалентов описаны выше.

На основе измерения количества вещества A^x0 со стадии (А) и после стадии (С) количество вещества прореагировавшего A^x0 может быть вычислено по уравнению (I):

где

A^x0₁ представляет собой количество вещества функциональных групп A^x0 гидрогеля со стадии (А) в ммоль/г;

A^x0₂ представляет собой количество вещества функциональных групп A^x0 гидрогеля после стадии (С) в ммоль/г; и

MW_Z означает молекулярную массу Z в ммоль/г.

Если необязательный спейсерный реагент был конъюгирован с гидрогелем со стадии (А), вычисление числа прореагировавших A^x2 осуществляется соответственно.

Процент прореагировавших функциональных групп A^x0 относительно функциональных групп A^x0 гидрогеля со стадии (А) вычисляется согласно уравнению (2):

где переменные применяются, как указано выше.

В одном варианте выполнения настоящего изобретения Z со стадии (С) конъюгируется с поверхностью гидрогеля. Это может быть достигнуто путем выбора размера и структуры реагента A^x3-Z так, что он является слишком большим для входа в поры или сеть гидрогеля. Соответственно, минимальный размер A^x3-Z зависит от свойств гидрогеля. Специалисту в данной области техники известны способы как протестировать способен ли реагент A^x3-Z входить в гидрогель, с применением стандартных экспериментов, например, путем применения эксклюзионной хроматографии, например, путем применения эксклюзионной хроматографии с гидрогелем в качестве стационарной фазы.

Составляющая линкера пролекарства, содержащаяся в VEGF-нейтрализующем пролекарстве, может иметь структуру любой составляющей линкера пролекарства, известной в данной области техники.

Предпочтительный линкер пролекарства описывается в и может быть получен как описывается в WO 2005/099768 А2. Соответственно, предпочтительный реагент обратимый линкер пролекарства-VEGF-нейтрализующая биологически активная составляющая имеет структуру формулы (А) или (В):

где

пунктирные линии показывают присоединение к остатку пролекарства, т.е. составляющей носителя или к необязательной спейсерной составляющей;

D представляет собой VEGF-нейтрализующую биологически активную составляющую, которая соединена с остальной частью составляющей через аминную группу соответствующего VEGF-нейтрализующего лекарственного средства;

Х представляет собой спейсерную составляющую, такую как R₅-Y₆,

Y₁, Y₂ независимо представляют собой О, S или NR₆,

Y₃, Y₅ независимо представляют собой О или S,

Y₄ представляет собой О, NR₆ или C(R₇)(R₈)-,

Y₆ представляет собой О, S, NR₆, сукцинимид, малеимид, насыщенные углерод-углеродные связи или любой гетероатом, содержащую свободную электронную пару, или отсутствует,

R₂, R₃ независимо друг от друга выбираются из водорода, замещенного или незамещенного линейного, разветвленного или циклического алкила или гетероалкила, арилов, замещенных арилов, замещенного или незамещенного гетероарила, циано, нитро, галоген, карбокси, карбоксилалкила, алкилакарбонила или карбоксамидоалкила;

R4 выбирается из водорода, замещенного или незамещенного линейного, разветвленного или циклического алкила или гетероалкила, арила, замещенного арила, замещенного или незамещенного гетероарила, замещенного или незамещенного линейного, разветвленного или циклического алкокси, замещенного или незамещенного линейного, разветвленного или циклического гетероакрилокси, арилаокси или гетероарилаокси, циано, галогена,

R₅ выбирается из замещенного или незамещенного линейного, разветвленного или циклического алкила или гетероалкила, арилов, замещенных арилов, замещенных или незамещенных гетероарилов,

R₆ выбирается из водорода, замещенного или незамещенного линейного, разветвленного или циклического алкила или гетероалкила, арилов, замещенных или незамещенных гетероарилов,

R₇, R₈ независимо выбираются из водорода, замещенного или незамещенного линейного, разветвленного или циклического алкила или гетероалкила, арилов, замещенных арилов, замещенных или незамещенных гетероарилов, карбоксиалкила, алкилакарбонил, карбоксамидоалкила, циано или галоген,

W выбирается из замещенного или незамещенного линейного, разветвленного или циклического алкила, арилов, замещенных арилов, замещенного или незамещенного линейного, разветвленного или циклического гетероалкила, замещенных или незамещенных гетероарилов,

Nu представляет собой нуклеофил,

n равно нулю или целому положительному числу, и

Ar представляет собой многозамещенный ароматический углеводород или многозамещенный ароматический гетероцикл.

Предпочтительно, R₂, R₃, R₄, R₅, R₆, R₇ и R₈ формулы (А) и (В) независимо выбираются из Н, C_1-6 алкила, C_2-6 алкенила и С_2-6 алкинила.

Предпочтительно, Y₆ формулы (А) и (В) представляет собой C_1-20 алкил, C_2-20 алкенил или C_2-20 алкинил.

Предпочтительно, Nu формулы (А) и (В) выбирается из группы нуклеофилов, состоящей из первичных, вторичных и третичных аминогрупп, тиола, карбоновой кислоты, гидроксиламина, гидразина и азот-содержащего гетероарила.

Предпочтительно, W формулы (А) и (В) представляет собой -(CR₉R₁₀)_b-, где R₉ и R₁₀ независимо выбираются из Н, C_1-6 алкила, C_2-6 алкенила и C_2-6 алкинила, и где b равно 1, 2, 3, 4 или 5.

Предпочтительно, n формулы (А) и (В) равно 0, 1 или 2, более предпочтительно, n равно 0 или 1, и наиболее предпочтительно n равно 0.

Предпочтительно, Ar формулы (А) и (В) выбирается из

Другие предпочтительные линкеры пролекарств раскрываются в и могут быть получены как описано в WO 2006/136586 А2. Соответственно, предпочтительная обратимый линкер пролекарства-VEGF-нейтрализующая биологически активная составляющая имеет структуру формулы (С), (D) или (Е):

где

пунктирные линии показывают присоединение к остатку пролекарства, т.е. составляющей носителя или к необязательной спейсерной составляющей;

D представляет собой VEGF-нейтрализующую биологически активную составляющую, которая соединена с остальной частью молекулы через аминную группу соответствующего VEGF-нейтрализующего лекарственного средства, образуя амидную связь;

Х представляет собой спейсерную составляющую, такую как R13-Y1;

Y1 представляет собой О, S, NR₆, сукцинимид, малеимид, насыщенные углерод-углеродные связи или любой гетероатом, содержащий свободную электронную пару, или отсутствует;

R₁₃ выбирается из замещенного или незамещенного линейного, разветвленного или циклического алкила или гетероалкила, арилов, замещенных арилов, замещенных или незамещенных гетероарилов;

R₂ и R₃ независимо выбираются из водорода, ацильных групп или защитных групп для гидроксильных групп;

R₄ - R₁₂ независимо выбираются из водорода, замещенного или незамещенного линейного, разветвленного или циклического алкила или гетероалкила, арилов, замещенных арилов, замещенных или незамещенных гетероарилов, циано, нитро, галогена, карбокси, карбоксамида.

Предпочтительно, R₂, R₃, R₄, R₅, R₆, R₇, R₈, R₉, R₁₀, R₁₁ и R₁₂ формулы (С), (D) и (Е) независимо выбираются из Н, C_1-6 алкила, C_2-6 алкенила и С_2-6 алкинила.

Предпочтительно, в формулах (С), (D) и (Е) Y1 представляет собой С_1-20 алкил, С_2-20 алкенил или С_2-20 алкинил.

Другие предпочтительные линкеры пролекарств раскрываются в и могут быть получены как описано в WO 2009/095479 А2. Соответственно, предпочтительная обратимый линкер пролекарства-VEGF-нейтрализующая биологически активная составляющая имеет структуру формулы (F):

где

пунктирные линии показывают присоединение к остатку пролекарства, т.е. составляющей носителя или к необязательной спейсерной составляющей;

D представляет собой VEGF-нейтрализующую биологически активную составляющую, которая соединяется с остатком молекулы через ароматический амин соответствующего VEGF-нейтрализующего лекарственного средства путем образования амидной связи;

X представляет собой C(R⁴R^4a); N(R⁴); О; C(R⁴R^4a)-C(R⁵R^5a); C(R⁵R^5a)-C(R⁴R^4a); C(R⁴R^4a)-N(R⁶); N(R⁶)-C(R⁴R^4a); C(R⁴R^4a)-O; или O-C(R⁴R^4a);

X¹ представляет собой С; или S(O);

X² представляет собой C(R⁷,R^7a); или C(R⁷,R^7a)-C(R⁸,R^8a);

R¹, R^1a, R², R^2a, R³, R^3a, R⁴, R^4a, R⁵, R^5a, R⁶, R⁷, R^7a, R⁸, R^8a независимо выбираются из группы, состоящей из Н; и С_1-4 алкила;

необязательно, одна или более пар R^1a/R^4a, R^1a/R^5a, R^4a/R^5a, R^4a/R^5a, R^7a/R^8a образуют химическую связь;

необязательно, одна или более пар R¹/R^1a, R²/R^2a, R⁴/R^4a, R⁵/R^5a, R⁷/R^7a, R⁸/R^8a соединяются вместе с атомом, к которому они присоединены, с образованием С_3-7 циклоалкила; или 4-7-членного гетероциклила;

необязательно, одна или более пар R¹/R⁴, R¹/R⁵, R¹/R⁶, R⁴/R⁵, R⁷/R⁸, R²/R³ соединяются вместе с атомом, к которому они присоединены, с образованием кольца А;

необязательно, R³/R^3a соединяются вместе с атомом, к которому они присоединены, с образованием 4-7-членного гетероцикла;

А выбирается из группы, состоящей из фенила; нафтила; инденила; инданила; тетралинила; С_3-10 циклоалкила; 4-7-членного гетероциклила; и 8-11-членного гетеробициклила;

при условии, что один водород из R¹, R^1a, R², R^2a, R³, R^3a, R⁴, R^4a, R⁵, R^5a, R⁶, R⁷, R^7a, R⁸ или R^8a замещен на связь для соединения составляющей формулы (F) с остальной частью VEGF-нейтрализующего пролекарства, т.е. составляющей носителя или с необязательной спейсерной составляющей.

При необходимости, составляющая обратимого линкера пролекарства формулы (F) далее замещена, при условии, что водород при азоте составляющей

не замещен, и что R³ и R^3a каждый независимо друг от друга представляет собой Н или соединены с N через SP³-гибридизованный атом углерода.

Другие предпочтительные линкеры пролекарств раскрываются в и могут быть получены как описано в WO 2011/012721 А1 и WO 2011/012722 А1. Соответственно, предпочтительная составляющая обратимый линкер пролекарства-VEGF-нейтрализующая биологически активная составляющая имеет структуру формулы (G):

где

пунктирные линии показывают присоединение к остатку пролекарства, т.е. составляющей носителя или к необязательной спейсерной составляющей;

D представляет собой VEGF-нейтрализующую биологически активную составляющую, которая соединяется с остатком молекулы через ароматический амин соответствующего VEGF-нейтрализующего лекарственного средства путем образования амидной связи;

X¹ X¹ представляет собой C(R¹R^1a) или циклический фрагмент, выбранный из С_3-8 циклоалкила, 4-7-членного гетероциклила, фенила, нафтила, инденила, инданила, тетралинила или 8-11-членного гетеробициклила,

где

если X¹ представляет собой циклический фрагмент, указанный циклический фрагмент включен в L¹ через два соседних кольцевых атома, и кольцевой атом X¹, который является соседним с атомом углерода амидной связи, также представляет собой атом углерода;

X² представляет собой химическую связь или выбирается из C(R³R^3a), N(R³), О, C(R³R^3a)-C(R⁴R^4a), C(R³R^3a)-N(R⁴), N(R³)-C(R⁴R^4a), C(R³R^3a)-O или О-С(R³R^3a),

где

если X¹ представляет собой циклический фрагмент, X² представляет собой химическую связь, C(R³R^3a), N(R³) или О;

необязательно, если X¹ представляет собой циклический фрагмент, и X² представляет собой С(R³R^3a), порядок X¹ фрагмента и X² фрагмента внутри L¹ может быть изменен, и циклический фрагмент включается в L¹ через два соседних кольцевых атома;

R¹, R³ и R⁴ независимо выбираются из группы, состоящей из Н, С_1-4 алкила и -N(R⁵R^5a);

R^1a, R², R^3a, R^4a и R^5a независимо выбираются из группы, состоящей из Н, и C_1-4 алкила;

R⁵ представляет собой C(O)R⁶;

R⁶ представляет собой C_1-4 алкил;

необязательно, одна из пар R^1a/R^4a, R^3a/R^4a или R^1a/R^3a образует химическую связь;

при условии, что один водород из R¹, R^1a, R², R^2a, R³, R^3a, R⁴, R^4a, R⁵, R^5a или R⁶ замещен на связь для соединения формулы (G) с остальной частью VEGF-нейтрализующего пролекарства, т.е. составляющей носителя или с необязательной спейсерной составляющей.

Другие предпочтительные линкеры пролекарств раскрываются в и могут быть получены как описано в WO 2011/089214 А1. Соответственно, предпочтительный обратимый линкер пролекарства-VEGF-нейтрализующая биологически активная составляющая имеет структуру формулы (Н):

где

пунктирные линии показывают присоединение к остатку пролекарства, т.е. составляющей носителя или к необязательной спейсерной составляющей;

D представляет собой VEGF-нейтрализующую биологически активную составляющую, которая соединяется с остатком молекулы через ароматический гидроксил (-ОН) соответствующего VEGF-нейтрализующего лекарственного средства путем образования карбаматной связи;

R¹ выбирается из группы, включающей С_1-4 алкил; гетероалкил; С_3-7 циклоалкил; и

R², R^2a, R³ и R^3a независимо выбираются из водорода, замещенного или незамещенного линейного, разветвленного или циклического С_1-4 алкила или гетероалкила;

каждый d независимо равен 2, 3 или 4;

при условии, что один водород из R¹, R², R^2a, R³ или R^3a замещен на связь для соединения составляющей формулы (Н) с остальной частью VEGF-нейтрализующего пролекарства, т.е. составляющей носителя или с необязательной спейсерной составляющей.

Другие предпочтительные линкеры пролекарств раскрываются в и могут быть получены как описано в WO 2011/089216 А1. Соответственно, предпочтительный обратимый линкер пролекарства-VEGF-нейтрализующая биологически активная составляющая имеет структуру формулы (J):

где

пунктирные линии показывают присоединение к остатку пролекарства, т.е. составляющей носителя или к необязательной спейсерной составляющей;

D представляет собой VEGF-нейтрализующую биологически активную составляющую, которая соединяется с остатком молекулы через алифатический амин соответствующего лекарственного средства путем образования амидной связи;

X₁ выбирается из О, S или CH-R^1a;

R¹ и R^1a независимо выбираются из Н, ОН, СН₃;

R², R^2a, R⁴ и R^4a независимо выбираются из Н и C_1-4 алкила,

R³ и R^3a независимо выбираются из Н, C_1-4 алкила, и R⁵;

R⁵ выбирается из

где

пунктирные линии показывают присоединение к остальной части молекулы;

при условии, что один водород из R¹, R^1a, R², R^2a, R³, R^3a, R⁴, R^4a и R⁵ замещен на связь для соединения составляющей формулы (J) с остальной частью VEGF-нейтрализующего пролекарства, т.е. составляющей носителя или с необязательной спейсерной составляющей.

Предпочтительно, R³ формулы (J) представляет собой Н, R^3a формулы (J) представляет собой R⁵.

Предпочтительно, один из R⁴/R^4a формулы (J) представляет собой Н.

Необязательно, одна или более пар R³/R^3a, R⁴/R^4a, R³/R⁴ формулы (J) может независимо образовывать один или более циклические фрагменты, выбранные из С_3-8 циклоалкила, 4-7-членного гетероциклила или 8-11-членного гетеробициклила.

Необязательно, R³, R^3a, R⁴ и R^4a формулы (J) замещены C_1-6 алкилом, С_2-6 алкенилом, C_2-6 алкинилом, фенилом, 4-7-членным гетероциклилом или галогеном.

Другие предпочтительные линкеры пролекарств раскрываются в и могут быть получены как описано в WO 2011/089215 А1. Соответственно, предпочтительная обратимый линкер пролекарства-VEGF-нейтрализующая биологически активная составляющая имеет структуру формулы (K):

где

пунктирные линии показывают присоединение к остатку пролекарства, т.е. составляющей носителя или к необязательной спейсерной составляющей;

D представляет собой VEGF-нейтрализующую биологически активную составляющую, которая соединяется с остатком молекулы через ароматический амин соответствующего VEGF-нейтрализующего лекарственного средства путем образования амидной связи;

R¹, R^1a, R², R³, R^3a, R⁴ и R^4a независимо выбираются из Н и С_1-4 алкила;

необязательно, любые два из R¹, R^1a, R², R³, R^3a, R⁴ и R^4a могут независимо образовывать один или более циклические фрагменты, выбранные из С_3-8 циклоалкила, 4-7-членного гетероциклила, фенила, нафтила, инденила, инданила, тетралинила или 8-11-членного гетеробициклила;

необязательно, R¹, R^1a, R², R³, R^3a, R⁴ и R^4a замещены заместителем, выбранным из группы, состоящей из С_1-6 алкила, С_2-6 алкенила, C_2-6 алкинила, С₃₈ циклоалкила, 4-7-членного гетероциклила, фенила, нафтила, инденила, инданила, тетралинила или 8-11-членного гетеробициклила;

при условии, что один водород из R¹, R^1a, R², R³, R^3a, R⁴ и R^4a замещен на связь для соединения составляющей формулы (J) с остальной частью VEGF-нейтрализующего пролекарства, т.е. составляющей носителя или с необязательной спейсерной составляющей.

Другие предпочтительные линкеры пролекарств раскрываются в и могут быть получены как описано в РСТ/ЕР2012/065748. Соответственно, предпочтительный обратимый линкер пролекарства-VEGF-нейтрализующая биологически активная составляющая имеет структуру формулы (L):

,

где

пунктирные линии показывают присоединение к остатку пролекарства, т.е. составляющей носителя или к необязательной спейсерной составляющей;

D представляет собой VEGF-нейтрализующую биологически активную составляющую, которая соединена с остальной частью молекулы через группу карбоновой кислоты (-(С=O)-ОН) соответствующего VEGF-нейтрализующего лекарственного средства путем образования связи на основе сложного эфира карбоновой кислоты;

R¹ выбирается из группы из незамещенного алкила; замещенного алкила; незамещенного фенила; замещенного фенила; незамещенного нафтила; замещенного нафтила; незамещенного инденила; замещенного инденила; незамещенного инданила; замещенного инданила; незамещенного тетралинила; замещенного тетралинила; незамещенного С_3-10 циклоалкила; замещенного С_3-10 циклоалкила; незамещенного 4-7-членного гетероциклила; замещенного 4-7-членного гетероциклила; незамещенного 8-11-членного гетеробициклила; и замещенного 8-11-членного гетеробициклила;

R² выбирается из Н, незамещенного алкила, и замещенного алкила

R³ и R⁴ независимо выбираются из группы, состоящей из Н, незамещенного алкила, и замещенного алкила;

е равно 0 или 1;

необязательно, R¹ и R³ соединены вместе с атомом, к которому они присоединены, с образованием кольца А;

А выбирается из группы, состоящей из С_3-10 циклоалкила; 4-7-членного алифатического гетероциклила; и 8-11-членного алифатического гетеробициклила, где А является незамещенным или замещенным;

Q выбирается из группы, состоящей из С_1-50 алкила, C_2-50 алкенила или С_2-50 алкинила, фрагменты которых необязательно прерываются одной или более группами, выбранными из -NH-, -N(C_1-4 алкила)-, -O-, -S-, -С(O)-, -C(O)NH-, -C(O)N(C_1-4 алкила)-, -О-С(О)-, -S(O)-, -S(O)₂-, 4-7-членного гетероциклила, фенила или нафтила.

Другие предпочтительные линкеры пролекарств раскрываются в и могут быть получены как описано в ЕР 12165 516. Соответственно, предпочтительная обратимый линкер пролекарства-VEGF-нейтрализующая биологически активная составляющая имеет структуру формулы (М):

где

пунктирные линии показывают присоединение к остатку пролекарства, т.е. составляющей носителя или к необязательной спейсерной составляющей;

D представляет собой VEGF-нейтрализующую биологически активную составляющую, которая соединена с остальной частью молекулы через гидроксильную группу соответствующего VEGF-нейтрализующего лекарственного средства путем образования сложноэфирной или карбаматной связи

Y представляет собой -C(R¹)(R^1a)-; или -N(R¹)-;

Х представляет собой -C(R⁴)(R^4a)-; -N(R⁴)-; -O-; -С(R⁴)(R^4a)-C(R⁵)(R^5a)-; -C(R⁴)(R^4a)-N(R⁶)-; N(R⁶)-C(R⁴)(R^4a)-; -C(R⁴)(R^4a)-O-; -O-C(R⁴)(R^4a)-; -C(O)-N(R⁶)-; или N(R⁶)C(О);

X¹ представляет собой ; или ;

X² представляет собой -C(R⁷)(R^7a)-; или -C(R⁷)(R^7a)-C(R⁸)(R^8a)-;

X³ представляет собой =O; =S; или =N-CN;

R¹, R^1a, R², R^2a, R³, R^3a, R⁴, R^4a, R⁵, R^5a, R⁶, R⁷, R^7a, R⁸, R^8a независимо выбираются из группы, состоящей из Н; C_1-6 алкила, С_2-6 алкенила, C_2-6 алкинила, C_1-20 гетероалкила и Y₁-T; и независимо ни от чего, одна или более пар R^1a/R^4a, R^1a/R^5a, R^4a/R^5a, R^7a/R^8a отсутствуют, и соответствующие атомы углерода, к которым они присоединены, образуют цис-двойную связь;

Y¹ представляет собой химическую связь или C_1-6 алкил, C_2-6 алкенил, C_2-6 алкинил;

Т выбирается из группы, состоящей из фенила; нафтила; инденила; инданила; тетралинила; С_3-10 циклоалкила; 4-7-членного гетероциклила; или 8-11-членного гетеробициклила, где Т необязательно замещен одной или более группами R⁹, которые являются одинаковыми или различными;

R⁹ представляет собой галоген; -CN; оксо (=O); -С(O)ОН; -ОН; S(O)₂NH₂; S(O)NH₂; S(O)₂OH; S(O)OH; SH; NH₂; NO₂; C_1-6 алкил или C_1-10 гетероалкил;

необязательно, одна или более из пар R¹/R^1a, R¹/R⁴, R¹/R⁶, R¹/R⁵, R²/R^2a, R²/R³, R⁴/R^4a, R⁴/R⁵, R⁵/R^5a, R⁷/R^7a, R⁷/R⁸, R⁸/R^8a соединяются вместе с атомом, к которому они присоединены, с образованием кольца Т;

необязательно, R³/R^3a соединяются вместе с атомом, к которому они присоединены, с образованием 4-7-членного гетероцикла;

при условии, что один водород из R¹, R^1a, R², R^2a, R³, R^3a, R⁴, R^4a, R⁵, R^5a, R⁶, R⁷, R^7a, R⁸ или R^8a замещен на связь для соединения составляющей формулы (М) с остальной частью VEGF-нейтрализующего пролекарства, т.е. составляющей носителя или с необязательной спейсерной составляющей.

Более предпочтительно, VEGF-нейтрализующее пролекарство содержит составляющая обратимого линкера пролекарства-VEGF-нейтрализующая биологически активная составляющая формулы (F).

Даже более предпочтительно, VEGF-нейтрализующее пролекарство содержит составляющая обратимого линкера пролекарства-VEGF-нейтрализующая биологически активная составляющая формулы (F), и присоединение к оставшейся части пролекарства, т.е. к носителю или к необязательному спейсеру, который соединен с носителем, осуществляется через R⁴ у Х или R³ формулы (F), наиболее предпочтительно через R⁴ формулы (F).

Даже более предпочтительно, VEGF-нейтрализующее пролекарство содержит составляющую формулы (F-i):

где

пунктирные линии показывают присоединение к носителю или необязательной спейсерной составляющей;

R¹, R^1a, R², R^2a, R³, R^3a, X¹, X² и D применяются как в формуле (F);

необязательно, составляющая формулы (F-i) далее замещена, при условии, что водород, отмеченный звездочкой, в формуле (F-i) не замещен заместителем, и что R³ и R^3a каждый независимо друг от друга представляет собой Н или соединены с N через SP³-гибридизированный атом углерода.

Предпочтительно, X¹ формулы (F-i) представляет собой С.

В одном варианте выполнения настоящего изобретения, X² формулы (F-i) представляет собой C(R⁷R^7a).

В другом варианте выполнения настоящего изобретения X² формулы (F-i) представляет собой C(R⁷R^7a)-C(R⁸R^8a).

Предпочтительно, R¹ формулы (F-i) представляет собой Н.

Предпочтительно, R^1a формулы (F-i) представляет собой Н.

Предпочтительно, R¹ и R^1a формулы (F-i) оба представляют собой Н.

Предпочтительно, R² формулы (F-i) представляет собой Н.

Предпочтительно, R^2a формулы (F-i) представляет собой Н.

Предпочтительно, R² и R^2a формулы (F-i) представляют собой Н.

Предпочтительно, R³ формулы (F-i) представляет собой Н или метил, этил или пропил.

Предпочтительно, R^3a формулы (F-i) представляет собой Н или метил, этил или пропил.

В одном предпочтительном варианте выполнения настоящего изобретения R³ и R^3a формулы (F-i) оба представляют собой Н.

В другом предпочтительном варианте выполнения настоящего изобретения R³ формулы (F-i) представляет собой Н, и R^3a формулы (F-i) представляет собой метил.

В другом предпочтительном варианте выполнения настоящего изобретения R³ и R^3a формулы (F-i) оба представляют собой метил.

Предпочтительно, D формулы (F-i) представляет собой ранибизумаб.

Предпочтительно, носитель формулы (F-i) представляет собой гидрогель, более предпочтительно гидрогель на основе ПЭГ.

В предпочтительном варианте выполнения настоящего изобретения VEGF-нейтрализующее пролекарство содержит составляющую формулы (f-ii)

где

пунктирные линии показывают присоединение к носителю;

R¹, R^1a, R², R^2a, R³, R^3a, X² и D применяются, как определено в формуле (F);

R¹⁰ выбираются из Н и C_1-6 алкила;

SP⁰ представляет собой спейсерную составляющую;

и где составляющая формулы (F-ii) необязательно далее замещена, при условии, что водород, отмеченный звездочкой в формуле (F-ii) не замещен заместителем, и что R³ и R^3a каждый независимо друг от друга представляет собой Н или соединены с N через SP³-гибридизированный атом углерода.

В одном варианте выполнения настоящего изобретения, X² формулы (F-ii) представляет собой C(R⁷R^7a).

В другом варианте выполнения настоящего изобретения X² формулы (F-ii) представляет собой С(R⁷R^7a)-С(R⁸R^8a).

Предпочтительно, R¹ формулы (F-ii) представляет собой Н.

Предпочтительно, R^1a формулы (F-ii) представляет собой Н.

Предпочтительно, R¹ и R^1a формулы (F-ii) оба представляют собой Н.

Предпочтительно, R² формулы (F-ii) представляет собой Н.

Предпочтительно, R^2a формулы (F-ii) представляет собой Н.

Предпочтительно, R² и R^2a формулы (F-ii) представляют собой Н.

Предпочтительно, R³ формулы (F-ii) представляет собой Н или метил, этил или пропил.

Предпочтительно, R^3a формулы (F-ii) представляет собой Н или метил, этил или пропил.

В одном предпочтительном варианте выполнения настоящего изобретения R³ и R^3a формулы (F-ii) оба представляют собой Н.

В другом предпочтительном варианте выполнения настоящего изобретения R³ формулы (F-ii) представляет собой Н и R^3a формулы (F-ii) представляет собой метил.

В другом предпочтительном варианте выполнения настоящего изобретения R³ и R^3a формулы (F-ii) оба представляют собой метил.

В одном варианте выполнения настоящего изобретения R¹⁰ формулы (F-ii) представляет собой Н.

В другом предпочтительном варианте выполнения настоящего изобретения R¹⁰ формулы (F-ii) представляет собой метил, этил, пропил, изопропил, бутил, изобутил или трет.-бутил. Более предпочтительно, R¹⁰ формулы (F-ii) представляет собой метил, этил, пропил или изопропил. Даже более предпочтительно, R¹⁰ формулы (F-ii) представляет собой метил или этил, и наиболее предпочтительно, R¹⁰ формулы (F-ii) представляет собой метил.

Предпочтительно, SP⁰ формулы (F-ii) выбирается из С_1-50 алкила; C_2-50 алкенила; и С_2-50 алкинила, где C_1-50 алкил; C_2-50 алкенил; и C_2-50 алкинил необязательно замещены одним или более заместителями R^a10, которые являются одинаковыми или различными, и где C_1-50 алкил; C_2-50 алкенил; и C_2-50 алкинил необязательно прерываются одной или более группами, выбранными из группы, включающей Т, С(O)O-; -O-; С(O)-; -C(O)N(R^a11)-; -S(O)₂N(R^a11)-; -S(O)N(R^a11)-; -S(O)₂-; -S(O)-; N(R^a11)S(O)₂N(R^a11a)-; S-; -N(R^a11)-; -OC(O)R^a11; -N(R^a11)C(O)-; -N(R^a11)S(O)₂-; N(R^a11)S(О)-; N(R^a11)C(O)O-; N(R^a11)C(O)N(R^a11a)-; и -OC(O)N(R^a11R^a11a);

Т выбирается из группы, включающей фенил; нафтил; инденил; инданил; тетралинил; С_3-10 циклоалкил; 4-7-членный гетероциклил; или 8-11- членный гетеробициклил, где Т необязательно замещен одним или более R^a10, которые являются одинаковыми или различными;

R^a10 представляет собой галоген; CN; оксо (=O); COOR^a12; OR^a12; C(O)R^a12; C(O)N(R^a12R^a12a); S(O)₂N(R^al2R^al2a); S(O)N(R^a12R^a12a); S(O)₂R^al2; S(O)R^a12; N(R^al2)S(O)₂N(R^al2aR^al2b); SR^a12; N(R^a12R^a12a); NO₂; OC(O)R^a12; N(R^a12)C(O)R^a12a; N(R^al2)S(O)₂R^al2a; N(R^a12)S(O)R^a12a; N(R^al2)C(O)OR^al2a; N(R^al2)C(O)N(R^al2aR^al2b); OC(O)N(R^a12R^a12a); или C_1-6 алкил, где C_1-6 алкил необязательно замещен одним или более галогеном, которые являются одинаковыми или различными;

R^a11, R^a11a, R^a12, R^a12a, R^a12b независимо друг от друга выбираются из группы, включающей Н; или C_1-6 алкил, где C_1-6 алкил необязательно замещен одним или более галогенами, которые являются одинаковыми или различными.

Предпочтительно, SP⁰ формулы (F-ii) представляет собой C_1-20 алкил, где C_1-20 алкил необязательно прерывается одной или более группами, независимо выбранными из -O-; и C(O)N(R^1aa); и где C_1-20 алкильная цепь необязательно замещена одной или более группами, независимо выбранными из ОН; и C(O)N(R^1aaR^1aaa); где R^1aa, R^1aaa независимо выбираются из группы, состоящей из Н; и С_1-4 алкила.

Предпочтительно, SP⁰ формулы (F-ii) имеет молекулярную массу в интервале от 14 г/моль до 750 г/моль.

Предпочтительно, SP⁰ формулы (F-ii) присоединена к носителю через составляющую формулы

; и .

Если SP⁰ формулы (F-ii) имеет такую терминальную группу, более того предпочтительно, что SP⁰ имеет молекулярную массу в интервале от 14 г/моль до 500 г/моль, вычисленную без такой терминальной группы.

Предпочтительно, D формулы (F-ii) представляет собой ранибизумаб.

Предпочтительно, носитель формулы (F-ii) представляет собой гидрогель, более предпочтительно гидрогель на основе ПЭГ.

Даже более предпочтительно, VEGF-нейтрализующее пролекарство содержит составляющую формулы (F-iiia) или (F-iiib):

где

пунктирные линии показывают присоединение к носителю;

R², R^2a, R³, R^3a, R⁷, R^7a, R⁸, R^8a, X² и D применяются, как определено для формулы (F);

R¹⁰ и SP⁰ применяются, как определено для формулы (F-ii);

и где составляющая формулы (F-iiia) или (F-iiib) необязательно далее замещена, при условии, что водород, отмеченный звездочкой в формуле (F-iiia) и (F-iiib), не замещен заместителем, и что R³ и R^3a каждый независимо друг от друга представляет собой И или соединены с N через SP³-гибридизированный атом углерода.

Предпочтительно, SP⁰ формулы (F-iiia) или (F-iiib) представляет собой С_1-20 алкил, где C_1-20 алкил необязательно прерывается одной или более группами, независимо выбранными из -O-; и C(O)N(R^1aa); и где C_1-20 алкильная цепь необязательно замещена одной или более группами, независимо выбранными из ОН; и C(O)N(R^1aaR^1aaa); где R^1aa, R^1aaa независимо выбираются из группы, состоящей из Н; и C_1-4 алкила.

Предпочтительно, SP⁰ формулы (F-iiia) или (F-iiib) имеет молекулярную массу в интервале от 14 г/моль до 750 г/моль.

Предпочтительно, SP⁰ формулы (F-iiia) или (F-iiib) присоединяется к носителю через терминальную группу, выбранную из

; и .

Если SP⁰ формулы (F-iiia) или (F-iiib) имеет такую терминальную группу, более того, предпочтительно, что SP⁰ имеет молекулярную массу в интервале от 14 г/моль до 500 г/моль, вычисленную без такой терминальной группы.

Предпочтительно, R² формулы (F-iiia) или (F-iiib) представляет собой Н.

Предпочтительно, R^2a формулы (F-iiia) или (F-iiib) представляет собой Н.

Предпочтительно, R² и R^2a формулы (F-iiia) или (F-iiib) представляет собой Н.

Предпочтительно, R³ формулы (F-iii) представляет собой Н или метил, этил или пропил.

Предпочтительно, R^3a формулы (F-iii) представляет собой Н или метил, этил или пропил.

В одном предпочтительном варианте выполнения настоящего изобретения R³ и R^3a формулы (F-iii) оба представляют собой Н.

В другом предпочтительном варианте выполнения настоящего изобретения R³ формулы (F-iii) представляет собой Н и R^3a формулы (F-iii) представляет собой метил.

В другом предпочтительном варианте выполнения настоящего изобретения R³ и R^3a формулы (F-iii) оба представляют собой метил.

Предпочтительно, R⁷ формулы (F-iiia) или (F-iiib) представляет собой Н.

Предпочтительно, R^7a формулы (F-iiia) или (F-iiib) представляет собой Н.

Предпочтительно, R⁸ формулы (F-iiib) представляет собой Н.

Предпочтительно, R^8a формулы (F-iiib) представляет собой Н.

Предпочтительно, R⁸ и R^8a формулы (F-iiib) оба представляют собой Н.

Предпочтительно, R¹⁰ формулы (F-iiia) представляет собой Н.

Предпочтительно, R¹⁰ формулы (F-iiib) представляет собой метил, этил или пропил. Наиболее предпочтительно, R¹⁰ формулы (F-iiib) представляет собой метил.

Предпочтительно, D формулы (F-iiia) или (F-iiib) представляет собой ранибизумаб.

Предпочтительно, носитель формулы (F-iiia) или (F-iiib) представляет собой гидрогель, более предпочтительно гидрогель на основе ПЭГ.

Даже более предпочтительно, VEGF-нейтрализующее пролекарство содержит составляющую формулы (F-iva) или (F-ivb):

где

пунктирные линии показывают присоединение к носителю;

R³ и R^3a применяются, как определено для формулы (I);

R^10b представляет собой C_1-6 алкил;

и где составляющая формулы (F-iva) или (F-ivb) необязательно далее замещена, при условии что водород, помеченный звездочкой, не замещен заместителем, и что R³ и R^3a каждый независимо друг от друга представляет собой Н или соединены с N через SP³-гибридизированный атом углерода.

Предпочтительно, SP⁰ формулы (F-iva) и (F-ivb) представляет собой C_1-20 алкил, где C_1-20 алкил необязательно прерывается одной или более группами, необязательно выбранными из -O-; и C(O)N(R^1aa); и где C_1-20 алкильная цепь необязательно замещена одной или более группами, необязательно выбранными из ОН; и C(O)N(R^1aaR^1aaa); где R^1aa, R^1aaa независимо выбираются из группы, состоящей из Н; и С_1-4 алкила.

Предпочтительно, SP⁰ формулы (F-iva) и (F-ivb) имеет молекулярную массу в интервале от 14 г/моль до 750 г/моль.

Предпочтительно, SP⁰ формулы (F-iva) и (F-ivb) присоединены к носителю через терминальную группу, выбранную из

; и .

Если SP⁰ формулы (F-iva) и (F-ivb) имеют такие терминальные группы, более того предпочтительно, что SP имеет молекулярную массу в интервале от 14 г/моль до 500 г/моль, вычисленную без таких терминальных групп.

Предпочтительно, R³ формулы (F-iva) или (F-ivb) представляет собой Н или метил, этил или пропил.

Предпочтительно, R^3a формулы (F-iva) или (F-ivb) представляет собой Н или метил, этил или пропил.

В одном предпочтительном варианте выполнения настоящего изобретения R³ и R^3a формулы (F-iva) или (F-ivb) оба представляют собой Н.

В другом предпочтительном варианте выполнения настоящего изобретения R³ формулы (F-iva) или (F-ivb) представляет собой Н и R^3a формулы (F-iva) или (F-ivb) представляет собой метил.

В другом предпочтительном варианте выполнения настоящего изобретения R³ и R^3a формулы (F-iva) или (F-ivb) оба представляют собой метил.

В другом предпочтительном варианте выполнения настоящего изобретения R³ формулы (F-iva) или (F-ivb) представляет собой Н, и R^3a формулы (F-iva) или (F-ivb) представляет собой метил.

Предпочтительно R^10b формулы (F-ivb) представляет собой метил, этил или пропил. Наиболее предпочтительно, R^10b представляет собой метил.

Предпочтительно, D формулы (F-iva) и (F-ivb) представляет собой ранибизумаб.

Предпочтительно, носитель формулы (F-iva) и (F-ivb) представляет собой гидрогель, более предпочтительно гидрогель на основе ПЭГ.

В одном варианте выполнения настоящего изобретения VEGF-нейтрализующее пролекарство содержит в связанной форме биологически активную составляющую, выбранную из группы лекарственных средств, включающей антисмысловую РНК, антисмысловую ДНК, рибозмы или РНКi молекулы, нацеленные на VEGF нуклеиновую кислоту; анти-VEGF аптамеры, анти-VEGF антитела, фрагменты анти-VEGF антител, дарпины и растворимые VEGF рецепторы-ловушки, которые предотвращают связывание VEGF с его родственным рецептором; антисенсы, рибозимы, и РНКi молекулы, нацеленные на нуклеиновую кислоту VEGF родственного рецептора (VEGFR); анти-VEGFR аптамеры или анти-VEGFR антитела, которые связываются с VEGFR родственным рецептором; фрагменты анти-VEGFR антител, которые связываются с VEGFR родственным рецептором, и VEGFR тирозинкиназные ингибиторы.

В предпочтительном варианте выполнения настоящего изобретения VEGF-нейтрализующее пролекарство содержит в связанной форме биологически активную составляющую, выбранную из группы лекарственных средств, включающей антисмысловую РНК, антисмысловую ДНК, рибозмы или РНКi молекулы, нацеленные на VEGF нуклеиновую кислоту; анти-VEGF аптамеры, анти-VEGF антитела, дарпины и растворимые VEGF рецепторы-ловушки, которые предотвращают связывание VEGF с его родственным рецептором; антисенсы, рибозимы, и РНКi молекулы, нацеленные на нуклеиновую кислоту VEGF родственного рецептора (VEGFR); анти-VEGFR аптамеры или анти-VEGFR антитела, которые связываются с VEGFR родственным рецептором; и VEGFR тирозинкиназные ингибиторы.

Предпочтительно, VEGF-нейтрализующее пролекарство содержит в связанной форме биологически активную составляющую, выбранную из группы, содержащей ранибизумаб, бевацизумаб, пегаптаниб, афлиберцепт, МР0112, KH902, ESBA1008, AL39324, ALG-1001, и бевазираниб и/или их фрагменты.

Более предпочтительно, VEGF-нейтрализующее пролекарство выбирается из группы, состоящей из ранибизумаб, бевацизумаб, пегаптаниб, афлиберцепт и бевазираниб и/или их фрагменты.

Наиболее предпочтительно, VEGF-нейтрализующее пролекарство представляет собой ранибизумаб.

В одном варианте выполнения настоящего изобретения, офтальмологическое заболевание, подлежащее лечению фармацевтической композицией согласно настоящему изобретению, представляет собой заболевание, связанное с глазной неоваскуляризацией.

Внутриглазная неоваскуляризация предпочтительно выбирается из группы, включающей неоваскуляризацию диска зрительного нерва, неоваскуляризацию радужной оболочки глаз, неоваскуляризацию сетчатки, неоваскуляризацию сосудистой оболочки глаза, неоваскуляризацию роговицы, неоваскуляризацию стекловидного тела, глаукому, поверхностный диффузный сосудистый кератит, птеригиум, отек желтого пятна, дегенерацию желтого пятна, связанную с возрастом дегенерацию желтого пятна, диабетическую ретинопатию, диабетическую ретинальную ишемию, диабетический отек желтого пятна, васкулярную ретинопатию, дегенерацию сетчатки, ретролентальную фиброплазию, ретинобластому, ретролентальную фиброплазию при дегенерации желтого пятна, неоваскуляризацию роговичного трансплантата, окклюзию центральной вены сетчатки (CRVO), патологическую миопию, опухоли глаз, увеит, воспалительные заболевания глаз, и пролиферативную витреоретинопатию.

В одном варианте выполнения настоящего изобретения фармацевтическая композиция дополнительно содержит одно или более лекарственных средств в его/их свободной форме, выбранных из перечня классов лекарственных средств, включающего антисмысловую РНК, антисмысловую ДНК, рибозмы или РНКi молекулы, нацеленные на VEGF нуклеиновую кислоту; анти-VEGF аптамеры, анти-VEGF антитела, фрагменты анти-VEGF антител, дарпины, антикалины, липокалины и растворимые VEGF рецепторы-ловушки, которые предотвращают связывание VEGF с его родственным рецептором; антисенсы, рибозимы, и РНКi молекулы, нацеленные на нуклеиновую кислоту VEGF родственного рецептора (VEGFR); анти-VEGFR аптамеры или анти-VEGFR антитела, которые связываются с VEGFR родственным рецептором; фрагменты анти- VEGFR антител, которые связываются с VEGFR родственным рецептором, и VEGFR тирозинкиназные ингибиторы.

В предпочтительном варианте выполнения настоящего изобретения фармацевтическая композиция дополнительно содержит одно или более лекарственных средств в его/их свободной форме, выбранных из перечня классов лекарственных средств, включающего антисмысловую РНК, антисмысловую ДНК, рибозмы или РНКi молекулы, нацеленные на VEGF нуклеиновую кислоту; анти-VEGF аптамеры, анти-VEGF антитела, дарпины, антикалины, липокалины и растворимые VEGF рецепторы-ловушки, которые предотвращают связывание VEGF с его родственным рецептором; антисенсы, рибозимы, и РНКi молекулы, нацеленные на нуклеиновую кислоту VEGF родственного рецептора (VEGFR); анти-VEGFR аптамеры или анти-VEGFR антитела, которые связываются с VEGFR родственным рецептором; и VEGFR тирозинкиназные ингибиторы.

Предпочтительно, фармацевтическая композиция дополнительно содержит один или более активных ингредиентов, которыми могут быть стероид, противовоспалительное соединение, антибиотическое, противовирусное, противогрибковое или анти-ангиогенезное соединение. Активным ингредиентом может быть, например, метотрексат, ретиноевая кислота, аспирин, диклофенак, флурбипрофен, ибупрофен, кеторолак, напроксен, упрофен, дексаметазон, кортизон, флуоцинолон, гидрокортизон, метилпреднизолон, преднизолон, преднизон или триамцинолон.

В одном предпочтительном варианте выполнения настоящего изобретения фармацевтическая композиция дополнительно содержит в его/их свободной форме один или более модуляторов активности одного или более белков, выбранных из группы, включающей основной фактор роста фибробластов (bFGF), кислотный фактор роста фибробластов (aFGF), трансформирующие факторы роста альфа (TGFa), трансформирующие факторы роста бета (TGFβ), фактор роста тромбоцитов (PDGF), ангиогенин, фактор роста эндотелиальных клеток, полученных из тромбоцитов (PD-ECGF), интерлейкин-1 (IL-1) интерлейкин-8 (IL-8), интерлейкин-12, васкулярный эндотелиальный фактор роста (VEGF), ангиопоэтин-1, Del-I, фоллистатин, гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (G-CSF), фактор роста гепатоцитов (HGF), лептин, мидкин, плацентный фактор роста, плеотрофин (PTN), програнулин, пролиферин, фактор некроза опухолей альфа (TNF-alpha), ангиоаррестин, ангиостатин (фрагмент плазминтогена), антиангиогенный анти-тромбин III, ингибитор, полученный из хряща (CDI), фрагмент комплимента CDS9, эндостатин (фрагмент коллагена XVIII), фрагмент фибронектина, gro-beta, гепариназы, гепарин гексасахаридный фрагмент, человеческий хорионический гонадотропин (hCG), интерферон альфа/бета/гамма, интерферон-индуцирующий белок (IP-IO), kringle S (фрагмент плазминтогена), ингибитора металлопротеиназ (TIMPs), 2-метоксиэстрадиол, ингибитор плацентарной рибонуклеазы, ингибитор активатора плазминтогена, тромбоцитарный фактор-4 (PF4), фрагмент пролактина 16 kD, пролиферин-связанный белок (PRP), ретиноиды, тетрагидрокортизол-S, тромбоспондин-1 (TSP-I), васкулостатин, и вакостатин (фрагмент калретикулина), простагландин, гормон роста, инсулин-подобный фактор роста-1 (IGF-I), сфингозин-1-фосфат, фактор D, RTP801, ингибиторы комплимента, включая С1, С3 и С5, α₂ адренергический агонист, mTOR, цилиарный нейротрофический фактор (CNTF), нейротрофический фактор головного мозга (BDNF), нейротрофический фактор, полученный из глиальных клеток (GDNF), фактор роста, выделяемый из эпителия (LEDGF), фактор жизнеспособности род полученных конус (RdCVF), фактор пигментного эпителия (PEDF), нейтрофил-активирующий белок, моноцитарный хемоаттрактантный белок, макрофагальный белок воспаления, малые индуцируемые секретированные (SIS) белки, тромбоцитарный фактор, основной тромбоцитарный белок, стимулирующая активность роста меланомы, эпидермальный фактор роста, фактор роста нервов, костный морфогенетический белок, хрящевой индуцирующий фактор роста костей, интерлейкины, ингибиторы интерлейкинов, рецепторы интерлейкинов, гематопоэтические факторы, гранулоцитарный колониестимулирующий фактор, макрофагальный колониестимулирующий фактор, гранулоцитарный-макрофагальный колониестимулирующий фактор, ингибин и активин.

Предпочтительными ингибиторами комплемента являются С1 ингибитор, С3 ингибитор и С5 ингибитор.

Предпочтительными ингибиторами факторов роста являются фактор роста тромбоцитов (PDGF), цилиарный нейротрофический фактор (CNTF), нейротрофический фактор из тканей мозга (BDNF), нейротрофический фактор, полученный из глиальных клеток (GDNF), фактор роста, выделяемый из эпителия (LEDGF), фактор жизнеспособности род полученных конус (RdCVF), фактор пигментного эпителия (PEDF).

Предпочтительным хрящевым индуцирующим фактором роста костей являются хрящевой индуцирующий фактор роста костей альфа и хрящевой индуцирующий фактор роста костей бета.

Предпочтительным гематопоэтическим фактором является эритропоэтин.

В другом варианте выполнения настоящего изобретения фармацевтическая композиция дополнительно содержит одно или более пролекарств, где одно или более пролекарств содержат в связанной форме биологически активную составляющую, выбранную из группы, включающей антисмысловую РНК, антисмысловую ДНК, рибозмы или РНКi молекулы, нацеленные на VEGF нуклеиновую кислоту; анти-VEGF аптамеры, анти-VEGF антитела, фрагменты анти-VEGF антител, дарпины, антикалины, липокалины и растворимые VEGF рецепторы-ловушки, которые предотвращают связывание VEGF с его родственным рецептором; антисенсы, рибозимы, и РНКi молекулы, нацеленные на нуклеиновую кислоту VEGF родственного рецептора (VEGFR); анти-VEGFR аптамеры или анти-VEGFR антитела, которые связываются с VEGFR родственным рецептором; фрагменты анти- VEGFR антител, которые связываются с VEGFR родственным рецептором, и VEGFR тирозинкиназные ингибиторы.

В другом предпочтительном варианте выполнения настоящего изобретения фармацевтическая композиция дополнительно содержит одно или более дополнительное пролекарств, где одно или более дополнительное пролекарств содержат в связанной форме биологически активную составляющую, где биологически активной составляющей является модулятор активности одного или более белка, выбранного из группы, включающей основной фактор роста фибробластов (bFGF), кислотный фактор роста фибробластов (aFGF), трансформирующие факторы роста альфа (TGFa), трансформирующие факторы роста бета (TGFβ), фактор роста тромбоцитов (PDGF), ангиогенин, фактор роста эндотелиальных клеток, полученных из тромбоцитов (PD-ECGF), интерлейкин-1 (IL-1) интерлейкин-8 (IL-8), интерлейкин-12, васкулярный эндотелиальный фактор роста (VEGF), ангиопоэтин-1, Del-I, фоллистатин, гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (G-CSF), фактор роста гепатоцитов (HGF), лептин, мидкин, плацентный фактор роста, плеотрофин (PTN), програнулин, пролиферин, фактор некроза опухолей альфа (TNF-alpha), ангиоаррестин, ангиостатин (фрагмент плазминтогена), антиангиогенный анти-тромбин III, ингибитор, полученный из хряща (CDI), фрагмент комплимента CDS9, эндостатин (фрагмент коллагена XVIII), фрагмент фибронектина, gro-beta, гепариназы, гепарин гексасахаридный фрагмент, человеческий хорионический гонадотропин (hCG), интерферон альфа/бета/гамма, интерферон-индуцирующий белок (IP-IO), kringle S (фрагмент плазминтогена), ингибитора металлопротеиназ (TIMPs), 2-метоксиэстрадиол, ингибитор плацентарной рибонуклеазы, ингибитор активатора плазминтогена, тромбоцитарный фактор-4 (PF4), фрагмент пролактина 16 kD, пролиферин-связанный белок (PRP), ретиноиды, тетрагидрокортизол-S, тромбоспондин-1 (TSP-I), васкулостатин, и вакостатин (фрагмент калретикулина), простагландин, гормон роста, инсулин-подобный фактор роста-1 (IGF-I), сфингозин-1-фосфат, фактор D, RTP801, ингибиторы комплимента, включая С1, С3 и С5, α₁ адренергический агонист, mTOR, цилиарный нейротрофический фактор (CNTF), нейротрофический фактор головного мозга (BDNF), нейротрофический фактор, полученный из глиальных клеток (GDNF), фактор роста, выделяемый из эпителия (LEDGF), фактор жизнеспособности род полученных конус (RdCVF), фактор пигментного эпителия (PEDF), нейтрофил-активирующий белок, моноцитарный хемоаттрактантный белок, макрофагальный белок воспаления, малые индуцируемые секретированные (SIS) белки, тромбоцитарный фактор, основной тромбоцитарный белок, стимулирующая активность роста меланомы, эпидермальный фактор роста, фактор роста нервов, костный морфогенетический белок, хрящевой индуцирующий фактор роста костей, интерлейкины, ингибиторы интерлейкинов, рецепторы интерлейкинов, гематопоэтические факторы, гранулоцитарный колониестимулирующий фактор, макрофагальный колониестимулируюпщй фактор, гранулоцитарный-макрофагальный колониестимулирующий фактор, ингибин и активин.

В одном варианте выполнения настоящего изобретения, одно или более дополнительное лекарственное средство находится в форме пролекарства.

Фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению содержит один или более эксципиентов. Эксципиенты можно подразделить на буферные вещества, модификаторы изотоничности, консерванты, стабилизаторы, вещества, препятствующие адсорбции, вещества, защищающие от окисления, загустители/повышающие вязкость вещества или другие вспомогательные агенты. В некоторых случаях эти ингредиенты могут иметь двойные или тройные функции. Фармацевтическая композиция может содержать один или большее количество вспомогательных веществ, выбранных из групп, состоящих из:

(i) Буферные вещества: физиологически переносимые буферы для поддержания рН в желательном интервале, такие как натрия фосфат, бикарбонат, сукцинат, гистидин, цитрат и ацетат, сульфат, нитрат, хлорид, пируват. Антациды, такие как Mg(OH)₂ или ZnCO₃, также могут использоваться. Буферная емкость может быть скорректирована, чтобы соответствовать условиям, наиболее чувствительным к стабильности рН;

(ii) Модификаторы изотоничности: для минимизации боли, которая может появиться из-за повреждения клеток, вызванного различиями осмотического давления в месте инъекции. Примерами являются глицерин и хлорид натрия. Эффективные концентрации можно определить с помощью осмометрии, используя допустимую осмоляльность 285-315 мОсмоль/кг для сыворотки;

(iii) Консерванты и/или противомикробные средства: мультидозовые парентеральные препараты требуют добавления консервантов в достаточной концентрации для минимизации риска пациентов стать инфицированными при инъекции, установлены соответствующие нормативные требования. Типичные консерванты включают м-крезол, фенол, метилпарабен, этилпарабен, пропилпарабен, бутилпарабен, хлорбутанол, бензиловый спирт, нитрат фенилртути, тимерозол, сорбиновую кислоту, сорбат калия, бензойную кислоту, хлоркрезол и бензалкония хлорид;

(iv) Стабилизаторы: Стабилизация достигается путем усиления белок-связывающих сил, путем дестабилизации денатурированного состояния, или путем прямого связывания вспомогательных веществ с белком. Стабилизаторами могут быть аминокислоты, такие как аланин, аргинин, аспарагиновая кислота, глицин, гистидин, лизин, пролин, сахара, такие как глюкоза, сахароза, трегалоза, полиолы, такие как глицерин, маннит, сорбит, соли, такие как фосфат калия, сульфат натрия, хелатирующие вещества, такие как EDTA, гексафосфат, лиганды, такие как двухвалентные ионы металлов (цинк, кальций и т.д.), другие соли или органические молекулы, такие как фенольные производные. Кроме того, могут использоваться олигомеры или полимеры, такие как циклодекстрины, декстран, дендримеры, ПЭГ или ПВП или протамин или человеческий сывороточный альбумин;

(v) Вещества, препятствующие адсорбции: Главным образом, ионогенные или неионогенные поверхностно-активные вещества или другие белки или растворимые полимеры используются для покрытия или адсорбции конкурентным образом с внутренней поверхностью композиций или контейнера композиций. Подходящие поверхностно-активные вещества представляют собой, например, алкилсульфаты, такие как лаурилсульфат аммония и лаурилсульфат натрия; сульфаты простых алкиловых эфиров, такие как лауретсульфат натрия и миретсульфат натрия; сульфонаты, такие как диоктил сульфосукцинаты натрия, перфтороктансульфонаты, перфторбутансульфонаты, алкилбензол сульфонаты; фосфаты, такие как фосфаты простых алкилариловых эфиров и фосфаты простых алкиловых эфиров; карбоксилаты, такие как соли жирных кислот (мыла) или стеарат натрия, лауроил саркозинат натрия, перфторнонаноат, перфтороктаноат; октенидина дигидрохлорид; катионы четвертичного аммония, такие как цетилтриметиламмония бромид, цетилтриметиламмония хлорид, цетилпиридиния хлорид, полиэтоксилированный талловый амин, бензалкония хлорид, бензетония хлорид, 5-бром-5-нитро-1,3-диоксан, диметилдиоктадециламмония хлорид, диоктадецилдиметиламмония бромид; цвиттерионные соединения, такие как 3-[(3-холамидопропил)диметиламмонио]-1-пропансульфонат, кокамидопропил гидроксисультаин, аминокислоты, иминокислоты, кокамидопропил бетаин, лецитин; жирные кислоты, такие как цетиловый спирт, стеариловый спирт, цетостеариловый спирт, олеиловый спирт; простые алкиловые эфиры полиоксиэтиленгликолей, такие как монододециловый эфир октаэтиленгликоля, монододециловый эфир пентаэтиленгликоля; простые алкиловые эфиры полиоксипропиленгликолей; глюкозид простые алкиловые эфиры, такие как децил глюкозид, лаурил глюкозид, октил глюкозид; простые октилфенольные эфиры полиоксиэтиленгликолей, такие как тритон Х-100; простые алкилфенольные эфиры полиоксиэтиленгликолей, такие как ноноксинол-9; сложные алкиловые эфиры глицерина, такие как лаурат глицерина; сложные сорбитан алкиловые эфиры полиоксиэтиленгликолей, такие как полисорбаты; сложные сорбитан алкиловые эфиры; кокамид МЭА и кокамид ДЭА; додецил диметиламин оксид; блоксополимеры полиэтиленгликоля и полипропиленгликоля, такие как полоксамеры (Pluronic F-68), ПЭГ додециловый эфир (Brij 35), полисорбат 20 и 80; другие препятствующие абсорбции вещества представляют собой декстран, полиэтиленгликоль, ПЭГ-полигистидин, БСА и ЧСА и желатины. Выбранная концентрация и тип вспомогательного вещества зависит от эффекта, которого следует избежать, но обычно монослой поверхностно-активного вещества образуется на границе раздела фаз прямо над показателем критической концентрации мицеллообразования;

(vi) Лио- и/или криопротекторы: В ходе лиофильной или распылительной сушки вспомогательные вещества могут препятствовать дестабилизирующим эффектам, вызванным разрывом водородных связей и удалением воды. Для этой цели могут использоваться сахара и полиолы, но соответствующие положительные эффекты также наблюдались для поверхностно-активных веществ, аминокислот, неводных растворителей и других пептидов. Трегалоза является особенно эффективной для снижения агрегации, вызванной влажностью, и также улучшает термическую стабильность, потенциально вызванную подверганием гидрофобных групп белка воздействию воды. Также могут использоваться маннит и сахароза, либо как единственный лио/криопротектор, либо в комбинации друг с другом, где высокие соотношения маннит : сахароза, как известно, увеличивают физическую стабильность лиофилизованной таблетки. Маннит можно также комбинировать с трегалозой. Трегалозу можно также комбинировать с сорбитом или сорбитом, используемым в качестве единственного протектора. Крахмал или производные крахмала также могут использоваться;

(vii) Вещества, защищающие от окисления: антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота, эктоин, метионин, глутатион, монотиоглицерин, морин, полиэтиленимин (ПЭИ), пропилгаллат, витамин Е, хелатирующие вещества, такие как лимонная кислота, EDTA, гексафосфат, тиогликолевая кислота;

(viii) Лиофилизирующее или диффундирующее вещество: модифицирует проницаемость соединительной ткани благодаря гидролизу компонентов внеклеточного матрикса в интерстициальном пространстве, таких как, но не ограничиваясь только указанными, гиалуроновая кислота, полисахарид, найденный в межклеточном пространстве соединительной ткани. Лиофилизирующее вещество, такое как гиалуронидаза, но не ограничиваясь только ей, временно снижает вязкость внеклеточного матрикса и содействует диффузии вводимых лекарств;

(ix) Другие вспомогательные вещества: такие как смачивающие вещества, модификаторы вязкости, антибиотики, гиалуронидаза. Кислоты и основания, такие как соляная кислота и гидроксид натрия, являются вспомогательными веществами, необходимыми для корректировки рН в ходе производства;

Фармацевтическая композиция может обеспечиваться в сухой форме, жидкой форме или в форме суспензии фармацевтической композиции.

Фармацевтическая композиция либо в сухой форме, либо в жидкой форме, либо в форме суспензии может обеспечиваться в виде фармацевтической композиции для однократного или многократного приема.

В одном варианте выполнения настоящего изобретения, фармацевтическая композиция либо в сухой форме, либо в жидкой форме, либо в форме суспензии обеспечивается виде одной дозы, что означает, что контейнер, в котором она поставляется, содержит одну фармацевтическую дозу.

В другом варианте выполнения настоящего изобретения фармацевтическая композиция либо в сухой форме, либо в жидкой форме, либо в форме суспензии представляет собой фармацевтическую композицию для многократного приема, что означает, что контейнер, в котором она поставляется, содержит более одной терапевтической дозы, т.е. композиция для многократного приема содержит по меньшей мере 2 дозы. Такая фармацевтическая композиция для многократного приема может использоваться для различных пациентов, нуждающихся в этом, либо может использоваться для одного пациента, где оставшиеся дозы хранятся после применения первой дозы до момента, пока они понадобятся.

Предпочтительно, фармацевтическая композиция обеспечивается в виде одной дозы.

В другом варианте выполнения настоящего изобретения фармацевтическая композиция находится в контейнере. Подходящими контейнерами для фармацевтической композиции либо в сухой форме, либо в жидкой форме, либо в форме суспензии, являются, например, шприцы, сосуды, сосуды с затычками и уплотнением, ампулы и картриджи. В частности, фармацевтическая композиция либо в сухой форме, либо в жидкой форме, либо в форме суспензии обеспечивается в шприце. Если фармацевтическая композиция представляет собой сухую фармацевтическую композицию, контейнер предпочтительно представляет собой двухкамерный шприц. В таком варианте выполнения указанная сухая фармацевтическая композиция представлена в первом контейнере двухкамерного шприца и восстанавливающий раствор предоставлен во второй камере двухкамерного шприца.

До применения сухой фармацевтической композиции на пациенте, нуждающемся в этом, сухую композицию восстанавливают. Восстановление может происходить в контейнере, в котором находится сухая композиция, таком как сосуд, шприц, двухкамерный шприц, ампула и картридж. Восстановление осуществляется путем добавления заданного количества восстанавливающего раствора к сухой композиции. Восстанавливающие растворы представляют собой стерильные жидкие среды, такие как вода или буфер, которые могут содержать дополнительные добавки, такие как консерванты и/или противомикробные средства, такие как, например, бензиловый спирт и крезол. Предпочтительно, восстанавливающий раствор представляет собой стерильную воду. Когда сухую фармацевтическую композицию восстанавливают, она именуется "восстановленной фармацевтической композицией" или "восстановленной композицией".

Предпочтительно, фармацевтическая композиция находится в форме жидкости или суспензии.

Другим объектом настоящего изобретения является набор из частей.

Если средство для введения представляет собой просто гиподермический шприц, тогда набор может содержать шприц, иглу и контейнер, содержащий сухую фармацевтическую композицию для применения со шприцем, и второй контейнер, содержащий растворитель.

Если фармацевтическая композиция представляет собой жидкую фармацевтическую композицию или суспензию фармацевтической композиции, тогда набор может содержать шприц, иглу и контейнер, содержащий жидкую фармацевтическую композицию или суспензию фармацевтической композиции для применения со шприцем.

Примеры

Вещества и способы

Lucentis и Ранибизумаб применяются в качестве синонимов в следующих примерах.

Вещества:

Амино 4-arm ПЭГ5000 приобрели у JenKem Technology, Beijing, P.R. China. Cithrol™ DPHS приобрели у Croda International Pie, Cowick Hall, United Kingdom.

цис-1,4-циклогександикарбоновую кислоту приобрели у TCI EUROPE N.V., Boerenveldseweg 6 - Haven 1063, 2070 Zwijndrecht, Belgium.

Изопропилмалоновую кислоту приобрели у ABCR GmbH & Co. KG, 76187 Karlsruhe, Germany.

N-(3-малеимидопропил)-39-амино-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-додекаокса-нонатриконтановой кислоты сложной пентафторфениловый сложный эфир (малеимид-NH-ПЭГ12-РРЕ) приобрели у Biomatrik Inc., Jiaxing, P.R. China.

Oxyma pure, HATU, HOAt, HOBt, PyBOP, TBTU, COMU, Fmoc-L-Asp(OBzl)-OH, Fmoc-L-Asp(OtBu)-OH, Fmoc-L-His(OTrt)-OH, Fmoc-Ado-OH и Rink амидную смолу приобрели у Merck Biosciences GmbH, Schwalbach/Ts, Germany.

Boc-Lys(Boc)-OSu приобрели у Senn chemicals AG, Dielsdorf, Switzerland. Fmoc-N-Me-L-Asp(OtBu)-OH приобрели у Bachem, Bubendorf, Switzerland. Tmoc-N-Me-L-Asp(OBzl)-OH приобрели у Peptides International, Louisville, KY, USA. 1,9-бис-Вос-1,5,9-тиазанонан приобрели у PolyPeptide Laboratories A/S, Hillerod, Denmark. (5-метил-2-оксо-1,3-диоксол-4-ил)-метил 4-нитрофенил карбонат приобрели у Chemzon Scientific Inc., Lachine, QC, Canada.

α-[3-(о-пиридилдисульфидо)пропаноиламидо]-ω-сукцинимидиловый сложный эфир додека(этиленгликоль) (OPSS-ПЭГ₁₂-NHS) приобрели у Iris Biotech GmbH, Marktredwitz, Germany.

Все другие химические вещества приобрели у Sigma-ALDRICH Chemie GmbH, Taufkirchen, Germany.

Способы:

Реакции проводились в сухих растворителях (DCM, THF, ACN, DMF, диоксан, МеОН, толуол), подаваемых над молекулярным ситом, поставляемым Sigma-ALDRICH Chemie GmbH, Taufkirchen, Germany. В общем, реакционные смеси перемешивались при комнатной температуре и контролировались с помощью ВЭЖХ/MS или TLC.

Обращенно-фазовую ВЭЖХ проводили на колонке 100×20 мм или 100×40 мм С 18 ReproSil-Pur 300 ODS-3 5 мкм (Dr. Maisch, Аммербух, Германия) или XBridge ВЕН300 С18 OBD Prep 10 мкм 30×150 мм или 5 мкм 10×150 мм (Waters, Eschbom, Германия) в составе ВЭЖХ-системы Waters 600 или 2535 и с детектором поглощения Waters 2487 или 2489, соответственно. Применяли линейный градиент раствора А (0.1% ТФУК в H2O) и раствора В (0.1% ТФУК в ацетонитриле). ВЭЖХ-фракции, содержащие продукт, собрали и лиофилизовали.

Флэш-хроматографические очистки осуществляли на системе Isolera One от Biotage AB, Sweden, с применением картриджей силикагеля Biotage KP-Sil и н-гептана, этилацетата и метанола в качестве элюентов. Продукты обнаруживали при 254 нм. Для продуктов, не показывающих поглощение при длине волны 240 нм, фракции подвергали скринингу с помощью LC/MS.

Аналитическая ультра-эффективная LC (UPLC) осуществлялась на системе Waters Acquity, оборудованной колонкой Waters ВЕН300 С 18 (2.1×50 мм, 1.7 мкм размер частиц), совмещенной с масс-спектрометром LTQ Orbitrap Discovery от Thermo Scientific.

ВЭЖХ-масс-спектрометрия с ионизацией электрораспылением (HPLC-ESI-MS) осуществлялась на Waters Acquity UPLC с детектором Acquity PDA, совмещенным с Thermo LTQ Orbitrap Discovery масс-спектрометром высокого разрешения высокой точности, оборудованном колонкой Waters ACQUITY UPLC ВЕН300 С 18 RP (2.1×50 мм, 300 Å, 1.7 мкм, скорость потока: 0.25 мл/минута; растворитель A: UP-H₂0 + 0.04% TFA, растворитель В: UP-ацетонитрил + 0.05% TFA.

MS спектр ПЭГ продуктов показал ряд (СН₂СН₂О)_n составляющих благодаря полидисперсности исходных ПЭГ-материалов. Для более легкой интерпретации в примерах приводится только один представительный сигнал m/z.

Буферный обмен осуществляется на HiTrap или HiPrep колонке (GE Healthcare), соединенной с системой Aekta Purifier 100.

Катионная ионообменная хроматография осуществляется на Source 15 S 6 мл колонке, соединенной с системой Aekta Purifier 100 с применением 20 мМ MES, рН 5.7 и 20 мМ MES, 500 мМ NaCl, pH 5.7 в качестве подвижной фазы А и В, соответственно.

Пример 1

Синтез реагента основной цепи 1а и 1g:

Реагент основной цепи 1а синтезировали как описано в примере 1 в WO 2011/012715 А1, за исключением применения Boc-DLys(Boc)-OH вместо Вос-LLys(Boc)-OH.

MS: m/z 888.50 = [М+10Н⁺]¹⁰⁺ (вычислено = 888.54)

Реагент основной цепи 1g синтезировали из амино 4-arm ПЭГ5000 1b согласно следующей схеме:

Для синтеза соединения 1b, амино 4-arm ПЭГ5000 (MW около 5350 г/моль, 10.7 г, 2.00 ммоль, HCl соль) и бис(пентафторфенил)карбонат (4.73 г, 12.0 ммоль) растворили в 43 мл DCM (безводный), и DIPEA (3.10 г, 24.0 ммоль, 4.18 мл) добавили при комнатной температуре. Через 10 минут, 1,9-бис-boc-1,5,9-тиазанон (5.30 г, 16.0 ммоль) добавили, и смесь перемешивали в течение 15 минут. Затем дополнительный 1,9-бис-boc-1,5,9-тиазанон (0.33 г, 1.0 ммоль) добавили. После полного растворения, реакционную смесь отфильтровали, и растворитель выпарили при комнатной температуре.

Остаток растворили в 40 мл iPrOH и разбавили с применением 320 мл МТВЕ. Продукт осаждался всю ночь при -20°С. Остаток собрали путем фильтрации через стеклянный фильтр Por. 3, и промыли с применением 200 мл холодного МТВЕ (0°С). Продукт высушивали in vacuo всю ночь.

Выход 11.1 г (83%) твердое вещество белого цвета 1b.

MS: m/z 1112.86 = [М+6Н]⁶⁺ (вычислено = 1113.04).

Для синтеза соединения 1с, boc-защищенное соединение 1b (11.1 г, 1.66 ммоль) растворили в 40 мл 3 М HCl в МеОН и перемешивали в течение 20 минут при 45°С, затем в течение 10 минут при 55°С.Для осаждения, 10 мл МеОН и 200 мл МТВЕ добавили, и смесь хранили в течение 16 часов при -20°С. Остаток собрали путем фильтрации через стеклянный фильтр Por. 3 и промыли с применением 200 мл холодного МТВЕ (0°С). Продукт высушивали in vacuo всю ночь.

Выход 9.14 г (89%) порошок белого цвета 1с (HCl соль).

MS: m/z 979.45 = [М+6Н]⁶⁺ (вычислено = 979.55).

Для синтеза соединения 1d, соединение 1с (9.06 г, 1.47 ммоль, HCl соль) и бис(пентафторфенил)карбонат (6.95 г, 17.6 ммоль) растворили в 50 мл DCM (безводный) и DIPEA (4.56 г, 35.3 ммоль, 6.15 мл) добавили при комнатной температуре. Через 10 минут, 1,9-бис-boc-1,5,9-тиазанон (7.80 г, 23.5 ммоль) добавили, и смесь перемешивали в течение 15 минут. Затем дополнительный 1,9-бис-boc-1,5,9-тиазанон (0.49 г, 1.5 ммоль) добавили. После полного растворения, растворитель выпарили при комнатной температуре.

Остаток растворили в 35 мл iPrOH при 40°С и разбавили с применением 200 мл МТВЕ. Продукт осаждался всю ночь при -20°С. Остаток собрали путем фильтрации через стеклянный фильтр Por. 3, и промыли с применением 200 мл холодного МТВЕ (0°С). Продукт высушивали in vacuo всю ночь с получением 1d в виде твердого вещества белого цвета.

Выход 11.6 г (90%) твердого вещества белого цвета 1d.

MS: m/z 1248.08 = [M+7H]⁷⁺ (вычислено = 1248.27).

Для синтеза соединения 1е, boc-защищенное соединение 1d (11.4 г, 1.31 ммоль) растворили в 40 мл 3 М HCl в МеОН и перемешивали в течение 20 минут при 45°С, затем в течение 10 минут при 55°С. Для осаждения, 10 мл МеОН и 200 мл МТВЕ добавили, и смесь хранили в течение 16 часов при -20°С. Остаток собрали путем фильтрации через стеклянный фильтр Por. 3 и промыли с применением 200 мл холодного МТВЕ (0°С). Продукт высушивали in vacuo всю ночь с получением порошка белого цвета 1е.

Выход 7.60 г (75%) порошка белого цвета 1е (HCl соль).

MS: m/z 891.96 = [M+8H]⁸⁺ (вычислено = 892.13).

Для синтеза соединения 1f, соединение 1е (7.56 г, 0.980 ммоль, HCl соль) и бис(пентафторфенил)карбонат (9.27 г, 23.0 ммоль) растворили в 250 мл DCM (безводный) и DIPEA (6.08 г, 47.0 ммоль, 8.19 мл) добавили при 35°С. Через 10 минут, 1,9-бис-boc-1,5,9-тиазанон (5.30 г, 16.0 ммоль) добавили, и смесь перемешивали в течение 15 минут. Затем дополнительный 1,9-бис-boc-1,5,9-тиазанон (0.33 г, 1.0 ммоль) добавили. После полного растворения, растворитель выпарили при комнатной температуре.

Остаток растворили в 250 мл iPrOH при 60°С и разбавили с применением 1350 мл МТВЕ. Продукт осаждался всю ночь при -20°С. Остаток собрали путем фильтрации через стеклянный фильтр Por. 3, и промыли с применением 400 мл холодного МТВЕ (0°С). Продукт высушивали in vacua всю ночь с получением If в виде стекловидного твердого вещества.

Выход 11.1 г (83%) стекловидного твердого вещества 1f.

MS: m/z 1312.01 = [M+10H]¹⁰⁺ (вычислено = 1312.21).

Для синтеза реагента основной цепи 1g, boc-защищенное соединение 1f (7.84 г, 0.610 ммоль) растворили в 16 мл МеОН при 37°С, и 55 мл предварительно охлажденный раствор 4 М HCl (4°С) в диоксане добавили при комнатной температуре. Смесь перемешивали без охлаждения в течение 20 минут. Через 20 минут 110 мл 3М HCl в МеОН добавили. Раствор распределили по 24 пробиркам фирмы Falcon (50 мл) и осаждали путем добавления 40 мл холодного МТВЕ (-20°С) в каждую пробирку фирмы Falcon. После центрифугирования при 3214 rcf в течение 1 минуты, супернатант отделили, и стекловидное твердое вещество растворили в 5 мл МеОН на пробирку фирмы Falcon и осадили путем добавления 40 мл холодного МТВЕ (-20°С) в каждую пробирку фирмы Falcon еще раз. Супернатант отделили, и оставшееся твердое вещество высушивали in vacua всю ночь.

Выход 5.74 г (87%) стекловидного вещества белого цвета 1g (HCl соль).

MS: m/z 965.46 = [М+10Н]¹⁰⁺ (вычислено = 965.45).

Пример 2

Синтез поперечно-сшивающих реагентов 2d, 2g, 2k и 2о

Поперечно-сшивающий реагент 2е получили из азелаиновой кислоты сложного монобензилового эфира и ПЭГ10000 согласно следующей схеме:

Для синтеза азелаиновой кислоты сложного монобензилового эфира 2а, смесь азелаиновой кислоты (37.6 г, 200 ммоль), бензилового спирта (21.6 г, 200 ммоль), п-толуолсульфоновой кислоты (0.80 г, 4.2 ммоль), и 240 мл толуола нагревали с отгонкой флегмы в течение 7 часов в устройстве Dean-Stark. После охлаждения, растворитель выпарили, и 300 мл насыщенного водного раствора NaHCO₃ добавили. Эту смесь экстрагировали с применением 3×200 мл МТВЕ. Объединенные органические фазы высушили над Na₂SO₄, и растворитель выпарили. Продукт очистили на 2×340 г силикагеля с применением этил ацетат / гептан (10:90→25:75) в качестве элюента. Элюент выпарили, и остаток высушивали in vacua всю ночь.

Выход 25.8 г (46%) бесцветного масла 2а.

MS: m/z 279.16 = [М+Н]⁺ (вычислено = 279.16).

Для синтеза соединения 2b, азелаиновой кислоты сложный монобензиловый эфир 2а (3.90 г, 14.0 ммоль) и ПЭГ 10000 (40.0 г, 4.00 ммоль) растворили в 64 мл дихлорметан и охладили на ледяной бане. Раствор DCC (2.89 г, 14.0 ммоль) и DMAP (0.024 г, 0.020 ммоль) в 32 мл дихлорметана добавили. Ледяную баню удалили, и смесь перемешивали при комнатной температуре всю ночь. Полученную суспензию охладили до 0°С, и твердое вещество отфильтровали. Растворитель выпарили in vacua.

Остаток растворили в 65 мл дихлорметана и разбавили с применением 308 мл МТВЕ при комнатной температуре. Смесь хранили всю ночь при -20°С. Остаток собрали путем фильтрации через стеклянный фильтр Por. 3, и промыли с применением 250 мл холодного МТВЕ (-20°С). Продукт высушивали in vacuo всю ночь.

Выход 40.8 г (97%) порошка белого цвета 2b.

MS: m/z 835.50 = [M+14H]¹⁴⁺ (вычислено = 835.56).

Для синтеза соединения 2с, соединение 2b (40.6 г, 3.86 ммоль) растворили в метил ацетате (250 мл), и 203 мг палладия на угле добавили. В атмосфере водорода при давлении окружающей среды, смесь перемешивали всю ночь при комнатной температуре. Реакционную смесь отфильтровали через слой целита, и фильтрат выпарили и высушивали in vacuo всю ночь.

Выход 37.2 г (93%) стекловидного твердого вещества 2с.

MS: m/z 882.53 = [М+13Н]¹³⁺ (вычислено = 882.51).

Для синтеза соединения 2d, соединение 2с (32.0 г, 3.10 ммоль) и TSTU (3.73 г, 12.4 ммоль) растворили в 150 мл дихлорметана при комнатной температуре. Затем DIPEA (1.60 г, 12.4 ммоль) добавили, и смесь перемешивали в течение 1 часа. Полученную суспензию отфильтровали, и фильтрат разбавили с применением 170 мл дихлорметана, промыли с применением 140 мл раствора 750 г воды / 197 г NaCl / 3 г NaOH. Органическую фазу высушивали над MgSO₄, и растворитель выпарили in vacuo.

Остаток растворили в 200 мл толуола, разбавили с применением 180 мл МТВЕ при комнатной температуре и хранили всю ночь при -20°С. Остаток собрали путем фильтрации через стеклянный фильтр Por. 3, и промыли с применением 100 мл холодного МТВЕ (-20°С). Продукт высушивали in vacuo всю ночь.

Выход 28.8 г (88%) порошка белого цвета 2d.

MS: m/z 795.47 = [М+15Н]¹⁵⁺ (вычислено = 795.54).

Поперечно-сшивающий реагент 2g получили из азелаиновой кислоты сложного монобензилового эфира и ПЭГ6000 согласно следующей схеме:

Для синтеза соединения 2е, азелаиновой кислоты сложный монобензиловый эфир 2а (6.50 г, 23.3 ммоль) и ПЭГ 6000 (40.0 г, 6.67 ммоль) растворили в 140 мл дихлорметана и охладили на ледяной бане. Раствор DCC (4.81 г, 23.3 ммоль) и DMAP (0.040 г, 0.33 ммоль) в 40 мл дихлорметана добавили. Ледяную баню удалили, и смесь перемешивали при комнатной температуре всю ночь. Полученную суспензию охладили до 0°С и твердое вещество отфильтровали. Растворитель выпарили in vacuo.

Остаток растворили в 70 мл дихлорметана и разбавили с применением 300 мл МТВЕ при комнатной температуре. Смесь хранили всю ночь при -20°С. Остаток собрали путем фильтрации через стеклянный фильтр Por. 3, и промыли с применением 500 мл холодного МТВЕ (-20°С). Продукт высушивали in vacuo всю ночь.

Выход 41.2 г (95%) порошка белого цвета 2е.

MS: m/z 833.75 = [M+8H]⁸⁺ (вычислено = 833.74).

Для синтеза соединения 2f, соединение 2е (41.2 г, 6.32 ммоль) растворили в метил ацетате (238 мл) и этаноле (40 мл), затем 400 мг палладия на угле добавили. В атмосфере водорода при давлении окружающей среды, смесь перемешивали всю ночь при комнатной температуре. Реакционную смесь отфильтровали через слой целита и фильтрат выпарили и высушивали in vacuo всю ночь.

Выход 38.4 г (96%) стекловидного твердого вещества 2f.

MS: m/z 750.46 = [M+9H]⁹⁺ (вычислено = 750.56).

Для синтеза соединения 2g, соединение 2f (38.2 г, 6.02 ммоль) и TSTU (7.25 г, ммоль) растворили в 130 мл дихлорметана при комнатной температуре. Затем DIPEA (3.11 г, 24.1 ммоль) добавили, и смесь перемешивали в течение 1 часа. Полученную суспензию отфильтровали, фильтрат разбавили с применением 100 мл дихлорметана и промыли с применением 200 мл раствора 750 г воды / 197 г NaCl / 3 г NaOH. Органическую фазу высушивали над MgSO₄, и растворитель выпарили in vacuo.

Остаток растворили в 210 мл толуола, разбавили с применением 430 мл МТВЕ при комнатной температуре и хранили всю ночь при -20°С. Остаток собрали путем фильтрации через стеклянный фильтр Por. 3, и промыли с применением 450 мл холодного МТВЕ (-20°С). Продукт высушивали in vacuo всю ночь.

Выход 35.8 г (91%) порошка белого цвета 2g.

MS: m/z 857.51 = [M+8H]⁸⁺ (вычислено = 857.51).

Поперечно-сшивающий реагент 2k получили из изопропилмалоновой кислоты сложного монобензилового эфира и ПЭГ10000 согласно следующей схеме:

Для синтеза изопропилмалоновой кислоты сложного монобензилового эфира rac-2h, изопропилмалоновую кислоту (35.0 г, 239 ммоль), бензиловый спирт (23.3 г, 216 ммоль) и DMAP (1.46 г, 12.0 ммоль) растворили в 100 мл ацетонитрила. Смесь охладили до 0°C с применением ледяной бани. Раствор DCC (49.4 г, 239 ммоль) в 150 мл ацетонитрила добавили в течение 15 минут при 0°С. Ледяную баню удалили, и реакционную смесь перемешивали всю ночь при комнатной температуре, затем твердое вещество отфильтровали. Фильтрат выпарили при 40°С in vacuo, и остаток растворили в 300 мл МТВЕ. Этот раствор экстрагировали с применением 2×300 мл насыщенного водного раствора NaHCO₃, затем объединенные водные фазы подкислили до рН=1-3 с применением 6 Н соляной кислоты. Оставшуюся эмульсию экстрагировали с применением 2×300 мл МТВЕ, и растворитель выпарили. Объединенные органические фазы промыли с применением 200 мл насыщенного водного раствора NaCl и высушивали над MgSO₄. Продукт очистили на 340 г силикагеля с применением этил ацетат / гептан (10:90→20:80) в качестве элюента. Элюент выпарили, и остаток высушивали in vacuo всю ночь.

Выход 9.62 г (17%) бесцветного масла rac-2b.

MS: m/z 237.11 = [М+Н]⁺ (вычислено = 237.11).

Для синтеза соединения rac-2i, изопропилмалоновой кислоты сложный монобензиловый эфир rac-2h (945 г, 4.00 ммоль) и ПЭГ 10000 (10.0 г, 4.00 ммоль) растворили в 20 мл дихлорметана и охладили на ледяной бане. Раствор DCC (825 мг, 4.00 ммоль) и DMAP (6 мг, 0.05 ммоль) в 10 мл дихлорметане добавили. Ледяную баню удалили, и смесь перемешивали при комнатной температуре всю ночь. Полученную суспензию охладили до 0°С, и твердое вещество отфильтровали. Растворитель выпарили in vacuo.

Остаток растворили в 20 мл дихлорметана и разбавили с применением 150 мл МТВЕ при комнатной температуре. Смесь хранили всю ночь при -20°С. Остаток собрали путем фильтрации через стеклянный фильтр Por. 3, и промыли с применением 500 мл холодного МТВЕ (-20°С). Продукт высушивали in vacuo всю ночь.

Выход 9.63 г (92%) порошка белого цвета rac-2i.

MS: m/z 742.50 = [М+16Н]¹⁶⁺ (вычислено = 742.51).

Для синтеза соединения rac-2j, соединение rac-2i (3.38 г, 0.323 ммоль) растворили в метил ацетате (100 мл), и 105 мг палладия на угле добавили. В атмосфере водорода при давлении окружающей среды, смесь перемешивали всю ночь при комнатной температуре. Реакционную смесь отфильтровали через слой целита и фильтрат выпарили и высушивали in vacuo всю ночь.

Выход 3.25 г (98%) стекловидного твердого вещества rac-2j.

MS: m/z 731.25 = [М+16Н]¹⁶⁺ (вычислено = 731.25).

Для синтеза соединения 2k, соединение 2j (3.10 г, 0.302 ммоль) и TSTU (0.364 г, 1.21 ммоль) растворили в 15 мл дихлорметана при комнатной температуре. Затем DIPEA (0.156 г, 1.21 ммоль) добавили, и смесь перемешивали в течение 45 минут. Полученную суспензию отфильтровали, и фильтрат промыли с применением 2×10 мл 0.5 М фосфатного буфера рН=6.5. Органическую фазу высушивали над MgSO₄, и растворитель выпарили in vacuo. Остаток растворили в 20 мл толуола, разбавили с применением 10 мл МТВЕ при комнатной температуре и хранили всю ночь при -20°С. Остаток собрали путем фильтрации через стеклянный фильтр Por. 3, и промыли с применением 250 мл холодного МТВЕ (-20°С). Продукт высушивали in vacuo всю ночь.

Выход 2.66 г (84%) порошка белого цвета 2k.

MS: m/z 743.37 = [М+16Н]¹⁶⁺ (вычислено = 743.38).

Поперечно-сшивающий реагент rac-2о получили из цис-1,4-циклогександикарбоновой кислоты и ПЭГ10000 согласно следующей схеме:

Для синтеза цис-1,4-циклогександикарбоновой кислоты сложного монобензилового эфира rac-2l, цис-1,4-циклогександикарбоновую кислоту (20.0 г, 116 ммоль), бензиловый спирт (11.3 г, 105 ммоль) и DMAP (710 мг, 5.81 ммоль) растворили в 200 мл THF. Смесь охладили до 0°C с применением ледяной бани. Раствор DCC (49.4 г, 239 ммоль) в 100 мл THF добавили в течение 15 минут при 0°С. Ледяную баню удалили, и реакционную смесь перемешивали всю ночь при комнатной температуре, затем твердое вещество отфильтровали. Фильтрат выпарили при 40°С, и остаток растворили в 300 мл МТВЕ. Этот раствор экстрагировали с применением 2×300 мл насыщенного водного раствора NaHCO₃, затем объединенные водные фазы подкислили до рН=1-3 с применением 6 Н соляной кислоты. Оставшуюся эмульсию экстрагировали с применением 2×300 мл МТВЕ, и растворитель выпарили. Объединенные органические фазы промыли с применением 200 мл насыщенного водного раствора NaCl и высушивали над MgSO₄. Продукт очистили на 340 г силикагеля с применением этилацетат / гептан (10:90→20:80) в качестве элюента. Элюент выпарили, и остаток в виде бесцветного масла кристаллизовали в ходе сушки in vacuo всю ночь.

Выход 4.82 г (16%) бесцветных кристаллов rac-2l.

MS: m/z 263.13 = [М+Н]⁺ (вычислено = 263.13).

Для синтеза соединения 2m, цис-1,4-циклогександикарбоновой кислоты сложный монобензиловый эфир 21 (2.10 г, 8.00 ммоль) и ПЭГ 10000 (20.0 г, 10.0 ммоль) растворили в 50 мл дихлорметана и охладили на ледяной бане. Раствор DCC (1.65 г, 8.00 ммоль) и DMAP (0.012 г, 0.10 ммоль) в 25 мл дихлорметана добавили. Ледяную баню удалили, и смесь перемешивали при комнатной температуре всю ночь. Полученную суспензию охладили до 0°С, и твердое вещество отфильтровали. Растворитель выпарили in vacuo.

Остаток растворили в 55 мл дихлорметана и разбавили с применением 300 мл МТВЕ при комнатной температуре. Смесь хранили всю ночь при -20°С. Остаток собрали путем фильтрации через стеклянный фильтр Por. 3, и промыли с применением 250 мл холодного МТВЕ (-20°С). Продукт высушивали in vacuo всю ночь.

Выход 18.2 г (87%) порошка белого цвета 2m.

MS: m/z 745.76 = [М+16Н]¹⁶⁺ (вычислено = 745.77).

Для синтеза соединения 2n, соединение 2m (9.00 г, 0.857 ммоль) растворили в метил ацетате (100 мл), и 157 мг палладия на угле добавили. В атмосфере водорода при давлении окружающей среды, смесь перемешивали всю ночь при комнатной температуре. Реакционную смесь отфильтровали через слой целита и фильтрат выпарили и высушивали in vacuo всю ночь.

Выход 8.83 г (100%) стекловидного твердого вещества 2n.

MS: m/z 734.50 = [М+16Н]¹⁶⁺ (вычислено = 734.50).

Для синтеза соединения 2о, соединение 2n (8.92 г, 0.864 ммоль) и TSTU (1.04 г, 3.64 ммоль) растворили в 35 мл дихлорметана при комнатной температуре. Затем DIPEA (0.447 г, 3.46 ммоль) добавили, и смесь перемешивали в течение 45 минут. Полученную суспензию отфильтровали, и фильтрат промыли с применением 2×10 мл 0.5 М фосфатного буфера рН=6.5. Органическую фазу высушивали над MgSO₄, и растворитель выпарили in vacuo.

Остаток растворили в 50 мл толуола, разбавили с применением 25 мл МТВЕ при комнатной температуре и хранили всю ночь при -20°С. Остаток собрали путем фильтрации через стеклянный фильтр Por. 3, и промыли с применением 400 мл холодного МТВЕ (-20°С). Продукт высушивали in vacuo всю ночь.

Выход 7.62 г (84%) порошка белого цвета 2о.

MS: m/z 702.60 = [М+16H]¹⁶⁺ (вычислено = 702.59).

Пример 3

Получение шариков гидрогеля 3а, 3b, 3с и 3d, содержащего свободные аминогруппы.

В цилиндрическом реакторе с объемом 250 мл и выходом на дне, диаметр 60 мм, оборудованном перегородками, эмульсию 218 мг Cithrol™ DPHS в 100 мл ундекана перемешивали с применением мешалки isojet, диаметр 50 мм при 580 оборотов в минуту, при температуре окружающей среды. Раствор 250 мг соединения 1а и 2205 мг соединения 2d в 22.1 г DMSO добавили и перемешивали в течение 10 минут при комнатной температуре с образованием суспензии. 1.1 мл TMEDA добавили для осуществления полимеризации. Смесь перемешивали в течение 16 часов. 1.7 мл уксусной кислоты добавили, и затем через 10 минут 100 мл 15 мас.% раствора хлорида натрия в воде добавили. Через 10 минут, мешалку остановили, и фазам дали разделиться. Через 2 часа водную фазу, содержащую гидрогель, выпустили.

Для фракционирования шариков по размеру, суспензию гидрогеля в воде разбавили с применением 40 мл этанола и просеяли во влажном состоянии на стальных ситах 125, 100, 75, 63, 50, 40 и 32 мкм с применением устройства, контролирующего просеивание, Retsch AS200 в течение 15 минут. Амплитуда просеивания составляла 1.5 мм, скорость течения воды 300 мл/минут. Фракции шариков, которые задерживались на ситах 63 и 75 мкм, объединили и промыли 3 раза с применением 0.1% АсОН, 10 раз с применением этанола, и высушивали в течение 16 часов при 0.1 мбар с получением 670 мг 3а в виде порошка белого цвета.

Содержание аминогрупп в гидрогеле в количестве 0.145 ммоль/г получили путем объединения fmoc-аминокислоты со свободными аминогруппами на гидрогеле и последующего определения fmoc.

3b получили, как описано для 3а, за исключением применения скорости мешалки 560 оборотов в минуту, применения 350 мг 1а, 2548 мг 2g, 26.1 г DMSO, 257 мг Cithrol™ DPHS, 1.5 мл TMEDA и 2.4 мл уксусной кислоты, с получением 550 мг 3b в виде порошка белого цвета, свободные аминогруппы - 0.120 ммоль/г.

3с получили, как описано для 3а, за исключением применения скорости мешалки 560 оборотов в минуту, применения 250 мг 1а, 3019 мг rac2k, 32.7 г DMSO, 290 мг Cithrol™ DPHS, 1.1 мл TMEDA, и 1.7 мл уксусной кислоты, с получением 770 мг 3с в виде порошка белого цвета, свободные аминогруппы - 0.126 ммоль/г.

3d получили, как описано для 3а, за исключением применения 250 мг 1а, 2258 мг rac2o, 22.6 г DMSO, 222 мг Cithrol™ DPHS, 1.1 мл TMEDA, и 1.7 мл уксусной кислоты, с получением 186 мг 3d в виде порошка белого цвета, свободные аминогруппы - 0.153 ммоль/г.

Пример 4

Синтез линкерного реагента 4с

Линкерный реагент 4с синтезировали согласно следующей схеме:

Синтез 4а:

Fmoc-L-Asp(OtBu)-OH (1.00 г, 2.43 ммоль) растворили с применением DCC (0.70 г, 3.33 ммоль) в DCM (25 мл). Oxyma pure (0.51 г, 3.58 ммоль) и коллидин (0.50 мл, 3.58 ммоль) добавили в виде одной части, и раствор N-Вос-этилендиамина (0.41 г, 2.56 ммоль) в DCM (15 мл) добавили медленно. После перемешивания смеси в течение 90 минут при комнатной температуре, образованный осадок отфильтровали, и фильтрат промыли с применением водной HCl (0.1 М, 50 мл). Водный слой экстрагировали с применением DCM (2×20 мл), и объединенные органические фракции промыли с применением насыщенного водного раствора NaHCO₃ (3×25 мл) и солевого раствора (1×50 мл), высушивали над Na₂SO₄, отфильтровали и концентрировали in vacuo. Неочищенное твердое вещество очистили с помощью флэш-хроматографии. Промежуточное соединение N-boc-N'-(N-fmoc-4-трет.-бутил-L-аспартоил)-этилендиамин получили в виде твердого вещества белого цвета (0.98 г, 1.77 ммоль, 73%).

MS: m/z 554.29 = [M+H]⁺, (вычислено = 554.29).

N-boc-N'-(N-fmoc-4-трет.-бутил-L-аспартоил)-этилендиамин (0.98 г, 1.77 ммоль) растворили в THF (15 мл), DBU (0.31 мл) добавили, и раствор перемешивали в течение 12 минут при комнатной температуре. Реакцию погасили с помощью АсОН (0.5 мл), концентрировали in vacuo, и остаток очистили с помощью флэш-хроматографии с получением 4а (0.61 г, 1.77 ммоль, 73% за 2 стадии) в виде твердого вещества белого цвета.

MS: m/z 332.38 = [М+Н]⁺, (вычислено = 332.22).

Синтез 4b:

6-Ацетилтиогексановую кислоту (0.37 г, 1.95 ммоль) растворили в DCM (19.5 мл), и Oxyma pure (0.35 г, 2.48 ммоль) и DCC (0.40 г, 1.95 ммоль) добавили в виде одной части. Раствор перемешивали в течение 30 минут при комнатной температуре, отфильтровали, и фильтрат добавили к раствору 4а (0.61 г, 1.77 ммоль) в DCM (10.5 мл). DIPEA (0.46 мл, 2.66 ммоль) добавили к раствору, и реакционную смесь перемешивали в течение 2 часов при комнатной температуре. Раствор промыли с применением водной H₂SO₄ (0.1 М, 2×30 мл), насыщенного водного раствора NaHCO₃ (2×20 мл) и соляного раствора (1×20 мл). Органический слой высушивали над Na₂SO₄, отфильтровали и концентрировали in vacuo. Неочищенное вещество очистили с помощью флэш-хроматографии с получением N-boc-N'-(N-6-ацетилтиогексил-4-трет.-бутил-L-аспартоил)-этилендиамина (0.65 г, 1.30 ммоль, 73% за 2 стадии) в виде твердого вещества белого цвета.

MS: m/z 504.27 = [М+Н]⁺, (вычислено = 504.28).

N-boc-N'-(N-6-Ацетилтиогексил-4-трет.-бутил-L-аспартоил)-этилендиамин (0.60 г, 1.18 ммоль) растворили в TFA (5 мл) и TES (0.13 мл) и воду (0.13 мл) добавили. Смесь перемешивали в течение 30 минут при комнатной температуре. TFA удалили в потоке N₂, и неочищенный 4b растворили в H2O/ACN 1:1 и очистили посредством обращенно-фазовой ВЭЖХ.

Выход: 0.39 г, 0.85 ммоль (TFA соль), 72%.

MS: m/z 348.25 = [M+H]⁺, (вычислено = 348.16).

Синтез 4с:

4b (TFA соль, 0.38 г, 0.80 ммоль) растворили в DMF (5 мл), и (5-метил-2-оксо-1,3-диоксол-4-ил)-метил 4-нитрофенил карбонат (0.26 г, 0.88 ммоль) и DIPEA (0.28 мл, 1.6 ммоль) добавили. Полученную суспензию разбавили с применением DCM (5 мл) и перемешивали в течение 3 часов при комнатной температуре. Дополнительный DIPEA (0.28 мл 1.6 ммоль) добавили, и перемешивание продолжали в течение 2 часов. DCM концентрировали in vacua, остаток разбавили с применением H2O/ACN 3:1 и очистили посредством обращенно-фазовой ВЭЖХ с получением N-(5-метил-2-оксо-1,3-диоксол-4-ил)-метил-оксокарбонил-N'-(N-6-ацетилтиогексил-L-аспартил)-этилендиамина (0.31 г, 0.62 ммоль, 77%) в виде бесцветного масла.

MS: m/z 504.16 = [М+Н]⁺, (вычислено = 504.17).

N-(5-метил-2-оксо-1,3-диоксол-4-ил)-метил оксокарбонил-N'-(N-6-ацетилтиогексил-L-аспартил)-этилепе-диамин (150 мг, 0.30 ммоль) растворили в DCM (17.5 мл) и NHS (41 мг, 0.36 ммоль), DCC (74 мг, 0.36 ммоль) и DMAP (4 мг, 0.03 ммоль) добавили в виде одной части. Реакцию перемешивали в течение 1 часов при комнатной температуре, и полученную суспензию отфильтровали. Осадок промыли с применением небольшого количества DCM, и объединенные фильтраты концентрировали in vacuo. 4с очистили посредством обращенно-фазовой ВЭЖХ с получением бесцветного масла (144 мг, 0.24 ммоль, 80%).

MS: m/z 601.18 = [М+Н]⁺, (вычислено = 601.18).

Пример 5

Получение шариков малеимид-функционализированного гидрогеля 5а

259.3 мг сухих шариков гидрогеля 3а инкубировали в течение 15 минут в 10 мл 1% н-пропиламина в NMP и далее промыли два раза с применением 1% н-пропиламина в NMP и два раза с применением 2% DIPEA в NMP. 171 мг малеимид-NH-ПЭГ12-PFE растворили в 1 мл NMP и добавили к промытым шарикам гидрогеля 3а. Суспензию гидрогеля инкубировали в течение 2 часов при комнатной температуре. Полученные шарики малеимид-функционализированного гидрогеля 5а промыли пять раз, каждый раз с помощью NMP, 20 мМ сукцината, 1 мМ Na₂EDTA, 0.01% Tween20, pH 3.0, воды, и с 0.1% уксусной кислоты, 0.01% Tween20.

Шарики малеимид-функционализированного гидрогеля 5b, 5с и 5d получили, соответственно применяя 3b, 3с и 3d.

Пример 6

Синтез пролкарства Lucentis-линкер-гидрогель 6с

4.6 мг Lucentis (показан на приведенной далее схеме как Lucentis-NH₂) (460 мкл 10 мг/мл Lucentis в 10 мМ гистидина, 10wt% α,α-трегалоза, 0.01% Tween20, pH 5.5) подвергли буферному обмену на 10 мМ фосфат натрия, 2.7 мМ хлорид калия, 140 мМ хлорид натрия, pH 7.4, и концентрацию Lucentis довели до 16.4 мг/мл. 6 мг линкерного реагента 4с растворили в 100 мкл DMSO с получением концентрации 100 мм. 1 мольный эквивалент линкерного реагента 4с относительно количества Lucentis добавили к раствору Lucentis. Реакционную смесь аккуратно смешали и инкубировали в течение 5 минут при комнатной температуре. Затем 2 дополнительных мольных эквивалента линкерного реагента 4с добавили к раствору Lucentis с шагом 1 мольный эквивалент, и после добавления каждого эквивалента реакционную смесь инкубировали в течение 5 минут при комнатной температуре с получением смеси немодифицированного Lucentis и моноконъюгата защищенный Lucentis-линкер 6а.

Значение pH реакционной смеси довели до pH 6.5 путем добавления 1 М цитрата натрия, pH 5.0 и Na₂EDTA добавили до конечной концентрации 5 мм. Для удаления защитных групп ба 0.5 М NH₂OH (растворенный в 10 мМ цитрата натрия, 140 мМ хлорида натрия, 5 мМ Na₂EDTA, pH 6.5) добавили до конечной концентрации 45 мм, и реакционную смесь без защитных групп инкубировали при комнатной температуре в течение 4 часов с получением моноконъюгата Lucentis-линкер 6b. Смесь Lucentis и моноконъюгата Lucentis-линкер 6b подвергли буферному обмену на 10 мМ фосфат натрия, 2.7 мМ хлорид калия, 140 мм хлорид натрия, 5 мм Na₂EDTA, 0.01% Tween 20, pH 6.5, и общую концентрацию двух видов Lucentis довели до 11.8 мг/мл. Содержание моноконъюгата Lucentis-линкер 6b в смеси составило 20%, как определено путем ESI-MS.

4 мг смесь Lucentis/Lucentis-линкер моноконъюгат 6b в 10 мМ фосфата натрия, 2.7 мМ хлорида калия, 140 мМ хлорида натрия, 5 мМ Na₂EDTA, 0.01% Tween 20, pH 6.5 добавили к 1 мг шариков малеимид-функционализированного гидрогеля 5а и инкубировали всю ночь при комнатной температуре с получением пролекарства Lucentis-линкер-гидрогель 6с.

Пример 7

Кинетика In vitro высвобождения - определение периода полураспада in vitro

Пролекарство Lucentis-линкер-гидрогель 6с (содержащее около 1 мг Licentious) промыли пять раз с применением 60 мМ фосфата натрия, 3 мМ Na₂EDTA, 0.01% Tween20, pH 7.4 и наконец суспендировали в 1 мл вышеуказанного буфера. Суспензию инкубировали при 37°С. Буфер суспензии обменивали через различные интервалы времени и анализировали путем ВЭЖХ-SEC при 220 нм. Пики, соответствующие высвобожденному Lucentis, интегрировали, и составили графики отношения всего высвобожденного Lucentis к общему времени инкубации. Программные обеспечения для подбора кривой по точкам применялись для определения скоростей расщепления первого порядка.

Пример 8

Синтез линкерного реагента 8е

Линкерный реагент 8е синтезировали согласно следующей схеме:

К раствору N-Вос-этилендиамина (2.08 г, 12.98 ммоль) и NaCNBH₃ (775 мг, 12.33 ммоль) в МеОН (20 мл, безводный) раствор 2,4,6-триметоксибензальдегида (2.29 г, 11.68 ммоль) в 40 мл безводного MeOH/DCM (1:1 об./об.) добавили за 2 часа с помощью шприцевого насоса. Смесь перемешивали в течение 90 минут, подкислили с помощью 0.4 М HCl (60 мл) и перемешивали еще 15 минут. Реакционную смесь экстрагировали с помощью этилацетата (5х). Объединенные органические фазы промыли с помощью насыщенного NaHCO₃ и соляного раствора и высушили над Na₂SO₄. Растворители удалили в вакууме, и осадок высушили в высоком вакууме (<0.1 мбар). Неочищенный N-Boc-N'-Tmob-этилендиамин 8а применяли на следующей стадии реакции без дальнейшей очистки. Выход: 3.70 г (10.87 ммоль, 84%) бесцветного твердого вещества. MS: m/z 341.21 = [М+Н]⁺, (вычисленная = 341.21).

Раствор 8а (1.7 г, 4.99 ммоль) в DCM (40 мл, безводный, мол. сито) добавили к раствору DCC (1.34 г, 6.50 ммоль), Oxyma pure (995 мг, 7.00 ммоль), Fmoc-L-Asp(OBn)-OH (2.22 г, 4.98 ммоль) и 2,4,6-коллидин (1.24 мл, 9.53 ммоль) в DCM (40 мл, безводный, мол. сито). Реакционную смесь перемешивали в течение 3 часов при комнатной температуре. Осадок отфильтровали, и фильтрат помыли с помощью 0.1 М HCl, насыщенного NaHCO₃ и соляного раствора. Органическую фазу высушили над Na₂SO₄ и растворители удалили в вакууме. Неочищенное вещество очистили с помощью флэш-хроматографии с плучением 8b (3.19 г, 4.15 ммоль, 83%) в виде твердого вещества грязновато-белого цвета. MS: m/z 768.35 = [М+Н]⁺, (вычисленная = 768.35).

К раствору 8b (8.59 г, 11.19 ммоль) в THF (98 мл) DBU (2 мл) добавили. Раствор перемешивали в течение 12 мину при комнатной температуре, и растворитель концентрировали in vacuo. С помощью флэш-хроматографии получили 4.89 г 8с (8,96 ммоль, 80%). MS: m/z 546.28 = [М+Н]⁺, (вычисленная = 546.28).

6-Тритилмеркаптогексановую кислоту (2.04 г, 5.22 ммоль) растворили в DCM (20 мл, безводный, мол. сито) и DCC (1.08 г, 5.22 ммоль), и Oxyma pure (945 мг, 6,65 ммоль) добавили. Через 30 минут, 8 с (2.59 г, 4.75 ммоль) и DIPEA (1.24 мл, 7.12 ммоль) добавили. Реакционную смесь перемешивали в течение 22 часов при комнатной температуре. Смесь экстрагировали с помощью 1 N H₂SO₄ (2x), нас. NaHCO₃ (2х) и соляного раствора. Органическую фазу высушили над Na₂SO₄, концентрировали in vacuo и 8d очистили с помощью флэш-хроматографии. Выход: 4.10 г (4.47 ммоль, 94%). MS: m/z 940.12 = [M+Na]⁺, (вычисленная = 940.43).

К раствору 8d (4.10 г, 4.47 ммоль) в i-PrOH (60 мл), воду (20 мл) и LiOH (322 мг, 13.41 ммоль) добавили, и реакционную смесь перемешивали в течение 1 часа при комнатной температуре. Толуол (300 мл) добавили, и органическую фазу обработали с помощью 0.1 N HCl и соляного раствора. Органическую фазу высушили над Na₂SO₄, отфильтровали и концентрировали in vacuo. 8e очистили с помощью флэш-хроматографии. Выход: 3.53 г (4.26 ммоль, 95%). MS: m/z 827.93 = [М+Н]⁺, (вычисленная = 828.39).

Пример 9

Синтез линкерного реагента 9с

Линкерный реагент 9с синтезировали согласно следующей схеме:

8e (300 мг, 0.36 ммоль) растворили в HFIP/вода/TES (39:1:1 об./об./об., 4.1 мл). При перемешивании TFA (0.35 мл) добавили, и реакционную смесь перемешивли в течение 75 минут. Растворители выпарили в потоке аргона. Остаток распределили между водой (20 мл) и DCM (40 мл). Водную фазу собрали, DCM фазу промыли водой (5 мл), и обе водные фазы объединили. Значение рН полученного раствора довели до рН 7.4 с помощью натрий-фосфатного буфера (0.5 М, 5 мл), и раствор 2,2'-дитиодипиридина в 1 мл добавили, и полученную суспензию перемешивали в течение 30 минут. Смесь лиофилизовали, и остаток суспендировали в ACN/вода (7:3 об./об., 9 мл) и отфильтровали. Фильтрат очистили с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ с получением 9а. Выход: 90 мг, 0.11 ммоль (TFA соль), 47%, MS: m/z 415.25 = [М+Н]⁺, (вычисленная = 415.15).

9а (90 мг, 0.17 ммоль) растворили в DCM (1.2 мл) и (5-метил-2-оксо-1,3-диоксол-4-ил)-метил 4-нитрофенил карбонат (138 мг, 0.47 ммоль) и 2,4,6-коллидин (129 мкл, 0.98 ммоль) добавили при перемешивании. DMF (1 мл) добавили для усиления растворения образованного осадка. Через 2 часа и 8 часов DIPEA (19 мкл, 0.11 ммоль, каждый раз) добавили, и реакционную смесь перемешивали в течение 48 часов. Реакцию погасили с помощью АсОН (38 мкл), и DCM выпарили в потоке азота. Остаток разбавили с помощью ACN/вода/TFA (1:1:0.002 об./об./об.) и очистили с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ с получением 9b. Выход: 64 мг, 0.11 ммоль, 65%, MS: m/z 571.09 = [M+H]⁺, (вычисленная = 571.15).

9b (32 мг, 56 мкмоль) растворили в DCM. При перемешивании NHS (8 мг, 67 мкмоль), DCC (14 мг, 67 мкмоль) и DMAP (0.7 мг, 6 ммоль) добавили. Реакционную смесь перемешали, и через 1.5 часа и 3.5 часа DCC добавили (3.5 мг, 11 мкмоль и 2.3 мг, 7 мкмоль, соответственно). Растворитель выпарили в потоке аргона, и остаток суспендировали в вода/ACN/TFA (1:9:0.01 об./об./об., 3 мл) и отфильтровали. Фильтрат очистили с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ с получением 9 с (28 мг, 42 мкмоль, 75%). MS: m/z 668.17 = [М+Н]⁺, (вычисленная = 668.17).

Пример 10

Синтез линкерного реагента 10f

Линкерный реагент 10f синтезировали согласно следующей схеме:

Fmoc-N-Me-L-Asp(0tBu)-OH (1 г, 2.35 ммоль) растворили в DCM (35 мл) и DCC (0.68 г, 3.29 ммоль), Oxyma pure (0.5 г, 3.53 ммоль) и 2,4,6-коллидин (0.49 мл, 3.76 ммоль) добавили. N-Вос-N-метил-этилендиамин растворили в DCM (15 мл) и медленно добавили с помощью шприца к реакционной смеси. Реакционную смесь перемешали в течение 16 часов, остаток отфильтровали, и фильтрат промыли с помощью 0.1 М HCl (50 мл). Водный слой реэкстрагировали дважды с помощью DCM (20 мл). Органические слои объединили и промыли с помощью насыщенного раствора бикарбоната натрия (1×50 мл, 2×25 мл) и соляного раствора (1×50 мл). Органическую фазу высушили над Na₂SO₄, концентрировали in vacuo, и 10а очистили с помощью флэш-хроматографии. Выход: 1.36 г (2.33 ммоль, 99%). MS: m/z 582.32 = [М+Н]⁺, (вычисленная = 582.32).

10а (1.36 г, 2.33 ммоль) растворили в THF (20 мл), и DBU (0.4 мл) добавили, и реакционную смесь перемешивали в течение 12 минут. АсОН (0.5 мл) добавили, и смесь концентрировали in vacua, и 10b очистили с помощью флэш-хроматографии. Выход: 0.82 г (2.28 ммоль, 98%). MS: m/z 360.25 = [M+H]⁺, (вычисленная = 360.25).

6-Ацетилмеркаптогексановую кислоту (0.49 г, 2.58 ммоль) растворили в DCM (25 мл) и DCC (0.53 г, 2.58 ммоль), Oxyma pure (0.47 г, 3.19 ммоль) добавили. Реакционную смесь перемешали в течение 45 минут и отфильтровали, применяя шприц с фриттой, в раствор 10b (0.82 г, 2.28 ммоль) в DCM (12 мл). DIPEA (0.61 мл, 3.42 ммоль) добавили, и реакционную смесь перемешали. Из-за недостаточного превращения Oxyma pure (0.2 г, 1.4 ммоль) и DIPEA (0.25 мл, 1.4 ммоль) добавили, и реакционную смесь перемешивали в течение 16 часов. Из-за недостаточного превращения 6-ацетилмеркаптогексановую кислоту (0.49 г, 2.58 ммоль), DCC (0.53 г, 2.58 ммоль) и Oxyma pure (0.47 г, 3.19 ммоль) перемешали в течение 30 минут, и отфильтровали в реакционную смесь. DIPEA (0.6 мл, 3.42 ммоль) добавили, и реакционную смесь перемешивали в течение 2.5 часов. Реакционную смесь промыли с помощью 0.1 М H₂SO₄ (20 мл), насыщенного раствора бикарбоната натрия (2×20 мл) и соляного раствора (20 мл). Органическую фазу высушили над Na₂SO₄, концентрировали in vacuo, и 10 с очистили с помощью флэш-хроматографии. Выход: 0.74 г (1.39 ммоль, 60%). MS: m/z 532.30 = [М+Н]⁺, (вычисленная = 532.31).

10с (0.74 г, 1.39 ммоль) растворили в TFA/TES/вода (95:2.5:2.5 об./об./об., 5.25 мл) и перемешали в течение 30 минут. Смесь концентрировали in vacua и очистили с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ с получением 10d (0.38 г, 0.78 ммоль, 56%) MS: m/z 376.19 = [М+Н]⁺, (вычисленная = 376.19).

10d (0.38 г, 0.78 ммоль) растворили в DCM (7 мл) и (5-метил-2-оксо-1,3-диоксол-4-ил)-метил 4-нитрофенил карбонат (0.35 г, 1.17 ммоль) и 2,4,6-коллидин (0.45 мл, 3.51 ммоль) добавили, и реакционную смесь перемешали. Через 1 час 2,4,6-коллидин (0.2 мл, 1.56 ммоль) добавили, и реакционную смесь перемешивали в течение 20 часов. Реакционную смесь концентрировали in vacua и очистили с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ с получением 10е (0.26 г, 0.49 ммоль, 63%) MS: m/z 532.20 = [М+Н]⁺, (вычисленная = 532.20).

10е (0.26 г, 0.49 ммоль) растворили в DCM (3.6 мл) и DCC (0.12 г, 0.59 ммоль), NHS (68 мг, 0.59 ммоль) и DMAP (6 мг, 0.05 ммоль) добавили. Реакционную смесь перемешали в течение 1 часа. Полученную суспензию отфильтровали, и остаток промыли с помощью DCM (2 мл). Фильтрат очистили с помощью флэш-хроматографии с получением 10f в виде пены белого цвета. Выход: 0.27 г (0.43 ммоль, 87%). MS: m/z 629.21 = [М+Н]⁺, (вычисленная = 629.21).

Пример 11

Синтез линкерного реагента 11d

Линкерный реагент 11d синтезировали согласно следующей схеме:

2-Хлортритилхлоридную смолу (1.4 ммоль/г, 357 мг, 0.5 ммоль) отвесили в 10 мл шприц с фриттой. Смола набухла в два раза в присутствии 2 мл DCM. N-Fmoc-N-метил-L-аспартат(СНВu)-ОН (532 мг, 1.25 ммоль и DIPEA (305 мкл, 1.75 ммоль) растворили в DCM (3 мл) и втянули в шприц. Шприц встряхивали в течение 1 часа. МеОН (0.5 мл) втянули в шприц, и шприц встряхивали в течение 30 минут. Смолу промыли 5 раз с DCM (4 мл) и 5 раз с DMF (4 мл). Смолу взбалтывали 3 раза в течение 5 минут с DMF : DBU : пиперидин (96:2:2 об./об./об., 4 мл). Смолу промыли 5 раз с DMF (4 мл). 6-тритилмеркаптогексановой кислотой (488 мг, 1.25 ммоль) и HATU (475 мг, 1.25 ммоль) растворили в DMF (3 мл), и DIPEA (436 мкл, 2.5 ммоль) добавили. Через 1 минуту преинкубации раствор втянули в шприц, и шприц встряхивали в течение 1 часа. Смолу промыли 5 раз с DMF (4 мл), 5 раз с DCM (4 мл) и дважды с МеОН (4 мл) и высушили in vacuo. Раствор HFIP/TES/уксусная кислота (90/5/5 об./об./об., 3 мл каждой) втянули в шприц, и шприц встряхивали дважды в течение 30 минут. Растворитель собрали, фильтраты выпарили в потоке азота. Остаток суспендировали в ACN/вода (1:1 об./об., 5 мл) и отфильтровали. 2,2'-дитиодипиридин (220 мг, 1 ммоль) в ACN (0.5 мл) добавили к фильтрату. рН реакционной смеси довели до 7 с помощью натрий-фосфатного буфера с рН 7.4 (0.5 М, 1.2 мл) и перемешали в течение 15 минут. Продукт непосредственно очистили с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ с получением На (117 мг, 0.27 ммоль, 53%) MS: m/z 443.30 = [М+Н]⁺, (вычисленная = 443.17).

11а (117 мг, 0.27 ммоль) растворили в DCM (2.4 мл). PyBOP (166 мг, 0.32 ммоль), DIPEA (185 мкл, 1.06 ммоль) и N-Boc-N-метилэтилендиамин (57 мкл, 0.32 ммоль) добавили, и реакционную смесь перемешивали в течение 45 минут. Уксусную кислоту (185 мкл) добавили, и растворители удалили в потоке азота. Остаток растворили с помощью ACN/вода/TFA (2:1:0.003 об./об./об.) и очистили с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ с получением 11b (135 мг, 0.23 ммоль, 85%) MS: m/z 599.27 = [М+Н]⁺, (вычисленная = 599.29).

11b (135 мг, 0.23 ммоль) растворили в TFA/TES/вода (95:2.5:2.5 об./об./об., 5 мл). Через 15 минут растворители выпарили в потоке азота. Остаток разбавили с помощью ACN/вода 1:1 и лиофилизовали. Остаток растворили в DCM (1.5 мл), и (5-метил-2-оксо-1,3-диоксол-4-ил)-метил 4-нитрофенил карбонат (80 мг, 0.27 ммоль) добавили. При перемешивании DIPEA (78 мкл, 0.46 ммоль) медленно добавили, пока реакционная смесь не окрасилась в бледно-желтый цвет. Еще DIPEA (39 мкл, 0.23 ммоль) добавили, и реакционную смесь перемешивали в течение 1 часа. После добавления DIPEA (20 мкл, 0.12 ммоль) реакционную смесь перемешали в течение 30 минут. Уксусную кислоту (140 мкл) добавили, и растворители удалили в потоке азота. Остаток разбавили с помощью ACN/вода/TFA (1:1:0.002 об./об./об., 3 мл) и очистили с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ с получением 11с (69 мг, 0.12 ммоль, 51%). MS: m/z 599.19 = [М+Н]⁺, (вычисленная = 599.19).

11c (69 мг, 0.12 ммоль) растворили в DCM и NHS (16 мг, 0.14 ммоль), DCC (29 мг, 0.14 ммоль) и DMAP (1.4 мг, 0.012 ммоль) добавили, и реакционную смесь перемешивали в течение 75 минут. Растворитель выпарили в потоке азота, и остаток суспендировали в ACN/вода/TFA (1:1:0.002 об./об./об., 3.5 мл) и отфильтровали. Фильтрат очистили с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ с получением 11d (60 мг, 0.09 ммоль, 75%). MS: m/z 696.20 = [M+H]⁺, (вычисленная = 696.20).

Пример 12

Синтез линкерного реагента 12е

Линкерный реагент 12е синтезировали согласно следующей схеме:

К раствору N-Вос-N-метилэтилендиамина (2 г, 11.48 ммоль) и NaCNBH₃ (819 мг, 12.63 ммоль) в МеОН (20 мл) добавили 2,4,6-триметоксибензальдегид (2.08 мг, 10.61 ммоль) по частям. Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 90 минут, подкислили с помощью 3 М HCl (4 мл) и перемешивали еще 15 минут. Реакционную смесь добавили к насыщенному раствору NaHCO₃ (200 мл) и экстрагировали 5 × с помощью CH₂Cl₂. Объединенные органические фазы высушили над Na₂SO₄ и растворители выпарили in vacuo. Полученный N-Boc-N-метил-N'-tmob-этилендиамин (12а) полностью высушили под высоким вакуумом и применяли на следующей стадии реакции без дальнейшей очистки. Выход: 3.76 г (11.48 ммоль, 89% чистота, 12а : дважды Tmob защищенный продукт = 8:1). MS: m/z 355.22 = [М+Н]⁺, (вычисленная = 355.23).

К раствору 12а (2 г, 5.65 ммоль) в CH₂Cl₂ (24 мл) COMU (4.84 г, 11.3 ммоль), N-Fmoc-N-метил-L-Asp(OBn)-OH (2.08 г, 4.52 ммоль) и 2,4,6-коллидин (2.65 мл, 20.34 ммоль) добавили. Реакционную смесь перемешивали в течение 3 часов при комнатной температуре, разбавили с помощью CH₂Cl₂ (250 мл) и промыли 3x с 0.1 М H₂SO₄ (100 мл) и 3 × с соляным раствором (100 мл). Водные фазы реэкстрагировали с CH₂Cl₂ (100 мл). Объединенные органические фазы высушили над Na₂SO₄, отфильтровали и остаток концентрировали до объема 24 мл. 12b очистили с применением флэш-хроматографии. Выход: 5.31 г (148%, 6.66 ммоль) MS: m/z 796.38 = [М+Н]⁺, (вычисленная = 796.38).

К раствору 12b [5.31 г, максимум 4.51 ммоль относительно N-Fmoc-N-Me-L-Asp(OBn)-OH] в THF (60 мл) DBU (1.8 мл, 3% об./об.) добавили. Раствор перемешивали в течение 12 мину при комнатной температуре, разбавили с помощью CH₂Cl₂ (400 мл) и промыли 3 × с 0.1 М H₂SO₄ (150 мл) и 3 × соляным раствором (150 мл). Водные фазы реэкстрагировали с CH₂Cl₂ (100 мл). Объединенные органические фазы высушили над Na₂SO₄ и отфильтровали. 12 с выделили при испарении растворителя и применяли в следующей реакции без дальнейшей очистки. MS: m/z 574.31 = [М+Н]⁺, (вычисленная = 574.31).

12с (5.31 г, 4.51 ммоль, неочищенный) растворили в ацетонитриле (26 мл), и COMU (3.87 г, 9.04 ммоль), 6-тритилмеркаптогексановую кислоту (2.12 г, 5.42 ммоль) и 2,4,6-коллидин (2.35 мл, 18.08 ммоль) добавили. Реакционную смесь перемешивали в течение 4 часов при комнатной температуре, разбавили с помощью CH₂Cl₂ (400 мл) и промыли 3 × с 0.1 М H₂SO₄ (100 мл) и 3 × соляным раствором (100 мл). Водные фазы реэкстрагировали с CH₂Cl₂ (100 мл). Объединенные органические фазы высушили над Na₂SO₄, отфильтровали, и 12d выделили при испарении растворителя. Продукт 7i очистили с применением флэш-хроматографии. Выход: 2.63 г (62%, 94% чистота) MS: m/z 856.41 = [М+Н]⁺, (вычисленная = 856.42).

К раствору 12d (2.63 г, 2.78 ммоль) в i-PrOH (33 мл) и H₂O (11 мл) добавили LiOH (267 мг, 11.12 ммоль), и реакционную смесь перемешивали в течение 70 минут при комнатной температуре. Смесь разбавили с помощью CH₂Cl₂ (200 мл) и промыли 3x с 0.1 М H₂SO₄ (50 мл) и 3x соляным раствором (50 мл). Водные фазы реэкстрагировали с CH₂Cl₂ (100 мл). Объединенные органические фазы высушили над Na₂SO₄, отфильтровали, и 12е выделили при испарении растворителя. 12е очистили с применением флэш-хроматографии. Выход: 2.1 г (88%) MS: m/z 878.4 = [M+Na]⁺, (вычисленная = 878.40).

Пример 13

Синтез линкерного реагента 13g

Линкерный реагент 13g синтезировали согласно следующей схеме:

К раствору N,N-диметилэтилендиамина (441 мг, 5 ммоль) и NaCNBH₃ (439 мг, 7 ммоль) в МеОН (21 мл) добавили раствор 2,4,6-триметоксибензальдегида (1.34 г, 6.85 ммоль) в DCM и МеОН (17 мл каждый) с помощью шприца. Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 60 минут, подкислили с помощью 0.5 М HCl (50 мл) и перемешивали еще 15 минут. Реакционную смесь довели до рН > 12 путем добавления 1 М NaOH и экстрагировали 4 раз этилацетатом (1×100 мл, 3×50 мл). Объединенные органические фазы высушили над MgSO₄ и растворители выпарили in vacuo. Полученный N,N-диметил-N'-tmob-этилендиамин (13а) полностью высушили под высоким вакуумом и применяли на следующей стадии реакции без дальнейшей очистки. Выход: 1.63 г (содержит дважды Tmob защищенный продукт). MS: m/z 269.19 = [М+Н]⁺, (вычисленная = 269.19).

13а (268 мг, около 0.83 ммоль) растворили в THF (5 мл), и 2,3-пиридиндикарбоновой кислоты ангидрид (149 мг, 1 ммоль), DIPEA (362 мкл, 2.08 ммоль) и DMF (1 мл) добавили. Раствор перемешивали в течение 15 минут, погасили с помощью АсОН (362 мкл), и THF удалили в потоке азота. Остаток разбавили с помощью ACN/вода/TFA (1:1:0.002 об./об./об., 4 мл) и очистили с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ с получением 13b (244 мг, 0.46 ммоль, 55%). MS: m/z 418.20 = [М+Н]⁺, (вычисленная = 418.20).

12е (500 мг, 0.58 ммоль) растворили в TFA/TES/DTT/вода (85:5:5:5 об./об./об./об., 10 мл) и перемешали в течение 4 часов. Растворители удалили в потоке азота, и остаток суспендировали в ACN/вода и отфильтровали. Фильтрат очистили с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ с получением 13с (71 мг, 0.21 ммоль, 36%). MS: m/z 334.43 = [М+Н]⁺, (вычисленная = 334.18).

13с (71 мг, 0.21 ммоль) растворили в ACN/вода (1:1, 1 мл), и 2,2'-дитиодипиридин (93 мг, 0.42 ммоль) в ACN/вода (1:1, 1 мл, суспензия) и рН 7.4 натрий-фосфатный буфер (0.5 М, 1 мл) добавили. Полученного раствора перемешали в течение 15 минут и непосредственно очистили с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ с получением 13d (64 мг, 0.15 ммоль, 68%). MS: m/z 443.30 = [M+H]⁺, (вычисленная = 443.18).

13b (91 мг, 0.22 ммоль) растворили в DMF (1 мл), и PyBOP (113 мг, 0.22 ммоль) добавили. DIPEA (50 мкл, 0.29 ммоль) добавили, и раствор перемешали в течение 15 минут. 13d (64 мг, 0.145 ммоль) растворили в DCM (1.5 мл) и добавили к DMF раствору. Реакционную смесь перемешали в течение 100 минут, и АсОН (50 мкл) добавили. DCM удалили в потоке азота, и остаток растворили в ACN/вода/TFA и очистили с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ с получением 13е (26 мг, 31 мкмоль, 21%). MS: m/z 842.14 = [М+Н]⁺, (вычисленная = 842.36).

13е (26 мг, 31 мкмоль) растворили в HFIP/TES/вода (39:1:1 об./об./об., 1 мл), и TFA (83 мкл) добавили при перемешивании. Через 90 минут растворители выпарили in vacuo, и остаток очистили с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ с получением 13f (11 мг, 17 мкмоль, 54%). MS: m/z 662.28 = [М+Н]⁺, (вычисленная = 662.28).

13f (11 мг, 17 мкмоль) растворили в DCM (1.5 мл), DCC (4.2 мг, 20 мкмоль), NHS (2.3 мг, 20 мкмоль) и DMAP (0.2 мг, 1 мкмоль) добавили, и суспензию перемешали. Через 1 час и 2 часа вышеуказанное количество DCC и NHS добавили снова. Через 3 часа растворитель выпарили в потоке азота. Остаток суспендировали в ACN/вода/TFA (1:1:0.002, 3 мл) и отфильтровали. Фильтрат очистили с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ с получением 13g (14 мг, 16 мкмоль (TFA соль), 94%). MS: m/z 759.30 = [М+Н]⁺, (вычисленная = 759.30).

Пример 14

Синтез линкерного реагента 14f

Линкерный реагент 14f синтезировали согласно следующей схеме:

Раствор n-монометокситритилхлорида (1.54 г, 5 ммоль) в DCM (10 мл) медленно добавили при перемешивании к раствору 3-(метиламино)пропиламина (4.4 г, 50 ммоль) в DCM (10 мл). Через 2 часа диэтиловый простой эфир (166 мл) добавили. Соляный раствор (100 мл) смешали с NaOH (4 М, 80 мкл), и реакционную смесь промыли с помощью этой смеси (3×33 мл). Органический слой промыли с помощью соляного раствора (30 мл), высушили с помощью MgSO₄ и концентрировали in vacuo. Выход (14а): 1.79 г (4.95 ммоль, 99%).

14а (0.36 г, 1 ммоль) растворили в THF (7 мл) и DIPEA (0.44 мл, 2.5 ммоль), и раствор хинолинового ангидрида (0.18 г, 1.2 ммоль) в THF (3 мл) добавили при перемешивании. Через 30 минут раствор 13а (0.54 г, 2 ммоль) в DMF (2 мл) и PyBOP (0.78 г, 1.5 ммоль) добавили, и реакционную смесь перемешивали в течение 1 часа. Реакционную смесь разбавили с помощью этилацетата (50 мл) и промыли с помощью NaOH (1 M, 20 мл). Водную фазу реэкстрагировали этилацетатом (2×20 мл), и собранные органически фазы объединили и концентрировали in vacuo и очистили с применением флэш-хроматографии с получением 14b (0.4 г, 0.53 ммоль, 53%) MS: m/z 760.41 = [М+Н]⁺, (вычисленная = 760.41).

14b (0.4 г, 0.53 ммоль) растворили в ACN (3 мл), и HCl (0.4 M, 3 мл) добавили, и раствор перемешали в течение 4 часов. Реакцию погасили с помощью NaOH (1 M, 15 мл) и экстрагировали с помощью DCM (5×30 мл). Объединенную органическую фазу высушили над MgSO₄, концентрировали in vacuo, и 14с очистили с помощью флэш-хроматографии. Выход: 0.32 г (0.42 ммоль, 81%, ММТ соль) MS: m/z 488.31 = [М+Н]⁺, (вычисленная = 488.29).

11a (49 мг, 0.11 ммоль) и 14 с (114 мг, 0.15 ммоль) растворили в DCM (1.4 мл), и PyBOP (62 мг, 0.12 ммоль) и DIPEA (38 мкл, 0.22 ммоль) добавили при перемешивании. Через 2 часа АсОН (40 мкл) добавили, и растворители выпарили in vacuo. Остаток растворили в ACN/вода/TFA (1:1:0.002 об./об./об., 5 мл) и очистили с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ с получением 14d (104 мг, 0.1 ммоль TFA соль, 92%). MS: m/z 912.19 = [М+Н]⁺, (вычисленная = 912.44).

14d (104 мг, 0.1 ммоль) растворили в HFIP/TES/вода (39:1:1 об./об./об., 3 мл) и TFA (0.25 мл) добавили при перемешивании. Через 2 часа TFA (0.25 мл) добавили при перемешивании и реакционную смесь перемешали в течение еще 20 часов. Смесь концентрировали in vacuo, и остаток растворили в ACN/вода/TFA (1:1:0.002 об./об./об., 3 мл) и очистили с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ с получением 14е (28 мг, 35 мкмоль TFA соль, 35%). MS: m/z 676.13 = [M+H]⁺, (вычисленная = 676.30).

14е (25 мг, 32 мкмоль) растворили в DCM (2 мл) и DCC (10 мг, 48 мкмоль), NHS (5.5 мг, 48 мкмоль) и DMAP (0.4 мг, 3.2 мкмоль) добавили, и суспензию перемешали. Через 1.5 часа вышеуказанное количество DCC и NHS добавили снова. Через 3 часа растворитель выпарили в потоке азота. Остаток суспендировали в ACN/вода/TFA (1:1:0.002 об./об./об., 4 мл) и отфильтровали. Фильтрат очистили с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ с получением 14f (28 мг, 31.6 мкмоль TFA соль, 99%). MS: m/z 773.31 = [М+Н]⁺, (вычисленная = 773.31).

Пример 15

Синтез линкерного реагента 15f

Линкерный реагент 15f синтезировали согласно следующей схеме:

К раствору 11a (0.29 г, 0.65 ммоль) и PyBOP (0.34 г, 0.65 ммоль) в ACN (5 мл) DIPEA (0.57 мл, 3.27 ммоль) добавили. Эту смесь перемешивали при комнатной температуре в течение одной минуты перед тем, как N,N-диметиламинопропан-1,3-диамин (0.12 мл, 0.98 ммоль) добавили. Через 30 минут АсОН (0.7 мл) добавили для погашения реакции. Эту смесь was разбавили с помощью вода и очистили с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ. Объединенное промежуточное вещество растворили в TFA (3 мл), и смесь перемешивали в течение 30 минут перед тем, как TFA удалили потоком N₂. Остаток высушили in vacua всю ночь с получением 15а (0.42 г, 0.61 ммоль (2 × TFA соль), 93%) в виде бесцветного масла, которое применяли на следующей стадии без дальнейшей очистки. MS: m/z=471.21 = [М+Н]⁺, (вычисленная 471.21).

К раствору 15а (0.23 мг, 0.33 ммоль) в DCM (5 мл) DMAP (8 мг, 65 мкмоль), NHS (75 мг, 0.65 ммоль) и DCC (135 мг, 0.65 ммоль) добавили. После перемешивания в течение 3 часов реакционную смесь погасили путем добавления АсОН (10 мкл). Растворитель удалили потоком N₂, и остаток суспендировали в H₂O/ACN/TFA (1:1:0.002 об./об./об.) и отфильтровали. Фильтрат очистили с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ с получением 15b (83 мг, 0.10 ммоль (2 × TFA соль), 32%) в виде бесцветного масла. MS: m/z=568.23 = [М+Н]⁺, (вычисленная 568.23).

Пример 16

Синтез метки для очистки 16е

Метку для очистки 16е синтезировали согласно следующей схеме:

К суспензии 6,6'-дитиодиникотиновой кислоты (0.62 г, 2 ммоль) в ACN (20 мл) добавили PyBOP (2.08 г, 4 ммоль) и DIPEA (1.29 г, 1.74 мл, 10 ммоль), и смесь перемешивали в течение 1 минуты. Полученный раствор коричневого цвета добавили к раствору 1,9-бис-Вос-1,5,9-триазанона (1.99 г, 6 ммоль) в смеси ACN (20 мл) и DMF (5 мл) и перемешали в течение 2 часов. Реакционную смесь разбавили с помощью EtOAc (150 мл), и органический слой промыли с помощью водной HCl (10 мМ, 5×100 мл), насыщенного раствора NaHCO₃ (3×100 мл) и соляного раствора (100 мл), последовательно. После высушивания над MgSO₄ и фильтрации, растворитель удалили in vacua, и неочищенный остаток очистили с помощью флэш-хроматографии с получением 16а (1.92 г, макс. 2 ммоль) в виде пены бледно-желтого цвета. Продукт содержит небольшое неотделяемое количество трипирролидин фосфорамида, который удалили на следующей стадии. MS: m/z=935.47 = [М+Н]⁺, (вычисленная 935.47).

16а (1.92 г, макс. 2 ммоль) растворили в TFA (10 мл), и раствор перемешивали в течение 10 минут. Реакционную смесь добавили по каплям в охлажденный льдом диэтиловый простой эфир (160 мл) до осаждения продукта. Полученную суспензию центрифугировали при 7000 × G и 2°С в течение 3 минут. Супернатант отделили, и остаток растворили в метаноле (10 мл). Этот раствор добавили по каплям в охлажденный льдом диэтиловый простой эфир (160 мл), и образованную суспензию центрифугировали при 7000 × G и 2°С в течение 3 минут. После отделения супернатанта, процедуру осаждения осуществили еще два раза, подобно тому, как описано выше. Оставшийся маслянистый осадок высушили in vacuo с получением 16b (1.77 г, 1.45 ммоль (6 × TFA соль), 73%) в виде очень гигроскопичного порошка светло-коричневого цвета. MS: m/z=535.26 = [М+Н]⁺, (вычисленная 535.26).

К раствору 16b (3.30 г, 2.7 ммоль) в DMF (90 мл) добавили DIPEA (5.4 мл, 31 ммоль) и Boc-L-Lys(Boc)-OSu (5.62 г, 12.7 ммоль). Смесь перемешивали в течение 14 часов, перед тем, как ее разбавили с помощью этилацетата (600 мл). Органический слой промыли с помощью водной HCl (10 мМ, 5×300 мл), насыщенного раствора NaHCO₃ (3×300 мл) и соляного раствора (300 мл) и высушили над MgSO₄. После фильтрации растворитель удалили in vacuo, и неочищенный остаток очистили с помощью флэш-хроматографии с получением 16 с (5.52 г, макс. 2.7 ммоль) в виде пены бледно-желтого цвета с 90% чистотой. MS: m/z=924.54 = [M+2H]⁺, (вычисленная 924.53).

16с (5.52 г, макс. 2.7 ммоль) растворили в TFA (20 мл). После перемешивания в течение 15 минут продукт осадили путем добавления реакционной смеси по каплям в охлажденный льдом диэтиловый простой эфир (160 мл). Полученную суспензию центрифугировали при 7000 × G и 2°С в течение 3 минут. Супернатант отделили, и остаток растворили в метаноле (10 мл). Этот раствор добавили по каплям в охлажденный льдом диэтиловый простой эфир (160 мл), и образованную суспензию центрифугировали при 7000 × G и 2°С в течение 3 минут. После отделения супернатанта процедуру осаждения осуществили еще два раза, подобно тому, как описано выше. Оставшийся маслянистый осадок высушили in vacuo с получением 16d (4.96 г, 2.27 ммоль (10 × TFA соль), 84%) в виде очень гигроскопичного порошка светло-коричневого цвета. MS: m/z=1046.64 = [М+Н]⁺, (вычисленная 1046.64).

К раствору 16d (1.53 г, 0.7 ммоль) в сухом DMF (20 мл) добавили раствор N,N-диметилглицина (1.16 г, 11.2 ммоль), PyBOP (5.83 г, 11.2 ммоль) и DIPEA (3.23 г, 4.36 мл, 25 ммоль) в DMF (35 мл) и перемешали в течение 1 часа. Смесь затем концентрировали in vacuo до приблизительного объема 10 мл. К этому остатку добавили воду до объема 100 мл, и раствор подкислили до рН 1-2 путем добавления TFA. Мутную смесь центрифугировали при 5000 × G и 2°С в течение 3 минут. Маслянистый осадок отделили: и супернатант очистили с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ с получением 16е (1.05 г, 0.37 ммоль (10 × TFA соль), 53%) в виде бесцветного масла. MS: m/z=864.54 = [M+2H]²⁺, (вычисленная 864.54).

Пример 17

Синтез линкерного реагента 17g

Линкерный реагент 17g синтезировали согласно следующей схеме:

2-Хлортритилхлоридную смолу (1.4 ммоль/г, 1.43 г, 2 ммоль) отвесили в 20 мл шприц с фриттой. Смола набухла в два раза в присутствии 10 мл DCM. N-Fmoc-N-метил-Z-Asp(OtBu)-OH (1.06 г, 2.5 ммоль) растворили в DCM (6 мл) и втянули в шприц. DIPEA (436 мкл, 2.5 ммоль) растворили в DCM (1 мл) и втянули в шприц. Шприц встряхивали в течение 5 минут. DIPEA (654 мкл, 3.75 ммоль) растворили в DCM (1 мл) и втянули в шприц. Шприц встряхивали в течение 1 часа. МеОН (2 мл) втянули в шприц, и шприц встряхивали в течение 30 минут. Смолу промыли 5 раз с DMF (10 мл). Смолу взбалтывали 3 раза в течение 5 минут с DMF : DBU : пиперидин (96:2:2 об./об./об. 7 мл). Смолу промыли 5 раз с DMF (5 мл). 6-Тритилмеркаптогексановую кислоту (1.95 г, 5 ммоль) и PyBOP (2.6 г, 5 ммоль) растворили в DMF (6 мл), и DIPEA (3.5 мл, 20 ммоль) добавили. Через 1 минуту преинкубации раствор втянули в шприц, и шприц встряхивали в течение 3 часов. Смолу промыли 5 раз с DMF (7 мл), 5 раз с DCM (7 мл). Раствор HFIP/DCM (1/4 об./об., 8 мл каждый) втянули в шприц, и шприц встряхивали 3 раза в течение 30 минут. Собранные фильтраты концентрировали in vacuo. Неочищенный 17а (0.84 г, 1.45 ммоль, 73%) применяли без дальнейшей очистки на следующей стадии. MS: m/z 598.18 = [M+Na]⁺, (вычисленная = 598.26).

17а (1.67 г, 2.9 ммоль) растворили в DCM (20 мл), и N-Boc-N-метилэтилендиамин (0.62 мл, 3.48 ммоль) и PyBOP (1.81 г, 3.48 ммоль) добавили. DIPEA (2.02 мл, 11.6 ммоль) добавили, и реакционную смесь перемешивали в течение 1 часа. АсОН (2 мл) добавили, смесь разбавили с помощью DCM (40 мл) и промыли с помощью вода (2×20 мл). Органический слой высушили над MgSO₄ и концентрировали in vacuo, и неочищенный остаток очистили с помощью флэш-хроматографии с получением 17b (1.74 г, 2.38 ммоль, 82%). MS: m/z=754.19 = [M+Na]⁺, (вычисленная 754.39).

17b (1.74 г, 2.38 ммоль) и трифенилметанол (0.62 г, 2.38 ммоль) растворили в DCM (7.2 мл), и TFA (7.2 мл) добавили при перемешивании. Реакционную смесь перемешали в течение 90 минут, и растворители удалили в потоке азота за 45 минут. Остаток совместно выпарили с DCM. Остаток суспендировали в ACN/вода/TFA (2:1:0.003 об./об./об., 14 мл) и отфильтровали. Фильтрат очистили с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ с получением 17с (0.9 г, 1.3 ммоль TFA соль, 55%). MS: m/z 576.20 = [M+H]⁺, (вычисленная = 576.29).

17с (0.9 г, 1.3 ммоль) растворили в DCM (20 мл), и (5-метил-2-оксо-1,3-диоксол-4-ил)-метил 4-нитрофенил карбонат (0.46 г, 1.56 ммоль) добавили. DIPEA (0.45 мл, 2.6 ммоль) медленно добавили, и реакционную смесь перемешивали в течение 30 минут. DIPEA (0.11 мл, 0.65 ммоль) добавили, и реакционную смесь перемешивали в течение 30 минут. Снова, DIPEA (0.11 мл, 0.65 ммоль) добавили, и реакционную смесь перемешивали в течение 60 минут. АсОН (0.68 мл) добавили, и смесь концентрировали in vacua, и неочищенный остаток очистили с помощью флэш-хроматографии с получением 17d (1.04 г, макс. 1.3 ммоль). MS: m/z=754.28 = [M+Na]⁺, (вычисленная 754.28).

17d (1.04 г, макс. 1.3 ммоль) растворили в HFIP/TES/вода (39:1:1 об./об./об., 8.2 мл), и TFA (0.66 мл) добавили. После перемешивания в течение 15 минут реакционную смесь концентрировали in vacuo, остаток суспендировали в ACN/вода/TFA (1:1:0.002 об./об./об. 12 мл) и отфильтровали. Фильтрат очистили с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ с получением 17е (0.32 г, 0.65 ммоль, 50%). MS: m/z 490.19 = [М+Н]⁺, (вычисленная = 490.19).

17е (181 мг, 0.37 ммоль) растворили в ACN/вода/TFA (1:1:0.002 об./об./об., 3 мл). 16е (1.05 г, 0.37 ммоль (10 × TFA соль) растворили в ACN/вода (1:1 об./об., 20 мл). Оба раствора объединили, и рН 7.4 натрий-фосфатный буфер (0.5 М, 4 мл) добавили, и смесь перемешали в течение 30 минут. Значение рН раствор довели до около рН 2 путем добавления АСМ/вода/ТРА (1:1:0.22 об./об./об.), и ACN удалили in vacuo. Остаток очистили с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ с получением 17f (0.47 г, 0.24 ммоль 5 × TFA соль, 65%). MS: m/z 676.86 = [M+2H]²⁺, (вычисленная = 676.86).

17f(0.18 г, 94 мкмоль) растворили в ACN (6 мл), и NHS (92 мг, 0.8 ммоль) и DCC (166 мг, 0.8 ммоль) добавили, и реакционную смесь перемешивали в течение 1 часа. Растворитель удалили in vacuo, и остаток суспендировали в ACN/вода/TFA (0.15:0.85:0.001 об./об./об., 6 мл) и отфильтровали. Фильтрат очистили с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ с получением 17g (129 мг, 64 мкмоль 5 × TFA соль, 68 %). MS: m/z 725.37 = [M+H]⁺, (вычисленная = 725.37).

Пример 18

Синтез линкерного реагента 18i

Линкерный реагент 18i синтезировали согласно следующей схеме:

N-Вос-этилендиамина (0.77 г, 4.8 ммоль) растворили в DCM (15 мл), и 6-тритилмеркаптогексановую кислоту (2.25 г, 5.76 ммоль) и PyBOP (3.0 г, 5.76 ммоль) добавили при перемешивании. DIPEA (2.52 мл, 14.4 ммоль) добавили, и реакционную смесь перемешивали в течение 1 часа. Реакционную смесь разбавили с помощью диэтилового простого эфира (150 мл) и промыли с помощью слегка основного соляного раствора (3×30 мл, полученного из 100 мл соляного раствора и 3 мл 0.1 М вод. NaOH). Органическую фазу промыли еще раз соляным раствором (30 мл), высушили над Na₂SO₄ и концентрировали in vacua и очистили с применением флэш-хроматографии с получением 18а в виде пены белого цвета. Выход: 2.55 г (4.79 ммоль, 99%) MS: m/z 555.24 = [M+Na]⁺, (вычисленная = 555.27).

18а (2.55 г, 4.79 ммоль) растворили в THF (26 мл) и перенесли в высушенную в печи заполненную аргоном круглодонную колбу. Borane - THF комплекс в THF (1 М, 17.7 мл, 17.71 ммоль) добавили, и реакционную смесь перемешивали в течение 15 часов. МеОН (5.4 мл) добавили медленно, и N,N'-диметилэтилендиамин (3.11 мл, 28.8 ммоль) добавили, и реакционную смесь нагревали с отгоном флегмы в течение 2.5 часов. После охлаждения реакционную смесь разбавили с помощью этилацетата и промыли с помощью насыщенного раствора бикарбоната натрия (2×125 мл) и соляного раствора (1×125 мл). Органическую фазу высушили над Na₂SO₄, концентрировали in vacua с получением 18b, который применяли без дальнейшей очистки на следующей стадии. Выход: 2.38 г (4.59 ммоль, 96%) MS: m/z 519.27 = [М+Н]⁺, (вычисленная = 519.31).

18b (1.19 г, 2.29 ммоль) растворили в DCM, и (5-метил-2-оксо-1,3-диоксол-4-ил)-метил 4-нитрофенил карбонат (1.02 г, 3.44 ммоль) и 2,4,6-коллидин (1.36 мл, 10.32 ммоль) добавили, и реакционную смесь перемешивали в течение 23 часов. Реакционную смесь концентрировали in vacua и очистили с применением флэш-хроматографии с получением 18с. Выход: 1.19 г (1.77 ммоль, 79%) MS: m/z 697.18 = [M+Na]⁺, (вычисленная = 697.29).

18с (0.5 г, 0.74 ммоль) растворили в DCM (2.5 мл), и трифенилметанол (0.19 г, 0.74 ммоль) и TFA (2.5 мл) добавили. Реакционную смесь перемешали в течение 40 минут, концентрировали в потоке аргона и высушили in vacuo (<0.1 мбар). Остаток растворили в ACN/вода (7:3 об./об., 10 мл) и очистили с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ с получением 18d (0.50 г, 0.84 ммоль, 114%). MS: m/z 575.33 = [М+Н]⁺, (вычисленная = 575.26).

2-Хлортритилхлоридную смолу (1.22 ммоль/г, 0.87 г, 1 ммоль) отвесили в 10 мл шприц с фриттой. Смола разбухла в присутствии 5 мл DCM, и ее промыли с помощью DCM (5×4 мл). N-Fmoc-L-Asp(OtBu)-OH (1.1 г, 2.7 ммоль) растворили в DCM (5 мл), и DIPEA (0.66 мл, 3.78 ммоль) добавили, и раствор втянули в шприц. Шприц встряхивали в течение 1 часа. МеОН (0.5 мл) втянули в шприц, и шприц встряхивали в течение 15 минут. Смолу промыли 5 раз с DCM (4 мл) и 5 раз с DMF (5 мл). Смолу взбалтывали 3 раза в течение 5 минут с DMF : DBU : пиперидин (96:2:2 об./об./об. 4 мл). Смолу промыли 5 раз с DMF (4 мл). Уксусный ангидрид (0.51 мл, 5.4 ммоль) и DIPEA (1.9 мл, 10.8 ммоль) растворили в DMF (6 мл), и раствор втянули в шприц, и шприц встряхивали в течение 15 минут. Смолу промыли 5 раз с DMF (4 мл), 5 раз с DCM (4 мл). Раствор HFIP/DCM (1/4 об./об., 5 мл каждый) втянули в шприц, и шприц встряхивали 3 раза в течение 10 минут. Собранные фильтраты концентрировали in vacuo. Неочищенный 18е (0.29 г, 1.23 ммоль, 114%) применяли без дальнейшей очистки на следующей стадии. MS: m/z 254.38 = [M+Na]⁺, (вычисленная = 254.12).

18е (65 мг, 0.28 ммоль) растворили в DCM (3 мл), и PyBOP (0.18 г, 0.34 ммоль) и DIPEA (0.15 мл, 0.84 ммоль) добавили. 18d (0.18 г, 0.31 ммоль) растворили в DCM (3 мл) и добавили к реакционной смеси. Реакционную смесь перемешали в течение 1 часа и концентрировали in vacuo. Остаток очистили с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ с получением 18f (97 мг, 0.12 ммоль, 44%). MS: m/z 810.02 = [M+Na]⁺, (вычисленная = 810.34).

18f (97 мг, 0.12 ммоль) растворили в TFA/TES/вода (92:2.5:2.5 об./об./об., 3 мл), и реакционную смесь перемешали энергично в течение 3 часов, тогда как поток аргона пропускали через раствор. Через 3 часа растворители удалили в потоке аргона, и остаток очистили с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ с получением 18g (16 мг, 33 мкмоль, 27%). MS: m/z 490.21 = [M+H]⁺, (вычисленная = 490.19).

18g (16 мг, 33 мкмоль) растворили в ACN/вода (1:1 об./об., 3 мл), и раствор 2,2'-дитиодипиридина (14 мг, 65 мкмоль) в ACN (0.1 мл) добавили с последующим добавлением рН 7.4 натрий-фосфатного буфера (0.5 М, 0.1 мл). Реакционную смесь перемешали в течение 4.5 часов, и продукт непосредственно очистили с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ с получением 18h (14 мг, 23 мкмоль, 71%). MS: m/z 598.98 = [М+Н]⁺, (вычисленная = 599.19).

18h (14 мг, 23 мкмоль) растворили в DCM (3 мл) и NHS (3 мг, 28 мкмоль), DCC (6.5 мг, 30 мкмоль) и DMAP (0.3 мг, 2 мкмоль) добавили. Реакционную смесь перемешали в течение 1.5 часов, и растворитель удалили в потоке аргона. Остаток суспендировали в ACN/вода/TFA (9:1:0.01 об./об./об., 3 мл) и отфильтровали. Фильтрат очистили с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ с получением 18i (17 мг, 23 мкмоль, 100%). MS: m/z 696.20 = [M+H]⁺, (вычисленная = 696.20).

Пример 19

Синтез поперечио-сшивающих реагентов 19с, 19g

Поперечно-сшивающий реагент 19с получали из монобензилового сложного эфира пробковой кислоты 2а и ПЭГ6000 согласно следующей схеме:

Для синтеза соединения 19а, монобензиловый сложный эфир пробковой кислоты 2а (6.50 г, 23.3 ммоль) и ПЭГ 6000 (40.0 г, 6.67 ммоль) растворили в 140 мл дихлорметана и охладили на ледяной бане. Раствор DCC (4.81 г, 23.3 ммоль) и DMAP (0.040 г, 0.33 ммоль) в 40 мл дихлорметана добавили. Ледяную баню удалили, и смесь перемешивали при комнатной температуре всю ночь. Полученную суспензию охладили до 0°С, и твердое вещество отфильтровали. Растворитель выпарили in vacuo.

Остаток растворили в 70 мл дихлорметана и разбавили с помощью 300 мл МТВЕ при комнатной температуре. Смесь оставили на всю ночь при -20°С. Остаток собрали путем фильтрации через стеклянный фильтр Por. 3, и промыли с помощью 500 мл охлажденного МТВЕ (-20°С). Продукт высушили in vacuo всю ночь.

Выход 41.2 г (95%) порошка белого цвета 19а.

MS: m/z 833.75 = [M+8H]⁸⁺ (вычисленная = 833.74).

Для масс-спектра полидисперсных ПЭГ-содержащих соединений, выбирался один одинарный пик массы.

Для синтеза соединения 19b, соединение 19а (41.2 г, 6.32 ммоль) растворили в метил ацетате (238 мл) и этаноле (40 мл), затем 400 мг палладия на угле добавили. В атмосфере водорода при давлении окружающей среды, смесь перемешивали всю ночь при комнатной температуре. Реакционную смесь отфильтровали через слой целита, и фильтрат выпарили и высушили in vacuo всю ночь.

Выход 38.4 г (96%) стекловидного твердого вещества 19b.

MS: m/z 750.46 = [M+9H]⁹⁺ (вычисленная = 750.56).

Для масс-спектра полидисперсных ПЭГ-содержащих соединений, выбирался один одинарный пик массы.

Для синтеза соединения 19с, соединение 19b (38.2 г, 6.02 ммоль) и TSTU (7.25 г, ммоль) растворили в 130 мл дихлорметана при комнатной температуре. Затем DIPEA (3.11 г, 24.1 ммоль) добавили, и смесь перемешивали в течение 1 часа. Полученную суспензию отфильтровали, фильтрат разбавили с помощью 100 мл дихлорметана и промыли с помощью 200 мл раствора 750 г вода / 197 г NaCl / 3 г NaOH. Органическую фазу высушили над MgSO₄, и растворитель выпарили in vacuo.

Остаток растворили в 210 мл толуола, разбавили с помощью 430 мл МТВЕ при комнатной температуре и хранили всю ночь при -20°С. Остаток собрали путем фильтрации через стеклянный фильтр Por. 3, и промыли с помощью 450 мл охлажденного МТВЕ (-20°С). Продукт высушили in vacuo всю ночь.

Выход 35.8 г (91%) порошка белого цвета 19с.

MS: m/z 857.51 = [M+8H]⁸⁺ (вычисленная = 857.51).

Для масс-спектра полидисперсных ПЭГ-содержащих соединений, выбирался один одинарный пик массы.

Поперечно-сшивающий реагент 19g получали из монобензилового сложного эфира изопропилмалоновой кислоты и ПЭГ8000 согласно следующей схеме реакции:

Для синтеза монобензилового сложного эфира изопропилмалоновой кислоты rac-19d, изопропилмалоновую кислоту (35.0 г, 239 ммоль), бензиловый спирт (23.3 г, 216 ммоль) и DMAP (1.46 г, 12.0 ммоль) растворили в 100 мл ацетонитрила. Смесь охладили до 0°С на ледяной бане. Раствор DCC (49.4 г, 239 ммоль) в 150 мл ацетонитрила добавили в течение 15 минут при 0°С. Ледяную баню удалили, и реакционную смесь перемешивали всю ночь при комнатной температуре, затем твердое вещество отфильтровали. Фильтрат выпарили при 40°С in vacua, и остаток растворили в 300 мл МТВЕ. Этот раствор экстрагировали с помощью 2×300 мл нас. водного раствора NaHCO₃, затем объединенные водные фазы подкислили до рН=1-3 с применением 6 N соляной кислоты. Полученную эмульсию экстрагировали с помощью 2×300 мл МТВЕ, и растворитель выпарили. Объединенные органические фазы промыли с помощью 200 мл нас. водного NaCl и высушили над MgSO₄. Продукт очистили на 340 г силикагеля с применением этилацетата / гептана (10:90→20:80) в качестве элюента. Элюент выпарили, и остаток высушивали in vacua всю ночь.

Выход 9.62 г (17%) бесцветного масла rac-19d.

MS: m/z 237.11 = [М+Н]⁺ (вычисленная = 237.11).

Для синтеза соединения rac-19е, монобензиловый сложный эфир изопропилмалоновой кислоты rac-19d (2.25 г, 9.50 ммоль) и ПЭГ 8000 (19.0 г, 2.38 ммоль) растворили в 100 мл дихлорметане и охладили на ледяной бане. Раствор DCC (1.96 г, 9.50 ммоль) и DMAP (14 мг, 0.12 ммоль) в 10 мл дихлорметана добавили. Ледяную баню удалили, и смесь перемешивали при комнатной температуре всю ночь. Полученную суспензию охладили до 0°С, и твердое вещество отфильтровали. Растворитель выпарили in vacuo.

Остаток растворили в 40 мл дихлорметана и разбавили с помощью 270 мл МТВЕ при комнатной температуре. Смесь оставили на всю ночь при -20°С. Остаток собрали путем фильтрации через стеклянный фильтр Por. 3, и промыли с помощью 500 мл охлажденного МТВЕ (-20°С). Продукт высушили in vacuo всю ночь.

Выход 18.5 г (92%) порошка белого цвета rac-19е.

MS: m/z 737.43 = [M+13H]¹³⁺ (вычисленная = 737.42).

Для масс-спектра полидисперсных ПЭГ-содержащих соединений, выбирался один одинарный пик массы.

Для синтеза соединения rac-19f, соединение rac-19е (18.4 г, 2.18 ммоль) растворили в метилацетате (160 мл), и 254 мг палладия на угле добавили. В атмосфере водорода при давлении окружающей среды, смесь перемешивали всю ночь при комнатной температуре. Реакционную смесь отфильтровали через слой целита, и фильтрат выпарили и высушили in vacuo всю ночь.

Выход 17.7 г (98%) стекловидного твердого вещества rac-19f.

MS: m/z 723.51 = [M+13H]¹³⁺ (вычисленная = 723.55).

Для масс-спектра полидисперсных ПЭГ-содержащих соединений, выбирался один одинарный пик массы.

Для синтеза соединения rac-19g, соединение rac-19f (13.6 г, 1.65 ммоль) и TSTU (1.96 г, 6.60 ммоль) растворили в 60 мл дихлорметана при комнатной температуре. Затем DIPEA (852 мг, 6.60 ммоль) добавили, и смесь перемешивали в течение 45 минут. Полученную суспензию отфильтровали, фильтрат разбавили с помощью 70 мл этилацетата и промыли с помощью 70 мл 0.5 М фосфатного буфера рН=6.5. Органическую фазу высушили над MgSO₄, и растворитель выпарили in vacuo. Остаток растворили в 80 мл толуола, оставшееся твердое вещество отфильтровали и промыли с помощью 20 мл толуола. Объединенные фракции толуола разбавили с помощью 35 мл МТВЕ при комнатной температуре и хранили всю ночь при -20°С. Остаток собрали путем фильтрации через стеклянный фильтр Por. 3, и промыли с помощью 600 мл охлажденного МТВЕ (-20°С). Продукт высушили in vacuo всю ночь.

Выход 12.1 г (87%) порошка белого цвета rac-19g.

MS: m/z 738.51=[М+13Н]¹³⁺ (вычисленная = 738.49).

Для масс-спектра полидисперсных ПЭГ-содержащих соединений, выбирался один одинарный пик массы.

Пример 20

Получение шариков гидрогеля 20а, содержащего свободные аминогруппы.

20а получили, как описано для примера 3с, за исключением применения скорости мешалки 560 оборотов в минуту, применения 398 мг 1b, 2690 мг 19 с, 27.8 г DMSO, 274 мг Cithrol™ DPHS, 1.8 мл TMEDA, 2.7 мл уксусной кислоты, с получением 0.22 г на 50 мкм сите, 0.33 г на 63 мкм сите, и 0.52 г на 75 мкм сите 20а в виде порошка белого цвета, свободные аминогруппы - 0.152 ммоль/г.

Получение шариков гидрогеля 20b, содержащего свободные аминогруппы.

20b получили, как описано для примера 3с, за исключением применения скорости мешалки 580 оборотов в минуту, применения 250 мг 1b, 2168 мг rac-19g, 21.8 г DMSO, 215 мг Cithrol™ DPHS, 1.1 мл TMEDA, 1.7 мл уксусной кислоты, с получением 0.09 г на 50 мкм сите, 0.17 г на 63 мкм сите, и 0.54 г на 75 мкм сите 20b в виде порошка белого цвета, свободные аминогруппы - 0.154 ммоль/г.

Пример 21

Получение малеимид, содержащий гистидин-метка 21

0.78 г RINK амид МВНА смолы (100-200 меш, 0.64 ммоль/г аминов) перенесли в шприц, объемом 20 мл, оборудованный фриттой, и позволил набухать в присутствии 10 мл DCM. Растворитель удалили, и смолу промыли три раз с NMP, растворитель отделяли каждый раз. Смолу обрабатывали в течение 15 минут и 5 минут, соответственно, с 5 мл 20% пиперидина в DMF для удаления Fmoc защитной группы, растворитель отделяли каждый раз. Смолу промыли десять раз с NMP. 775 мг Fmoc-His(Trt)-OH и 475 мг HATU растворили в 3 мл 0.5М НОАТ в DMF, и 850 мкл DIPEA добавили. Раствор втянули в шприц, и суспензию инкубировали при аккуратном встряхивании в течение 3 часов при температуре окружающей среды. Растворитель отделили, и смолу промыли пять раз с NMP. Fmoc-защитную группу удалили, как описано выше. Следующие пять связываний каждое осуществили с применением связывающего раствора из 620 мг Fmoc-His(Trt)-OH, 77 мг HOBt, 160 мг TBTU и 850 мкл DIPEA в 3 мл NMP. Реакционную смесь каждый раз оставляли на 1 час при температуре окружающей среды при бережном встряхивании, с последующим промыванием с помощью NMP и Fmoc-удалением защиты. Затем, смолу обрабатывали с раствором 385 мг Fmoc-Ado-OH, 475 мг HATU, 850 мкл DIPEA в 3 мл 0.5М HOAt в DMF в течение 1 часа при температуре окружающей среды, с последующим промыванием с помощью NMP и Fmoc удалением защиты. Смолу обрабатывали с 169 мг малеимидопропионовой кислоты, 475 мг HATU, 850 мкл DIPEA в 3 мл 0.5 М HOAt в DMF в течение восьми часов при температуре окружающей среды при бережном встряхивании. Растворитель отделили, и смолу промыли пять раз с NMP и десять раз с DCM. Растворитель отделяли каждый раз. Наконец, смолу обрабатывали с, в каждом случае, 5 мл раствора 95% TFA/2.5% TIPS/2.5% вода, два раза по 30 минут и два раза по одному часу. Раствор удалили в отельные 50 мл пробирки фирмы Falcon, и TFA выпарили под непрерывным потоком азота. К остатку, 45 мл охлажденного льдом простого эфира добавили, и пробирку фирмы Falcon центрифугировали, и супернатант отделили. Остаток растворили в 50% ACN/вода и очистили с помощью препаративной ВЭЖХ и лиофилизовали с получением 21.

Выход 0.15 г (26%).

MS: m/z 1136.49 = [M+H]⁺ (вычисленная = 1136.49).

Пример 22

Получение ПЭГилированных шариков гидрогеля в DMSO 22

Сухие шарики гидрогеля, как например описано в 3с, перенесли в шприц, оборудованный фриттой, и NMP (5 мл/100 мг шариков гидрогеля) добавили. Гидрогелю позволили набухать в течение 10 минут при температуре окружающей среды при бережном встряхивании. Растворитель удалили, и гидрогель промыли десять раз, каждый раз с помощью DMSO, затем промыли десять раз, каждый раз с помощью 1% TMEDA/DMSO (5 мл/100 мг шариков гидрогеля), растворитель каждый раз отделили.

0.2 эквивалента (на основе содержания аминов в шариках гидрогеля) ПЭГ-NHS растворили в растворе, содержащем 2 эквивалента (на основе содержания аминов в шариках гидрогеля) TMEDA в DMSO при 37°С в течение 15 минут. Раствор втянули в шприц, и полученную суспензию гидрогеля инкубировали при бережном встряхивании. Растворитель удалили, и гидрогель промыли пять раз с DMSO (5 мл/100 мг шариков гидрогеля), с последующими пятью циклами промывки с 0.1% уксусная кислота/0.01% Tween 20 (5 мл/100 мг шариков гидрогеля). Свежую 0.1% уксусную кислоту/0.01% Tween 20 залили в шприц с получением суспензии 10 мг/мл гидрогеля из расчета на первоначальную массу. Содержание аминов в шариках гидрогеля определяли как описано выше. На основе уравнения (2) это относится к степени ПЭГилирования.

Пример 22а получали согласно методике, описанной выше, применяя 50 мг гидрогеля 20а и 60.8 мг 40 кДа ПЭГ-NHS с получением ПЭГилированных шариков гидрогеля с содержанием аминов 0.141 ммоль/г.

Пример 22b получали согласно методике, описанной выше, применяя 51.3 мг гидрогеля 20b и 59.5 мг 40 кДа ПЭГ-NHS с получением ПЭГилированных шариков гидрогеля с содержанием аминов 0.118 ммоль/г.

Пример 23

Получение малеимид-функпионализированных шариков гидрогеля 23

ПЭГилированные шарики гидрогеля в виде суспензии 10 мг/мл на основе первоначальной массы шариков гидрогеля до ПЭГилирования перенесли в шприц, оборудованный фриттой,. Растворитель удалили и гидрогель промыли десять раз водой (5 мл/100 мг шариков гидрогеля), растворитель отделяли каждый раз. Шарики гидрогеля затем промыли десять раз с NMP и пять раз с 2% DIPEA в NMP. 5 эквивалентов Mal-ПЭГ₆-Pfp (на основе содержания аминов в шариках гидрогеля) растворили в NMP (1 мл/50 мг реагента) и добавили к промытым шарикам гидрогеля. Суспензию гидрогеля инкубировали в 2 часов при комнатной температуре. Полученные малеимид-функционализированные шарики гидрогеля промыли пять раз, каждый раз с NMP и затем с 0.1% уксусная кислота/ 0.01% Tween20.

Содержание малеимида в шариках гидрогеля определили путем конъюгирования Fmoc-цистеина с малеимидными группами на гидрогеле и последующего Fmoc-определения, как описано в Gude, M., J. Ryf, et al. (2002) Letters in Peptide Science 9(4): 203-206.

Пример 23а получали согласно методике, описанной выше, применяя 35 мг 22а (на основе первоначальной сухой массы 20а) и 13 мг Mal-ПЭГ₆-Pfp.

Пример 23b получали согласно методике, описанной выше, применяя 35 мг 22b (на основе первоначальной сухой массы 20b) и 17 мг Mal-ПЭГ₆-Pfp.

Пример 24

Синтез пролкарства Lucentis-линкер-гидрогель

80 мг Lucentis (показан на приведенной далее схеме как Lucentis-NH₂) (2000 мкл 40 мг/мл Lucentis в 10 мМ гистидине, 10 мас.% α,α-трегалоза, 0.01% Tween20, рН 5.5) подвергли буферному обмену на 10 мМ фосфат натрия, 2.7 мМ хлорид калия, 140 мМ хлорид натрия, рН 7.4, и концентрацию Lucentis довели до 13.5 мг/мл. 6 мг линкерного реагента 4с растворили в 100 мкл DMSO с получением концентрации 100 мМ. 1 мольный эквивалент линкерного реагента 4c относительно количества Lucentis добавили к раствору Lucentis. Реакционную смесь аккуратно смешали и инкубировали в течение 5 минут при комнатной температуре. Затем 1.3 дополнительных мольных эквивалента линкерного реагента 4с добавили к раствору Lucentis с получением смеси немодифицированного Lucentis и моноконъюгата защищенный Lucentis-линкер 24а.

Значение рН реакционной смеси довели до рН 6.5 путем добавления 1 М цитрата натрия, рН 5.0 и Na₂EDTA добавили до конечной концентрации 5 мМ. Для удаления защитных групп 24а 0.5 М NH₂OH (растворенный в 10 мМ цитрата натрия, 140 мМ хлорида натрия, 5 мМ Na₂EDTA, рН 6.5) добавили до конечной концентрации 45 мМ, и реакционную смесь без защитных групп инкубировали при комнатной температуре в течение 4 часов с получением моноконъюгата Lucentis-линкер 24b. Смесь Lucentis и моноконъюгата Lucentis-линкер 24b подвергли буферному обмену на 10 мМ фосфат натрия, 2.7 мМ хлорид калия, 140 мм хлорид натрия, 5 мм Na₂EDTA, 0.01% Tween 20, рН 6.5, и общую концентрацию двух видов Lucentis довели до 12.1 мг/мл.

Пример 25

Синтез пролкарства Lucentis-линкер-гидрогель 25а

20 мг смеси Lucentis/Lucentis-линкер моноконъюгат 24b в 10 мМ фосфата натрия, 2.7 мМ хлорид калия, 140 мМ хлорида натрия, 5 мМ Na₂EDTA, 0.01% Tween 20, pH 6.5 добавили к 2.5 мг малеимид-функционализированных шариков гидрогеля 5а и инкубировали всю ночь при комнатной температуре с получением пролкарства Lucentis-линкер-гидрогель 25а.

Пример 25b получили согласно методике, описанной для 25а с применением 2.5 мг (на основе сухой массы 20а) 23а.

Пример 25c получили согласно методике, описанной для 25b с применением 2.5 мг (на основе сухой массы 20b) 23b.

Пример 26

Шарики блокированного гидрогеля 26

Шарики гидрогеля синтезировали согласно методике, описанной в примере 3с, и функционализировали малеимидными группами согласно методике, описанной в примере 5а. После этого, 4 мл суспензии гидрогеля при 10 мг/мл перенесли в шприц, объемом 20 мл, оборудованный фриттой. Растворитель удалили, и гидрогель промыли 10 раз с помощью 5 мл 10 мМ гистидин/10 мас.% α,α-трегалоза/0.01% Tween20/pH 5.5. Растворитель удалили, и 5 мл 1 мМ β-меркаптоэтанола в 10 мМ гистидин/10 мас.% α,α-трегалоза/0.01% Tween20/pH 5.5 втянули в шприц. Полученную суспензию инкубировали при температуре окружающей среды при мягком перемешивании в течении 5 минут. Растворитель удалили, и гидрогель обработали еще 9 раз с применением 5 мл 1 мМ β-меркаптоэтанола в 10 мМ гистидин/10 мас.% α,α-трегалоза/0.01% Tween20/pH 5.5. Растворитель каждый удаляли. Шарики гидрогеля затем промыли 10 раз, каждый раз с применением 5 мл 10 мМ гистидин/10 мас.% α,α-трегалоза/0.01% Tween20/pH 5.5, растворитель удаляли каждый раз. Шарики гидрогеля промыли 10 раз, каждый раз с применением 5 мл PBS-T/pH 7.4, растворитель удаляли каждый раз. Наконец, свежий PBS-T/pH 7.4 втянули в шприц, и суспензию перенесли в пробирку фирмы Falcon с получением 26.

Пример 27

Антитело, связывающееся с шариками гидрогеля с Lucentis 27

20 мкл суспензий гидрогеля 25а-с (35 об.-%) в PBS-T буфере смешали с 400 мкл раствора первичного антитела в PBS-T с 1% BSA (Sigma, A3059) и инкубировали в течение 1 часа при 200 оборотов в минуту в 1.5 мл пробирках Эппендорфа. Для шариков гидрогеля с Lucentis применялось 1:100 разбавления антитела ab771 (Антитело фрагмента Fab анти-человеческого IgG [4A11] (ab771) - Abeam, Cambridge, UK). Шарики гидрогеля осадили на стадии центрифугирования при 100 g в течение 1 минуты на настольной центрифуге. Супернатант удалили с помощью пипетирования и применяли меры предосторожности, чтобы исключить удаление каких-либо шариков гидрогеля. Промывку шариков осуществляли в виде двух циклов на стадиях промывки, которые включали добавление 1 мл PBS-Т буфера, центрифугирование при 100 g в течение 1 минуты, и бережное удалили супернатант путем пипетирования. 400 мкл вторичного антитела в PBS-T с 1% BSA (Sigma, A3059) добавили к шарикам и инкубировали в течение 1 часа при 200 оборотах в минуту. Для шариков гидрогеля с Lucentis применялось 1:50 разбавление антитела ab97041 (Goat Анти-Mouse IgG H&L (Phycoerythrin) preadsorbed (ab97041) - Abeam, Cambridge, UK). Супернатант удалили с помощью пипетирования и применяли меры предосторожности, чтобы исключить удаление каких-либо шариков гидрогеля. Промывку шариков осуществляли в виде четырех циклов на стадиях промывки, которые включали добавление 1 мл PBS-T буфера, центрифугирование при 100 g в течение 1 минуты, и бережное удалили супернатант путем пипетирования. Промытые шарики ресуспендировали в 200 мкл PBS-T и полностью перенесли на черные 96-луночные планшеты (черные, без связывания. Art. no. 655900, Greiner bio-one GmbH, 72636 Frickenhausen, Germany). Интенсивность флуоресценции определяли с помощью Tecan Infinite М200 планшетного ридера флуорисценции (Возбуждение 495 нм. Излучение 575 нм. Число вспышек- 25, Время интеграции - 20 мкс, Множество считываний на лунку - 5×5 (Border 250 мкм). Optimal gain).

Анализ данных

Определение связывания антитела с ПЭГ-модифицированными шариками гидрогеля с Lucentis осуществляли по сравнению со стандартной кривой немодифицированных шариков гидрогеля с Lucentis 25a. Немодифицированные шарики гидрогеля с Lucentis смешали с шариками гидрогеля с плацебо 26 в различных отношениях. График (процент немодифицированных шариков гидрогеля с Lucentis относительно интенсивности флуорисценции) построили линейным образом. Процент связывания антитела с ПЭГилированными шариками гидрогеля с Lucentis определили с помощью обратных вычислений по полученной калибровочной кривой.

Результаты

Пример 28

Кинетика In vitro высвобождения - определение периода полураспада in vitro 28а

50.3 мг густой суспензии Lucentis-линкер-гидрогель 25а (содержащей около 1.68 мг Lucentis) промыли пять раз с 60 мМ фосфата натрия, 3 мМ Na₂EDTA, 0.01% Tween20, pH 7.4 и наконец суспендировали в 1 мл вышеуказанного буфера. Суспензию инкубировали при 37°С. Буфер суспензии подвергали обмену через различные интервалы времени и проанализировали с помощью ВЭЖХ-SEC при 220 нм. Пики, соответствующие выделенному Lucentis, интегрировали, и составили графики отношения всего высвобожденного Lucentis к общему времени инкубации. Программные обеспечения для подбора кривой по точкам применялись для определения скоростей расщепления первого порядка.

Кинетика высвобождения 28а:

Пример 28b получили согласно методике, описанной для 28а, но с 35.0 мг густой суспензии пролекарства Lucentis-линкер-гидрогель 25b (содержащей около 1.14 мг Lucentis).

Кинетика высвобождения 28b:

Пример 28с получили согласно методике, описанной для 28а, но с 25.3 мг густой суспензии пролекарства Lucentis-линкер-гидрогель 25с (содержащей около 0.73 мг Lucentis).

Кинетика высвобождения 28с:

Пример 29

Получение тиол-функционализированных шариков гидрогеля 29

100 сухих шариков гидрогеля, как описано в 3с, с содержанием аминов 0.097 ммоль/г перенесли в шприц, объемом 20 мл, оборудованный фриттой. Гидрогель набух в NMP, и растворитель отделили. Гидрогель промыли пять раз, каждый раз с помощью 5 мл NMP, растворитель отделяли каждый раз. Шарики гидрогеля промыли пять раз, каждый раз с помощью 5 мл 2% DIPEA в NMP, растворитель отделяли каждый раз. Шарики гидрогеля промыли пять раз с 5 мл DMSO, растворитель отделяли каждый раз. 17.7 мг OPSS-ПЭГ₁₂-NHS растворили в 1 мл DMSO и втянули в шприц. Суспензию инкубировали в течение 2 часов при бережном встряхивании при температуре окружающей среды. Растворитель удалили, и шарики гидрогеля промыли пять раз, каждый раз с помощью 5 мл DMSO и пять раз каждый раз 5 мл 15 мМ сукцинат/100 мМ NaCl/5 мМ EDTA/pH 4.0, растворитель каждый раз отделяли. 10 мл 15 мМ сукцинат/100 мМ NaCl/5 мМ EDTA/pH 4.0 буфера втянули в шприц, и полученную суспензию перенесли в пробирку фирмы Falcon. 10 мкл Tween20 добавили. 1 мл этой суспензии гидрогеля перенесли в шприц, объемом 5 мл, оборудованный фриттой, и растворитель удалили. Шарики гидрогеля инкубировали с 1 мл 50 мМ ТСЕР растворе в воде в течение 10 минут при температуре окружающей среды при бережном встряхивании. Растворитель удалили, и шарики гидрогеля промыли пять раз, каждый раз с помощью 1 мл 50 мМ ТСЕР раствора в воде, растворитель отделяли каждый раз. Шарики гидрогеля промыли десять раз с 1 мл 15 мМ сукцината/100 мМ NaCl/5 мМ EDTA/0.01% Tween20/pH 4.0, растворитель каждый раз отделяли. 1 мл 15 мМ сукцинат/100 мМ NaCl/5 мМ EDTA/0.01% Tween20/ рН 4.0 втянули в шприц с получением 29 в виде суспензии гидрогеля 10 мг/мл на основе первоначальной сухой массы шариков гидрогеля.

Пример 30

Получение тиол-функционализированной гистидиновой метки 30

0.2 г RINK амид МВНА смолы (100-200 меш, 0.64 ммоль/г аминов) перенесли в шприц, объемом 5 мл, оборудованный фриттой, и позволил набухать в присутствии 2 мл DMF в течение 10 минут. Растворитель удалили, и смолу промыли пять раз с 5 мл DMF, растворитель отделяли каждый раз. Смолу обрабатывали в течение 15 минут с 5 мл 20% пиперидина в DMF, растворитель отделяли каждый раз, для удаления Fmoc защитной группы. Смолу промыли десять раз с 2 мл DMF. 198 мг Fmoc-His(Trt)-OH и 146 мг HATU растворили в 1 мл 0.5М НОАТ в DMF, и 223 мкл DIPEA добавили. Раствор втянули в шприц, и суспензию инкубировали при аккуратном встряхивании в течение 1,5 часов при температуре окружающей среды. Растворитель отделили, и смолу снова обрабатывали в течение 198 мг Fmoc-His(Trt)-OH, 146 мг HATU и 223 мкл DIPEA в 1 мл 0.5М НОАТ в DMF. Растворитель отделили, смолу промыли десять раз с 2 мл DMF, каждый раз, растворитель каждый раз удаляли. Fmoc-защитную группу удалили, как описано выше. Следующие пять связываний каждое осуществили с применением связывающего раствора из 198 мг Fmoc-His(Trt)-OH, 146 мг HATU и 223 мкл DIPEA в 1 мл 0.5М НОАТ в DMF. Реакционную смесь каждый раз оставляли на 1,5 часа при температуре окружающей среды при бережном встряхивании, с последующим промыванием с помощью DMF и Fmoc-удалением защиты. Затем, смолу обрабатывали с раствором 123 мг Fmoc-Ado-OH, 122 мг HATU, 223 мкл DIPEA в 1 мл 0.5М НОАТ в DMF в течение 1,5 часов при температуре окружающей среды, с последующим промыванием с помощью DMF и Fmoc удалением защиты. Смолу обрабатывали с 112 мг 3-(тритилтио)-пропионовой кислоты, 122 мг HATU и 223 мкл DIPEA в 1 мл 0.5М НОАТ в DMF в течение одного часа при температуре окружающей среды при бережном встряхивании. Растворитель отделили, и смолу промыли десять раз с DMF и десять раз с DCM. Растворитель отделяли каждый раз. Наконец, смолу обрабатывали с, в каждом случае, 3 мл раствора 95% TFA/2.5% TIPS/2.5% вода, два раза по 30 минут и два раза по одному часу. Раствор удалили в отдельные 50 мл пробирки фирмы Falcon, и TFA выпарили под непрерывным потоком азота. К остатку, 45 мл охлажденного льдом простого эфира добавили, и пробирку фирмы Falcon центрифугировали и супернатант отделили. Остаток растворили в 50% ACN/вода и очистили с помощью препаративной ВЭЖХ и лиофилизовали с получением 21.

Выход 8.1 мг(6%).

MS: m/z 1073.46 = [M+H]⁺ (вычисленная = 1073.46).

Пример 31

Получение 2-(2-пиридилдисульфанил)этанола 31

250 мг алдритиола-2 растворили в 10 мл 50 мМ фосфат/ACN рН 7.4, и 95 мкл 2-меркаптоэтанола добавили. Раствор перемешивали в течение 5 минут при температуре окружающей среды. Затем, еще 50 мг алдритиола-2 добавили. Раствор перемешивали в течение 16 часов при температуре окружающей среды. Неочищенный продукт очистили с помощью препаративной ВЭЖХ и лиофилизовали с получением 31.

Выход 140.6 мг (55%).

MS: m/z 188.02 = [M+Н]⁺ (вычисленная = 188.02).

Пример 32

Блокирование тиол-функционализированного гидрогеля 32

4 мг (на основе сухой массы первоначального гидрогеля) тиол-функционализированных шариков гидрогеля 29 перенесли в виде суспензии 10 мг/мл в 15 мМ сукцинат/100 мМ NaCl/5 мМ EDTA/0.01% Tween20/pH 4.0 шприц, объемом 5 мл, оборудованный фриттой. Растворитель удалили, и 322 мкл 5 мМ раствора 31 в 15 мМ сукцинат/100 мМ NaCl/5 мМ EDTA/0.01% Tween20/pH 4.0 втянули в шприц. Суспензию инкубировали при температуре окружающей среды при бережном встряхивании в течение 16 часов. Растворитель удалили, и шарики гидрогеля промыли десять раз с 2 мл 15 мМ сукцинат/100 мМ NaCl/5 мМ EDTA/0.01% Tween20/pH 4.0, растворитель отделяли каждый раз.

Пример 33

Синтез пролкарства Lucentis-линкер-гидрогель 33d

360 мг Lucentis (показан на приведенной далее схеме как Lucentis-NH₂) (9 мл 40 мг/мл Lucentis в 10 мМ гистидина, 10 мас.% α,α-трегалоза, 0.01% Tween20, pH 5.5) подвергли буферному обмену на 10 мМ фосфат натрия, 2.7 мМ хлорид калия, 140 мМ хлорид натрия, pH 7.4, и концентрацию Lucentis довели до 20 мг/мл. Линкерный реагент 11d с получением концентрации 100 мм. 5 мольных эквивалентов линкерного реагента 11d относительно количества Lucentis добавили к раствору Lucentis в виде 2, 2, и 1 мольных эквивалентов. Реакционную смесь аккуратно смешивали после каждого добавления линкерного реагента и инкубировали в течение 5 минут при комнатной температуре с получением смеси немодифицированного Lucentis и моноконъюгата защищенный Lucentis-линкер 33а.

Значение pH реакционной смеси довели до pH 6.5 путем добавления 1 М цитрата натрия, pH 5.0 и Na₂EDTA добавили до конечной концентрации 5 мМ. Для удаления (5-метил-2-оксо-1,3-диоксол-ил)-метил оксокарбонильной защитной группы 33а 0.5 М NH₂OH (растворенный в 10 мМ цитрата натрия, 140 мМ хлорида натрия, 5 мМ Na₂EDTA, pH 6.5) добавили до конечной концентрации 45 мМ, и реакционную смесь без защитных групп инкубировали при комнатной температуре в течение 135 минут с получением моноконъюгата Lucentis-линкер 33b. Смесь Lucentis и моноконъюгата Lucentis-линкер 33b подвергли буферному обмену на 15 мМ янтарной кислоты, 100 мМ хлорида натрия, 5 мМ Na₂EDTA, pH 4.0 и затем концентрировали до концентрации 15 мг/мл. Раствор белка охладили до 4°С, и 1 мольный эквивалент 25 мМ DTT в 15 мМ янтарной кислоты, 100 мМ хлорида натрия, 5 мМ Na₂EDTA, pH 4.0 относительно общего содержания Lucentis добавили для удаления Pys защитной группы с получением моноконъюгата Lucentis-линкер 33с. Смесь немодифицированного Lucentis и собой моноконъюгата Lucentis-линкер 33с подвергли буферному обмену на 15 мМ янтарной кислоты, 100 мМ хлорида натрия, 5 мМ Na₂EDTA, pH 4.0 и затем концентрировали до концентрации 28.7 мг/мл. Содержание моноконъюгата Lucentis-линкер 33с в смеси составила 15%, как определено с помощью анализа Ellman.

79.7 мг смеси Lucentis/ моноконъюгат Lucentis-линкер 33е в 15 мМ янтарной кислоты, 100 мМ хлорида натрия, 5 мМ Na₂EDTA, pH 4.0 добавили к 5.1 мг малеимид-функционализированных шариков гидрогеля 5 с, pH довели до pH 5 путем добавления 0.5 М янтарной кислоты, pH 6.0 и инкубировали всю ночь при комнатной температуре с получением пролекарства Lucentis-линкер-гидрогель 33d. Избыток малеимидов блокировали с помощью восьми стадий инкубации с 1 молярным эквивалентом (относительно содержания малеимида в малеимид-функционализированных шариках гидрогеля 5с) 1 мМ 2-меркаптоэтанола в 15 мМ янтарной кислоты, 100 мМ хлорида натрия, 5 мМ Na₂EDTA, pH 4.0 в течение 15 минут при комнатной температуре. In vitro кинетический анализ высвобождения для определения in vitro периода полураспада 33d осуществили согласно Примеру 7.

Пример 34

Синтез конъюгата Lucentis-линкер-гистидин-метка 34d

120 мг Lucentis (показан на приведенной далее схеме как Lucentis-NH₂) (3 мл 40 мг/мл Lucentis в 10 мМ гистидина, 10 мас.% α,α-трегалоза, 0.01% Tween20, pH 5.5) подвергли буферному обмену на 60 мМ фосфата натрия, 100 мМ хлорида натрия, pH 7.4, и концентрацию Lucentis довели до 20 мг/мл. Линкерный реагент 14f (только 1 региоизомер показан на приведенной ниже схеме) растворили в DMSO с получением концентрации 100 мМ. 2 мольных эквивалента линкерного реагента 14f относительно количества Lucentis добавили в раствор Lucentis. Реакционную смесь бережно смешали и инкубировали в течение 5 минут при комнатной температуре. Затем 1 дополнительный мольный эквивалент линкерного реагента 14f добавили. Дополнительная инкубация в течение 5 минут при комнатной температуре обеспечила смесь немодифицированного Lucentis и защищенного моноконъюгата Lucentis-линкер 34а. Инкубация при комнатной температуре в течение 4 часов привела к количественному превращению моноконъюгата Lucentis-линкер 34а в моноконъюгат Lucentis-линкер 34b.

Смесь немодифицированного Lucentis и моноконъюгата Lucentis-линкер 34b подвергли буферному обмену на 15 мМ янтарной кислоты, 100 мМ хлорида натрия, 5 мМ Na₂EDTA, pH 4.0, и концентрацию белка довели до 11.8 мг/мл. Раствор белка охладили до 4°С, и 1 мольный эквивалент 25 мМ DTT в 15 мМ янтарной кислоты, 100 мМ хлорида натрия, 5 мМ Na₂EDTA, pH 4.0 относительно общего содержания Lucentis добавили для удаления Pys защитной группы с получением моноконъюгата Lucentis-линкер 34с. Смесь немодифицированного Lucentis и моноконъюгата Lucentis-линкер 34с подвергли буферному обмену на 15 мМ янтарной кислоты, 100 мМ хлорида натрия, 5 мМ Na₂EDTA, pH 4.0, и далее концентрировали до концентрации 17.2 мг/мл.

К 106.5 мг смеси Lucentis/ моноконъюгат Lucentis-линкер 34с смесь в 15 мМ янтарной кислоты, 100 мМ хлорида натрия, 5 мМ Na₂EDTA, pH 4.0 1 мольный эквивалент относительно общего содержания Lucentis в веществе 21 малеимид, содержащий гистидин-метка добавили, и pH довели до pH 5 путем добавления 0.5 М янтарной кислоты, pH 6.0. Инкубирование при комнатной температуре в течение 4.5 часов обеспечило конъюгат Lucentis-линкер-гистидин-метка 34d, который очистили с помощью катионной ионообменной хроматографии от Lucentis и избытка вещества 21 малеимид, содержащий гистидин-метка.

Пример 35

In vitro кинетика высвобождения - определение in vitro периода полураспада переходных конъюгатов гистидин-метка

Очищенный с помощью катионной ионообменной хроматографии конъюгат Lucentis-линкер-гистидин-метка 34d подвергли обмену буфера 60 мМ фосфата натрия, 3 мМ Na₂EDTA, 0.01% Tween20, pH 7.4, и концентрацию довели до 1 мг/мл. После инкубации при 37°С в течение различных периодов времени 200 vru образца белка проанализировали с помощью катионной ионообменной хроматографии. Количество выделенного Lucentis определили путем сравнения с площадями пиков Lucentis и конъюгата Lucentis-линкер-гистидин-метка 34d, и построили графики относительно времени инкубации. Программные обеспечения для подбора кривой по точкам применялись для определения скоростей расщепления первого порядка.

Пример 36

Синтез и очистка переходного меченного моноконъюгата Lucentis-линкер 36b

400 мг Lucentis (показан на приведенной далее схеме как Lucentis-NH₂) (10 мл 40 мг/мл Lucentis в 10 мМ гистидина, 10 мас.% α,α-трегалоза, 0.01% Tween20, pH 5.5) подвергли буферному обмену на 60 мМ фосфата натрия, 100 мМ хлорида натрия, pH 7.4, и концентрацию Lucentis довели до 20.8 мг/мл. Линкерный реагент 17g растворили в DMSO с получением концентрации 100 мМ. 4.5 мольных эквивалентов линкерного реагента 17g относительно количества Lucentis добавили к раствору Lucentis. Реакционную смесь аккуратно смешали и инкубировали в течение 5 минут при комнатной температуре с получением смеси немодифицированного Lucentis и защищенного меченного моноконъюгата Lucentis-линкер 36а.

Смесь Lucentis и защищенного меченного моноконъюгата Lucentis-линкер 36а подвергли буферному обмену на 60 мМ фосфата натрия, 100 мМ хлорида натрия, pH 6.5. Для удаления (5-метил-2-оксо-1,3-диоксол-ил)-метиловый оксокарбонильной группы 36а 0.5 М NH₂OH (растворили в 10 мМ цитрата натрия, 140 мМ хлорида натрия, 5 мМ Na₂EDTA, pH 6.5) добавили до конечной концентрации 45 мМ, и реакционную смесь после удаления защиты инкубировали при комнатной температуре в течение 2.5 часов с получением меченного моноконъюгата Lucentis-линкер 36b, который отделили от немодифицированного Lucentis путем катионной ионообменной хроматографии.

Пример 37

Синтез пролекарства Lucentis-линкер-гидрогель 37а с применением конъюгата тиол/активированный дисульфид

61.5 мг смеси Lucentis/ моноконъюгат Lucentis-линкер 33b (с=41 мг/мл) в 15 mM янтарной кислоты, 100 мМ хлорида нгатрия, 5 мМ Na₂EDTA, pH 4.0 добавили к 6.6 мг шариков тиол-функционализированного гидрогеля 29. Гидрогель, загруженный реакционной смесью, инкубировали в течение 60 часов при 4°С а затем 16 часов при комнатной температуре с получением с получением пролекарства Lucentis-линкер-гидрогель 37а.

Пример 38

Синтез пролекарства Lucentis-линкер-гидрогель 38а с применением конъюгата тиол/малеимид

10 мг Lucentis-моноконъюгат Lucentis-линкер 34с при концентрации 20 мг/мл добавили к 5 мг малеимид-функционализированного гидрогеля, и реакционную смесь инкубировали при рН 5 и комнатной температуре всю ночь с получением пролекарства Lucentis-линкер-гидрогель 38а. Избыток малеимидов блокировали посредством восьми стадий инкубации с 1 мольным эквивалентом (относительно содержания малеимида в шариках малеимид-функционализированного гидрогеля 5с) 1 мМ 2-маркаптоэтанола в 15 мМ янтарной кислоты, 100 мМ хлорида натрия, 5 мМ Na₂EDTA, рН 4.0 в течение 15 минут при комнатной температуре.

Пример 39

Синтез пролекарства Lucentis-линкер-гидрогель 39а с применением конъюгата тиол/активированного дисульфида

50 мг смеси Lucentis/моноконъюгат Lucentis-линкер 34b при общей концентрации Lucentis 40 мг/мл в 15 мМ янтарной кислоты, 100 мМ хлорида натрия, 5 мМ Na₂EDTA, рН 4.0 добавили к 5 мг шариков тиол-функционализированного гидрогеля 29, и реакционную смесь инкубировали при комнатной температуре всю ночь с получением пролекарства Lucentis-линкер-гидрогель 39а. Избыток тиольных групп на гидрогеле блокировали путем инкубирования с 5 мольными эквивалентами (относительно содержания тиола в шариках тиол-функционализированного гидрогеля 29) 1 мМ раствора 31 в 15 мМ янтарной кислоты, 100 мМ хлорида натрия, 5 мМ Na₂EDTA, рН 4.0 в течение 16 часов при комнатной температуре.

Пример 40

Синтез конъюгата Lucentis-линкер-гистидин-метка 40а

Конъюгат Lucentis-линкер-гистидин-метка 40а получили согласно Примеру 33, применяя линкерный реагент 9c.Вместо малеимид-функционализированного гидрогеля 5c 1 мольный эквивалент относительно общего содержания Lucentis малеимид функционализированного гистидина-метки 21 применялось.

Пример 41

Синтез конъюгата Lucentis-линкер-гистидин-метка 41 а

Конъюгат Lucentis-линкер-гистидин-метка 41а получили согласно Примеру 34, применяя линкерный реагент 13g.

Пример 42

Синтез пролекарства Lucentis-линкер-гидрогель 42а

Пролекарство Lucentis-линкер-гидрогель 42а получили согласно Примеру 33, применяя линкерный реагент 15b. Благодаря отсутствию (5-метил-2-оксо-1,3-диоксол-ил)-метил оксокарбонильной защитной группы не проводилось стадии удаления защиты, связанной с гидроксиламином.

Пример 43

Синтез пролекарства Lucentis-линкер-гидрогель 43а

Пролекарство Lucentis-линкер-гидрогель 43а получили согласно Примеру 33, применяя линкерный реагент 18i.

Пример 44

Синтез пролекарства Lucentis-линкер-гидрогель 44а

1147 мг смеси Lucentis/моноконъюгат Lucentis-линкер 6b в 10 мМ фосфата натрия, 2.7 мМ хлорида калия, 140 мМ хлорида натрия, 5 мМ Na₂EDTA, 0.01% Tween 20, pH 6.5 добавили к 153 мг шариков малеимид-функционализированного гидрогеля 5с и инкубировали всю ночь при комнатной температуре с получением пролекарства Lucentis-линкер-гидрогель 44а.

Пример 45

Оценка аффинности связывания Lucentis, высвободившегося из пролекарства Lucentis-линкер-гидрогель 44а

Концентрацию активного VEGF связывания с Lucentis, высвободившемся из пролекарства Lucentis-линкер-гидрогель 44а измерили на системе резонанс поверхностных плазмонов Biacore (Biacore T200, Pharmacia, Piscataway, NJ). VEGF ковалентно иммобилизировали на сенсорном чипе из карбоксиметилированного декстрана (СМ5) с применением набора связывания набора для связывания амина (GE Healthcare). Связывание Lucentis с VEGF определили путем контроля в резонансных единицах до и после инъекции в течение 180 секунд. Концентрацию активного VEGF связывания определяли с применением стандартной калибровочной кривой, полученной путем серийного разбавления контрольного материала от 5 мкг/мл до 0.156 мкг/мл. Отношение этой концентрации активного связывания к общей концентрации белка определяли с помощью анализа Bradford или UV-Vis поглощения, с получением процента связывания.

Для пролекарства Lucentis-линкер-гидрогель 44а было показано, что Lucentis высвобождается через 28 дней и через более чем 120 дней показывает 80±10% связывания.

Пример 46

Измерения и анализ ранибизумаба

Для обеих групп проверочный анализ связывания лиганда провели для измерения концентраций ранибизумаба в стеклообразной матрице глаза кролика. Для оценки пролекарства Lucentis-линкер-гидрогель 44а, гидрогель определили как неинтерферирующий с количественной оценкой ранибизумаба при все тестируемых концентрациях. Для анализа применяли рекомбинантный человеческий VEGF-A для захвата ранибизумаба в образцы стекловидного тела кролика. Связанный ранибизумаб определяли с применением анти-человеческого F(ab')2, конъюгированного с пероксидазой хрена (HRP), и субстрат пероксидазы (ТМВ) применяли для получения цвета. Уровни лекарственного средства количественно оценивали с применением абсорбционной спектрометрии, применяя микропланшетный ридер. Концентрацию ранибизумаба в тестируемых образцах вычисляли по стандартной кривой, и минимальная определяемая концентрация (MQC) в стеклообразной матрице глаза кролика составляла 1.5 нг/мл. Построили графики концентраций в стекловидном теле и проанализировали их с применением программного обеспечения MATLAB.

Аббревиатуры:

вод.	водный
Asp	аспартат
Boc	трет-бутилоксикарбонил
CIEC	катионная ионообменная хроматография
COMU	(1-циано-2-этокси-2-оксоэтилиденаминооксо)диметиламино-морфолино-карбениягексафтоорфосфат
DBU	1,8-диазабицикло(5.4.0)ундец-7-ен
DCC	дициклогексилкарбодиимид
DCM	дихлорметан
DIPEA	диизопропилэтиламин
DMAP	диметиламинопиридин
DMF	диметилформамид
DMSO	диметилсульфоксид
DTT	дитиотреитол
EDTA	этилепдиаминтетрауксусная кислота
Fmoc	флуоренилметилоксикарбонил
HATU	1-[бис(диметиламино)метилен]-1Н-1,2,3-триазоло[4,5-b]пиридиния 3-оксида гексафторфосфат
HFIP	гексафторизопропанол
HPLC	высокоэффективная жидкостная хроматография
iPrOH	изопропанол
Lys	лизин
макс.	Максимальный
Малеимид-NH-ПЭГ12-РFЕ
	N-(3-малеимидопропил)-39-амино-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-додекаокса-нонатриконтановой кислоты пентафторфениловый сложный эфир
Me	метил
MeOAc	метилацетат
MeOH	метанол
MES	2-(N-морфолино)этансульфоновая кислота

MMT	4-метокситрифенилметил
MS	масс-спектрометрия
МТВЕ	метил-трет-бутиловый простой эфир
NHS	N-гидроксисукцинимид
Оксита Pure	этил 2-циано-2-(гидроксиимино)ацетат
ПЭГ	полиэтиленгликоль
Pys	2-пиридинсульфенил
PyBOP	бензотриазол-1-ил-окситрипирролидинофосфония гексафторфосфат
RP-HPLC	обращено-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография
RT	комнатная температура
нас.	насыщенный
Su	N-гидроксисукцинимидил
tBu и t-Bu	трет.-бутил
TAN	1,5,9-триазанон
TES	триэтилсилан
TFA	трифторуксусная кислота
THF	тетрагидрофуран
TLC	тонкослойная хроматография
TMEDA	N,N,N',N'-тетраметилэтилен диамин
Tmob	2,4,6-триметоксибензил
Trt	тритил
TSTU	O-(N-сукцинимидил)-N,N,N',N'-тетраметилурония тетрафторборат

1. Фармацевтическая композиция, предназначенная для внутриглазного введения путем внутриглазной инъекции, для лечения болезней, связанных с глазной неоваскуляризацией, содержащая один или более фармацевтически приемлемых эксципиентов и связанное с носителем VEGF-нейтрализующее пролекарство,

причем связанное с носителем пролекарство содержит ковалентно связанный VEGF-нейтрализующий биологически активный фрагмент, фрагмент обратимого линкера пролекарства и группу носителя, представляющего собой биоразлагаемый гидрогель, выбранный из группы, состоящей из гидрогелей на основе ПЭГ и гиалуроновой кислоты, причем VEGF-нейтрализующий биологически активный фрагмент обратимо связан с носителем через фрагмент обратимого линкера пролекарства, причем между фрагментом носителя и обратимым линкером пролекарства необязательно имеется спейсерный фрагмент и причем обратимый линкер пролекарства имеет формулу (F):

где

пунктирная линия означает присоединение к фрагменту носителя или к необязательному спейсерному фрагменту;

D представляет собой VEGF-нейтрализующий биологически активный фрагмент, который соединен с остатком молекулы через амин соответствующего VEGF-нейтрализующего лекарственного средства путем образования амидной связи;

X представляет собой C(R⁴R^4a); N(R⁴); О; C(R⁴R^4a)-C(R⁵R^5a); C(R⁵R^5a)-C(R⁴R^4a); C(R⁴R^4a)-N(R⁶); N(R⁶)-C(R⁴R^4a); C(R⁴R^4a)-O или O-C(R⁴R^4a);

X¹ представляет собой С или S(O);

X² представляет собой C(R⁷, R^7a) или C(R⁷, R^7a)-C(R⁸, R^8a);

R¹, R^1a, R², R^2a, R³, R^3a, R⁴, R^4a, R⁵, R^5a, R⁶, R⁷, R^7a, R⁸, R^8a независимо выбраны из группы, состоящей из Н и С_1-4 алкила;

необязательно, одна или более пар R^1a/R^4a, R^1a/R^5a, R^4a/R^5a, R^7a/R^8a образуют химическую связь;

необязательно, одна или более пар R¹/R^1a, R²/R^2a, R⁴/R^4a, R⁵/R^5a, R⁷/R^7a, R⁸/R^8a соединены вместе с атомом, к которому они присоединены, с образованием С_3-7 циклоалкила или 4-7-членного гетероциклила;

необязательно, одна или более пар R¹/R⁴, R¹/R⁵, R¹/R⁶, R⁴/R⁵, R⁷/R⁸, R²/R³ соединены вместе с атомами, к которым они присоединены, с образованием кольца А;

необязательно, R³/R^3a соединены вместе с атомом азота, к которому они присоединены, с образованием 4-7-членного гетероцикла;

А выбран из группы, состоящей из фенила; нафтила; инденила; инданила; тетралинила; С_3-10 циклоалкила; 4-7-членного гетероциклила и 8-11-членного гетеробициклила;

при условии, что один водород из R¹, R^1a, R², R^2a, R³, R^3a, R⁴, R^4a, R⁵, R^5a, R⁶, R⁷, R^7a, R⁸ или R^8a замещен на связь для соединения фрагмента формулы (F) с фрагментом носителя или с необязательным спейсерным фрагментом.

2. Фармацевтическая композиция по п. 1, отличающаяся тем, что связанное с носителем пролекарство, содержащееся в фармацевтической композиции, имеет концентрацию от 5 до 200 мг пролекарства/мл фармацевтической композиции.

3. Фармацевтическая композиция по п. 1, отличающаяся тем, что композиция содержит от 8 до 80 массовых процентов VEGF-нейтрализующего биологически активного фрагмента на основе общей массы связанного с носителем пролекарства.

4. Фармацевтическая композиция по п. 1, отличающаяся тем, что инъекция осуществляется в объеме инъекции в интервале от 10 до 200 мкл на инъекцию.

5. Фармацевтическая композиция по п. 1, отличающаяся тем, что период времени между двумя внутриглазными введениями связанного с носителем VEGF-нейтрализующего пролекарства составляет по меньшей мере 1 месяц.

6. Фармацевтическая композиция по п. 1, отличающаяся тем, что связанное с носителем VEGF-нейтрализующее пролекарство содержит в связанной форме биологически активный фрагмент, выбранный из группы лекарственных средств, состоящей из антисмысловой РНК, антисмысловой ДНК, рибозмов или PHКi молекул, нацеленных на VEGF нуклеиновую кислоту; анти-VEGF аптамеров, анти-VEGF антител, фрагментов анти-VEGF антител, дарпинов и растворимых VEGF рецепторов-ловушек, которые предотвращают связывание VEGF с его родственным рецептором; антисенсов, рибозимов и PHКi молекул, нацеленных на нуклеиновую кислоту VEGF родственного рецептора (VEGFR); анти-VEGFR аптамеров или анти-VEGFR антител, которые связываются с VEGFR родственным рецептором; фрагментов анти-VEGFR антител, которые связываются с VEGFR родственным рецептором, и VEGFR тирозинкиназных ингибиторов.

7. Фармацевтическая композиция по п. 1, отличающаяся тем, что связанное с носителем VEGF-нейтрализующее пролекарство содержит в связанной форме биологически активный фрагмент, выбранный из группы, состоящей из ранибизумаба, бевацизумаба, пегаптаниба, афлиберцепта, МР0112, KH902, ESBA1008, AL 39324, ALG-1001 и бевазираниба и/или их фрагментов.

8. Фармацевтическая композиция по п. 1, отличающаяся тем, что связанное с носителем VEGF-нейтрализующее пролекарство содержит в связанной форме ранибизумаб.

9. Фармацевтическая композиция по п. 1, отличающаяся тем, что связанное с носителем VEGF-нейтрализующее пролекарство содержит фрагмент формулы (F-i):

где

D представляет собой ранибизумаб;

пунктирная линия означает присоединение к носителю или необязательным спейсерным фрагментам;

X представляет собой C(R⁴R^4a); N(R⁴); О; C(R⁴R^4a)-C(R⁵R^5a); C(R⁵R^5a)-C(R⁴R^4a); C(R⁴R^4a)-N(R⁶); N(R⁶)-C(R⁴R^4a); C(R⁴R^4a)-O или O-C(R⁴R^4a);

X¹ представляет собой С или S(O);

X² представляет собой C(R⁷, R^7a) или C(R⁷, R^7a)-C(R⁸, R^8a);

R¹, R^1a, R², R^2a, R³, R^3a, R⁴, R^4a, R⁵, R^5a, R⁶, R⁷, R^7a, R⁸, R^8a независимо выбраны из группы, состоящей из Н и С_1-4 алкила;

необязательно, одна или более пар R^1a/R^4a, R^1a/R^5a, R^4a/R^5a, R^7a/R^8a образуют химическую связь;

необязательно, одна или более пар R¹/R^1a, R²/R^2a, R⁴/R^4a, R⁵/R^5a, R⁷/R^7a, R⁸/R^8a соединены вместе с атомом, к которому они присоединены, с образованием С_3-7 циклоалкила или 4-7-членного гетероциклила;

необязательно, одна или более пар R¹/R⁴, R¹/R⁵, R¹/R⁶, R⁴/R⁵, R⁷/R⁸, R²/R³ соединены вместе с атомом, к которому они присоединены, с образованием кольца А;

необязательно, R³/R^3a соединены вместе с атомом азота, к которому они присоединены, с образованием 4-7-членного гетероцикла;

А выбран из группы, состоящей из фенила; нафтила; инденила; инданила; тетралинила; С_3-10 циклоалкила; 4-7-членного гетероциклила и 8-11-членного гетеробициклила;

необязательно, фрагмент формулы (F-i) далее замещен, при условии, что водород, отмеченный звездочкой, в формуле (F-i) не замещен заместителем и что R³ и R^3a каждый независимо друг от друга представляет собой Н или соединены с N через SP³-гибридизированный атом углерода.

10. Фармацевтическая композиция по п. 9, отличающаяся тем, что X¹ представляет собой С.

11. Фармацевтическая композиция по п. 9 или 10, отличающаяся тем, что связанное с носителем VEGF-нейтрализующее пролекарство содержит фрагмент формулы (f-ii):

где

пунктирная линия означает присоединение к носителю;

R¹, R^1a, R², R^2a, R³, R^3a, X² и D применяются, как определено в п. 9;

R¹⁰ выбран из Н и С_1-6 алкила;

SP⁰ представляет собой спейсерный фрагмент;

и где фрагмент формулы (F-ii) необязательно далее замещен, при условии, что водород, отмеченный звездочкой в формуле (F-ii), не замещен заместителем и что R³ и R^3a каждый независимо друг от друга представляет собой Н или соединены с N через SP³-гибридизированный атом углерода.

12. Фармацевтическая композиция по п. 9 или 10, отличающаяся тем, что R¹ и R^1a оба представляют собой Н.

13. Фармацевтическая композиция по п. 9 или 10, отличающаяся тем, что связанное с носителем VEGF-нейтрализующее пролекарство содержит фрагмент формулы (F-iiia) или (F-iiib):

где

пунктирная линия означает присоединение к носителю;

R², R^2a, R³, R^3a, R⁷, R^7a, R⁸, R^8a, X² и D применяются, как определено в п. 9;

R¹⁰ и SP⁰ применяются, как определено в п. 11;

и где фрагмент формулы (F-iiia) или (F-iiib) необязательно далее замещен, при условии, что водород, отмеченный звездочкой в формуле (F-iiia) и (F-iiib), не замещен заместителем и что R³ и R^3a каждый независимо друг от друга представляет собой Н или соединены с N через SP³-гибридизированный атом углерода.

14. Фармацевтическая композиция по п. 9 или 10, отличающаяся тем, что связанное с носителем VEGF-нейтрализующее пролекарство содержит фрагмент формулы (F-iva) или (F-ivb):

где

пунктирная линия означает присоединение к носителю;

R³ и R^3a применяются, как определено в п. 9;

R^10b представляет собой C_1-6 алкил;

и где фрагмент формулы (F-iva) или (F-ivb) необязательно далее замещен, при условии, что водород, помеченный звездочкой, не замещен заместителем и что R³ и R^3a каждый независимо друг от друга представляет собой Н или соединены с N через SP³-гибридизированный атом углерода.

15. Фармацевтическая композиция по п. 9 или 10, отличающаяся тем, что R³ представляет собой Н и R^3a представляет собой метил.

16. Фармацевтическая композиция по п. 9 или 10, отличающаяся тем, что R³ и R^3a оба представляют собой Н.

17. Фармацевтическая композиция по п. 9 или 10, отличающаяся тем, что R³ и R^3a оба представляют собой метил.

18. Фармацевтическая композиция по п. 1, отличающаяся тем, что фармацевтическая композиция дополнительно содержит одно или более лекарственных средств в его/их свободной форме, выбранных из группы, состоящей из антисмысловой РНК, антисмысловой ДНК, рибозмов или PHКi молекул, нацеленных на VEGF нуклеиновой кислоты; анти-VEGF аптамеров, анти-VEGF антител, фрагментов анти-VEGF антител, дарпинов, антикалинов, липокалинов и растворимых VEGF рецепторов-ловушек, которые предотвращают связывание VEGF с его родственным рецептором; антисенсов, рибозимов и PHKi молекул, нацеленных на нуклеиновую кислоту VEGF родственного рецептора (VEGFR); анти-VEGFR аптамеров или анти-VEGFR антител, которые связываются с VEGFR родственным рецептором; фрагментов анти-VEGFR антител, которые связываются с VEGFR родственным рецептором, и VEGFR тирозинкиназных ингибиторов.

19. Фармацевтическая композиция по п. 1, отличающаяся тем, что фармацевтическая композиция дополнительно содержит одно или более пролекарств, где одно или более пролекарств содержат в связанной форме биологически активный фрагмент, выбранный из группы, состоящей из антисмысловой РНК, антисмысловой ДНК, рибозмов или PHКi молекул, нацеленных на VEGF нуклеиновую кислоту; анти-VEGF аптамеров, анти-VEGF антител, фрагментов анти-VEGF антител, дарпинов, антикалинов, липокалинов и растворимых VEGF рецепторов-ловушек, которые предотвращают связывание VEGF с его родственным рецептором; антисенсов, рибозимов и PHКi молекул, нацеленных на нуклеиновую кислоту VEGF родственного рецептора (VEGFR); анти-VEGFR аптамеров или анти-VEGFR антител, которые связываются с VEGFR родственным рецептором; фрагментов анти-VEGFR антител, которые связываются с VEGFR родственным рецептором, и VEGFR тирозинкиназных ингибиторов.