Способ поверхностной стерилизации эксплантов осины in vitro

Авторы патента:

A01H4/00 - Разведение растений из тканевых культур

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ стерилизации эксплантов осины in vitro, включающий заготовку одревесневших побегов взрослых деревьев в марте-апреле, выгонку молодых растущих побегов, их поэтапную экспозицию в хлорсодержащих агентах, таких как 2% раствор «Domestos» в течение 8 минут и 10% раствор «Аламинол» в течение 10 минут. Изобретение позволяет получить высокую долю асептических жизнеспособных культур до 90%. 1 ил., 2 табл.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности, к культивированию тканей и органов растений, и может быть использовано в лесном хозяйстве для повышения эффективности клонального микроразмножения хозяйственно-ценных форм осины с целью массового получения посадочного материала и сохранения генофонда ценных и редких сортов и гибридов.

Известны работы по получению асептических культур осины, включающие, обработку хлорсодержащими агентами (хлорамин [1], гипохлорит натрия [2]) и дезинфицирующими средствами на их основе, а также ртутьсодержащими веществами (сулема [3, 4], нитрат ртути [5]). К числу недостатков использования указанных способов относятся низкая эффективность стерилизации тканей взрослых сильно инфицированных деревьев и высокая токсичность ртутьсодержащих средств.

Наиболее близким к предлагаемому изобретению является «Способ выращивания посадочного материала» (Патент России №2485755) [6], в котором отрезки изолированных в июне неодревесневших побегов тополя подвергают поэтапной стерилизации: 2% раствором «Domestos» в течение 15 минут с последующей промывкой в проточной водопроводной воде, в асептических условиях (в условиях ламинар-бокса) 0,025% раствором мертиолята в сочетании с жидким дезинфицирующим раствором "Белизна" (7% раствор) и средством «Твин» (0,08…0,12%) в течение 15 мин, с последующей 5-кратной промывкой стерильной дистиллированной водой.

Недостатком данного способа (прототипа) является использование мертиолята - высокотоксичного ртутьсодержащего соединения (I класс опасности), оказывающего мутагенное и канцерогенное действие.

Задача изобретения - обеспечение безопасного для здоровья исследователей и при этом эффективного способа стерилизации первичных эксплантов при введении в культуру in vitro сильно инфицированных тканей и органов взрослых древесных растений.

Технический результат достигается путем использования в качестве основного стерилизатора средства «Аламинол», действующим веществом которого является алкилдиметилбензиламмония хлорид - низкотоксичное соединение, относящееся к IV классу малоопасных веществ при нанесении на кожу и при ингаляционном воздействии. «Аламинол» применяется для дезинфекции помещений, поверхностей, мебели, а также инструментов, предметов, оборудования медицинского назначения при инфекциях бактериальной, вирусной, грибковой этиологии. Однако случаи использования «Аламинол» для стерилизации растительного материала in vitro неизвестны.

Новым в предложенном способе является то, что «Аламинол» впервые применяется в качестве стерилизатора в культуре тканей растений.

Способ реализуется следующим образом:

1. Заготовленные в марте - апреле месяце одревесневшие побеги взрослых деревьев осины помещают в лабораторных условиях в сосуды с водой и в течение 1-3 недель выгоняют из них молодые растущие побеги.

2. Молодые побеги размером 3-5 см выдерживают в проточной воде в течение 15-20 мин, а затем в нестерильных условиях проводят предварительную стерилизацию 2% раствором средства «Domestos» в течение 8 мин с последующим промыванием в проточной воде 15-20 мин;

3. Основную стерилизацию побегов осуществляют в условиях ламинар-бокса» 10% раствором дезинфицирующего средства «Аламинол» (действующее вещество - алкилдиметилбензиламмония хлорид) в течение 10 мин с последующей 3х кратной промывкой стерильной дистиллированной водой.

4. Простерилизованные побеги в стерильных чашках Петри разрезают на экспланты размером 1,5-2 см с одной - двумя пазушными почками и помещают на питательные среды, содержащие 1/2 концентрации макросолей Woody Plant Medium (WPM), полный состав микросолей, витаминов и органических добавок среды WPM, 20 мг/л сахарозы, 0,2-0,5 мг/л 6-бензиламинопурина (6-БАП). Эффективность стерилизации оценивается долей асептических жизнеспособных культур от общего числа исходных эксплантов, учет проводится через 4 недели.

В таблицах 1-2 представлена эффективность различных режимов стерилизации побегов осины.

Как следует из приведенных данных, наиболее эффективным является способ стерилизации эксплантов, полученных выгонкой в лабораторных условиях в марте-апреле, включающий предварительную стерилизацию 2% раствором «Domestos» в течение 8 мин и основную стерилизацию 10% раствором «Аламинол» в течение 10 мин, позволивший получить до 90% асептических жизнеспособных культур (фиг. 1).

Таким образом, способ получения асептических жизнеспособных культур осины в условиях in vitro отличается эффективной обработкой эксплантов, более безопасен для здоровья исследователей по сравнению с ранее применяемыми способами. Способ позволяет получить достаточное количество жизнеспособных стерильных культур для их последующего клонального микроразмножения и массового получения посадочного материала, сохранения представителей ценного генофонда в коллекциях in vitro.

Источники информации:

1. Авторское свидетельство №1581741 А1, Способ микроклонального размножения гибридов осины // Байбурина Р.К. [и др.]. - 4472702/31-13, заяв. 10.08.1988, опуб. 30.07.1990., Бюл. №28. - 5 с.

2. Зонтиков Д.Н. и др. Оценка способа стерилизации и минерального состава питательных сред на эффективность культивирования Populus tremula L. в условиях in vitro. Научный журнал КубГАУ. №91(07). 2013.

3. Королева Ю.А. Микроклональное размножение видов рода Populus / Ю.А. Королева [и др.] // Вестник Удмуртского Университета. 2012. Вып. 3. С. 50-54.

4. Исхакова Д.Я. Экспериментальный морфогенез в культуре ткани осины триплоидной (Populus tremula L.) // Вестник КазНУ. 2014. №1/2 (60). С. 364-366.

5. Гарипов Н.Р. "Отбор и выращивание триплоидной осины (Populus tremula L.) с применением методов молекулярной генетики и биотехнологии в Республике Татарстан": дис. … канд. с.-х. наук. Пушкино, 2014. 128 с.

6. Патент РФ №2485755 С1,. Способ выращивания посадочного материала // Сиволапов А.И. [и др.]. - 2011143443/13, заяв. 28.10.2011, опуб. 27.06.2013., Бюл. №18. - 3 с.

Способ стерилизации эксплантов осины in vitro, включающий заготовку одревесневших побегов взрослых деревьев в марте-апреле, выгонку молодых растущих побегов, их поэтапную экспозицию в хлорсодержащих агентах, таких как 2% раствор «Domestos» в течение 8 минут и 10% раствор «Аламинол» в течение 10 минут.

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ получения микроклубней картофеля in vitro, включающий черенкование пробирочных растений и высадку одноузловых черенков на агаризованную питательную среду, содержащую макро- и микроэлементы и витамины на основе прописи питательной среды Мурасиге и Скуга, Fe-хелат, агар-агар, сахарозу.

Способ размножения иммунноустойчивых образцов картофеля in vitro на аэрогидропонике // 2670485

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ размножения иммунноустойчивых образцов картофеля in vitro на аэрогидропонике, включающий орошение оснований черенков регенерантов, где в качестве питательного раствора вводят водный препарат Флорон в концентрации 0,5% с добавлением пектина в концентрации 0,3-0,4% водного раствора Флорона, причем, пектин готовят из кортофельных очисток оздоровленных клубней того же сорта или гибрида размножаемых регенерантов.

Способ получения безвирусного посадочного материала картофеля ценных сортов // 2668153

Изобретение относится к сельскохозяйственной биотехнологии. Изобретение представляет собой способ получения безвирусного посадочного материала картофеля ценных сортов, заключающийся в том, что проводят прививку поделенных на части микро- и мини-клубней картофеля ценного сорта после предварительного обеззараживания, подсушивания и удаления с клубня-няньки картофеля обычного сорта всех глазков, проводят прививку на клубень-няньку путем прижатия фрагментов микро- и мини-клубней к местам удаленных глазков с последующим подсушиванием, обеззараживанием среза вокруг прививки и дальнейшим культивированием в условиях in vivo.

Способ получения адвентивных корней вздутоплодника сибирского (phlojodicarpus sibiricus (steph.) к.-pol.) в условиях in vitro // 2666920

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ получения адвентивных корней вздутоплодника сибирского (Phlojodicarpus sibiricus (Steph.) K.-Pol.) в условиях in vitro, включающий стерилизацию семян вздутоплодника перекисью водорода в течение 5 мин, ополаскивание, трехкратное отмывание в течение 5 мин в дистиллированной воде, помещение стерильных семян на твердую питательную среду без гормонов, следующего состава: NH4NO3 1650,000±2,0000 мг, KNO3 1900,000±2,0000 мг, MgSO4×7H2O 370,000±1,0000 мг, KH2PO4 170,000±0,1000 мг, CaCl2×2H2O 440,000±0,5000 мг, Н3ВО3 6,200±0,0100 мг, MnSO4×4H2O 22,300±0,0200 мг, ZnSO4×7H2O 8,600±0,0100 мг, KI 0,830±0,0010 мг, Na2MoO4×2H2O 0,250±0,0010 мг, CuSO4×5H2O 0,025±0,0001 мг, CoCl2×6H2O 0,025±0,0001 мг, FeSO4×7H2O 2,785±0,001 мг, Na-ЭДТА 3,725±0,001 мг, тиамин 0,100±0,0010 мг, пиридоксин 0,100±0,0010 мг, сахароза 30000,000±100,0000 мг, вода 1000 мл, агар 5000 мг, дальнейшее помещение растений, полученных in vitro, в аналогичную питательную среду с добавлением ауксина, при этом культивирование растений проводят в темноте, при температуре 26±1°С, влажности помещения 70±5%, цикл субкультивирования составляет 4 недели, при пересеве используют 1/3 адвентивных корней, полученные адвентивные корни выращивают в течение более тридцати циклов.

Способ клонального микроразмножения кирказона маньчжурского (aristolochia manshuriensis kom.) // 2662682

Изобретение относится к области биотехнологии растений. Изобретение представляет собой способ клонального микроразмножения эндемика Маньчжурского флористического района Aristolochia manshuriensis Kom., включающий вычленение апикальных и латеральных почек, стерилизацию гипохлоритом натрия (экспозиция 7-10 мин), высаживание на питательные среды MS с добавлением 0,8 мг/л 6-ВАР и 0,05 мг/л ИУК, размножение микропобегов, их последующее укоренение на среде MS, содержащей 20 мг/л сахарозы и ИМК в концентрации 3-5 мг/л, адаптацию растений-регенерантов к условиям ex vitro посредством высаживания на смесь песка, торфа и дерновой листовой земли в соотношении 1:1:1, предварительно простерилизованной при 85-90°С в течение 1-2 ч.

Способ клонального микроразмножения иван-чая узколистного (chamaenerion angustifolium (l.) holub) // 2662677

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ клонального микроразмножения иван-чая узколистного Chamaenerion angustifolium L.Holub, включающий вычленение пазушных меристем, стерилизацию эксплантов 7%-ным гипохлоритом кальция в течение 7 минут, высаживание на питательные среды MS с добавлением 6-ВАР в количестве 0,5 мг/л и MS с добавлением FeSO4⋅7H2O в количестве 30 мл/л, 6-ВАР в количестве 0,5 мг/л, IAA в количестве 0,01 мг/л, размножение микропобегов, их последующее укоренение на среде MS, дополненной 1 мг/л IBA, адаптацию растений-регенерантов к условиям ex vitro.

Способ сохранения ювенильного статуса культуры in vitro малины (rubus idaeus) // 2662670

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ сохранения ювенильного статуса культуры in vitro малины (Rubus idaeus), включающий перенос микрорастений малины на стадиях мультипликации или укоренения на питательные среды в условиях с пониженным уровнем освещенности и пониженной температурой, где смена освещенности и температуры происходит через 5 дней на стадии мультипликации и через 14 дней на стадии укоренения после начала очередного пассажа культивирования, при этом в качестве питательной среды на стадии мультипликации используют питательную среду MS с добавлением сахарозы 30 г/л, инозитола 100 мг/л, пиридоксина 0,1 мг/л, тиамина 0,1 мг/л, никотиновой кислоты 0,5 мг/л, 6-БАП 0,8 мг/л и зеатина 0,1 мг/л, а на стадии укоренения в качестве питательной среды используют питательную среду 1/2 QL с добавлением сахарозы 20 г/л, инозитола 100 мг/л, пиридоксина 0,1 мг/л, тиамина 0,1 мг/л, никотиновой кислоты 0,5 мг/л, индолилмасляной кислоты (ИМК) 0,1 мг/л, ИУК 0,1 мг/л, при этом уровень интенсивности освещенности снижается до 1000±200 люкс, а температура - до 4-8°С.

Способ укоренения и адаптации растений, полученных в культуре in vitro с использованием мха сфагнума // 2659237

Изобретение относится к области биотехнологии растений и может быть использовано в питомниководстве для производства посадочного материала с помощью технологии клонального микроразмножения.

Способ выращивания растений // 2653601

Изобретение относится к области сельского хозяйства, а именно к картофелеводству. Способ включает получение оздоровленных растений картофеля для черенкования (промежуточный продукт), мини-клубней картофеля (промежуточный продукт), клубней супер – суперэлиты (промежуточный продукт), клубней суперэлиты (промежуточный продукт), клубней элиты (промежуточный продукт), клубней первой полевой репродукции (конечный продукт).

Способ клонального микроразмножения алычи in vitro // 2652953

Изобретение относится к области биотехнологии растений. Изобретение представляет собой способ клонального микроразмножения алычи in vitro, включающий культивирование микропобегов алычи на этапе мультипликации на среде QL с добавлением сахарозы 30 г/л, агар-агара 9 г/л, БАП 0,5-2 мг/л и зеатина 0,05-1 мг/л, укоренение микропобегов на половинной по макросолям среде QL с добавлением сахарозы 20 г/л, агар-агара 9 г/л, ИУК 0,1-1 мг/л и/или ИМК 0,1-1 мг/л, и/или НУК 0,1-1 мг/л, при этом этап мультипликации проводят в два пассажа по три недели каждый, причем на второй пассаж переносят целые конгломераты почек и побегов без разделения, а этап укоренения проводят в течение первых 2-7 суток в темноте, а затем - 1-2 недели на свету.

Питательная среда для укоренения побегов винограда в культуре in vitro // 2676127

Изобретение относится к биотехнологии. Изобретение представляет собой питательную среду для укоренения побегов винограда in vitro, содержащую аммоний азотнокислый, калий азотнокислый, магний сернокислый, натрий фосфорнокислый, железо сернокислое, этилендиаминотетраацетат натрия, борную кислоту, марганец сернокислый, цинк сернокислый, калий йодистый, натрий молибденовокислый, медь сернокислую, кобальт хлористый, миоинозит, тиамин, пиридоксин, ИУК или ИМК, сахарозу, агар, воду, где оптимизированы соотношения макроэлементов и дополнительно содержатся натрий фосфорнокислый и кальций азотнокислый. Изобретение позволяет повысить количество и качество укорененных побегов и преодолеть сортовую специфику виноградного растения на этапе укоренения. 1 ил., 1 табл.