Способ прогнозирования развития нефрита в индуцированной модели системной красной волчанки

Изобретение относится к экспериментальной медицине и касается прогнозирования развития нефрита в индуцированной модели системной красной волчанки (СКВ). Способ заключается в том, что здоровым самкам мышам-гибридам (C57BL/6хDBA2)F1 внутрибрюшинно вводят липополисахарид в дозе 0,5 мкг/кг. Затем через 24 часа индуцируют модель СКВ путем внутривенного введения клеток селезенки мышей самок линии DBA/2. На 4-й и 8-й неделе от момента индукции СКВ определяют индекс соотношения нейтрофилов к лимфоцитам крови (N/L) и при достоверном увеличении значения N/L на 8-й неделе относительно 4-й недели от момента индукции СКВ прогнозируют развитие нефрита. 1 табл., 1 пр.

 

Изобретение относится к способу прогнозирования системных воспалительных состояний у здоровых животных, способных привести к развитию нефрита в индуцированной модели системной красной волчанки (СКВ).

В последние годы активно развиваются исследования, связанные с изучением фенотипической разнородности аутоиммунных, аллергических, онкологических заболеваний для разработки подходов персонализированной терапии. Примером фенотипической гетерогенности системной красной волчанки (далее - СКВ) у людей является наличие нефрита (более чем у половины больных) или его отсутствие. Системная красная волчанка (СКВ) - системное аутоиммунное заболевание, при котором сочетание генетических и эпигенетических факторов дает гетерогенную клиническую картину: от кожных проявлений до поражения почек (у 50% больных). Волчаночный нефрит является одним из серьезных проявлений и одним из самых сильных предикторов неблагоприятного исхода СКВ. Актуальным является поиск ранних предикторов нефрита, когда у больных СКВ оценивают разнообразные параметры воспаления (US 2008187944, C12Q 1/46, 2008; КР 101320694, C12Q 1/37, 2013).

В настоящее время относительно лабораторных животных формируется взгляд, учитывающий то, что, несмотря на исходную генетическую идентичность, животные в процессе онтогенеза под действием различных факторов внешней среды приобретают стабильные отличающиеся признаки посредством эпигенетических механизмов. Известна фенотипическая разнородность не только по размерам, весу среди инбредных (чистолинейных) однопометных мышей, разводимых в контролируемых условиях, но они проявляют значительную вариабельность в сложных поведенческих проявлениях. Эпигенетические модификации (влияние внешней среды) не изменяя нуклеотидную последовательность в геноме, вносят коррективы в активность генов, причем изменения эти сохраняются в течение всей жизни индивидуума и могут быть переданы по наследству. Эпигенетические модификации влияют на развитие организма, на темпы старения, они могут провоцировать аутоиммунные и другие заболевания, которые сегодня обозначены как заболевания «образа жизни». Характер эпигенетических изменений во многом зависит от внешней среды.

Собственно, такие модификации - один из самых мощных рычагов влияния среды на организм (Оеу Н., Isbel L, Hickey P., Ebaid В., Whitelaw E. Genetic and epigenetic variation among inbred mouse littermates: identification of inter-individual differentially methylated regions. Epigenetics & Chromatin (2015) 8:54 DOI 10.1186/s13072-015-0047-z). Эпигенетические изменения могут быть связаны с увеличением уровня ЛПС в крови здоровых животных.

Известно, что причиной аутоиммунных заболеваний является наличие липополисахарида (далее - ЛПС) - эндотоксина - продукта бактерий из желудочно-кишечного тракта, который появляется в крови больных и определяет картину воспаления низкой степени выраженности (WO 2008029897, А61K 38/00, 2008). Для изучения механизмов такого воспаления в настоящее время апробируются разнообразные экспериментальные модели. К числу таких моделей относится модель экспериментальной низкодозовой эндотоксемии, когда здоровым людям-добровольцам внутривенно вводится липополисахарид (ЛПС). Ответ на введение ЛПС у части здоровых лиц выявляет отклонения, характерные для больных сердечно-сосудистыми заболеваниями. Реакция на внутривенное введение ЛПС, который активирует врожденный иммунитет и вызывает специфические метаболические последствия, расценивается как интегральный показатель сложных физиологических, молекулярных и генетических взаимодействий, определяющих воспаление у каждого конкретного индивидуума (Patel P.N., Shah R.Y., Ferguson J.F., Reilly M.P. Human Experimental Endotoxemia in Modeling the Pathophysiology, Genomics and Therapeutics of Innate Immunity in Complex Cardiometabolic Diseases. Arterioscler Thromb Vase Biol. 2015; 35(3): 525-534). Введение ЛПС внутривенно здоровым людям, для оценки их реагирования и выявления предрасположенности к системным воспалительным процессам, является более полноценной реакцией по сравнению с условиями in vitro.

Известна модель на мышах C57BL/6, которым производится трансфекция гена лимфопролиферации - Ipr. Введение гена лимфопролиферации Ipr неизбежно вызывает развитие поликлональной активации В-клеток, нарастание титра антиДНК антител, т.е. развитию системной красной волчанки. Модель используется как способ тестирования терапевтических агентов для лечения системной красной волчанки по измерению средней продолжительности жизни, изменению в тканях, органах, клетках, изменению титра антиДНК антител в сыворотке крови (US 2005066378, А61K 67/027, 2005).

Описанные способы не позволяют прогнозировать предрасположенность к системным воспалительным заболеваниям у потенциально здоровых организмов.

Известен способ создания модели СКВ в полуаллогенной модели: перенос клеток селезенки от самок мышей DBA/2 ->самкам (C57BL/6 х DBA2) F1 гибридам. После индукции модели через 12 недель в популяции генетически однородных F1 гибридов у всех мышей имеются признаки СКВ: спленомегалия, гипергаммаглобулинемия, продукция аутоантител к ДНК, при этом у части мышей с более выраженными симптомами СКВ развивается нефрит (СКВнефрит+), а у мышей с менее выраженными симптомами СКВ нефрит отсутствует - сквнефрит-(Колесникова О.П., Кудаева О.Т., Вольский Н.Н., Гойман Е.В., Гаврилова Е.Д., Перминова О.М., Демченко Е.Н., Козлов В.А. Экспериментальная модель аутоиммунного процесса: роль эпигенетической изменчивости в популяции мышей-гибридов. Вестник РАМН 2015; 70 (2): 152-158). Оценка развития нефрита производится через 12 недель после индукции модели по уровню белка в моче. Можно предполагать, что разделение мышей на группы СКВнефрит- и СКВнефрит+, равное примерно 50/50 при индукции модели СКВ, обусловлено у части мышей эпигенетическими изменениями в системе врожденного иммунитета, определяющими более сильный воспалительный ответ, что в дальнейшем приведет к формированию группы СКВнефрит+.

Недостатком способа являются длительные сроки определения развития нефрита при СКВ по уровню белка в моче.

Задачей изобретения является создание способа более раннего прогнозирования развития нефрита в индуцированной модели системной красной волчанки in vivo.

Поставленная задача решается тем, что в способе прогнозирования развития нефрита в индуцированной модели системной красной волчанки (СКВ), здоровым самкам мышам-гибридам (C57BL/6 х DBA2)F1 внутрибрюшинно вводят липополисахарид в дозе 0,5 мкг/кг, затем через 24 часа индуцируют модель СКВ путем внутривенного введения клеток селезенки мышей самок линии DBA/2, на 4-й и 8-й неделе от момента индукции СКВ определяют индекс соотношения нейтрофилов к лимфоцитам крови (N/L) и при достоверном увеличении значения N/L на 8-й неделе относительно 4-й недели от момента индукции СКВ прогнозируют развитие нефрита.

Изобретение, на наш взгляд, является новым и обладает изобретательским уровнем.

Способ осуществляется следующим образом.

1) 27 здоровым самкам мышам - гибридам (C57BL/6 х DBA/2)F1 вводим ЛПС в дозе 0,5 мкг/кг внутрибрюшинно;

2) через 24 часа этим мышам вводим внутривенно клетки селезенки мышей самок линии DBA/2, индуцируя таким образом модель СКВ;

3) на 4-й и 8-й неделе от момента индукции модели определяем индекс N/L (соотношения нейтрофилов к лимфоцитам крови); оцениваем изменение индекса на 8 неделе относительно 4 недели у каждой мыши индивидуально.

4) у части мышей выявлено увеличение индекса N/L на 25%, а у другой части мышей - не установлено изменений индекса (увеличение составило 1,5% - в пределах ошибки);

5) через 12 недель после индукции модели у всех 27 мышей измеряем белок в моче для установления развития нефрита;

6) установлено, что у 14 мышей имеется нефрит (белок больше или равен 3 мг/мл), а у 13 - нефрита нет (белок меньше 3 мг/мл);

Важно, что увеличение индекса N/L выявляет подгруппу мышей СКВнефрит+ до выявления протеинурии, которая начинает определяться у мышей этой группы на 12 неделе от момента индукции модели. Опыт показывает, что через 8 недель можно прогнозировать развитие нефрита в индуцированной модели системной красной волчанки in vivo, а не через 12 недель - как при известных способах.

Пример. Доза ЛПС - 0,5 мкг/кг и индекс N/L как ранний маркер развития нефрита.

Ретроспективный анализ средних значений лейкоцитов, нейтрофилов, лимфоцитов в группе СКВнефрит- и СКВнефрит+ на 4 и 8 неделе от момента индукции модели не выявляет каких-либо существенных различий. При этом средние значения и индивидуальные колебания индекса N/L выявляют тенденцию его увеличения в группе СКВнефрит+ по сравнению с группой СКВнефрит- на 8 неделе по сравнению с 4 неделей от момента индукции модели. Для нормирования колебаний индекса N/L у каждого отдельного животного было подсчитано изменение (увеличение/уменьшение) индекса N/L к восьмой неделе относительно четвертой недели и было установлено, что изменения индекса N/L в группах СКВнефрит- и СКВнефрит+ достоверно отличаются: у мышей СКВнефрит+ выявляется существенное и достоверное увеличение индекса N/L - он составляет в среднем 25,1%, у мышей СКВнефрит- не выявляется существенных изменений индекса (увеличение 1,5% - в пределах ошибки измерения). Эти изменения в группах касаются и частотных характеристик: увеличение индекса N/L выявляется у 10 из 14 мышей СКВнефрит+ и только у 4 из 13 мышей СКВнефрит- (уровень статистической значимости различий индекса с наличием протеинурии по критерию Пирсона х2 соответствует р<0.05).

Примечания к таблице 1: n - количество мышей в группе;

в числителе - количество мышей с протеинурией в знаменателе - количество мышей в группе

Мы полагаем, что достоверное увеличение индекса N/L связано с началом развития нефрита в группе мышей CRDнефрит+, что согласуется с данными у человека [Li L, Xia Y., Chen С, Cheng P., Peng C. Neutrophil-lymphocyte ratio in systemic lupus erythematosus disease: a retrospective study. Int J Clin Exp Med. 2015; 8(7): 11026-31]. Возможность выявить группу мышей CRDнефрит+ на сроке 8 недель по увеличению индекса N/L относительно 4 недели представляется важным, т.к. в этот срок у мышей не выявляется протеинурия, на основании которой мы разделяем мышей на фенотипически разнородные группы СКВнефрит+ и СКВнефрит-.

Важно, что введение ЛПС здоровым мышам в дозе 0,5 мкг/кг не провоцирует развитие нефрита, т.к. известно, что введение ЛПС мышам с генетически обусловленной СКВ убыстряет и утяжеляет развитие нефрита. Пример 2. Было обнаружено, что после введения интактным реципиентам ЛПС в дозе 0,5 мкг/кг за сутки до индукции модели, через 12 недель у 20 мышей из 38 развился нефрит, у 18 мышей нефрита не было, т.е. процентное соотношение мышей СКВнефрит+/СКВнефрит- составило 53/47.

Введение ЛПС в дозе 0,5 мкг/кг за сутки до индукции процесса не изменяет частоты вариантов СКВнефрит+/СКВнефрит-, которое при стандартных условиях опыта в среднем также примерно равно 50/50. Таким образом, уже через 8 недель можно прогнозировать развитие нефрита в индуцированной модели системной красной волчанки in vivo, а не через 12 недель - как при известных способах.

Способ прогнозирования развития нефрита в индуцированной модели системной красной волчанки (СКВ), заключающийся в том, что здоровым самкам мышам-гибридам (C57BL/6 х DBA2)F1 внутрибрюшинно вводят липополисахарид в дозе 0,5 мкг/кг, затем через 24 часа индуцируют модель СКВ путем внутривенного введения клеток селезенки мышей самок линии DBA/2, на 4-й и 8-й неделе от момента индукции СКВ определяют индекс соотношения нейтрофилов к лимфоцитам крови (N/L) и при достоверном увеличении значения N/L на 8-й неделе относительно 4-й недели от момента индукции СКВ прогнозируют развитие нефрита.

-.



 

Похожие патенты:
Изобретение относится к медицине, а именно к экспериментальной хирургии. Используют устройство для травмы мелких лабораторных животных по механизму «удар», а именно травмирующего воздействия груза массой 425 г, который падает с высоты 28 см и передает свою энергию на переднюю брюшную стенку лабораторной крысе массой 360-390 г, находящейся в положении лежа на спине с ориентацией центра ударной площадки диаметром 3,5 см на 5 мм правее и выше кончика мечевидного отростка.

Изобретение относится к медицине, а именно к экспериментальной медицине. Вводят раствор капсаицина.

Изобретение относится к области ветеринарии и может быть использовано для изучения морфологии головного мозга животных. Для этого способ изготовления рельефных слепков коры и ствола головного мозга животных включает герметизацию полости обезжиренного, очищенного и высушенного черепа и заполняют ее, используя пластмассу холодной полимеризации типа порошок-жидкость в пропорции 1 часть порошка:1 часть жидкости.
Изобретение относится к медицине, в частности к экспериментальной фармакологии, акушерству и гинекологии. Способ включает моделирование гестоза внутрибрюшинным введением N-нитро-L-аргинин метилового эфира в дозе 25 мг/кг/сут в течение 7 суток лабораторной крысе на 13-14-е сутки беременности.
Изобретение относится к экспериментальной медицине и касается моделирования послеоперационных гнойно-воспалительных осложнений. Для этого крысе под эфирным наркозом при соблюдении правил асептики и антисептики создают срединную рану живота.

Изобретение относится к экспериментальной медицине и может быть использовано для ускорения восстановления количества эритроцитов и гемоглобина у крыс после кровопотери, являющейся моделью постгеморрагической анемии.

Изобретение относится к медицине, а именно к психиатрии и наркологии. Регистрируют электроэнцефалограмму (ЭЭГ), с электродов, расположенных по международной системе 10/20, определяют совокупность распределения средних значений мощности ЭЭГ ритмов в следующих частотных диапазонах: 14-20 Гц (бета 1), 21-30 Гц (бета 2), 11-20 Гц (альфа 2), 5,0-7,0 Гц (тета) и 1,0-4,0 Гц (дельта).

Изобретение относится к экспериментальной медицине, в частности к экспериментальной онкологии, и может быть использовано для прогнозирования роста опухоли в эксперименте.

Изобретение относится к экспериментальной медицине, а именно к экспериментальной токсикологии и гепатологии, и касается моделирования цирроза печени. Для этого проводят внутрижелудочное введение лабораторным животным в течение 3-х недель, через день, 40% этанола в дозе 3 г/кг.
Изобретение относится к медицине, в частности к микрохирургии и экспериментальной офтальмологии, и касается моделирования травматического процесса в роговице глаза.

Предложенная группа изобретений относится к области медицины, в частности акушерству и медицинской генетике. Предложены способы определения источника анеуплоидных клеток по крови беременной женщины.

Изобретение относится к медицине, а именно к пульмонологии и токсикологии. На территории по среднесуточному содержанию мелкодисперсной пыли, в 1,6 и более раз превышающему предельно-допустимую концентрацию, выявляют детей с рецидивирующим бронхитом.

Изобретение относится к измерительной емкости, которая предназначена для циркуляции газа, анализируемого методом спектрометрии. Емкость выполнена в виде полой трубки (20), снабженной отражающим материалом, образующим отражающий оптический слой.

Изобретение относится к прикладной гидробиологии, а именно к физиологии гидробионтов, и может быть использовано для экспресс-оценки общего уровня загрязненности акватории в естественной среде, в эксперименте и при культивировании.

Изобретение относится к прикладной гидробиологии, а именно к физиологии гидробионтов, и может быть использовано для экспресс-оценки общего уровня загрязненности акватории в естественной среде, в эксперименте и при культивировании.

Изобретение относится к области ветеринарии и представляет собой способ лабораторной диагностики ранних стадий жеребости кобыл, включающий воздействие в течение 30 с на термостатируемые образцы крови ультразвуковой волной интенсивностью 0,05 Вт/см2 с несущей частотой 0,88 МГц, частотой модуляции 1100 кГц и анализ морфологического состояния клеток методами световой микроскопии, в случае агрегации лимфоцитов диагностируют наличие жеребости.

Изобретение относится к биофизике, биологии и медицине, а именно к диагностике обменных нарушений, интоксикации организма при различных заболеваниях, в том числе наследственных, генетических, экологических, аутоиммунных.

Группа изобретений относится к области исследования параметров гемостаза. Картридж для исследования образцов содержит участок для подготовки образцов, включающий в себя блок обработки текучей среды; участок испытаний образцов, включающий в себя блок фиксации образцов, блок фиксации образцов, фиксирующий испытуемый образец таким образом, чтобы возбудить его колебания с целью получения отклика резонансной вибрации на колебательное возбуждение, прилагаемое к картриджу, и позволяющий вести наблюдение над образцами, колебания которых возбуждаются резонансной вибрацией.

Изобретение относится к ветеринарии, а именно к лабораторной диагностике, и может применяться для определения белковых фракций сыворотки крови. Способ определения белковых фракций сыворотки крови, включающий осаждение белковых фракций сыворотки крови фосфатными растворами в 6-ти пробирках, определение оптической плотности по степени мутности растворов и вычисление содержания белковых фракций сыворотки крови, отличается тем, что в пробирку №0 вносят 1,0 мл дистиллированной воды, по 1,0 мл соответствующих рабочих фосфатных растворов в пробирки №№1, 2, 3, 4 и 0,1 мл сыворотки крови, 0,15 мл дистиллированной воды, 0,75 мл основного фосфатного раствора в пробирку №5 с последующим перемешиванием путем перевертывания пробирки №5 и перенесением смеси по 0,1 мл в пробирки №№0, 1, 2, 3, 4, при этом измерение оптической плотности проводят на биохимическом анализаторе.

Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторной диагностике, и может быть использовано для измерения распределения эритроцитов по степени их деформируемости.

Группа изобретений относится к медицине и может быть использована для получения, разделения и исследования компонентов биологических жидкостей. Для этого первоначально в биологическую жидкость вводят не более одного реагента. Затем перемешивают и ожидают выпадения преципитата в течение 5-10 минут. После чего разделяют на фракции при центрифугировании в течение 3-5 минут. Затем проводят исследования количественного и качественного состава фракций для диагностики патологических состояний. Также представлено одноразовое устройство для получения, разделения и исследования компонентов биологических жидкостей. Группа изобретений обеспечивает получение, разделение и исследование компонентов биологических жидкостей с целью диагностики патологических состояний. 2 н. и 15 з.п. ф-лы, 9 ил.

Изобретение относится к экспериментальной медицине и касается прогнозирования развития нефрита в индуцированной модели системной красной волчанки. Способ заключается в том, что здоровым самкам мышам-гибридам F1 внутрибрюшинно вводят липополисахарид в дозе 0,5 мкгкг. Затем через 24 часа индуцируют модель СКВ путем внутривенного введения клеток селезенки мышей самок линии DBA2. На 4-й и 8-й неделе от момента индукции СКВ определяют индекс соотношения нейтрофилов к лимфоцитам крови и при достоверном увеличении значения NL на 8-й неделе относительно 4-й недели от момента индукции СКВ прогнозируют развитие нефрита. 1 табл., 1 пр.

Наверх