Способ селективного выделения аутоштаммов lactobacillus spp. из клинического материала
Владельцы патента RU 2675315:
Общество с ограниченной ответственностью Торговый дом "ЭкоФарм сервис" (RU)
Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии. Предложен способ селективного выделения аутоштаммов Lactobacillus spp. из клинического материала. Способ включает культивирование посевов лактобактерий в два этапа: на жидкой питательной среде «Бульон MRS для лактобактерий», дополнительно содержащей натрия гидрофосфат и пиобактериофаг поливалентный очищенный, а на втором этапе для пересева используют среду «Лактобакагар», разведенную водой дистиллированной до 1000 мл. Способ обеспечивает селективность выделения аутоштаммов Lactobacillus spp. и повышение выхода биомассы лактобактерий за счет ингибирования роста сопутствующих условно-патогенных микроорганизмов. 2 табл., 2 пр.
Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии, и может быть использовано для селективного выделения аутоштаммов Lactobacillus spp.из клинического материала (отделяемое слизистых влагалища, кал), получения бактерийных препаратов и лечения дисбиотических процессов.
Бактерии рода Lactobacillus являются обязательной и крайне значимой составляющей нормальной микробиоты пищеварительной и репродуктивной систем млекопитающих. В связи с этим культуры Lactobacillus spp.широко используются в качестве действующего начала в составе пробиотиков и синбиотиков [Червинец Ю.В., Червинец В.М., Миронов А.Ю. Симбиотические взаимоотношения лактобацилл и микроорганизмов желудочно-кишечного тракта: монография. Тверь: Ред.-изд. центр Твер. гос. мед. ун-та, 2016.- 214 с; Martin D.H. The microbiota of the vagina and its influence on women's health and disease. Am. J. Med. Sci. 2012; 343(1): 2-9].
Наряду с этим известно, что количественный и качественный состав микробиоты подвержен как эволюционным, так и инволюционным изменениям. С другой стороны - показано, что наибольший терапевтический эффект и, одновременно, в контексте концепции развития персонализированной медицины, могут оказывать аутоштаммы представителей нормобиоты, выделенные непосредственно от пациента [Compare D., Rocco A., Coccoli P., Angrisani D., Sgamato C, Iovine В., Salvatore U., Nardone G. Lactobacillus casei DG and its postbiotic reduce the inflammatory mucosal response: an ex-vivo organ culture model of postinfectious irritable bowel syndrome. BMC Gastroenterology. 2017; 17: 53. DOI 10.1186/s12876-017-0605-x]. He все виды и штаммы бактерий рода Lactobacillus одинаково биологически активны, поэтому показана перспективность разработки и применения комбинированных препаратов пробиотиков, включающих одновременно несколько видов Lactobacillus spp.[Hasannejad Bibalan M, Eshaghi M., Rohani M., Esghaei M., Darban-Sarokhalil D., Pourshafie M.R., Talebi M. Isolates of Lactobacillus plantarum and L. reuteri display greater antiproliferative and antipathogenic activity than other Lactobacillus isolates. J. Med. Microbiol. 2017; 66(10): 1416-1420. doi: 10.1099/jmm.0.000591].
Это актуализирует постоянную необходимость выделения и характеристики новых штаммов Lactobacillus spp., но существенно осложняется при исследовании клинического материала жизнедеятельностью антагонистических представителей микробиоты и многочисленностью видов лактобацилл. Так в настоящее время описано свыше 120 видов бактерий рода Lactobacillus, многие из которых недостаточно изучены, что не исключает их медико-биологического значения для человека (см. табл.1).
Основным способом выделения чистых культур Lactobacillus spp.для диагностики дисбактериоза, изучения штаммов и формирования коллекций указанных микроорганизмов является культуральный. Он основывается на применении питательных сред. Однако их общим недостатком является то, что используемые на данный момент питательные среды не обладают необходимой селективностью для подавления рост сопутствующей бактериальной флоры. Это существенно снижает эффективность проводимых в данном направлении исследований.
Известен способ выделения бактерий рода Lactobacillus из клинического материала, который предполагает приготовление серии 10-кратных разведений исследуемого материала в жидкой селективной питательной среде, обогащение при 39°С, высев из разведений на поверхность плотной селективной питательной среды, дополнительное культивирование посевов 24-48 ч при повышенном содержании углекислого газа (5%) и пониженной концентрации кислорода (16%) в атмосфере культивирования, при этом жидкая селективная питательная среда обогащения имеет достаточно сложный состав (г/л): гидролизат обезжиренного молока жидкий 225,0±25,0, аутолизат дрожжей концентрированный 110,0±10,0, агар 0,8, вода дистиллированная до 1 л, раствор едкого натра 20% до рН среды 5,4±0,1, а затем проводят выделение лактобацилл на плотной селективной питательной среде состава, г/л: гидролизат обезжиренного молока жидкий 225,0±25,0, аутолизат дрожжей концентрированный 110,0±10,0, агар 22,5±2,5, вода дистиллированная до 1 л, раствор едкого натра 20% до рН среды 5,4±0,1 [патент РФ №2154822, 2000 г.]. Несмотря на некоторое улучшение диагностики гинекологических заболеваний, способ отличается сложным составом используемых селективных питательных сред. Не показана его эффективность при исследовании содержимого кишечника
Известен способ выделения бактерий рода Lactobacillus из клинического материала. Состав питательной среды: аутолизат дрожжей концентрированный (аминный азот 580-600 мг %), лактоза, кислота уксусная ледяная, агар, отвар крупы сои (аминный азот 38-40 мг %), раствор едкого натра 20%. Культивирование проводится при температуре 39°С, повышенном содержании углекислого газа - 5% и пониженной концентрации кислорода 16%. Новизна этого способа состоит в том, что для приготовления питательных сред вместо гидролизата молока жидкого используют отвар крупы сои, лактозу и уксусную кислоту. Способ отличается трудоемкостью, технической сложностью, продолжительностью и не показана его эффективность при исследовании содержимого кишечника или отделяемого влагалища [патент РФ №2193060, 2002 г.].
Известен способ выделения бактерий рода Lactobacillus, который предусматривает высев клинического материала на поверхность плотной среды Рогоза следующего состава (в граммах на 1 литр): 25,0 дрожжевого аутолизата обыкновенного; 20,0 агар-агара; 10,0 пептона; 20,0 глюкозы; 1,0 Твин-80; 6,0 KH2PO4; 25,0 ацетата натрия; 2,0 цитрата аммония; 0,575 MgSO4; 0,12 MnSO4⋅2H2O; 0,034 FeSO4⋅7H2O; 1,32 уксусной кислоты ледяной; воды дистиллированной до 1 л; рН среды 5,4±0,1; с последующей инкубацией посевов при температуре 37°С в заполненном углекислым газом анаэростате в течение 4 суток [Ленцнер А.А., Тоом М.А., Воронина М.Н., Микельсаар М.Э. К методике выделения отдельных видов лактобацилл микрофлоры человека. Лабораторное дело. 1967; 5: 301-302].
Недостатком данного способа является связанная со сложным составом питательной среды трудоемкость ее изготовления в условиях практической баклаборатории и длительность культивирования выделяемых микроорганизмов. Однако наиболее существенным недостатком является то, что селективность предложенной среды обеспечивается высокими концентрациями ацетата натрия - 25 г/л. Тогда как показано, что увеличение концентраций ацетата натрия свыше 3 г/л существенно снижает буферную емкость питательных сред. Это в ходе столь продолжительного культивирования неминуемо снизит всхожесть не только сопутствующих бактерий, но непосредственно культивируемых Lactobacillus spp. Показанное снижение буферной емкости данной питательной среды, используемой для культивирования преимущественно факультативно-анаэробных и анаэробных представителей рода Lactobacillus, существенно повышает силу ингибирования их роста в том числе и остаточными концентрациями О2 в связи с увеличением окислительно-восстановительного потенциала (Eh) [Поляк М.С., Сухаревич В.И., Сухаревич М.Э. Питательные среды для медицинской и санитарной микробиологии. СПб.: ЭЛБИ-СПб.- 2008.- 352 с.].
Наиболее близким аналогом изобретения является способ выделения аутопробиотических Lactobacillus spp., заключающийся в том, что из фекалий осуществляют забор материала у пациентов. Для этого необходимо не менее 0,5 г материала (желательно - 5,0 г), при жидком стуле - слой не менее 1-2 см от дна посуды. Доставку в бактериологическую лабораторию осуществляют не позднее 2 часов после забора материала. Затем в стерильных условиях к 1 г материала добавляют 9 мл стерильного фосфатного буфера (физиологический раствор хлорида натрия с добавлением фосфатов натрия двух- и однозамещенных, смешанных в пропорции, необходимой для создания рН 7,4). Суспензию фекалий в разведении 1:10 высевают в количестве 100 мкл на селективную среду для лактобацилл МРС-4, содержащую: 10,0 г мясного экстракта; 10,0 г протеозопептона; 3,0 г дрожжевого экстракта; 17,5 г гидролизата казеина ферментативного; печеночную воду 100,0 мл; Твин-80 1,0 мл; 2,5 г глюкозы; 0,2 г L-цистеина; 2,0 г калия фосфата двузамещенного; 0,05 г сульфата марганца; 0,2 г сульфата магния; 5,0 г ацетата натрия; 2,0 г цитрата аммония; 15,0 г агара микробиологического и воду дистиллированную до 1 литра (производство НИЦФ, Санкт-Петербург, http://www.nicf.spb.ru/Download/%D0%9A%D0%B0%D1%82%D0%B0% D0%BB%D0%BE%D0%B3_%D0%9D%D0%98%D0%A6%D0%A4.pdf). Культивируют в течение 24-48 часов при 37°С в анаэробных или микроаэрофильных условиях. Затем выбирают типичные для Lactobacillus spp.отдельные колонии и отсевают их на новую чашку Петри со средой МРС-4 секторами с целью получения чистой культуры. Культивируют в течение 24-48 часов при 37°С в анаэробных или микроаэрофильных условиях. При световой микроскопии при окрашивании по методу Грама клетки лактобацилл приобретают темно-синий цвет, имеют форму палочек и располагаются в виде цепочек или отдельных клеток. Чистые культуры направляют на генетический анализ [патент РФ №2546253, 2015 г.]. Наиболее значимым недостатком предложенного способа является применение только богатых питательных сред, не оказывающих селективного эффекта на сопутствующие сапрофитные бактерии, количество которых, например, в фекалиях чрезвычайно велико, и, соответственно, высоки риски ингибирования ими выделяемых аутоштаммов Lactobacillus spp.из клинического материала.
Задачей изобретения является разработка способа селективного выделения аутоштаммов Lactobacillus spp.из клинического материала.
Технический результат при использовании изобретения - повышение селективности выделения аутоштаммов известных представителей рода Lactobacillus из клинического материала и выхода биомассы лактобактерий в результате ингибирования роста основных условно-патогенных представителей нормальной микробиоты (Staphylcoccus spp., Streptococcus spp., Proteus spp., Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa).
Предлагаемый способ селективного выделения аутоштаммов Lactobacillus spp.из клинического материала осуществляется следующим образом.
Выделение бактерий рода Lactobacillus из клинического материала (отделяемое слизистых влагалища, кал) осуществляют в два этапа: - накопление бактерий рода Lactobacillus на жидкой питательной среде «Бульон MRS для лактобактерий» (HiMedia Laboratories Pvt. Limited (Индия), селективность которой существенно повышается в результате внесения в нее в асептических условиях препарата «Пиобактериофаг поливалентный очищенный» (ФГУП НПО «Микроген», Россия) в соотношении 1:10;
- последующий высев на плотную неселективную питательную среду «Лактобакагар» для получения изолированных колоний.
Первый этап. Для получения накопительной культуры лактобактерий клинический материал (отделяемое слизистых влагалища, кал) вносят в пробирку с модифицированной жидкой селективной питательной средой «Бульон MRS для лактобактерий», содержащей на 1 л: протеозопептон -10,0 г; мясной экстракт - 10,0 г; дрожжевой экстракт - 5,00 г, глюкозу -20,0 г; Твин-80 - 1,0 мл; аммония цитрат - 2,0 г; натрия ацетат - 5,0 г; магния сульфат - 0,10 г; марганца сульфат - 0,05, натрия гидрофосфат - 2,0 г; пиобактериофаг - 100 мл и воду дистиллированную до 1000 мл. Инкубируют в анаэробных условиях при 37°C в течение 24-48 ч (не более 72 ч) до появления признаков роста. Результат учитывают визуально, по наличию общего помутнения среды. При росте бактерий рода Lactobacillus наблюдается диффузное помутнение среды с прозрачной зоной в верхней части. Из образцов накопительных культур с наличием роста готовят фиксированные препараты, окрашивают по Граму. Отмечают характерные по морфологии грамположительные палочки, без капсулы, неспорообразующие, расположенные отдельно или цепочками.
Второй этап - выделение чистой культуры лактобактерий на плотной питательной среде.
Для этого проводят посев по методу Коха 0,1 мл полученной накопительной культуры на поверхность плотной неселективной питательной среды «Лактобакагар», содержащей в грамм/литр: панкреатический гидролизат рыбной муки - 20,0; дрожжевой экстракт 5,0; экстракт мясной или пептон - 5,0; Д-глюкозу - 20,0; калия монофосфат - 2,0; натрия ацетат 3-водный - 5,0; твин-80 - 1 мл; аммония цитрат - 2,0; магния сульфат 7-водный - 0,1; марганца хлорид 4-водный - 0,05; агар-агар - 13,0±2,0 и воду дистиллированную до 1000 мл, рассевают шпателем по трем чашкам Петри для получения изолированных колоний. Культивирование посевов проводят в течение 24-48 ч при 37°C в анаэростате. Колонии описывают и микроскопируют фиксированные окрашенные препараты. Колонии бактерий рода Lactobacillus вырастают разной величины, от точечных (росинки), до 2-3 мм в диаметре, чаще плоские, шероховатые, слегка опалесцирующие, прозрачные, иногда с возвышением в центре и валиком по краю, редко белого цвета. Для последующей идентификации все колонии рекомендуется проверять путем микроскопии окрашенных по Граму мазков.
Питательная среда для выделения и культивирования лактобацилл «Лактобакагар» (ФБУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» (Оболенск)) предназначена для выделения и культивирования лактобацилл при бактериологическом исследовании в клинической лабораторной диагностике, пищевой микробиологии. Достоинством данной среды является то, что совокупность компонентов, входящих в состав Лактобакагара, обеспечивает необходимые питательные потребности для роста лактобактерий и ингибиции отдельных видов микроорганизмов (кишечной палочки, клебсиелл и псевдомонад), недостатком - рост энтерококков и дрожжеподобных грибов.
На первом этапе культивирования на жидкой селективной среде, благодаря добавлению пиобактериофага, задерживается рост сопутствующей микрофлоры, что способствует ускоренному накоплению лактобактерий. На втором этапе культивирования посевов на плотной питательной среде обеспечивается рост изолированных колоний, которые в дальнейшем могут быть охарактеризованы. Колонии штаммов-кандидатов могут использоваться для паспортизации и практического применения. В частности выделенные культуры используют для дальнейшего изучения: определения биосовместимости с эубиотическими штаммами бактерий, приготовления лактобактерина на основе аутоштаммов бактерий рода Lactobacillus, определения чувствительности аутоштаммов бактерий к антибиотикам, антагонизм аутоштаммов по отношению к условно-патогенным бактериям, адгезивность на культурах клеток.
Для подтверждения принадлежности к роду Lactobacillus и определения вида выделенной культуры проводят анализ методом полимеразной цепной реакции с родо- и видоспецифичными праймерами.
Пример 1. Выделение бактерий рода Lactobacillus из клинического материала (вагинальное отделяемое).
Стерильную жидкую селективную питательную среду для выделения лактобактерий «Бульон MRS для лактобактерий» в асептических условиях разливают в подготовленные две пробирки по 10,0 мл. В первую пробирку добавляют 1,0 мл препарата «Пиобактериофаг поливалентный очищенный» (ФГУП НПО «Микроген», Россия), включающего родоспецифические (Staphylococcus spp., Streptococcus spp., Proteus spp.) и видоспецифические (Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa) бактериофаги (опыт), во вторую - 1,0 мл дистиллированной воды (контроль). Добавляют клинический материал - 0,1 мл вагинального отделяемого (дисбиоз влагалища, исходная концентрация лактобактерий 103 КОЕ/мл). Посевы инкубируют в анаэробных условиях при 37°С в течение 24 ч. Результат учитывают визуально, наблюдают диффузное помутнение столбика среды с прозрачной зоной в верхней части. Из образцов накопительных культур с наличием роста готовят фиксированные препараты, окрашивают по Граму. Отмечают по морфологии грамположительные палочки бактерий рода Lactobacillus, расположенные отдельно и цепочками.
Затем готовят серию 10-кратных разведений полученных накопительных культур из опытной и контрольной пробирок. Разведения делают в пробирках, содержащих по 4,5 мл жидкой селективной питательной среды, при помощи автоматического дозатора со съемными наконечниками, путем последовательного перенесения из пробирки в пробирку по 0,5 мл. Титрование по 0,5 мл производят до 10-10.
После титрования посевы инкубируют в течение 24 часов в анаэробных условиях при температуре 37°С. Результат учитывают визуально, по наличию общего помутнения среды или росту изолированных колоний. Затем из пробирок с наличием роста готовят мазки, окрашивают по Граму. Оценку количественного содержания лактобактерий определяют по максимальному разведению, в котором обнаружены типичные грамположительные палочки. Пробирки, в которых обнаружена кокковая флора или грамотрицательные палочки, не учитываются.
Конечная концентрация лактобактерий в опытной пробирке с добавлением пиобактериофага составила 109 КОЕ/мл, в контрольной - 105 КОЕ/мл.
Проводят посев 0,1 мл полученной накопительной культуры из опытной пробирки на поверхность плотной питательной среды для выделения лактобактерий «Лактобакагар» по методу Коха, рассевают его шпателем по трем чашкам Петри для получения изолированных колоний. Культивирование посевов проводят в течение 24-48 ч при 37°С в анаэростате. Получают изолированные колонии аутоштаммов Lactobacillus spp.
Получение аутоштаммов с использванием пиобактериофага позволило повысить выход биомассы лактобактерий.
Пример 2. Результаты бактериологического контроля на предлагаемой и известных средах.
Из данных таблицы 2 видно, что предлагаемая модифицированная среда для лактобактерий с добавлением пиобатериофага имеет преимущество, так как на ней подавляется рост Candida albicans и Enterococcus faecium. На известной же среде (без модификаций) энтерококки и дрожжеподобные грибы вырастают в виде гладких, круглых, белых и полупрозрачных колоний. Параллельно проводят контроль жизнеспособности бактерий путем высева на простой питательный бульон.
Способ селективного выделения аутоштаммов Lactobacillus spp.из клинического материала 
Способ селективного выделения аутоштаммов Lactobacillus spp.из
клинического материала
Примечание: «-» - отсутствие роста бактерий; «+» - наличие роста бактерий.
Способ селективного выделения аутоштаммов Lactobacillus spp. из клинического материала, включающий на первом этапе высев исследуемого клинического материала на питательную среду для лактобактерий, содержащую: протеозопептон - 10,0 г; мясной экстракт - 10,0 г; Твин-80 - 1,0 мл; аммония цитрат - 2,0 г; натрия ацетат - 5,0 г; марганца сульфат - 0,05 г, дрожжевой экстракт, глюкозу, магния сульфат и воду до 1000 мл, инкубирование посева в анаэробных условиях при 37°C в течение 24-48 ч, на втором этапе выделение чистой культуры путем пересева на плотную питательную среду для выделения и культивирования лактобактерий, рассевание на чашку Петри для получения изолированных колоний и культивирование посевов в течение 24-48 ч при 37°C в анаэробных условиях, отличающийся тем, что на первом этапе высев проводят на жидкую питательную среду, содержащую дополнительно натрия гидрофосфат и пиобактериофаг поливалентный очищенный при следующем соотношении компонентов среды, г/л:
| протеозопептон | 10,0 |
| мясной экстракт | 10,0 |
| дрожжевой экстракт | 5,0 |
| глюкоза | 20,0 |
| аммония цитрат | 2,0 |
| натрия ацетат | 5,0 |
| магния сульфат | 0,10 |
| марганца сульфат | 0,05 |
| натрия гидрофосфат | 2,0 |
а также, мл:
| Твин-80 | 1,0 |
| пиобактериофаг | |
| поливалентный очищенный | 100 |
| вода дистиллированная | до 1000 |
а на втором этапе для пересева используют среду «Лактобакагар», разведенную водой дистиллированной до 1000 мл.
