Композиции клеток, полученные из дедифференцированных перепрограммированных клеток

Изобретение относится к области клеточной биологии и биотехнологии, а именно к получению инсулина. Способ включает обеспечение контакта индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека, из которых исключены эмбриональные стволовые клетки человека, полученные путем разрушения эмбриона, in vitro с первой средой для выращивания клеток, содержащей агент, активирующий член семейства рецепторов TGFβ, выбранный из группы, включающей Активин А, Активин В, Nodal, GDF-8, GDF-9, GDF-10, GDF-11 и костный морфогенетический белок (BMP). Далее осуществляют культивирование in vitro указанных клеток во второй среде для выращивания клеток, не содержащей агент, активирующий член семейства рецепторов TGFβ, с получением, таким образом, клеток энтодермы передней части пищеварительного тракта. Далее осуществляют контакт клеток энтодермы передней части пищеварительного тракта с агентом, активирующим рецептор ERBB тирозинкиназы, с получением, таким образом, субпопуляции клеток, включающей эндокринные клетки и неэндокринные клетки. После этого происходит созревание указанных субпопуляций in vivo с получением, таким образом, инсулин-секретирующих клеток. Настоящее изобретение позволяет упростить получение клеток, которые секретируют инсулин в ответ на стимуляцию глюкозой. 2 н. и 9 з.п. ф-лы, 8 ил., 12 табл., 7 пр.

 

Перекрестные ссылки на родственные заявки

По настоящей заявке испрашивается приоритет патентной заявки США №13/761,078, озаглавленной «Композиции клеток, полученные из дедифференцированных перепрограммированных клеток», поданной 6 февраля 2013, которая является частичным продолжением заявки США №12/765,714, озаглавленной «Композиции клеток, полученные из дедифференцированных перепрограммированных клеток», поданной 22 апреля 2010, которая является непредварительной заявкой, по которой испрашивается приоритет по 35 U.S.C. §119(e) для предварительной патентной заявки США №61/171,759, озаглавленной «Композиции клеток, полученные из дедифференцированных перепрограммированных клеток», поданной 22 апреля 2009, описание которой полностью включено в настоящее описание посредством.

Список последовательностей

Настоящая заявка подана вместе со списком последовательностей в электронном формате. Список последовательностей представлен в виде файла, озаглавленного CYTHERA068P1.TXT, созданного 28 января 2013, размером 8,92 кб. Информация в электронном формате Списка последовательностей полностью включена в настоящее описание посредством ссылки.

Области техники, к которой относится настоящее изобретение

Настоящее изобретение относится к выделению, поддержанию и применению культур клеток. В частности, оно относится к композициям клеток, полученным из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток.

Предшествующий уровень техники

Важным применением плюрипотентных клеток является их применение в клеточной терапии. Плюрипотентные стволовые клетки включают стволовые клетки эмбриона человек (hES), зародышевые клетки эмбриона человека (hEG), но не ограничиваются ими. Существуют другие типы плюрипотентных клеток, например, дедифференцированные стволовые клетки человека и мыши, т.е. дифференцированные соматические взрослые клетки, дедифференцированные для получения стволовых клеток, подобных плюрипотентным. Эти дедифференцированные клетки, индуцированные для получения клеток, обладающих плюрипотентностью и способностью к росту, подобной ES клеткам, также называют «индуцированными плюрипотентными стволовыми (iPS) клетками», «клетками, подобным эмбриональным стволовым клеткам», «ES-подобными клетками», или их эквивалентами. Такие клетки являются потенциально жизнеспособными альтернативными плюрипотентными клетками. Для терапевтического применения iPS клеток требуется доказательство того, что эти клетки стабильны и демонстрируют подходящий профиль безопасности в доклинических исследования при лечении диабета и других заболеваний. Перепрограммирование дифференцированных соматических клеток человека в плюрипотентное состояние обеспечивает получение стволовых клеток, специфичных для пациента и заболевания. См. Takahashi, K. et al. Cell, 1-12, 2007, и Ju, J. et al. Science 2007. Takahashi et al. и Ju et al. вводили четыре гена в фибробласты взрослого человека и плода/новорожденного для генерации iPS клеток: Oct4, Sox2, Klf4 и c-myc у Takahashi et al; Oct4, Sox2, Nanog и Lin28 y Ju et al. В каждом случае iPS клетки обладали некоторыми характеристиками hES клеток, включая морфологию, экспрессию маркеров, пролонгированную пролиферацию, нормальный кариотип и плюрипотентность hES клеток.

Хотя iPS клетки могут обеспечивать регенеративное средство на клеточной основе без связанных этических проблем, свойства дифференцировки iPS клеток, например, потенциал дифференцировки и эффективность дифференцировки in vitro, остаются неясными, и способ направленной дифференцировки для iPS клеток не был продемонстрирован. Таким образом, имеется потребность в определении и демонстрации детальных свойств дифференцировки и эффективности направленной дифференцировки iPS клеток.

Изложение сущности настоящего изобретения

Варианты осуществления, описанные в настоящей заявке, обеспечивают композиции клеток, полученные из плюрипотентных клеток, например, дедифференцированных перепрограммированных клеток, таких как индуцированные плюрипотентные стволовые (iPS) клетки.

Один вариант осуществления обеспечивает композиции и способы изготовления культуры клеток in vitro, включающей клетки человека, в которой по меньшей мере примерно 15% клеток человека являются дефинитивными энтодермальными клетками, где дефинитивные клетки получены из дедифференцированных генетически перепрограммированных клеток. В одном аспекте дефинитивные энтодермальные клетки являются мультипотентными клетками, которые могут дифференцироваться в клетки кишечной трубки или органы, полученные из нее.

Другие варианты осуществления обеспечивают композиции и способы получения культуры клеток in vitro, включающей клетки человека, где по меньшей мере примерно 15% клеток человека являются энтодермальными клетками передней части пищеварительного тракта, позитивными в отношении панкреато-дуоденального гомеобоксного фактора-1 (PDX1), где PDX1-позитивные энтодермальные клетки передней части пищеварительного тракта являются полученными из дедифференцированных генетически перепрограммированных клеток. В одном аспекте PDX1-позитивные энтодермальные клетки передней части пищеварительного тракта являются PDX1, SOX9, PROX1 и HNF6 позитивными одновременно.

Другой вариант осуществления обеспечивает композиции и способы получения культуры клеток in vitro, включающей клетки человека, где по меньшей мере примерно 15% клеток человека являются панкреатическими прогениторными клетками, позитивными в отношении панкреато-дуоденального гомеобоксного фактора-1 (PDX1), где PDX1-позитивные панкреатические прогениторные клетки получены из дедифференцированных генетически перепрограммированных клеток. В одном аспекте PDX1-позитивные панкреатические прогениторные клетки являются PDX1 и NKX6.1 позитивными одновременно.

Еще один вариант осуществления обеспечивает композиции и способы получения культуры клеток in vitro, включающей клетки человека, где по меньшей мере примерно 15% клеток человека являются эндокринными клетками-предшественниками, позитивными в отношении нейрогенина-3 (NGN3), где NGN3-позитивные эндокринные клетки-предшественники получены из дедифференцированных перепрограммированных клеток. В одном аспекте NGN3-позитивные эндокринные клетки-предшественники являются NGN3, РАХ4 и NKX2.2 позитивными одновременно.

Другие варианты осуществления композиций культур клеток, описанных в настоящей заявке, включают in vitro культуры панкреатических энтодермальных клеток человека, содержащие дифференцированные клетки, полученные из дедифференцированных генетически перепрограммированных клеток, и агент, активирующий тирозинкиназу ERBB рецептора.

Дополнительные варианты осуществления, описанные в настоящей заявке, относятся к способу получения инсулина. В некоторых таких вариантах осуществления способ включает этапы (а) обеспечения контакта по меньшей мере культуры энтодермальных клеток передней части пищеварительного тракта и/или по меньшей мере культуры PDX1-негативных энтодермальных клеток передней части пищеварительного тракта, полученных из дедифференцированных генетически перепрограммированных клеток in vitro, с агентом, активирующим тирозинкиназу ERBB рецептора, таким образом, продуцируя популяцию панкреатических энтодермальных клеток, включающую субпопуляции эндокринных клеток и неэндокринных клеток; и (b) трансплантации и созревания популяции панкреатических энтодермальных клеток, полученных на этапе (а), или субпопуляции клеток, полученной на этапе (a), in vivo, получая таким образом инсулин-секретирующие клетки, где инсулин-секретирующие клетки секретируют инсулин в ответ на стимуляцию глюкозой.

Другие варианты осуществления, описанные в настоящей заявке, относятся к способу получения инсулина, включающему этапы: (а) обеспечения контакта дедифференцированных генетически перепрограммированных клеток in vitro с первой средой, содержащей агент, активирующий член семейства рецептора TGFβ; (b) культивирования in vitro клеток, полученных на этапе (а), во второй среде, не содержащей агент, активирующий член семейства рецептора TGFβ, с получением таким образом по меньшей мере энтодермальных клеток передней части пищеварительного тракта и/или по меньшей мере PDX1-негативных энтодермальных клеток передней части пищеварительного тракта; (с) обеспечения контакта клеток, полученных на этапе (b), с агентом, активирующим тирозинкиназу ERBB рецептора, с генерацией, таким образом, популяции клеток, включающей субпопуляции эндокринных клеток и не-эндокринных клеток; и (d) трансплантации и созревания популяции клеток, полученной на этапе (с), или субпопуляции клеток, полученной на этапе (с), in vivo, с получением, таким образом, инсулин-секретирующих клеток, где инсулин-секретирующие клетки секретируют инсулин в ответ на стимуляцию глюкозой. Другие варианты осуществления, описанные в настоящей заявке, относятся к обеспечению контакта популяции, содержащей по меньшей мере энтодермальные клетки передней части пищеварительного тракта, по меньшей мере PDX1-негативные энтодермальные клетки передней части пищеварительного тракта, и/или по меньшей мере PDX1-позитивные панкреатические энтодермальные клетки, с агентом, активирующим тирозинкиназу ERBB рецептора, с получением таким образом популяции клеток, способной к созреванию в чувствительные к глюкозе инсулин-секретирующие клетки in vivo.

Другие варианты осуществления, описанные в настоящей заявке, относятся к обеспечению контакта популяции, включающей по меньшей мере энтодермальные клетки передней части пищеварительного тракта, по меньшей мере PDX1-негативные энтодермальные клетки передней части пищеварительного тракта, и/или по меньшей мере PDX1-позитивные панкреатические энтодермальные клетки, с агентом, активирующим тирозинкиназу ERBB рецептора, и ингибитором rho-киназы, с получением таким образом популяции клеток, способной к созреванию в чувствительные к глюкозе инсулин-секретирующие клетки in vivo.

Выражение «по меньшей мере энтодермальные клетки передней части пищеварительного тракта», «по меньшей мере PDX1-негативные энтодермальные клетки передней части пищеварительного тракта», и «по меньшей мере PDX1-позитивные панкреатические энтодермальные клетки», использующееся в настоящей заявке, означает, что некоторая часть клеток в популяции клеток дифференцирована из iPSC в энтодермальные клетки передней части пищеварительного тракта или дальше, из iPSC в PDX1-негативные энтодермальные клетки передней части пищеварительного тракта или дальше, и/или из iPSC в PDX1-позитивные панкреатические энтодермальные клетки или дальше в их дифференцировке по направлению к клеткам панкреатических островков.

Термины «некоторые из» и/или «часть из», использующееся в настоящей заявке по отношению к популяции клеток, означает, что популяция клеток содержит по меньшей мере 5%, меньшей мере 10%, меньшей мере 15%, меньшей мере 20%, меньшей мере 25%, меньшей мере 30%, меньшей мере 35%, меньшей мере 40%, меньшей мере 45%, меньшей мере 50%, меньшей мере 55%, меньшей мере 60%, меньшей мере 65%, меньшей мере 70%, меньшей мере 75%, меньшей мере 80%, меньшей мере 85%, меньшей мере 90%, меньшей мере 95% или меньшей мере больше 95% клеток специфического типа.

Краткое описание чертежей

Фигура 1 является фотографическим изображением агрегатной суспензионной культуры дедифференцированных перепрограммированных клеток, или также упомянутых как iPS клетки.

Фигуры 2A-L являются гистограммами, демонстрирующими относительные уровни экспрессии генов ОСТ4 (Фиг. 2А), BRACHYURY (Фиг. 2В), CER1 (Фиг. 2С), GSC (Фиг. 2D), FOXA2 (Фиг. 2Е), FOXA1 (Фиг. 2F), HNF6 (Фиг. 2G), PDX1 (Фиг. 2Н), PTF1A (Фиг. 2I), NKX6.1 (Фиг. 2J), NGN3 (Фиг. 2K) и INS (Фиг. 2L). Уровни экспрессии нормализованы до средних уровней экспрессии конститутивных генов, экспрессии циклофилина G и ТАТА-связывающего белка (ТВР). Графики изображают кратность положительной регуляции против наименьшей точки данных в наборе данных.

Фигуры 3A-3D являются микрофотографиями иммуноцитохимии (ИЦХ) культур iPS клеток человека с 4 стадии дифференцировки с применением антител, специфичных к (3А) PDX-1; (3В) NKX6.1; (3С) PTF1A; и (3D) Dapi.

Фигуры 4A-4D являются изображениями иммуноцитохимии (ИЦХ) культур iPS клеток с 4 стадии дифференцировки с применением лигандов, специфичных к (4А) глюкагону; (4В) инсулину; (4С) соматостатину; и (4D) Dapi.

Фигуры 5А-В являются схемой расположения матрицы и ключа матрицы, обеспеченных в Proteome Profiler™ биочипах фосфо-RTK антител человека от R&D Systems. Схема расположения на Фигуре 5А показывает координаты или расположение RTK-антител. Идентичность или наименование RTK-семейства или антител описаны в ключе, Фигура 5В. Позитивные сигналы, наблюдаемые на проявленной пленке, таким образом, можно идентифицировать путем наложения слайда, как на Фигуре 5, и идентификации сигналов путем ссылки на координаты на накладке (Фигура 5А) с наименованием RTK на Фигуре 5В.

Фигура 6A-D являются анализом RTK матрицы полученных из iPS клеток панкреатических энтодермальных клеток (РЕС) в различных условиях (А, В, С и D, как описано в Примере 5). Фосфорилирование тирозина определенных RTK наблюдали путем идентификации сигналов от высокой к низкой интенсивности. Идентифицированы или заключены в рамку члены семейств IGF1R/IR и ERBB (EGFR).

Фигуры 7А-С являются графиками, демонстрирующими концентрации С-пептида и инсулина человека в сыворотке крови при имплантации мышам для экспериментов Е2314, Е2356 и Е2380 (Фиг. 7А), Е2347 (Фиг. 7В), и Е2354 (Фиг. 7С), как указано в Таблице 9. У мышей, которым имплантировали РЕС, анализировали в указанные моменты времени после трансплантации сывороточные уровни С-пептида человека натощак, и спустя 30 минут и 60 минут после интраперитонеального введения глюкозы. На Фиг. 7С РЕС инкапсулировали с устройством для инкапсулирования клеток (Encaptra® EN20, или EN20, ViaCyte, Сан-Диего, Калифорния), и в некоторых случаях устройства имели микроперфорации (pEN20, ViaCyte, Сан-Диего, Калифорния). Такие устройства описаны в патенте США №8,278,106, описание которого полностью включено в настоящее описание посредством ссылки.

Фигуры 8А и 8В являются графиками, демонстрирующими результаты анализа глюкозы крови мышей, леченных STZ, в Эксперименте №2347. На Фигуре 8А показана глюкоза крови для каждой из 13 мышей (базовая линия с херегулином и без него), а на Фигуре 8В показаны комбинированные средние значения для каждого лечения (базовая линия с херегулином и без него). Результаты анализа произвольных уровней глюкозы в крови не-натощак показаны для 13 мышей, которым имплантировали iPEC, до 14 суток перед лечением STZ (день 0), и для тех же самых мышей после лечения STZ и после удаления трансплантатов. Животные, леченные STZ, получали STZ примерно 26 недель после трансплантации (день 0). На 28 неделе после трансплантации, примерно 2 недели после начала лечения STZ, iPEC трансплантаты эксплантировали (удаляли). Образец для анализа глюкозы крови не натощак собирали на протяжении времени для каждого из животных.

Подробное описание настоящего изобретения

Настоящее изобретение станет более понятным со ссылкой на следующее подробное описание предпочтительных вариантов осуществления изобретения и примеров, включенных него. Однако перед раскрытием и описанием представленных соединений, композиций и способов, необходимо понимать, что настоящее изобретение не ограничивается специфическими типами клеток, специфическими слоями фидерных клеток, специфическими условиями, или специфическими способами, и т.д., и как таковое, может варьировать. Многочисленные модификации и варианты станут понятными для специалистов в данной области техники. Необходимо понимать, что терминология, используемая в настоящей заявке, предназначена только для описания специфических вариантов осуществления, и не предназначена для ограничения.

Определения

Необходимо понимать, что все численные диапазоны, выраженные в настоящей заявке, включают конечные точки, указанные далее, и описывают все числа между конечными точками в установленном численном диапазоне.

Если не указано иное, термины, используемые в настоящей заявке, необходимо понимать в соответствии с их обычным применением рядовым специалистом в соответствующей области техники. Кроме того, для целей настоящего описания и формулы изобретения, если не указано иное, все числа, выражающие количества ингредиентов, проценты или пропорции материалов, условия реакции, и другие численные величины, используемые в данном описании и формуле изобретения, необходимо понимать как модифицированные во всех случаях термином «примерно». Соответственно, если не указано противоположное, численные параметры, установленные в следующем описании и формуле изобретения, являются приблизительными, и могут варьировать в зависимости от необходимых свойств, ожидаемых при осуществлении настоящего изобретения. В крайнем случае, и не с целью ограничения заявки доктриной эквивалентов в объеме формулы изобретения, каждый численный параметр должен быть истолкован по меньшей мере в свете ряда указанных значимых чисел и путем применения обычных методик округления.

При осуществлении вариантов, описанных в настоящей заявке, если не указано иное, применяются обычные методики клеточной биологии, молекулярной биологии, генетики, химии, микробиологии, рекомбинантной ДНК, и иммунологии.

Необходимо понимать, что при использовании в настоящей заявке и формуле изобретения формы единственного числа включают множественное число, если в контексте явно не указано иное. Так, например, ссылка на «клетку» включает одну или несколько таких различных клеток, а ссылка на «способ» включает ссылку на эквивалентные этапы и способы, известные рядовому специалисту в данной области техники, которые могут быть модифицированы или заменены на способы, описанные в настоящей заявке.

Термин «клетка», использующийся в настоящей заявке, также относится к индивидуальным клеткам, линиям клеток, или культурам, полученным из таких клеток. «Культура» означает композицию, включающую изолированные клетки того же самого или отличающегося типа.

Термин «тотипотентные стволовые клетки», использующийся в настоящей заявке, относится к клеткам, обладающим способностью к дифференцировке во все клетки, составляющие организм, такие как клетки, полученные при слиянии яйцеклетки и сперматозоида. Клетки, полученные путем первых нескольких делений оплодотворенной яйцеклетки, также могут быть тотипотентными. Эти клетки могут дифференцироваться в эмбриональные и экстраэмбриональные типы клеток. Плюрипотентные стволовые клетки, например, такие как ES клетки, могут давать начало любому типу клеток плода или взрослого организма. Однако по отдельности они не могут развиться в плод или взрослое животное, поскольку не обладают потенциалом к развитию экстраэмбриональной ткани. Экстраэмбриональная ткань является, например, полученной из экстраэмбриональной энтодермы, и может дополнительно классифицироваться на париетальную энтодерму (мембрану Рейхерта) и висцеральную энтодерму (образует часть желточного мешка). Как париетальная, так и висцеральная энтодерма поддерживают развитие эмбриона, но сами не образую эмбриональных структур. Также существуют другие экстраэмбриональные ткани, включая экстраэмбриональную мезодерму и экстраэмбриональную эктодерму.

В некоторых вариантах осуществления «плюрипотентную клетку» применяют в качестве исходного материала для дифференцировки в энтодермальную линию, или более конкретно, в типы клеток панкреатической энтодермы. Термин «плюрипотентность» или «плюрипотентные клетки», использующийся в настоящей заявке, или их эквиваленты означают клетки, которые способны как к пролиферации в культуре клеток, так и к дифференцировке в множество линиеспецифических популяций клеток, которые проявляют мультипотентные свойства; например, и плюрипотентные ES клетки, и индуцированные плюрипотентные стволовые (iPS) клетки могут давать начало каждой из трех эмбриональных линий клеток. Однако плюрипотентные клетки не обладают способностью к образованию целого организма. То есть, плюрипотентные клетки не являются тотипотентными.

В некоторых вариантах осуществления плюрипотентные клетки, применяемые в качестве исходного материала, являются стволовыми клетками, включая hES клетки, hEG клетки, iPS клетки, даже партеногенные клетки и тому подобные. Термин «эмбриональные», использующийся в настоящей заявке, означает ряд стадий развития организма, начиная от единственной зиготы, и заканчивая многоклеточной структурой, которая больше не содержит плюрипотентных или тотипотентных клеток, отличных от развитых половых клеток. В дополнение к эмбриону, полученному при слиянии гамет, термин «эмбриональный» относится к эмбриону, полученному путем переноса ядра соматической клетки. В еще одном варианте осуществления плюрипотентные клетки не получены или не получены непосредственно из эмбриона, например, iPS клетки получены из не-плюрипотентной клетки, например, мультипотентной клетки или окончательно дифференцированной клетки.

Плюрипотентные стволовые клетки человека также могут быть определены или охарактеризованы по наличию некоторых факторов транскрипции и белков поверхности клеток, включая факторы транскрипции Oct-4, Nanog и Sox-2, которые формируют коровый регуляторный комплекс, обеспечивающий супрессию генов, приводящих к дифференцировке и поддержанию плюрипотентности; и антигены поверхности клеток, такие как гликолипиды SSEA3, SSEA4 и кератансульфатные антигены, Tra-1-60 and Tra-1-81.

Термин «индуцированные плюрипотентные стволовые клетки» или «iPS клетки» или «iPSC», использующийся в настоящей заявке, означает тип плюрипотентных стволовых клеток, искусственно полученных из не-плюрипотентной клетки, как правило, взрослой соматической клетки, или окончательно дифференцированной клетки, такой как фибробласт, гемопоэтическая клетка, миоцит, нейрон, эпидермальная клетка, или тому подобной, путем вставки некоторых генов или продуктов генов, обозначаемых как факторы перепрограммирования. См. Takahashi et al., Cell 131: 861-872 (2007); Wernig et al., Nature 448: 318-324 (2007); Park et al., Nature 451: 141-146 (2008), которые полностью включены в настоящее описание посредством ссылки. Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки по существу подобны натуральным плюрипотентным стволовым клеткам человека, таким как hES клетки, во многих отношениях, включая экспрессию некоторых генов и белков стволовых клеток, характер метилирования хроматина, время удвоения, формирование эмбриоидных телец, формирование тератомы, формирование жизнеспособной химеры, и потенцию и способность к дифференцировке. iPS клетки человека обеспечивают источник плюрипотентных стволовых клеток без сопутствующего применения эмбрионов.

Могут применяться различные способы получения iPS клеток, которые более подробно описаны ниже. Однако все методологии используют определенные перепрограммирующие факторы, включающие кассеты экспрессии, кодирующие Sox-2, Oct-4, Nanog и факультативно Lin-28, или кассеты экспрессии, кодирующие Sox-2, Oct-4, Klf4 и факультативно c-myc, или кассеты экспрессии, кодирующие Sox-2, Oct-4, и факультативно Esrrb. Нуклеиновые кислоты, кодирующие эти перепрограммирующие факторы, могут быть в одной и той же кассете экспрессии, различных кассетах экспрессии, одном и том же перепрограммирующем векторе, или различных перепрограммирующих векторах. Oct-3/4 и некоторые члены семейства генов Sox (Sox-1, Sox-2, Sox-3 и Sox-15) являются ключевыми регуляторами транскрипции, вовлеченными в индукцию процесса, чье отсутствие делает индукцию невозможной. Oct-3/4 (Pou5f1) является одним из семейства октамерных («Oct») факторов транскрипции, и играет важную роль в поддержании плюрипотентности. Например, отсутствие Oct-3/4 в нормально Oct-3/4+ клетках, таких как бластомеры и эмбриональные стволовые клетки, приводит к спонтанной дифференцировке трофобласта; в то время как присутствие Oct-3/4 дает начало плюрипотентности и потенциалу дифференцировки эмбриональных стволовых клеток. Кроме того, другие гены в семействе «Oct», например, Oct1 и Oct6, не индуцируют плюрипотентность; таким образом, этот процесс индукции плюрипотентности может быть связан с Oct-3/4. Другим семейством генов, связанных с поддержанием плюрипотентности, подобно Oct-3/4, является семейство Sox. Однако семейство Sox не является исключительным для плюрипотентных типов клеток, но также связано с мультипотентными и унипотентными стволовыми клетками. Было установлено, что семейство Sox работает также в процессе индукции. Исходные исследования Takahashi et al., 2006 ранее использовали Sox2. С того времени гены Sox1, Sox3, Sox15 и Sox18 также генерировали iPS клетки. Klf4 из семейства генов Klf (Klf-1, Klf2, Klf4 и Klf5) был исходно идентифицирован Yamanaka et al. 2006 ранее, в качестве фактора генерации iPS клеток мыши. iPS клетки человека из S. Yamanaka были использованы в настоящей заявке для осуществления клеточных терапевтических приложений hIPS клеток. Однако, Yu et al. 2007 ранее сообщали, что Klf4 не требовался, и фактически был неспособен к получения iPS клеток человека. Другие члены семейства Klf способны к генерации iPS клеток, включая Klf1, Klf2 и Klf5. Наконец, прото-онкогены семейства Мус (C-myc, L-myc и N-myc) вовлечены в патогенез рака; с-myc является фактором, вовлеченным в получение iPS клеток мыши и человека, но Yu et al. (2007) ранее сообщал, что с-myc не требовался для генерации iPS клеток человека.

Термины «мультипотентность» или «мультипотентная клетка», использующиеся в настоящей заявке, или их эквиваленты означают тип клеток, который может давать начало ограниченному количеству других конкретных типов клеток. То есть, мультипотентные клетки являются коммитированными для одного или нескольких эмбриональных клеточных зачатков, и таким образом, в отличие от плюрипотентных клеток, не могут давать начало каждой из трех эмбриональных линий клеток, а также экстраэмбриональных клеток. Мультипотентные соматические клетки являются более дифференцированными, по сравнению с плюрипотентными клетками, но не являются окончательно дифференцированными. Плюрипотентные клетки, таким образом, обладают более высокой потенцией, чем мультипотентные клетки. Факторы, определяющие потенцию, которые могут перепрограммировать соматические клетки или использоваться для генерации iPS клеток, включают такие факторы, как Oct-4, Sox2, FoxD3, UTF1, Stella, Rex1, ZNF206, Sox15, Myb12, Lin28, Nanog, DPPA2, ESG1, Otx2 или их комбинации, но не ограничиваются ими.

Термин «агент, активирующий тирозинкиназу ERBB рецептора», использующийся в настоящей заявке, включает по меньшей мере 16 различных лигандов семейства EGF, связывающихся с ERBB рецепторами: EGF (эпидермальный фактор роста), AG или AREG (амфирегулин), и TGF-α (трансформирующий фактор роста-альфа), Btc (бетацеллюлин), HBEGF (гепарин-связывающий EGF), и Ereg (эпирегулин), нейрегулины (или херегулины), такие как нейрегулин-1, -2, -3 и -4 (или херегулин-1, -2, -3 and -4), но не ограничивается ими. Однако настоящее изобретение подразумевает любой лиганд, способный к связыванию с любым одним из четырех ERBB рецепторов или их комбинацией для индукции образования гомо- и гетеродимерных рецепторных комплексов, приводя к активации мембранного киназного домена и последующему фосфорилированию. См. также Таблицу 11.

Некоторые варианты осуществления способов получения инсулина, описанные в настоящей заявке, могут включать лечение животных, страдающих диабетом, или контроль концентрации глюкозы в крови животного, путем обеспечения животного панкреатическими энтодермальными клетками, которые могут созревать in vivo в инсулин-продуцирующие клетки, которые секретируют инсулин в ответ на стимуляцию глюкозой.

Один аспект, описанный в настоящей заявке, включает популяции плюрипотентных клеток или клеток-предшественников, которые способны к избирательному, и в некоторых аспектах к избирательно обратимому развитию в различные линии клеток при культивировании в подходящих условиях. Термин «популяция», использующийся в настоящей заявке, относится к культуре клеток более чем из одной клетки, обладающей одними и теми же идентификационным характеристиками. Термин «клеточная линия» означает все стадии развития типа клетки, от самой ранней клетки-предшественника до полностью созревшей клетки (т.е. специализированной клетки). «Клетка-предшественник» или «прогениторная клетка» может быть любой клеткой на пути дифференцировки клеток, способной к дифференцировке в более зрелую клетку. Как таковая, клетка-предшественник может быть плюрипотентной клеткой, или она может быть частично дифференцированной мультипотентной клеткой, или обратимо дифференцированной клеткой. Термин «популяция клеток-предшественников» означает группу клеток, способных к развитию в более зрелый или дифференцированный тип клетки. Популяция клеток-предшественников может содержать клетки, являющиеся плюрипотентными, клетки, которые являются линиеспецифическими стволовым клетками (т.е. клетками, способными развиваться в клетки не всех эктодермальных линий, или например, клетками только нейрональной линии), и клетки, которые являются обратимо линиеспецифическими стволовыми клетками. Таким образом, термин «прогениторная клетка» или «клетка-предшественник» может означать «плюрипотентную клетку» или «мультипотентную клетку».

Термин «перепрограммирование», «перепрограммированная», использующийся в настоящей заявке, или их эквиваленты относятся к процессу, который обеспечивает для клетки измеримо повышенную способность к образованию потомства по меньшей мере одного нового типа клеток, в культуре или in vivo, по сравнению с теми же самыми условиями без перепрограммирования. В некоторых вариантах осуществления, описанных в настоящей заявке, соматические клетки «перепрограммированы» в плюрипотентные клетки. В некоторых аспектах соматические клетки перепрограммированы так, чтобы после достаточной пролиферации измеряемая часть клеток in vivo или в культуре клеток in vitro проявляла фенотипические характеристики нового плюрипотентного типа клеток. Без перепрограммирования такие соматические клетки не дают начало потомству, проявляющему фенотипические характеристики нового плюрипотентного типа клеток. Если даже без перепрограммирования соматические клетки могут давать начало потомству, проявляющему фенотипические характеристики нового плюрипотентного типа клеток, доля потомства этих соматических клеток, проявляющего фенотипические характеристики нового плюрипотентного типа клеток, измеримо увеличивается по сравнению с тем, что было до перепрограммирования.

Выражение «перепрограммирование дифференцировки», использующееся в настоящей заявке, относится к процессу, изменяющему клетку до образования потомства по меньшей мере одного нового типа клеток с новым статусом дифференцировки, либо в культуре, либо in vivo, по сравнению с теми же самыми условиями без перепрограммирования дифференцировки. Этот процесс включает дифференцировку, дедифференцировку и трансдифференцировку. Следовательно, выражение «дифференцировка», использующееся в настоящей заявке, означает процесс, при котором менее специализированные клетки становятся более специализированным типом клеток. Напротив, выражение «дедифференцировка» означает клеточный процесс, при котором частично или окончательно дифференцированные клетки обращаются на раннюю стадию развития, такую как клетки, обладающие плюрипотентностью или мультипотентностью. Далее, выражение «трансдифференцировка» означает процесс трансформации одного дифференцированного типа клеток в другой дифференцированный тип клеток.

Термины «развиваться из плюрипотентных клеток», «дифференцироваться из плюрипотентных клеток», «созревать из плюрипотентных клеток», или «продуцированный из плюрипотентных клеток», «полученный из плюрипотентных клеток», «дифференцированный из плюрипотентных клеток», использующееся в настоящей заявке, и эквивалентные выражения относятся к получения дифференцированного типа клеток из плюрипотентных клеток in vitro или in vivo, например, в случае эндокринных клеток, созревающих из трансплантированных PDX1 панкреатических энтодермальных клеток in vivo, как описано в Международной патентной заявке №PCT/US 2007/015536, озаглавленной «Способы получения панкреатических гормонов», описание которой полностью включено в настоящее описание посредством ссылки. Все такие термины относятся к развитию клетки от стадии с потенциалом дифференцировки по меньшей мере в две различных линии клеток до специализированной и окончательно дифференцированной клетки. Такие термины могут применяться взаимозаменяемо для целей настоящей заявки. Варианты осуществления, описанные в настоящей заявке, подразумевают условия культивирования, позволяющие такой дифференцировке быть обратимой, так чтобы плюрипотентность или по меньшей мере способность к дифференцировке в более чем одну линию клеток могла быть избирательно восстановлена.

Термин «фидерная клетка» означает культуру клеток, выращенную in vitro и секретирующую по меньшей мере один фактор в культуральную среду, и которую можно применять для поддержания роста другой необходимой клетки в культуре. Термин «слой фидерных клеток», использующийся в настоящей заявке, может применяться взаимозаменяемо с термином «фидерная клетка». Фидерная клетка может включать монослой, где фидерные клетки покрывают поверхность культуральной чашки полным слоем перед ростом сверху других клеток, или может включать кластеры клеток. В предпочтительном варианте осуществления фидерная клетка включает адгезивный монослой.

Термины «кластер» и «скопление» или «агрегат», использующиеся в настоящей заявке, могут применяться взаимозаменяемо, и обычно означают группу клеток, которая не диссоциирована на отдельные клетки. Кластеры могут диссоциироваться на более мелкие кластеры. Эта диссоциация обычно по природе осуществляется вручную (например, с применением пастеровской пипетки), но подразумеваются и другие средства диссоциации. Суспензия агрегатов плюрипотентных или мультипотентных культур клеток является по существу такой, как описано в Международных публикациях PCT/US 2007/062755, озаглавленной «Композиции и способы культивирования дифференцированных клеток» и PCT/US 2008/082356, озаглавленной «Суспензионные композиции агрегатов стволовых клеток и способы их дифференцировки», полностью включенных в настоящее описание посредством ссылки.

Подобным образом, варианты осуществления, в которых плюрипотентные культуры клеток или агрегатные плюрипотентные суспензионные культуры растут в определенных условиях без применения фидерных клеток, являются «бесфидерными». Бесфидерные способы культивирования повышают масштабируемость и воспроизводимость плюрипотентной культуры клеток и снижают риск контаминации, например, инфекционными агентами из фидерных клеток или других компонентов культур животного происхождения. Бесфидерные способы также описаны в патенте США №6,800,480, Bodnar et al. (принадлежит Geron Corporation, Менло-Парк, Калифорния). Однако, и в отличие от патента США №6,800,480, варианты осуществления, описанные в настоящей заявке, являющиеся плюрипотентными, мультипотентными или дифференцированными культурами клеток, являются бесфидерными и не содержат дополнительно эндогенного или экзогенного экстрацеллюлярного матрикса, т.е. культуры, описанные в настоящей заявке, свободны от экстрацеллюлярного матрикса, а также являются бесфидерными. Например, в патенте США №6,800,480 экстрацеллюлярный матрикс готовят путем культивирования фибробластов, лизиса фибробластов in situ, с последующим отмыванием того, что осталось после лизиса. Альтернативно, в патенте США №6,800,480 экстрацеллюлярный матрикс может также быть приготовлен из изолированного компонента матрикса или комбинации компонентов, выбранных из коллагена, плацентарного матрикса, фибронектина, ламинина, мерозина, тенасцина, гепаринсульфата, хондроитинсульфата, дерматансульфата, аггрекана, бигликана, тромбоспондина, витронектина и декорина. Варианты осуществления, описанные в настоящей заявке, не продуцируют экстрацеллюлярный матрикс путем роста фидерного или фибробластного слоя и лизиса клеток для получения экстрацеллюлярного матрикса; и не требуют первоначального покрывания сосуда для культивирования ткани компонентом экстрацеллюлярного матрикса или комбинацией компонентов экстрацеллюлярного матрикса, выбранных из коллагена, плацентарного матрикса, фибронектина, ламинина, мерозина, тенасцина, гепаринсульфата, хондроитинсульфата, дерматансульфата, аггрекана, бигликана, тромбоспондина, витронектина и декорина. Следовательно, агрегатные суспензионные культуры, описанные в настоящей заявке для плюрипотентных, мультипотентных и дифференцированных клеток, не требуют фидерного слоя, лизированных фидерных или фибробластных клеток для получения покрытия из экстрацеллюлярного матрикса, экзогенно добавленного экстрацеллюлярного матрикса или компонента матрикса; скорее применение растворимого компонента сыворотки человека, как описано в Международной заявке PCT/US 2008/080516, озаглавленной «Способы и композиции для бесфидерной среды для плюрипотентных стволовых клеток, содержащей сыворотку человека», полностью включенной в настоящее описание посредством ссылки, преодолевает потребность в фидерных клетках или фидерном монослое, а также преодолевает потребность в эндогенном экстрацеллюлярном матриксе из фидерной или фибробластной клетки или из экзогенно добавленных компонентов экстрацеллюлярного матрикса.

В предпочтительных вариантах осуществления способы культивирования не включают продуктов животного происхождения. В другом предпочтительном варианте осуществления способы культивирования не содержат ксеногенных продуктов. В еще более предпочтительных вариантах осуществления одно или несколько условий или требований для коммерческого производства лечебных средств на основе клеток человека удовлетворяются или соответствуют лучшим показателям с помощью способов культивирования, описанных в настоящей заявке.

Популяция плюрипотентных клеток может быть далее культивирована в присутствии некоторых дополнительных факторов роста для получения популяции клеток, которые являются или будут развиваться в различные линии клеток, или могут быть избирательно обратимыми, чтобы быть способными к развитию в различные линии клеток. Термин «дополнительный фактор роста» используется в самом широком контексте, и означает вещество, эффективное для активации роста плюрипотентной клетки, поддержания выживания клетки, стимуляции дифференцировки клетки и/или стимуляции обращения дифференцировки клетки. Далее, дополнительный фактор роста может быть веществом, секретируемым фидерной клеткой в среду. Такие вещества включают цитокины, хемокины, малые молекулы, нейтрализующие антитела, и белки, но не ограничиваются ими. Факторы роста могут также включать межклеточные сигнальные полипептиды, которые контролируют развитие и поддержание клетки, а также форму и функции тканей. В предпочтительных вариантах осуществления дополнительный фактор роста выбран из группы, состоящей из фактора стволовых клеток (SCF), онкостатина M (OSM), цилиарного нейротрофического фактора (CNTF), интерлейкина-6 (IL-6) в комбинации с растворимым рецептором интерлейкина-6 (IL-6R), фактора роста фибробластов (FGF), костного морфогенетического белка (BMP), фактора некроза опухоли (TNF), и гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (GM-CSF).

В некоторых способах получения клеток, как описано в настоящей заявке, факторы роста удаляют из культуры клеток или популяции клеток после их добавления. Например, фактор роста, такой как активин А, активин В, GDF-8 или GDF-11, можно добавить и удалить в пределах примерно одного дня, примерно двух дней, примерно трех дней, примерно четырех дней, примерно пяти дней, примерно шести дней, примерно семи дней, примерно восьми дней, примерно девяти дней или примерно десяти дней после их добавления. В некоторых вариантах осуществления факторы дифференцировки не удаляют из культуры клеток.

Поскольку эффективность процесса дифференцировки можно регулировать путем модификации определенных параметров, которые включают условия роста клеток, концентрации факторов роста и продолжительность этапов культивирования, но не ограничиваются ими, процедуры дифференцировки, описанные в настоящей заявке, могут приводить примерно к 5%, примерно к 10%, примерно к 15%, примерно к 20%, примерно к 25%, примерно к 30%, примерно к 35%, примерно к 40%, примерно к 45%, примерно к 50%, примерно к 55%, примерно к 60%, примерно к 65%, примерно к 70%, примерно к 75%, примерно к 80%, примерно к 85%, примерно к 90%, примерно к 95%, или к более чем примерно 95% превращению плюрипотентных клеток, которые включают индуцированные плюрипотентные клетки, к мультипотентным или дифференцированным клеткам, например, окончательной энтодермы, энтодермы передней части пищеварительного тракта, PDX1-позитивной энтодермы передней части пищеварительного тракта, PDX1-позитивной панкреатической энтодермы или PDX1/NKX6.1 со-позитивной панкреатической энтодермы, эндокринного предшественника или NGN3/NKX2.2 со-позитивного эндокринного предшественника, и гормон-секретирующим эндокринным клеткам или INS, GCG, GHRL, SST, РР единично-позитивным эндокринным клеткам. В способах, в которых применяют выделение клеток препервичной полоски или мезоэнтодермальных клеток, можно выделить по существу чистую популяцию клеток препервичной полоски или мезоэнтодермы.

Различные композиции клеток, полученные из плюрипотентных стволовых клеток, описаны в настоящей заявке. Один вариант осуществления включает iPS клетки и клетки, полученные из них. Другие способы и композиции, родственные, но отличающиеся от вариантов осуществления, описанных в настоящей заявке, можно найти в предварительной заявке на патент США №60/532,004, озаглавленной «Дефинитивная энтодерма», поданной 23 декабря 2003; предварительной заявке на патент США №60/566,293, озаглавленной «PDX1-экспрессирующая энтодерма», поданной 27 апреля 2004; предварительной заявке на патент США №60/586,566, озаглавленной «Хемокиновый рецептор поверхности клеток для выделения дефинитивной энтодермы», поданной 9 июля 2004; предварительной заявке на патент США №60/587,942, озаглавленной «Хемокиновый рецептор поверхности клеток для выделения дефинитивной энтодермы», поданной 14 июля 2004; патентной заявке США №11/021,618, озаглавленной «Дефинитивная энтодерма», поданной 23 декабря 2004; и патентной заявке США №11/115,868, озаглавленной «PDX1-экспрессирующая энтодерма», поданной 26 апреля 2005; патентной заявке США №11/165,305, озаглавленной «Способы идентификации факторов для дифференцировки дефинитивной энтодермы», поданной 23 июня, 2005; предварительной патентной заявке США №60/730,917, озаглавленной «PDX1-экспрессирующая дорзальная и вентральная энтодерма передней части пищеварительного тракта», поданной 27 октября 2005; предварительной патентной заявке США №60/736,598, озаглавленной «Маркеры дефинитивной энтодермы», поданной 14 ноября 2005; предварительной патентной заявке США №60/778,649, озаглавленной «Инсулин-продуцирующие клетки и способ их получения», поданной 2 марта 2006; предварительной патентной заявке США №60/833,633, озаглавленной «Инсулин-продуцирующие клетки и способ их получения», поданной 26 июля 2006; предварительной патентной заявке США №60/852,878, озаглавленной «Обогащение эндокринных клеток-предшественников, незрелых клеток панкреатических островков и зрелых клеток панкреатических островков с применением NCAM», поданной 18 октября 2006; патентной заявке США №11/588,693, озаглавленной «PDX1-экспрессирующая дорзальная и вентральная энтодерма передней части пищеварительного тракта», поданной 27 октября 2006; патентной заявке США №11/681,687, озаглавленной «Эндокринные клетки-предшественники, панкреатические гормон-экспрессирующие клетки и способы их получения», поданной 2 марат 2007; патентной заявке США №11/773,944, озаглавленной «Способы получения панкреатических гормонов», поданной 5 июля, 2007; патентной заявке США №60/972,174, озаглавленной «Способы лечения диабета», поданной 13 сентября 2007; патентной заявке США №11/860,494, озаглавленной «Способы увеличения получения дефинитивной энтодермы», поданной 24 сентября 2007; патентной заявке США №60/977,349, озаглавленной «Маркеры поверхности клеток эмбриональных стволовых клеток человека и раковых стволовых клеток», поданной 3 октября 2007; и патентной заявке США №12/099,759, озаглавленной «Способы получения панкреатических гормонов», поданной 8 апреля 2008; и патентной заявке США №12/107,020, озаглавленной «Способы очистки энтодермальных и панкреатических энтодермальных клеток, полученных из эмбриональных стволовых клеток человека», поданной 21 апреля 2008, описания которых полностью включены в настоящее описание посредством ссылки.

Общие способы получения клеток энтодермальных линий, полученных из hES клеток, описаны в родственных заявках США, как указано выше, и в D'Amour et al. 2005 Nat Biotechnol. 23:1534-41 и D'Amour et al. 2006 Nat Biotechnol. 24(11): 1392-401, описания которых полностью включены в настоящее описание посредством ссылки. D'Amour et al. описывают 5-этапный протокол дифференцировки: этап 1 (приводит в основном к получения дефинитивной энтодермы); этап 2 (приводит в основном к получения PDX1-негативной энтодермы передней части пищеварительного тракта); этап 3 (приводит в основном к получения PDX1-позитивной энтодермы передней части пищеварительного тракта); этап 4 (приводит в основном к получения панкреатической энтодермы или панкреатического эндокринного предшественника) и этап 5 (приводит в основном к получения гормон-экспрессирующих эндокринных клеток).

Термин «трофоэктодерма» относится к мультипотентным клеткам с относительно высокой экспрессией маркеров, выбранных из группы, состоящей из HAND1, Eomes, MASH2, ESXL1, HCG, KRT18, PSG3, SFXN5, DLX3, PSX1, ETS2, и ERRB генов, по сравнению с уровнями экспрессии HAND1, Eomes, MASH2, ESXL1, HCG, KRT18, PSG3, SFXN5, DLX3, PSX1, ETS2, и ERRB в не-трофоэктодермальных клетках или популяциях клеток.

«Экстраэмбриональная энтодерма» означает мультипотентную клетку с относительно высокими уровнями экспрессии маркеров, выбранных из группы, состоящей из SOX7, SOX17, THBD, SPARC, DAB1 или AFP генов, по сравнению с уровнями экспрессии SOX7, SOX17, THBD, SPARC, DAB1 или AFP в не-экстраэмбриональных энтодермальных клетках или популяциях клеток.

Термин «клетки препервичной полоски» относится к мультипотентным клеткам с относительно высокими уровнями экспрессии генов маркеров FGF8 и/или NODAL, по сравнению с клетками с низкой экспрессией BRACHURY, FGF4, SNAI1, SOX17, FOXA2, SOX7 и SOX1.

Термин «мезоэнтодермальная клетка» относится к мультипотентной клетке с относительно высокими уровнями экспрессии генов маркеров BRACHURY, FGF4, SNAI1 MIXL1 и/или WNT3, по сравнению с клетками с низкой экспрессией SOX17, CXCR4, FOXA2, SOX7 и SOX1.

Термин «дефинитивная энтодерма (DE)» означает мультипотентную энтодермальную линию клеток, которая может дифференцироваться в клетки кишечной трубки или органы, полученные из кишечной трубки. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, клетки дефинитивной энтодермы являются клетками млекопитающих, а в предпочтительном варианте осуществления клетки дефинитивной энтодермы являются клетками человека. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения клетки дефинитивной энтодермы экспрессируют или незначительно экспрессируют некоторые маркеры. В некоторых вариантах осуществления один или несколько маркеров, выбранных из SOX17, CXCR4, MIXL1, GATA4, HNF3β, GSC, FGF17, VWF, CALCR, FOXQ1, CMKOR1 и CRIP1, экспрессируются в клетках дефинитивной энтодермы. В других вариантах осуществления один или несколько маркеров, выбранных из ОСТ4, альфа-фетопротеина (AFP), тромбомодулина (ТМ), SPARC, SOX7 и HNF4-альфа, не экспрессируются или незначительно экспрессируются клетками дефинитивной энтодермы. Популяции клеток дефинитивной энтодермы и способы их получения также описаны в заявке США №11/021,618, озаглавленной «Дефинитивная энтодерма», поданной 23 декабря 2004, которая полностью включена в настоящее описание.

Другие варианты осуществления относятся ккультурам клеток, обозначенным как «PDX1-негативные энтодермальные клетки передней части пищеварительного тракта» или «энтодермальные клетки передней части пищеварительного тракта», или их эквивалентами. В некоторых вариантах осуществления энтодермальные клетки передней части пищеварительного тракта экспрессируют SOX17, HNF1β (HNF1B), HNF4-альфа (HNF4A) и FOXA1 маркеры, но по существу не экспрессируют PDX1, AFP, SOX7, или SOX1. PDX1-негативные популяции энтодермальных клеток передней части пищеварительного тракта и способы их получения также описаны в заявке США №11/588,693, озаглавленной «PDX1-экспрессирующая дорзальная и вентральная энтодерма передней части пищеварительного тракта», поданной 27 октября 2006, полностью включенной в настоящее описание посредством ссылки.

Другие варианты осуществления, описанные в настоящей заявке, относятся ккультурам клеток «PDX1-позитивных дорсальных энтодермальных клеток передней части пищеварительного тракта» (дорсальных PDX1-позитивных энтодермальных клеток передней части пищеварительного тракта» или просто «PDX1-позитивной энтодермы». В некоторых вариантах осуществления PDX1-позитивные энтодермальные клетки экспрессируют один или несколько маркеров, выбранных из Таблицы 1 и/или один или несколько маркеров, выбранных из таблицы 2, также описанных в родственной заявке США №11/588,693, озаглавленной «PDX1-экспрессирующая дорзальная и вентральная энтодерма передней части пищеварительного тракта», поданной 27 октября 2006, а также заявке США №11/115,868, озаглавленной «PDX1-экспрессирующая энтодерма», поданной 26 апреля 2005, полностью включенных в настоящее описание посредством ссылки.

PDX1-позитивные клетки энтодермы передней части пищеварительного тракта, такие как те, что получены в соответствии со способами, описанными в настоящей заявке, являются предшественниками, которые могут использоваться для получения полностью дифференцированных панкреатических гормон-секретирующих или эндокринных клеток, например, инсулин-продуцирующих β-клеток. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения PDX1-позитивные клетки энтодермы передней части пищеварительного тракта получают путем дифференцировки клеток дефинитивной энтодермы, которые по существу не экспрессируют PDX1 (PDX1-негативные клетки дефинитивной энтодермы; также обозначаемые как дефинитивная энтодерма), до формирования PDX1-позитивных клеток энтодермы передней части пищеварительного тракта.

Термины «панкреатическая энтодерма», «панкреатический эпителиальный», «панкреатический эпителий» (сокращенно «РЕ»), «панкреатический прогенитор», «PDX-1 позитивная панкреатическая энтодерма», использующиеся в настоящей заявке, или их эквиваленты, такие как панкреатические энтодермальные клетки («РЕС»), все являются предшественниками или прогениторными панкреатическими клетками. РЕС, как описано в настоящей заявке, является популяцией прогениторных клеток после 4 стадии дифференцировки (примерно 12-14 день) и включает по меньшей мере две основных различных популяции: (i) панкреатические прогениторные клетки, которые экспрессируют NKX6.1, но не экспрессируют CHGA (или CHGA-негативные, CHGA-); и (ii) полигормональные эндокринные клетки, которые экспрессируют CHGA (CHGA-позитивные, CHGA+). Не углубляясь в теорию, полагают, что популяция клеток, которая экспрессирует NKX6.1, но не CHGA, является более активным или терапевтическим компонентом РЕС, в то время как популяция CHGA-позитивных полигормональных эндокринных клеток далее дифференцирует и созревает in vivo в глюкагон-экспрессирующие островковые клетки. См. Kelly et al. (2011) «Cell-surface markers for the isolation of pancreatic cell types derived from human embryonic stem cells», Nat Biotechnol. 29(8): 750-756 («Маркеры поверхности клеток для выделения типов панкреатических клеток, полученных из эмбриональных стволовых клеток человека»), опубликовано он-лайн 31 июля 2011, и Schulz et al. (2012), «A Scalable System for Production of Functional Pancreatic Progenitors from Human Embryonic Stem Cells», PLosOne 7(5): 1-17, e37004 («Масштабируемые системы для получения функциональных панкреатических прогениторов из эмбриональных стволовых клеток человека»), описания которых полностью включены в настоящее описание посредством ссылки.

До сих пор, иногда панкреатические энтодермальные клетки применяют без ссылки на РЕС, как описано выше, но обозначают в целом как типы клеток по меньшей мере на 3 и 4 стадии дифференцировки. Применение и значение станет ясным из контекста. Панкреатическая энтодерма, полученная из плюрипотентных стволовых клеток, и по меньшей мере hES и hIPS клеток, таким образом, отличается от других типов энтодермальных линий клеток, на основе отличающихся или высоких уровней экспрессии маркеров, выбранных из PDX1, NKX6.1, PTF1A, СРА1, cMYC, NGN3, РАХ4, ARX и NKX2.2 маркеров, но по существу не экспрессирующих гены, являющиеся признаком панкреатических эндокринных клеток, например, CHGA, INS, GCG, GHRL, SST, MAFA, PCSK1 и GLUT1. Кроме того, некоторые «эндокринные прогениторные клетки», экспрессирующие NGN3, могут дифференцироваться в другие не-панкреатические структуры (например, двенадцатиперстную кишку). В одном варианте осуществления NGN3-экспрессирующий эндокринный прогенитор, описанный в настоящей заявке, дифференцируется в зрелую панкреатическую линию клеток, например, панкреатические эндокринные клетки. Популяции панкреатических энтодермальных или эндокринных прогениторных клеток и способы для них также описаны, например, а патентной заявке США №11/773,944, озаглавленной «Способы получения панкреатических гормонов», поданной 5 июля 2007, и патентной заявке США №12/107,020, озаглавленной «Способы очистки энтодермы и панкреатических энтодермальных клеток, полученных из эмбриональных стволовых клеток человека», поданной 21 апреля 2008, описания которых полностью включены в настоящее описание посредством ссылки.

Термин «эндокринная клетка-предшественник», использующийся в настоящей заявке, означает мультипотентную клетку дефинитивной энтодермальной линии, экспрессирующую нейрогенин-3 (NEUROG3), которая может далее дифференцироваться в клетки эндокринной системы, включая гормон-экспрессирующие клетки панкреатических островков, но не ограничиваясь ими. Эндокринные клетки-предшественники не могут дифференцироваться во многие различные клетки, ткани/или типы органов, по сравнению с менее специфически дифференцированнымилиниями клеток дефинитивной энтодермы, такими как PDX1-позитивная панкреатическая энтодермальная клетка.

Термины «гормон-экспрессирующая клетка панкреатических островков», «панкреатическая эндокринная клетка», использующиеся в настоящей заявке, или ее эквиваленты означают клетку, которая получена из плюрипотентной клетки in vitro, которая может быть полигормональной или моногормональной. Таким образом, эндокринные клетки могут экспрессировать один или несколько панкреатических гормонов, которые выполняют по меньшей мере некоторые из функций клеток человека панкреатических островков. Клетки, экспрессирующие гормоны панкреатических островков, могут быть зрелыми или незрелыми. Незрелые гормон-экспрессирующие клетки панкреатических островков могут отличаться от зрелых гормон-экспрессирующих клеток панкреатических островков на основе дифференциальной экспрессии некоторых маркеров, или на основе функциональных способностей, например, чувствительности к глюкозе.

Условия среды для культивирования или роста многих стволовых клеток указаны в вариантах осуществления, описанных в настоящей заявке, включая среды с определенным составом, кондиционированные среды, бесфидерные среды, бессывороточные среды и тому подобное. Термин «среда для выращивания» или «коктейль», использующийся в настоящей заявке, или его эквиваленты означают среду, в которой недифференцированные или дифференцированные стволовые клетки (например, эмбриональные стволовые клетки приматов) пролиферируют in vitro. Характеристики среды включают среду, в которой культивируют клетки, и поддерживающую структуру (такую, как субстрат на твердой поверхности), если она присутствует. Способы культивирования или поддержания плюрипотентных клеток и/или дифференцировки плюрипотентных клеток также описаны в PCT/US 2007/062755, озаглавленной «Композиции и способы, пригодные для культивирования дифференцируемых клеток», поданной 23 февраля 2007; заявке США №11/993,399, озаглавленной «Композиции для культивирования эмбриональных стволовых клеток и способы их применения», поданной 20 декабря 2007; и заявке США №11/875,057, озаглавленной «Способы и композиции для бесфидерных сред для плюрипотентных стволовых клеток, содержащих сыворотку человека», поданной 19 октября 2007, полностью включенных в настоящее описание посредством ссылки.

Термин «по существу» или «в основном» означает минимальное или сниженное количество компонента или клетки, присутствующих в любомагрегате клеток суспензионного типа, например, агрегаты клеток в суспензии, описанные в настоящей заявке, являются «по существу или в основном однородными», «по существу или в основном гомо-целлюлярными», или состоят «по существу из hES клеток», «по существу или в основном из дефинитивных энтодермальных клеток», «по существу или в основном из клеток энтодермы передней части пищеварительного тракта», «по существу или в основном из PDX1-негативных клеток энтодермы передней части пищеварительного тракта», «по существу или в основном из PDX1-позитивных препанкреатических энтодермальных клеток», «по существу или в основном из PDX1-позитивных панкреатических энтодермальных или прогениторных клеток», «по существу или в основном из PDX1-позитивных панкреатических энтодермальных концевых клеток», «по существу или в основном из панкреатических эндокринных клеток-предшественников», «по существу или в основном из панкреатических эндокринных клеток», и тому подобное.

Что касается клеток в культурах клеток или популяциях клеток, термин «по существу не содержит» означает, что указанный тип клеток, который не содержит культура клеток или популяция клеток, присутствует в количестве менее примерно 10%, менее примерно 9%, менее примерно 8%, менее примерно 7%, менее примерно 6%, менее примерно 5%, менее примерно 4%, менее примерно 3%, менее примерно 2% или менее примерно 1% от общего числа клеток, присутствующих в культуре клеток клеток или популяции клеток.

Культуры клеток Культуры клеток могут быть выращены в среде, содержащей сниженное количество сыворотки или по существу свободной от сыворотки, или без сыворотки. В определенных условиях культивирования концентрации сыворотки могут находиться в диапазоне примерно от 0 об. % до 10 об. %. Например, в некоторых способах дифференцировки концентрация сыворотки в среде может составлять меньше примерно 0,05% (об./об.), меньше примерно 0,1% (об./об.), меньше примерно 0,2% (об./об.), меньше примерно 0,3% (об./об.), меньше примерно 0,4% (об./об.), меньше примерно 0,5% (об./об.), меньше примерно 0,6% (об./об.), меньше примерно 0,7% (об./об.), меньше примерно 0,8% (об./об.), меньше примерно 0,9% (об./об.), меньше примерно 1% (об./об.), меньше примерно 2% (об./об.), меньше примерно 3% (об./об.), меньше примерно 4% (об./об.), меньше примерно 5% (об./об.), меньше примерно 6% (об./об.), меньше примерно 7% (об./об.), меньше примерно 8% (об./об.), меньше примерно 9% (об./об.) или меньше примерно 10% (об./об.). В некоторых способах клетки препервичной полоски выращивают без сыворотки или без замены сыворотки. В таких способах концентрация В27 добавки может быть в диапазоне примерно от 0,1% (об./об.) до 20% (об./об.).

В других способах незрелые гормон-экспрессирующие клетки панкреатических островков выращивают в присутствии В27. В таких способах концентрация добавки В27 может быть в диапазоне примерно от 0,1% (об./об.) до 20% (об./об.), или в концентрациях выше примерно 20% (об./об.). В некоторых способах концентрация В27 в среде составляет примерно 0,1% (об./об.), примерно 0,2% (об./об.), примерно 0,3% (об./об.), примерно 0,4% (об./об.), примерно 0,5% (об./об.), примерно 0,6% (об./об.), примерно 0,7% (об./об.), примерно 0,8% (об./об.), примерно 0,9% (об./об.), примерно 1% (об./об.), примерно 2% (об./об.), примерно 3% (об./об.), примерно 4% (об./об.), примерно 5% (об./об.), примерно 6% (об./об.), примерно 7% (об./об.), примерно 8% (об./об.), примерно 9% (об./об.), примерно 10% (об./об.), примерно 15% (об./об.) или примерно 20% (об./об.). Альтернативно, концентрация внесенной добавки В27 может быть измерена в виде кратности крепости коммерческого маточного раствора В27. Например, В27 поставляется Invitrogen (Карлсбад, Калифорния) в виде 50Х маточного раствора. Добавление достаточного количества такого маточного раствора к достаточному объему среды для выращивания обеспечивает среду с добавлением необходимого количества В27. Например, добавление 10 мл 50Х маточного раствора В27 к 90 мл среды для выращивания обеспечивает среду для выращивания с 5Х В27. Концентрация добавки В27 может составлять примерно 0,1Х, примерно 0,2Х, примерно 0,3Х, примерно 0,4Х, примерно 0,5Х, примерно 0,6Х, примерно 0,7Х, примерно 0,8Х, примерно 0,9Х, примерно 1X, примерно 1,1Х, примерно 1,2Х, примерно 1,3Х, примерно 1,4Х, примерно 1,5Х, примерно 1,6Х, примерно 1,7Х, примерно 1,8Х, примерно 1,9Х, примерно 2Х, примерно 2,5Х, примерно 3Х, примерно 3,5Х, примерно 4Х, примерно 4,5Х, примерно 5Х, примерно 6Х, примерно 7Х, примерно 8Х, примерно 9Х, примерно 10Х, примерно 11Х, примерно 12Х, примерно 13Х, примерно 14Х, примерно 15Х, примерно 16Х, примерно 17Х, примерно 18Х, примерно 19Х, примерно 20Х и более чем примерно 20Х.

Термин «экзогенно добавленные» соединения, использующийся в настоящей заявке, такие как факторы роста, факторы дифференцировки, и тому подобные, в контексте культур или кондиционированных сред, означают факторы роста, которые добавляют в культуры или среды для дополнения любыми соединениями или факторами роста, которые уже могут присутствовать в культуре или среде. Например, в некоторых вариантах осуществления культуры клетоккультуры клеток и/или популяции клеток не включают экзогенно добавленного ретиноида.

Термин «ретиноид», использующийся в настоящей заявке, означает ретинол, ретиналь или ретиноевую кислоту, а также производные любого из этих соединений. В предпочтительном варианте осуществления ретиноид является ретиноевой кислотой.

«Фактор роста семейства FGF», «фактор роста фибробластов» или «член семейства фактора роста фибробластов» означает FGF, выбранный из группы, состоящей из FGF1, FGF2, FGF3, FGF4, FGF5, FGF6, FGF7, FGF8, FGF9, FGF10, FGF11, FGF12, FGF13, FGF14, FGF15, FGF16, FGF17, FGF18, FGF19, FGF20, FGF21, FGF22 и FGF23. В некоторых вариантах осуществления «фактор роста семейства FGF», «фактор роста фибробластов» или «член семейства фактора роста фибробластов» означает любой фактор роста, обладающий гомологией и/или функцией, подобной известному члену семейства фактора роста фибробластов.

Термин «экспрессия», использующийся в настоящей заявке, означает получение материала или вещества, а также уровень или количество получения материала или вещества. Таким образом, определение экспрессии специфического маркера означает детекцию относительного или абсолютного количества экспрессируемого маркера, или просто детекцию присутствия или отсутствия маркера.

Термин «маркер», использующийся в настоящей заявке, означает любую молекулу, которую можно наблюдать или выявлять. Например, маркер может включать нуклеиновую кислоту, такую как транскрипт специфического гена, полипептидный продукт гена, полипептид - не-генный продукт, гликопротеин, углевод, гликолипид, липид, липопротеин, или малую молекулу (например, молекулы с молекулярной массой меньшей 10,000 а.е.м.), но не ограничивается ими.

Для большинства маркеров, описанных в настоящей заявке, обеспечивается официальный символ гена Международной организации по изучению генома человека (HUGO). Такие символы, которые разработаны Комитетом по номенклатуре генов HUGO, обеспечивают уникальные аббревиатуры для каждого из названных генов человека и продуктов генов. Эти символы генов легко распознаются и могут легко быть ассоциированы с соответствующим уникальным геном человека и/или белковой последовательностью рядовым специалистом в данной области техники.

В соответствии с обозначениями HUGO, определены следующие символы генов: GHRL - грелин; IAPP - островковый амилоидный полипептид; INS - инсулин; GCG - глюкагон; ISL1 - фактор транскрипции ISL1; РАХ6 - ген спаренных боксов 6; РАХ4 - ген спаренных боксов 4; NEUROG3 - нейрогенин 3 (NGN3); NKX2-2 - NKX2-фактор-транскрипции-зависимый, локус 2 (NKX2.2); NKX6-1 - ΝΚΧ6-фактор транскрипции-зависимый, локус 1 (NKX6.1); LPF1 - промоторный инсулиновый фактор 1 (PDX1); ONECUT1 - one cut домен, член семейства 1 (HNF6); HLXB9 - гомеобокс В9 (НВ9); TCF2 - фактор транскрипции 2, печеночный (HNF1b); FOXA1- forkhead box A1; HGF - фактор роста гепатоцитов; IGF1 - инсулиноподобный фактор роста 1; POU5F1 - POU домен, класс 5, фактор транскрипции 1 (ОСТ4); NANOG - Nanog гомеобокс; SOX2 - SRY (полоопределяющий участок Y)-бокс 2; CDH1 - кадгерин 1, тип 1, Е-кадгерин (ECAD); Τ - brachyury гомолог (BRACH); FGF4 - фактор роста фибробластов 4; WNT3 - бескрылого типа MMTV семейства сайта интеграции, член 3; SOX17 - SRY (полоопределяющий участок Y)-бокс 17; GSC - гусекоид; CER1 - (cerberus 1, cysteine-knot суперсемейства, гомолог (CER); CXCR4 - хемокина (С-Х-С мотив) рецептор 4; FGF17 - фактор роста фибробластов 17; FOXA2 - forkhead бокс А2; SOX7 - SRY (полоопределяющий участок Y)-бокс 7; SOX1 - SRY (полоопределяющий участок Y)-бокс 1; AFP - альфа-фетопротеин; SPARC - секретируемый белок, кислый, богатый цистеином (остеонектин); и THBD - тромбомодулин (ТМ), NCAM - молекула адгезии нервных клеток; SYP - синаптопсин; ZIC1 - Zic семейства член 1; NEF3 - нейрофиламент 3 (NFM); SST - соматостатин; MAFA - v-maf мышечно-апоневротической фибросаркомы онкогена гомолог A; MAFB - v-maf мышечно-апоневротической фибросаркомы онкогена гомолог В; SYP - синаптопсин; CHGA - хромогранин А (паратиреоидный секреторный белок 1).

Далее приведены полные наименования генов, соответствующих не-HUGO символам генов, а также другие аббревиатуры, которые могут применяться в настоящей заявке: SS - соматостатин (SOM); РР - панкреатический полипептид; С-пептид - соединительный пептид; Ех4 - эксендин 4; NIC - никотинамид и DAPT - N-[N-(3,5-дифторфенацетил)-L-аланил]-S-фенилглицин t-бутиловый эфир; RA - ретиноевая кислота; RPMI - среда Мемориального института Розуэлла Парка; CMRL - среда Лаборатории медицинских исследований Коннаута; FBS - эмбриональная телячья сыворотка; NBP10 - NCAM связывающий белок 10; PTF1a - панкерато-специфический фактор транскрипции 1а.

Развитие плюрипотентных клеток в различные мультипотентные и/или дифференцированные клетки можно контролировать путем определения относительной экспрессии генов, или маркеров генов, характерных для специфических клеток, по сравнению с экспрессией второго или контрольного гена, например, конститутивных генов. В некоторых способах экспрессию определенных маркеров оценивают путем детекции присутствия или отсутствия маркера. Альтернативно, экспрессию некоторых маркеров можно определить путем измерения уровня, на котором маркер присутствует в клетке из культуры клеток или популяции клеток. В таких способах измерение экспрессии маркеров может быть качественным или количественным. Одним способом количественного определения экспрессии маркеров, продуцируемых генами маркеров, является применение количественной ПЦР (Q-PCR). Способы выполнения Q-PCR хорошо известны в данной области техники. Другие способы, известные в данной области техники, также можно применять для количественного определения экспрессии гена маркера. Например, экспрессию продукта маркерного гена можно определить с применением антител, специфичных для интересующего продукта гена маркера.

В некоторых способах наивысшая экспрессия следующих генов является показателем для некоторых популяций клеток, например, SOX17, SOX7, AFP или THBD являются показателями экстраэмбриональной энтодермы; NODAL и/или FGF8 являются показателями препервичной полоски; brachyury, FGF4, SNAI1 и/или WNT3 являются показателями мезоэнтодермы; CER, GSC, CXCR4, SOX17 и FOXA2 являются показателями дефинитивных энтодермальных клеток; SOX17, FOXA2, FOXA1, HNF1B и HNF4A являются показателями энтодермы передней части пищеварительного тракта (или PDX1-негативной энтодермы); PDX1, HNF6, SOX9 и PROX1 являются показателями PDX1-позитивной энтодермы; PDX1, NKX6.1, PTFA1, CPA и cMYC являются показателями панкреатического эпителия (РЕ или панкреатического прогенитора); NGN3, РАХ4, ARX и NKX2.2 являются показателями эндокринных клеток-предшественников; a ENS, GCG, GHRL, SST и РР являются показателями различных эндокринных клеток; относительно высокая экспрессия генов MAFA - MAFB является показателем инсулин-секретирующих эндокринных клеток; а относительно высокая экспрессия генов MAFB - MAFA является показателем глюкагон-секретирующих эндокринных клеток.

Термины «фактор роста фибробластов 7 (FGF7)» и фактор роста кератиноцитов (KGF) являются синонимами.

Способы получения индуцированных плюрипотентных стволовых (iPS) клеток

Варианты осуществления, описанные в настоящей заявке, не ограничиваются каким-либо одним типом iPS клеток или каким-либо одним способом получения iPS клеток. Варианты осуществления не ограничиваются и не зависят от уровней эффективности получения iPS клеток, поскольку существуют различные способы. Варианты осуществления, описанные в настоящей заявке, применяются к дифференцировке iPS клеток в энтодермальные линии клеток, и к их применению.

Описаны вирусные, невирусные и неинтегрирующие вирусные способы генерации индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSC) с применением аденовирусов, плазмид или вырезания перепрограммирующих факторов с применением Cre-loxP3, или piggyback транскрипции. См. Stadtfeld, M., et al., Science 322, 945-949 (2008); Okita, K. et al., Science 322, 949-953 (2008); Kaji, K. et al. Nature 458, 771-775 (2009); Soldner, F. et al. Cell 136, 964-977 (2009); и Woltjen, K. et al. Nature 458, 766-770 (2009), которые полностью включены в настоящее описание посредством ссылки. См. также патентную заявку США №20100003757 от Mack, A. et al. (опубликовано 7 января 2010) и №PCT/US 2009/037429 от Shi et al, которые полностью включены в настоящее описание посредством ссылки. Эти способы, однако, обладают низкой перепрограммирующей эффективностью (<0,003%), и могут оставлять остаточные векторные последовательности, несмотря на вырезание, что ограничивает терапевтическое применение. Например, вирусная интеграция в геном хозяина и гиперэкспрессия вышеуказанных факторов транскрипции является потенциально характеристикой, которая отличает ES клетки и iPS клетки. См. Solder, F. et al., Cell 136: 964-977 (2009); Foster et al., Oncogene 24: 1491-1500 (2005); и Hochedlinger, K. et al., Cell 121: 465-477 (2005), которые полностью включены в настоящее описание посредством ссылки.

В других вариантах осуществления настоящего изобретения способы генерации iPSC включают эписомальные векторы, полученные из вируса Эпштейн-Барра. См. Yu, J. et al. Science 324, 797-801 (2009) и заявку США №20100003757 от Mack, A. et al. опубликованную 7 января 2010, которые полностью включены в настоящее описание посредством ссылки. Эти способы требуют трех отдельных плазмид, несущих комбинацию семи факторов, включая онкоген SV40.

В другом варианте осуществления изобретения способы генерации iPSC включают iPSC на белковой основе от фетальных и неонатальных клеток мыши и человека. См. Zhou, H. et al. Cell Stem Cell 4, 381-384 (2009); и Kim, D. et al. Cell Stem Cell 4, 472-476 (2009), которые полностью включены в настоящее описание посредством ссылки. Эти методологии осуществляют с применением химической обработки (например, вальпроевой кислотой в случае Zhou et al. 2009, выше) или многих циклов обработки (Kim et al. 2009, выше).

В другом варианте осуществления настоящего изобретения можно применять миникольцевые векторы или плазмиды, которые являются молекулами сверспиральной ДНК, утратившей бактериальное происхождение репликации и генов устойчивости к антибиотикам. См. See Chen, Z.-Y. et al., Mol. Ther. 8, 495-500 (2003); Chen, Z.-Y. et al., Hum. Gene Ther. 16, 126-131 (2005); и Jia, F. et al., Nature Methods Advance Publication Online, 7 февраля 2010, которые полностью включены в настоящее описание посредством ссылки. Эти методологии генерируют iPSC с более высокой эффективностью трансфекции и более длительной эктопической экспрессией, поскольку они имеют меньшую активацию экзогенных механизмов сайленсинга.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения iPS могут быть генерированы от людей - пациентов, включая больных диабетом, боковым амиотрофическим склерозом, спинальной мышечной дистрофией и болезнью Паркинсона. См. Maehr et al. PNAS USA 106(37): 15768-73 (2009); Dimos et al., Science, 321: 1218-21 (2008); Ebert et al. Nature 457: 277-80 (2009); Park et al. Cell 134: 877-886 (2008); и Soldner et al., Cell 136: 964-977, которые полностью включены в настоящее описание посредством ссылки. По меньшей мере одним преимуществом получения hIPS клеток от пациентов со специфическими заболеваниями является то, что полученные клетки могут содержать генотип и иметь клеточный ответ для заболевания человека. Также, см. Таблицу 3, перечисляющую по меньшей мере некоторые существующие iPS линии клеток человека. Эта информация была получена из литературы и доступна в базах данных, включая например, Реестр стволовых клеток Национального института здравоохранения (NIH), Реестр эмбриональных стволовых клеток человека и Международный реестр стволовых клеток, расположенный в Медицинской школе Массачусетского университета, Ворчестер, Массачусетс, США. Эти базы данных периодически обновляются, когда становятся доступными линии клеток и получена регистрация.

Варианты осуществления композиций и способов, описанных в настоящей заявке, подразумевают применение различных дифференцируемых плюрипотентных стволовых клеток приматов, включая плюрипотентные стволовые клетки человека, такие как hESC, включая СуТ49, СуТ212, СуТ203, СуТ25, (коммерчески доступные по меньшей мере ко времени подачи настоящей заявки от ViaCyte Inc., расположенном в 3550 General Atpmics Court, Сан-Диего, Калифорния, 92121) BGO1, BG02 и MEL1, и индуцированные плюрипотентные стволовые (iPS) клетки, такие как iPSC-482c7 и iPSC-603 (Cellular Dynamics International, Inc., Мэдисон, Висконсин) и iPSC-G4 (далее «G4») и iPSC-B7 (далее «В7») (Shinya Yamanaka, Центр исследования iPS клеток, Университет Киото), но не ограничиваясь ими; исследования с применением G4 и В7 подробно описаны ниже. Некоторые из этих плюрипотентных стволовых клеток человека зарегистрированы в национальных реестрах, таких как Реестр Национального института здравоохранения (NIH), и перечислены в Реестре стволовых клеток человека NIH (например, СуТ49, регистрационный номер 0041). Информацию по СуТ49, другим доступным линиям клеток также можно найти в Интернете на stemcells.nih.gov/research/registry. Другие линии клеток, например, BG01 и BG01v, поставляются и распространяются третьими лицами от WiCell^®, филиалом Висконсинского международного банка стволовых клеток (WISC) (номер по каталогу BG01) и АТСС (номер по каталогу SCRC-2002), соответственно. В то время как другие линии клеток, описанные в настоящей заявке, могут быть не зарегистрированы и не распределяться биологическим репозиторием, таким как WiCell^® или АТСС, такие линии клеток доступны напрямую или опосредованно от основных исследователей, лабораторий и/или институтов. Публичный запрос на линии клеток и реагенты, например, является обычным для рядовых специалистов в данной области техники. Как правило, передача этих клеток или материалов осуществляется путем стандартного соглашения по передаче материалов между собственникомлинии клеток или материала, и потребителем. Передача этих типов материалов осуществляется частным образом в исследовательской среде, в частности, в области науки о жизни. Фактически, автор заявки рутинно передавал клетки со времени их получения и характеристики, включая СуТ49 (2006), СуТ203 (2005), Cyt212 (2009), СуТ25 (2002), BG01 (2001), BG02 (2001), BG03 (2001) и BG01v (2004), посредством таких соглашений с коммерческими и некоммерческими промышленными партнерами и соавторами. Год в скобках после каждой линии клеток в предыдущем списке указывает год, когда линии клеток или материалы становятся публично доступными и бессмертными (например, из банков клеток, где они изготовлены), и таким образом, разрушение другого эмбриона не проводится и не требуется, благодаря получению этих линий клеток для создания композиций и осуществления способов, описанных в настоящей заявке.

В августе 2006 Klimanskaya et al. показали, что hESC можно получить из единичных бластомеров, таким образом, сохраняя эмбрион интактным и не вызывая его разрушения. Были проведены биопсии из каждого эмбриона с применением методики микроинкапсулирования, и было получено девятнадцать (19) продуктов, подобных ES-клеткам, и две (2) стабильных hESC линии. Эти hESC линии были способны к сохранению в недифференцированном состоянии в течение более чем шести (6) месяцев, и демонстрировали нормальный кариотип и экспрессию маркеров плюрипотентности, включая Oct-4, SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81, Nanog и щелочную фосфатазу. Эти hESC могут дифференцировать и формировать производные всех трех (3) эмбриональных зародышевых слоев in vitro и формировать тератомы in vivo. Эти способы создания новых линий стволовых клеток без разрушения эмбриона направлены на этические проблемы применения эмбрионов человека. См. Klimanskaya et al. (2006) Nature 444:481-5, опубликовано 23 августа 2006, описания которых полностью включены в настоящее описание посредством ссылки. Однако Klimanskaya et al. совместно культивировали полученную линию hESC с другими hESC. Позднее, в 2008, Chung Y. et al., смогли получить линии hES клеток, вновь из единственного бластомера, но без совместного культивирования с hESC. См. Chung Y. et al., Cell Stem Cell 2008, 2(2), 113-117, который полностью включен в настояще описание посредством ссылки. Таким образом, композиции и способы, описанные в настоящей заявке, и в частности, такие композиции и способы, которые относятся к индуцированным плюрипотентным стволовым клеткам или генетически дедифференцированным плюрипотентным стволовым клеткам, не требуют разрушения эмбриона человека.

Таблицы 3 и 4 являются не ограничивающими перечнями некоторых iPSC и hESC. соответственно, которые доступны во всем мире для исследовательских и/или коммерческих целей, и пригодны для применения в способах и композициях из настоящего изобретения. Информация из Таблиц 3 и 4 получена из литературы и публичных баз, включая, например Реестр стволовых клеток Национального института здравоохранения (NIH), Реестр эмбриональных стволовых клеток человека и Международный реестр стволовых клеток медицинской школы Массачусетского университета, США. Эти базы данных периодически обновляются, когда линии клеток становятся доступными и зарегистрированными.

iPSC человека, описанные в настоящей заявке (по меньшей мере iPSC-603 и iPSC-482-с7), получали от Cellular Dynamics International, Inc. (Мэдисон, Висконсин, США).

Другим преимуществом является то, что hIPS клетки будут соответствовать иммунологически аутологичной популяции клеток; и пациент-специфические клетки можно получать для изучения происхождения и прогрессирования заболевания. Таким образом, можно понять первопричины заболевания, что позволит создать представление, ведущее к разработке профилактического и терапевтического лечения заболевания.

Плюрипотентные эмбриональные стволовые (hES) клетки человека

Некоторые варианты осуществления направлены на способы получения дефинитивных энтодермальных клеток и наконец, любого типа клеток, полученных из энтодермальной линии, включая энтодерму передней части пищеварительного тракта, панкреатическую энтодерму, эндокринные клетки-предшественники и/или гормон-экспрессирующие клетки панкреатических островков, но не ограничиваясь ими, с применением эмбриональных стволовых (hES) клеток человека в качестве исходного материала. Эти hES клетки могут быть клетками, происходящими из морулы, внутренней клеточной массы эмбриона или клетками, полученными из эмбриональных половых гребней. Эмбриональные стволовые клетки человека могут поддерживаться в культуре в плюрипотентном состоянии без существенной дифференцировки с применением способов, известных в данной области техники. Такие способы описаны, например, в патентах США №№5,453,357, 5,670,372, 5,690,926 5,843,780, 6,200,806 и 6,251,671, описания которых полностью включены в настоящее описание посредством ссылки.

В некоторых способах плюрипотентные стволовые клетки, например, hES клетки, поддерживаются на фидерном слое. В таких способах может применяться любой фидерный слой, позволяющий плюрипотентной клетке сохраняться в плюрипотентном состоянии. Одним обычно используемым фидерным слоем для культивирования эмбриональных стволовых клеток человека является слой фибробластов мыши. Недавно были разработаны фидерные слои фибробластов человека для применения при культивировании плюрипотентных клеток (см. патентную заявку США №2002/0072117, описание которой полностью включено в настоящее описание посредством ссылки). Альтернативные способы позволяют поддерживать плюрипотентные клетки без применения фидерного слоя. Способы поддержания плюрипотентных клеток в бесфидерных условиях описаны в патентной публикации США №2003/0175956, описание которой полностью включено в настоящее описание посредством ссылки.

Плюрипотентные клетки, раскрытые в настоящей заявке, можно поддерживать в культуре с сывороткой или без сыворотки, с экстрацеллюлярным матриксом или без него, с FGF или без него. В некоторых процедурах поддержания плюрипотентных клеток применяют замену сыворотки. Эти и другие способы культивирования и дифференцировки плюрипотентных или мультипотентных клеток, соответственно, описаны в PCT/US 2007/062755, поданной 23 февраля 2007, и озаглавленной «Композиции и способы культивирования дифференциальный клеток», и PCT/US 2008/080516, поданной 20 октября 2008, и озаглавленной «Способы и композиции для бесфидерных сред для плюрипотентных стволовых клеток, содержащих сыворотку человека», которые полностью включены в настоящее описание посредством ссылки.

Изобретение, раскрытое в настоящей заявке, пригодно для всех hES линий клеток, и по меньшей мере тех, которые перечислены в Таблице 4. Эта информация получена из литературы и публичных баз данных, включая, например, Реестр стволовых клеток Национального института здравоохранения (NIH), Реестр эмбриональных стволовых клеток человека и Международный реестр стволовых клеток, расположенный в Медицинской школе Массачусетского университета, Ворчестер, Массачусетс, США. Эти базы данных периодически обновляются, когда становятся доступными линии клеток и получена регистрация. На дату подачи настоящей заявки имеется 254 линии iPSC, перечисленных в Международной реестре стволовых клеток, и 1211 линий hESC. В Таблице 4 внизу не включены все перечисленные hESC и iPSC, но скорее приведены примеры потенциально доступных плюрипотентных стволовых клеток.

Плюрипотентные дедифференцированные соматические клетки

Недавние исследования с применением определенных нуклеарных перепрограммирующих факторов обеспечили получение плюрипотентных стволовых клеток или плюрипотентно-подобных стволовых клеток из собственных соматических клеток пациента. Эти клетки также называются индуцированными плюрипотентными стволовыми (iPS) клетками. Настоящее изобретение описывает различные линии iPS клеток, предоставленные Shinya Yamanaka, Университет Киото. Однако, другие линии iPS клеток, например, описанные James Thomson et al., включены в настоящее изобретение. См. публикацию США 20090047263, Международную публикацию WO 2005/80598, публикацию США 20080233610 и Международную публикацию WO 2008/11882, которые полностью включены в настоящее описание посредством ссылки. Таким образом, термин «индуцированные плюрипотентные стволовые (iPS) клетки», использующийся в настоящей заявке, означает клетки, обладающие свойствами, подобными свойствам других плюрипотентных стволовых клеток, например, hES клетки, hEG клетки, pPS клетки (плюрипотентные стволовые клетки приматов), патогенные клетки, и тому подобное.

Ядерные программирующие факторы описаны в публикации США 20090047263, Международной публикации WO 2005/80598, публикации США 20080233610 и Международной публикации WO 2008/11882, и применяются для индукции перепрограммировании дифференцированных клеток без применения яйцеклеток, эмбрионов или ES клеток. Способы приготовления индуцированных iPS клеток из соматических клеток путем применения ядерных перепрограммирующих факторов подобны тем, которые описаны в настоящем изобретении, и не ограничиваются конкретно. В предпочтительных вариантах осуществления ядерные перепрограммирующие факторы контактируют с соматическими клетками в среде, в которой соматические клетки и индуцированные плюрипотентные стволовые клетки могут пролиферировать. Преимуществом некоторых вариантов осуществления, описанных в настоящей заявке, является то, что индуцированные плюрипотентные стволовые клетки можно приготовить путем контакта ядерного перепрограммирующего фактора с соматическими клетками при отсутствии яйцеклеток, эмбрионов или эмбриональных стволовых (ES) клеток. С применением ядерного перепрограммирующего фактора ядро соматической клетки можно перепрограммировать для получения iPS клетки или «ES-подобной клетки».

Плюрипотентные стволовые клетки, описанные в настоящей заявке, являющиеся hES клетками или iPS клетками, могут экспрессировать любое количество маркеров плюрипотентных клеток, включая щелочную фосфатазу (АР); ABCG2; стадиеспецифический эмбриональный антиген-1 (SSEA-1); SSEA-3; SSEA-4; TRA-1-60; TRA-1-81; Tra-2-49/6Е; ERas/ECAT5, Е-кадгерин; βΙΙΙ-тубулин; альфа-гладкомышечный актин (альфа-SMA); фактор роста фибробластов 4 (Fgf4), Cripto, Dax1; белок «цинковые пальцы» 296 (Zfp296); N-ацетилтрансферазу-1 (Nat1); ассоциированный с ES клетками транскрипт 1 (ЕСАТ1); ESG1/DPPA5/ECAT2; ЕСАТ3; ЕСАТ6; ЕСАТ7; ЕСАТ8; ЕСАТ9; ЕСАТ10; ЕСАТ15-1; ЕСАТ15-2; Fthll7; Sall4; фактор транскрипции недифференцированных эмбриональных клеток (Utf1); Rex1; р53; G3PDH; теломеразу, включая TERT; молчащие гены X хромосомы; Dnmt3a; Dnmt3b; TRIM28; F-бокс содержащий белок 15 (Fbxl5); Nanog/ECAT4; Oct3/4; Sox2; Klf4; c-Myc; Esrrb; TDGF1; GABRB3; Zfp42, FoxD3; GDF3; CYP25A1; дифференцировочный ассоциированный с плюрипотентностью 2 (DPPA2); Т-клеточной лимфомы точка разрыва 1 (Tcl1); DPPA3/Stella; DPPA4 и тому подобные, но не ограничиваясь ими. Необходимо понимать, что настоящее изобретение не ограничивается маркерами, перечисленными в настоящей заявке, и охватывает такие маркеры, как маркеры поверхности клеток, антигены, и другие продукты генов, включая EST, РНК (включая микроРНК и антисмысловые РНК), ДНК (включая гены и кДНК), и их части.

В одном варианте осуществления линии iPS клеток, применяемые в настоящей заявке, содержат следующие гены ядерных перепрограммирующих факторов: семейство генов Oct, семейство генов Klf, и семейство генов Sox. В одной линии iPS клеток обеспечен каждый из трех видов генов: Oct3/4, Klf4, и Sox2. Применялись другие продукты генов линии iPS из каждого из следующих трех видов: ген семейства Oct, ген семейства Klf, и ген семейства Мус, например, Oct3/4, Klf4 и с-Мус. Соответственно, необходимо понимать, что ядерный перепрограммирующий фактор может быть с геном семейства Мус или без него.

Ядерные перепрограммирующие факторы, описанные в настоящей заявке и также известные в данной области техники, можно применять для генерации iPS клеток из дифференцированных взрослых соматических клеток, и они не ограничиваются типом перепрограммируемых соматических клеток, т.е. любой вид соматических клеток можно перепрограммировать или дедифференцировать. Поскольку перепрограммирование соматических клеток не требует яйцеклетки и/или эмбриона, iPS клетка может быть клеткой млекопитающего, таким образом, обеспечивая возможность генерации пациент- или болезнь-специфических плюрипотентных стволовых клеток.

Суспензия агрегатов плюрипотентных стволовых клеток

В отличие от ранее известных способов тканевой инженерии, которые основаны на высеве индивидуальных клеток на полимерные каркасы, матрицы и/или гели, варианты осуществления, описанные в настоящей заявке, могут применять суспензии агрегатов клеток, полученные из плюрипотентной стволовой клетки, суспензий отдельных клеток или суспензий дифференцированных отдельных клеток, полученных из них. Способы обработки и/или производства суспензий агрегатов стволовых клеток и дифференцировки клеток из них описаны в Международных заявках PCT/US 2007/062755 и PCT/US 2008/082356, которые полностью включены в настоящее описание посредством ссылки.

В одном варианте осуществления обеспечиваются способы получения суспензий агрегатов плюрипотентных столовых клеток из суспензии отдельных клеток культур плюрипотентных стволовых клеток, например, культур hES или iPS. Плюрипотентные стволовые клетки можно исходно культивировать на фибробластных фидерах или без фидеров. Способы выделения hES клеток и их культивирования на фидерных клетках человека описаны в патенте США №7,432,104, полностью включенном в настоящее описание посредством ссылки.

Термин «суспензия из отдельных клеток», использующийся в настоящей заявке, или его эквиваленты означает суспензию плюрипотентных, мультипотентных или окончательно дифференцированных отдельных клеток, или суспензию отдельных клеток, полученных их плюрипотентной или мультипотентных клеток, любыми механическими или химическими средствами. Существует несколько способов диссоциации кластеров клеток до получения суспензий отдельных клеток из первичных тканей, прикрепленных клеток в культуре, и агрегатов, например, физические усилия (механическая диссоциация, такая как с помощью скребка для клеток, измельчение с помощью пипетки с узким поперечным сечением, тонкоигольная аспирация, дизагрегация с помощью вортекса и принудительная фильтрация через мелкую сетку из нейлона или нержавеющей стали), ферменты (ферментативная диссоциация таким ферментами, как трипсин, коллагеназа, Accutase™ и тому подобное), или комбинация того и другого. Далее, способы и условия культуральных сред, пригодных для поддержания диссоциации на отдельные клетки плюрипотентных, мультипотентных или дифференцированных клеток, применяются для экспансии, сортировки клеток, и установленного высева для анализа на многолуночных планшетах и обеспечения автоматизации процедур культивирования и клональной экспансии.

Другие варианты осуществления обеспечивают способы получения суспензий агрегатов плюрипотентных стволовых клеток непосредственно в средах для дифференцировки, например, средах для дифференцировки, содержащих агент, предпочтительно, член семейства TGFβ, способный активировать рецептор семейства TGFβ, например, активин А, активин В, GDF-8, GDF-11, и Nodal. Факторы роста для получения энтодермы описаны в Международной заявке №PCT/US 2008/065686, полностью включенной в настоящее описание посредством ссылки. Способы получения суспензии агрегатов клеток в средах для дифференцировки могут отличаться от других способов, также описанных в настоящей заявке, которые обеспечивают получение агрегатных суспензионных культур клеток в средах для плюрипотентных стволовых клеток, например, StemPro® hES SFM (Invitrogen) на основе херегулин-основанных DC-HAIF сред, описанных в PCT/US 2007/062755.

Варианты осуществления, описанные в настоящей заявке, относятся к способам генерации агрегата плюрипотентных клеток в суспензии из плюрипотентной адгезивной культуры, путем культивирования плюрипотентной клетки в условиях адгезивной ростовой культуры, обеспечивающих экспансию в недифференцированном состоянии; диссоциации адгезивной культуры плюрипотентных клеток в суспензионную культуру отдельных клеток; контактирования суспензионной культуры отдельных клеток при первых дифференцирующих условиях культивирования, обеспечивающих образование агрегатов клеток из hES в суспензии путем перемешивания суспензионной культуры из отдельных клеток в течение такого периода времени, когда суспензионная культура из отдельных клеток образует в суспензии агрегаты клеток, полученные из плюрипотентных; и таким образом, генерации агрегатов клеток в суспензии, полученных из плюрипотентных клеток. В предпочтительных вариантах осуществления перемешивание суспензионной культуры отдельных клеток выполняют путем вращения со скоростью 80-160 об./мин. В некоторых других вариантах осуществления, описанных в настоящей заявке, ингибитор rho-киназы применяют для облегчения агрегации, роста, пролиферации, экспансии и/или клеточной массы плюрипотентных стволовых клеток.

Варианты осуществления, описанные в настоящей заявке, также относятся к способам генерации агрегатов, полученных из плюрипотентных клеток, в суспензии из отдельных плюрипотентных клеток, путем культивирования hES клеток в условиях адгезивной ростовой культуры, обеспечивающих экспансию в недифференцированном состоянии; контактирования недифференцированных hES клеток с первыми дифференцирующими культуральными условиями, пригодными для дифференцировки hES клеток с получением адгезивных клеток, полученных из плюрипотентных; диссоциации адгезивных клеток, полученных из hES, в суспензионную культуру из отдельных клеток; контактирования суспензионной культуры из отдельных клеток со вторыми дифференцирующими культуральными условиями, обеспечивающими образование агрегатов, полученных из hES клеток, в суспензии, путем перемешивания суспензионной культуры отдельных клеток в течение такого периода времени, чтобы суспензионная культура из отдельных клеток формировала агрегаты, полученные из плюрипотентных клеток, в суспензии, и таким образом, получая агрегаты, образованные из плюрипотентных клеток, в суспензии. В предпочтительных вариантах осуществления перемешивание суспензионной культуры из отдельных клеток выполняют путем вращения со скоростью примерно от 80 об./мин до 160 об./мин.

В предпочтительных вариантах осуществления суспензионные культуры промышленного масштаба применяют непрерывную перфузию сред в качестве способа поддержания жизнеспособности клеток при максимизации плотности клеток. В этом контексте замен среды вносит сдвиг жидкости в культуру, влияя на адгезивные клетки и суспендированные агрегаты по-разному. Иммобилизованные адгезивные клетки подвергаются стрессу сдвига жидкости, когда среда течет, касаясь поверхности клеток. Напротив, суспендированные агрегаты подвергаются значительно меньшему влиянию сдвигового стресса вдоль поверхности агрегатов, поскольку агрегаты свободно переворачиваются в ответ на прилагаемое сдвиговое усилие. Ожидается, что длительный сдвиговый стресс является вредным для адгезивных плюрипотентных клеток, и что формат суспендированных агрегатов предпочтителен для оптимального выживания и функции. Таким образом, на основе потребности в эффективном производственном процессе для получения плюрипотентных стволовых клеток и/или мультипотентных прогениторных клеток, полученных из плюрипотентных стволовых клеток и вышеуказанных механических факторов, связанных со сдвиговым усилием и сдвиговым стрессом, варианты осуществления, описанные в настоящей заявке, обеспечивают в первую очередь способы производства для получения плюрипотентных стволовых клеток и/или мультипотентных прогениторных клеток, полученных из плюрипотентных стволовых клеток в формате суспензии, в частности, формате суспензии агрегатов клеток.

В еще одном варианте осуществления суспензии агрегатов hES клеток культивировали в среде, по существу свободной от сыворотки, и кроме того, не содержащей экзогенно добавленного фактора роста фибробластов (FGF). Это отличается от патента США №7,005,252 от Thomson, J., в котором было необходимо культивирование hES клеток в среде без сыворотки, но содержащей экзогенно добавленные ростовые факторы, включая FGF. В некоторых вариантах осуществления суспензии агрегатов iPS клеток культивировали в среде, по существу свободной от сыворотки и/или дополнительно при отсутствии экзогенно добавленного фактора роста фибробластов (FGF).

В отличие от агрегатов клеток, полученных ранее известными способами, которые могут варьировать по размеру и форме, агрегаты клеток и способы, описанные в настоящей заявке, имеют более узкий диапазон распределения по размеру и форме, т.е. агрегаты клеток являются по существу однородными по размеру и/или форме. Однородность размера агрегатов клеток является критической для эффективности дифференцировки и однородности культуры. При использовании основного анализа массового переноса агрегатов ожидается, что диффузия кислорода и нутриентов к центру больших агрегатов будет низкой по сравнению с диффузией в меньшие агрегаты, с учетом равной проницаемости. Поскольку дифференцировка агрегированных ES клеток, или iPS клеток, в линию панкреатических клеток зависит от временного применения специфических факторов роста, культура со смесью агрегатов различного диаметра, вероятно, будет десинхронизованной, по сравнению с однородной (по размеру и форме) культурой агрегатов клеток. Смесь агрегатов клеток дает начало гетерогенности, и может привести к плохой эффективности дифференцировки, и в итоге не будет пригодной для производства, масштабирования и выработки. Таким образом, выражение «по существу однородный» или «по существу однородный по размеру и форме», использующееся в настоящей заявке, или его эквиваленты, относится к разбросу по однородности агрегатов, и составляет не более примерно 20%. В другом варианте осуществления разброс по однородности агрегатов составляет не более примерно 15%, 10% или 5%.

Хотя точное число клеток на агрегат не является критическим, специалистам в данной области техники понятно, что размер каждого агрегата (и таким образом, число клеток на агрегат) ограничивается способностью кислорода и нутриентов к диффузии в центральные клетки, и что это число может также варьировать в зависимости от типа клеток и питательных потребностей этого типа клеток. Агрегаты клеток могут содержать минимальное число клеток (например, две или три клетки) на агрегат, или могут содержать многие сотни или тысячи клеток на агрегат. Как правило, агрегаты клеток содержать сотни или тысячи клеток на агрегат. Для целей настоящего изобретения агрегаты клеток, как правило, имеют размер примерно от 50 микрон до 600 микрон, хотя, в зависимости от типа клеток, размер может быть меньше или больше этого диапазона. В одном варианте осуществления агрегаты клеток имеют размер примерно от 50 микрон до 250 микрон, или примерно от 75 до 200 микрон, и предпочтительно, примерно от 100 до 150 микрон.

Другие способы описывают получение эмбриоидных телец (ЕВ). Термины «эмбриоидные тельца», «агрегатные тельца», использующиеся в настоящей заявке, или их эквиваленты означают агрегаты из дифференцированных или недифференцированных клеток, которые появляются, когда ES клетки перерастают в однослойных культурах, или поддерживаются в суспензионных культурах в не-дифференцирующей среде, или дифференцируются с помощью ненаправленных протоколов в ткани из множества зародышевых листков. То есть, ЕВ не образуются из суспензии из отдельных клеток или плюрипотентных стволовых клеток, как описано в настоящей заявке, и не образуются из адгезивных культур или мультипотентных клеток, полученных из плюрипотентных. Эти характеристики по отдельности явно отличают настоящее изобретение от эмбриоидных телец.

В отличие от эмбриоидных телец, которые являются смесью дифференцированных и недифференцированных клеток, и, как правило, состоят из клеток из нескольких зародышевых листков и проходят через произвольную дифференцировку, агрегаты клеток, описанные в настоящей заявке, по существу или в основном являются гомо-клеточными, существуя в виде агрегатов из плюрипотентных, мультипотентных, бипотентных или унипотентных типов клеток, например, эмбриональных клеток, дефинитивной энтодермы, энтодермы передней части пищеварительного тракта, PDX1 позитивной панкреатической энтодермы, панкреатических эндокринных клеток и тому подобного.

Варианты осуществления, описанные в настоящей заявке, решают вышеуказанные проблемы путем обеспечения экономичных производственных процессов или способов, обеспечивающих воспроизводимое получение агрегатов клеток, по существу однородных по размеру и форме, с применением способа, который легко применить в производственном масштабе. В одном частном варианте осуществления дифференцируемые клетки увеличиваются в суспензионной культуре, с применением клеточных сред из настоящего изобретения. В другом частном варианте осуществления дифференцируемые клетки могут поддерживаться и увеличиваться в суспензии, т.е. они остаются недифференцированными, или предотвращается их дальнейшая дифференцировка. Термин «увеличиваться» в контексте культуры клеток применяется так, как в данной области техники, и относится к пролиферации клеток и повышению количества клеток, предпочтительно, к повышению числа жизнеспособных клеток. В специфическом варианте осуществления клетки увеличиваются в суспензии культуры более чем примерно за одни сутки, т.е. примерно за 24 часа. В более специфическом варианте осуществления клетки увеличиваются в суспензионной культуре путем культивирования в течение по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 суток, или по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 недель.

Другие варианты осуществления настоящего изобретения обеспечивают способы получения суспензий агрегатов клеток, образованных из культур дифференцированных плюрипотентных стволовых клеток, например, клеток, полученных из плюрипотентных клеток, описанных в настоящей заявке, и включая клетки от этапов 1, 2, 3, 4 и 5, как описано в d'Amour 2005 and 2006, выше. Таким образом, способы получения агрегатов клеток, описанных в настоящей заявке, не ограничиваются какой-либо одной плюрипотентной или мультипотентной клеткой или стадией клетки, но скорее способом применения и потребностью в оптимизации типа клеток, которые диктуют, какие способы являются предпочтительными.

Способы, описанные в настоящей заявке для получения агрегатных суспензионных культур плюрипотентных клеток, например, hES или iPS клеток, и клеток, полученных из других источников плюрипотентных клеток, например, эмбриональных зародышевых клеток или пратенотов, подробно описаны в PCT/US 2007/062755, поданной 23 февраля 2007, и озаглавленной «Compositions and methods for culturing differential cells» («Композиции и способы культивирования различных клеток») и PCT/US 2008/080516, поданной 20 октября, 2008, и озаглавленной «Methods and compositions for feeder-free pluripotent stem cell media containing human serum» («Способы и композиции для бесфидерных сред для плюрипотентных стволовых клеток, содержащих сыворотку человека»), которые полностью включены в настоящее описание посредством ссылки.

Способы, описанные в настоящей заявке, никоим образом не требуют предварительного покрытия сосудов для культивирования экстрацеллюлярным матриксом, например, как описано в патенте США №6,800,480, Bodnar et al., принадлежащем Geron Corporation. В некоторых вариантах осуществления, описанных в настоящей заявке, iPS клетки можно культивировать таким же способом, как и другие плюрипотентные стволовые клетки, например, hES и iPS клетки, которые культивируют с применением растворенной сыворотки человека, как подробно описано в патентной заявке США PCT/US 2008/080516, поданной 20 октября 2008, и озаглавленной «Methods and compositions for feeder-free pluripotent stem cell media containing human serum» («Способы и композиции для бесфидерных сред для плюрипотентных стволовых клеток, содержащих сыворотку человека»), полностью включенной в настоящее описание посредством ссылки.

Способы, описанные в настоящей заявке, никоим образом не требуют экзогенно добавленного фактора роста фибробластов (FGF) из иного источника, чем просто слой фидерных фибробластов, как описано в патенте США №7,005,252, Thomson, J., принадлежащем Wisconsin Alumni Research Foundation (WARF), полностью включенном в настоящее описание посредством ссылки.

Композиции мультипотентных и дифференцированных клеток

Композиции клеток, полученные посредством способов из настоящей заявки, включают культуры клеток, содержащие плюрипотентные стволовые клетки, клетки препервичной полоски, мезоэнтодермы, дефинитивной энтодермы, энтодермы передней части пищеварительного тракта, PDX1-позитивной энтодермы передней части пищеварительного тракта, PDX1-позитивной панкреатической энтодермы или PDX1/NKX6.1-co-позитивной панкреатической энтодермы, эндокринного предшественника или NGN3/NKX2.2-co-позитивного эндокринного предшественника, и гормон-секретирующие эндокринные клетки или INS, GCG, GHRL, SST, РР одинарно-позитивные эндокринные клетки, где по меньшей мере примерно 5-90% клеток в культуре являются полученными клетками препервичной полоски, мезоэнтодермы, дефинитивной энтодермы, энтодермы передней части пищеварительного тракта, PDX1-позитивной энтодермы передней части пищеварительного тракта, PDX1-позитивной панкреатической энтодермы или PDX1/NKX6.1-со-позитивной панкреатической энтодермы, эндокринного предшественника или NGN3/NKX2.2-co-позитивного эндокринного предшественника, и гормон-секретирующими эндокринными клетками или ENS, GCG, GHRL, SST, РР одинарно-позитивными эндокринными клетками.

Некоторые варианты осуществления, описанные в настоящей заявке, относятся к композициям, таким как популяции клеток и культуры клеток клеток, содержащие как плюрипотентные клетки, так и стволовые клетки, такие как стволовые клетки и iPS клетки, и мультипотентные клетки, такие как клетки препервичной полоски, мезоэнтодермы или дефинитивной энтодермы, а также более дифференцированные, но все еще потенциально мультипотентные клетки, такие как клетки PDX1-позитивной энтодермы передней части пищеварительного тракта, PDX1-позитивной панкреатической энтодермы или PDX1/NKX6.1-со-позитивной панкреатической энтодермы, эндокринного предшественника или NGN3/NKX2.2-co-позитивного эндокринного предшественника, и гормон-секретирующие эндокринные клетки или INS, GCG, GHRL, SST, РР одинарно-позитивные эндокринные клетки. Например, с применением способов, описанных в настоящей заявке, можно получить композиции, содержащие смеси плюрипотентных стволовых клеток и других мультипотентных или дифференцированных клеток. В некоторых вариантах осуществления получают композиции, содержащие по меньшей мере примерно 5 мультипотентных или дифференцированных клеток на каждые 95 плюрипотентных клеток. В других вариантах осуществления получают композиции, содержащие по меньшей мере примерно 95 мультипотентных или дифференцированных клеток на каждые 5 плюрипотентных клеток. Дополнительно подразумеваются композиции, содержащие другие отношения мультипотентных или дифференцированных клеток к плюрипотентным клеткам. Например, подразумеваются композиции, содержащие по меньшей мере 1 мультипотентную или дифференцированную клетку примерно на каждые 1,000,000 плюрипотентных клеток, по меньшей мере 1 мультипотентную или дифференцированную клетку примерно на каждые 100,000 плюрипотентных клеток, по меньшей мере 1 мультипотентную или дифференцированную клетку примерно на каждые 10,000 плюрипотентных клеток, по меньшей мере 1 мультипотентную или дифференцированную клетку примерно на каждые 1000 плюрипотентных клеток, по меньшей мере 1 мультипотентную или дифференцированную клетку примерно на каждые 500 плюрипотентных клеток, по меньшей мере 1 мультипотентную или дифференцированную клетку примерно на каждые 100 плюрипотентных клеток, по меньшей мере 1 мультипотентную или дифференцированную клетку примерно на каждые 10 плюрипотентных клеток, по меньшей мере 1 мультипотентную или дифференцированную клетку примерно на каждые 5 плюрипотентных клеток, и примерно на каждую 1 плюрипотентную клетку, и по меньшей мере примерно 1,000,000 мультипотентных или дифференцированных клеток примерно на каждую 1 плюрипотентную клетку.

Некоторые варианты осуществления, описанные в настоящей заявке, относятся ккультурам клеток или популяциям клеток, содержащим по меньшей мере примерно от 5% мультипотентных или дифференцированных клеток до 99% мультипотентных или дифференцированных клеток. В некоторых вариантах осуществления культуры клетоккультуры клеток или популяции клеток содержат клетки млекопитающих. В предпочтительных вариантах осуществления культуры клетоккультуры клеток или популяции клеток содержат клетки человека. Например, некоторые специфические варианты осуществления относятся ккультурам клеток, содержащим клетки человека, где по меньшей мере примерно от 5% до 99% от клеток человека являются мультипотентными или дифференцированными клетками. Другие варианты осуществления относятся ккультурам клеток, содержащим клетки человека, где по меньшей мере примерно 5%, по меньшей мере примерно 10%, по меньшей мере примерно 15%, по меньшей мере примерно 20%, по меньшей мере примерно 25%, по меньшей мере примерно 30%, по меньшей мере примерно 35%, по меньшей мере примерно 40%, по меньшей мере примерно 45%, по меньшей мере примерно 50%, по меньшей мере примерно 55%, по меньшей мере примерно 60%, по меньшей мере примерно 65%, по меньшей мере примерно 70%, по меньшей мере примерно 75%, по меньшей мере примерно 80%, по меньшей мере примерно 85%, по меньшей мере примерно 90%, по меньшей мере примерно 95%, по меньшей мере примерно 98%, по меньшей мере примерно 99%, или больше 99% клеток человека являются мультипотентными или дифференцированными клетками. В вариантах осуществления, где культуры клетоккультуры клеток или популяции клеток содержат фидерные клетки человека, вышеуказанные проценты рассчитывают по отношению к фидерным клеткам человека в культурах клеток.

Плюрипотентные, мультипотентные или дифференцированные клетки способны к дифференцировке, или дополнительной дифференцировке в клетки препервичной полоски, мезоэнтодермы, дефинитивной энтодермы, а также клетки, ткани и органы, происходящие из них. Клетки мезоэнтодермы способны к дифференцировке в клетки мезодермы и/или клетки дефинитивной энтодермы, а также клетки, ткани и/или органы, полученные из каждой из этих линий. В некоторых вариантах осуществления клетки препервичной полоски превращаются, через промежуточную мезоэнтодерму, в окончательно дифференцированные клетки линий мезодермы или дефинитивной энтодермы. Например, такие процессы могут обеспечить основу для эффективной получения тканей человека, полученных из энтодермы, таких как поджелудочная железа, печень, легкие, желудок, тонкая кишка, щитовидная железа, паращитовидная железа, тимус, глотка, желчный пузырь и мочевой пузырь. Важно, что получение клеток препервичной полоски и/или клеток мезоэнтодермы является ранним этапом дифференцировки плюрипотентной стволовой клетки в функциональную инсулин-продуцирующую β-клетку. В качестве другого примера, дифференцировка клеток препервичной полоски и/или клеток мезоэнтодермы может обеспечить основу для эффективной получения тканей человека, полученных из мезоэнтодермы, таких как клетки крови, сердечнососудистые ткани, скелетные ткани, а также другие структурные и соединительные ткани.

Композиции и способы, описанные в настоящей заявке, имеют некоторые полезные характеристики. Например, культуры клетоккультуры клеток и популяции клеток, включающие мультипотентные клетки, например, клетки препервичной полоски и/или клетки мезоэнтодермы, а также способы получения культур клеток и популяций клеток клеток, пригодны для моделирования ранних этапов развития человека. Далее, композиции и способы, описанные в настоящей заявке, можно также использовать для терапевтического вмешательства в патологические состояния, такие как сахарный диабет. Например, поскольку клетки препервичной полоски и/или мезоэнтодермальные клетки служат в качестве источника только ограниченного числа тканей, они могут служить для получения чистых тканей или типов клеток. В некоторых способов получения клеток препервичной полоски плюрипотентные клетки, используемые в качестве исходного материала, являются плюрипотентными стволовыми клетками, например, hES, hEG или iPS клетками.

Трофоэктодермальные клетки

С помощью способов, описанных в настоящей заявке, можно получить композиции, содержащие трофоэктодермальные клетки, по существу свободные от других типов клеток. В некоторых вариантах осуществления, описанных в настоящей заявке, трофоэктодермальные популяции клеток или культуры клеток, полученные способами, описанными в настоящей заявке, по существу имеют высокую экспрессию маркеров, выбранных из группы, состоящей из HAND1, Eomes, MASH2, ESXL1, HCG, KRT18, PSG3, SFXN5, DLX3, PSX1, ETS2 и ERRB генов, по сравнению с уровнями экспрессии HAND1, Eomes, MASH2, ESXL1, HCG, KRT18, PSG3, SFXN5, DLX3, PSX1, ETS2 и ERRB в не-трофоэктодермальных клетках или популяциях клеток.

Клетки препервичной полоски

С применением способов, описанных в настоящей заявке, можно получить композиции, содержащие клетки препервичной полоски, по существу свободные от других типов клеток. В некоторых вариантах осуществления, описанных в настоящей заявке, популяции или культуры клеток препервичной полоски, полученные способами, описанным в настоящей заявке, по существу экспрессируют FGF8 и/или NODAL маркерные гены, по сравнению с BRACHURYlow, FGF4 low, SNAI1 low, SOX17 low, FOXA2 low, SOX7 low и SOX1 low.

Экстраэмбриональные клетки

С применением способов, описанных в настоящей заявке, можно получить композиции, содержащие экстраэмбриональные клетки, по существу свободные от других типов клеток. Клетки примитивной, висцеральной и париетальной энтодермы являются экстраэмбриональными клетками. Клетки примитивной энтодермы дают начало клеткам висцеральной и париетальной энтодермы. Клетки висцеральной энтодермы являются энтодермальными клетками, которые образуют часть желточного мешка. Функцией клеток висцеральной энтодермы является захват и транспорт нутриентов. Клетки париетальной энтодермы соприкасаются с экстраэмбриональной тканью, известной как мембрана Рейхерта. Одной из ролей клеток париетальной энтодермы является продукция компонентов базальной мембраны. Вместе клетки висцеральной энтодермы и клетки париетальной энтодермы образуют то, что часто обозначают как экстраэмбриональная энтодерма. Как предполагает наименование, клетки экстраэмбриональной энтодермы не дают начало эмбриональным структурами, образуемым при развитии. Напротив, клетки дефинитивной энтодермы и другие клетки энтодермальных линий или панкреатических линий, описанные в настоящей заявке, являются эмбриональными или полученными из эмбриональных клеток, и дают начало тканям, которые получены из кишечной трубки, образуемой при развитии эмбриона. В некоторых вариантах осуществления, описанных в настоящей заявке, популяции или культуры экстраэмбриональных клеток, полученных способами, описанными в настоящей заявке, по существу имеют высокую экспрессию маркеров, выбранных из группы, состоящей из генов SOX7, SOX17, THBD, SPARC, DAB1, HNF4alpha или AFP, по сравнению с уровнями экспрессии по меньшей мере SOX7, SOX17, THBD, SPARC, DAB1 или AFP, которые на экспрессируются в других типах клеток или популяций клеток, например, дефинитивной энтодерме.

Мезоэнтодермальные клетки

С применением способов, описанных в настоящей заявке, можно получить композиции, содержащие мезоэнтодермальные клетки, по существу свободные от других типов клеток. В некоторых вариантах осуществления, описанных в настоящей заявке, популяции или культуры мезоэнтодермальных клеток, полученные способами, описанным в настоящей заявке, по существу имеют высокую экспрессию маркеров, выбранных из группы, состоящей из FGF4, SNAI1 MIXL1 и/или WNT3 маркерных генов, по сравнению с SOX17 low, CXCR4 low, FOXA2 low, SOX7 low и SOX1 low.

Способы скрининга

В некоторых вариантах осуществления применяются способы скрининга для получения определенных популяций клеток, включающих плюрипотентные, мультипотентные и/или дифференцированные клетки, такие как плюрипотентные стволовые клетки человека, индуцированные плюрипотентные стволовые клетки, клетки препервичной полоски, мезоэнтодермальные клетки, клетки дефинитивной энтодермы, клетки энтодермы передней части пищеварительного тракта или PDX1-негативные клетки энтодермы передней части пищеварительного тракта, PDX1-позитивные клетки энтодермы передней части пищеварительного тракта или PDX1-позитивные панкреатические энтодермальные клетки или панкреатические прогениторные клетки, эндокринные клетки-предшественники, и/или эндокринные клетки. Популяция клеток затем обеспечивается потенциальным фактором дифференцировки. В первый момент времени, который отмечается до или примерно в то же время, что и обеспечение потенциального фактора дифференцировки, определяют экспрессию маркера. Альтернативно, экспрессию маркера можно определить после обеспечения потенциального фактора дифференцировки. Во второй момент времени, который отмечается после первого момента времени и после этапа обеспечения потенциального фактора дифференцировки популяции клеток, вновь определяют экспрессию того же самого маркера. Определяют, способен ли потенциальный фактор дифференцировки к стимуляции дифференцировки панкреатических клеток-предшественников, путем сравнения экспрессии маркера в первый момент времени с экспрессией маркера во второй момент времени. Если экспрессия маркера во второй момент времени повышается или снижается, по сравнению с экспрессией маркера в первый момент времени, то потенциальный фактор дифференцировки способен к стимуляции дифференцировки панкреатических прогениторных клеток.

Некоторые варианты осуществления способов скрининга, описанных в настоящей заявке, используют популяции или культуры клеток, содержащие клетки дефинитивной энтодермы человека, PDX-1 негативные клетки энтодермы передней части пищеварительного тракта, PDX-1 позитивные клетки энтодермы передней части пищеварительного тракта, PDX-1 позитивные панкреатические энтодермальные клетки, или панкреатические прогениторные клетки или эндокринные клетки-предшественники. Например, популяция клеток может быть по существу очищенной популяцией PDX-1 позитивных панкреатических энтодермальных клеток или панкреатических прогениторных клеток. Например, популяция клеток может быть обогащенной популяцией панкреатических прогениторных клеток человека, где по меньшей мере 50%-97% клеток человека в популяции клеток являются панкреатическими клетками-предшественниками человека, остаток включает эндокринные предшественники или эндокринные клетки и другие типы клеток.

В вариантах осуществления способов скрининга, описанных в настоящей заявке, популяция клеток контактирует или иным образом обеспечена потенциальным (тестируемым) фактором дифференцировки. Потенциальный фактор дифференцировки может содержать любую молекулу, которая может обладать потенциалом стимуляции дифференцировки любой из вышеупомянутых клеток, например, панкреатических клеток-предшественников человека. В некоторых вариантах осуществления, описанных в настоящей заявке, потенциальный фактор дифференцировки включает молекулу, которая известна как фактор дифференцировки для одного или нескольких типов клеток. В альтернативных вариантах осуществления потенциальный фактор дифференцировки включает молекулу, которая неизвестна как стимулятор дифференцировки клеток. В предпочтительных вариантах осуществления потенциальный фактор дифференцировки включает молекулу, которая неизвестна как стимулятор дифференцировки панкреатических клеток-предшаственников человека.

В некоторый вариантах осуществления способов скрининга, описанных в настоящей заявке, потенциальный фактор дифференцировки включает малую молекулу. В предпочтительных вариантах осуществления малая молекула является молекулой, имеющей молекулярную массу примерно 10,000 а.е.м. или меньше.

В других вариантах осуществления, описанных в настоящей заявке, потенциальный фактор дифференцировки содержит большую молекулу, например, полипептид. Полипептид может быть любым полипептидом, включая гликопротеин, липопротеин, белок экстрацеллюлярного матрикса, цитокин, хемокин, пептидный гормон, интерлейкин или фактор роста, но не ограничиваясь ими. Предпочтительные полипептиды включают факторы роста.

В некоторых вариантах осуществления способов скрининга, описанных в настоящей заявке, потенциальные факторы дифференцировки включают один или несколько факторов роста, выбранных из группы, состоящей из амфирегулина, стимулятора В-лимфоцитов, ИЛ-16, тимопоэтина, TRAIL/Аро-2, пре-В-клеточного колониестимулирующего фактора, фактора, связанного с дифференцировкой эндотелия 1 (EDF1), эндотелиального моноцит-активирующего полипептида II; фактора, ингибирующего миграцию макрофагов (MIF); фактора, усиливающего естественные киллерные клетки (NKEFA); костного морфогенетического белка 2, костного морфогенетического белка 8 (остеогенного белка 2), костного морфогенетического белка 6, костного морфогенетического белка 7, фактора роста соединительной ткани (CTGF), CGI-149 белка (нейроэндокринного фактора дифференцировки), цитокина A3 (макрофагального воспалительного белка 1-альфа); белка, связанного с дифференцировкой клеток глиобластомы (GBDR1), фактора роста из гепатомы, предшественника нейромедина U-25, фактора роста эндотелия сосудов (VEGF), фактора роста эндотелия сосудов В (VEGF-B), Т-клеточно-специфического предшественника RANTES; фактора, полученного из дендритных клеток тимуса - 1; трансферрина, интерлейкина-1 (IL 1), интерлейкина-2 (IL 2), интерлейкина-3 (IL 3), интерлейкина-4 (IL 4), интерлейкина-5 (IL 5), интерлейкина-6 (IL 6), интерлейкина-7 (IL 7), интерлейкина-8 (IL 8), интерлейкина-9 (IL 9), интерлейкина-10 (IL 10), интерлейкина-11 (IL 11), интерлейкина-12 (IL 12), интерлейкина-13 (IL 13), гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (G-CSF), гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (GM-CSF), макрофагального колониестимулирующего фактора (M-CSF), эритропоэтина, тромбопоэтина, витамина D3, эпидермального фактора роста (EGF), нейротрофического фактора головного мозга; фактора, ингибирующего лейкемию; тиреоидного гормона, основного фактора роста фибробластов (bFGF), aFGF, FGF-4, FGF-6, FGF-7/фактора роста кератиноцитов (KGF), тромбоцитарного фактора роста (PDGF), тромбоцитарного фактора роста-ВВ, β-фактора роста нервов, активина А, трансформирующего фактора роста β1 (ΤGFβ1), интерферона-α, интерферона-β, интерферона-γ, фактора некроза опухоли-α, фактора некроза опухоли-β, бурст-промоторной активности (ВРА), эритроидной промоторной активности (ЕРА), PGE2, инсулиноподобного фактора роста-1 (IGF-1), IGF-II, фактора роста нервов (NGF), нейтрофина-3, нейтрофина 4/5, цилиарного нейротрофического фактора, глиального нексина, дексаметазона, β-меркаптоэтанола, ретиноевой кислоты, бутилированного гидроксианизола, 5-азацитидина, амфотерицина В, аскорбиновой кислоты, аскорбата, изобутилксантина, индометацина, β-глицерофосфата, никотинамида, ДМСО, тиазолидиндионов, TWS119, окситоцина, вазопрессина, меланоцитостимулирующего гормона, кортикотропина, липотропина, тиротропина, гормона роста, пролактина, лютеинизирующего гормона, хорионического гонадотропина человека, фолликулостимулирующего гормона, кортиколиберина, гонадолиберина, пролактолиберина, пролактин-ингибирующего фактора, соматолиберина, соматостатина, тиреолиберина; пептида, кодируемого геном кальцитонина; паратиреоидного гормона, глюкагоноподобного пептида-1, глюкозозависимого инсулинотропного пептида, гастрина, секретина, холецистокинина, мотилина, вазоактивного интестинального пептида, субстанции Р, панкреатического полипептида, пептида тирозин-тирозин, нейропептида тирозина, инсулина, глюкагона. плацентарного лактогена, релаксина, ангиотензина II, кальцитриола, предсердного натрийуретического пептида, и мелатонина, тироксина, трийодтиронина, кальцитонина, эстрадиола, эстрона, прогестерона, тестостерона, кортизола, кортикостерона, альдостерона, эпинефрина, норэпинефрина, андростена, кальцитриола, коллагена, дексаметазона, β-меркаптоэтанола, ретиноевой кислоты, бутилированного гидроксианизола, 5-азацитидина, амфотерицина В, аскорбиновой кислоты, аскорбата, изобутилксантина, индометацина, β-глицерофосфата, никотинамида, ДМСО, тиазолидиндионов, и TWS119.

В некоторых вариантах осуществления способов скрининга, описанных в настоящей заявке, потенциальный фактор дифференцировки обеспечивается для популяции клеток в одной или нескольких концентрациях. В некоторых вариантах осуществления потенциальный фактор дифференцировки обеспечивается для популяции клеток так, чтобы концентрация потенциального фактора дифференцировки в среде, окружающей клетки, была в диапазоне примерно от 0,1 нг/мл до 10 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления концентрация потенциального фактора дифференцировки в среде, окружающей клетки, находится в диапазоне примерно от 1 нг/мл до 1 мг/мл. В других вариантах осуществления концентрация потенциального фактора дифференцировки в среде, окружающей клетки, находится в диапазоне примерно от 10 нг/мл до 100 мкг/мл. В других вариантах осуществления концентрация потенциального фактора дифференцировки в среде, окружающей клетки, находится в диапазоне примерно от 100 нг/мл до 10 мкг/мл. В предпочтительных вариантах осуществления концентрация потенциального фактора дифференцировки в среде, окружающей клетки, находится в диапазоне примерно от 5 нг/мл до 1000 мкг/мл.

В некоторых вариантах осуществления этапы способов скрининга, описанных в настоящей заявке, включают определение экспрессии по меньшей мере одного маркера в первый момент времени и второй момент времени. В некоторых из этих вариантов осуществления первый момент времени может быть до или примерно в то же самое время, что и обеспечение популяции клеток потенциальным фактором дифференцировки. Альтернативно, в некоторых вариантах осуществления первый момент времени отмечается после обеспечения популяции клеток потенциальным фактором дифференцировки. В некоторых вариантах осуществления экспрессию множества маркеров определяют в первый момент времени.

В дополнение к определению экспрессии по меньшей мере одного маркера в первый момент времени, некоторые варианты осуществления способов скрининга, обеспеченные в настоящей заявке, подразумевают определение экспрессии по меньшей мере одного маркера во второй момент времени, после второго момента времени, и который отмечается после обеспечения популяции клеток потенциальным фактором дифференцировки. В таких вариантах осуществления экспрессию того же самого маркера определяют и в первый, и во второй момент времени. В некоторых вариантах осуществления экспрессию множества маркеров определяют и в первый, и во второй момент времени. В таких вариантах осуществления экспрессию одного и того же множества маркеров и в первый, и во второй момент времени. В некоторых вариантах осуществления экспрессию маркеров определяют во множестве моментов времени, каждый из которых отмечается после первого момента времени, и каждый из которых отмечается после обеспечения популяции клеток потенциальным фактором дифференцировки. В некоторых вариантах осуществления экспрессию маркеров определяют путем Q-PCR. В других вариантах осуществления экспрессию маркеров определяют с помощью иммунохимии.

В некоторых вариантах осуществления способов скрининга, описанных в настоящей заявке, маркер, чью экспрессию определяют в первый и второй моменты времени, является маркером, связанным с дифференцировкой панкреатических прогениторных клеток в клетки, являющиеся предшественниками окончательно дифференцированных клеток, которые образуют ткани панкреатических островков. Такие клетки могут включать незрелые гормон-экспрессирующие клетки панкреатических островков.

В некоторых вариантах осуществления способов скрининга, обеспеченных в настоящей заявке, обеспечивается достаточное время между обеспечением популяции клеток потенциальным фактором дифференцировки и определением экспрессии маркера во второй момент времени. Достаточное время между обеспечением популяции клеток потенциальным фактором дифференцировки и определением экспрессии маркера во второй момент времени может составлять от всего лишь примерно 1 час вплоть до примерно 10 дней. В некоторых вариантах осуществления экспрессию по меньшей мере одного маркера определяют много раз после обеспечения популяции клеток потенциальным фактором дифференцировки. В некоторых вариантах осуществления достаточное время составляет по меньшей мере примерно 1 час, по меньшей мере примерно 6 часов, по меньшей мере примерно 12 часов, по меньшей мере примерно 16 часов, по меньшей мере примерно 1 сутки, по меньшей мере примерно 2 суток, по меньшей мере примерно 3 суток, по меньшей мере примерно 4 суток, по меньшей мере примерно 5 суток, по меньшей мере примерно 6 суток, по меньшей мере примерно 7 суток, по меньшей мере примерно 8 суток, по меньшей мере примерно 9 суток, по меньшей мере примерно 10 суток, по меньшей мере примерно 11 суток, по меньшей мере примерно 12 суток, по меньшей мере примерно 13 суток, по меньшей мере примерно 14 суток, по меньшей мере примерно 1 неделю, по меньшей мере примерно 2 недели, по меньшей мере примерно 3 недели, по меньшей мере примерно 4 недели, по меньшей мере примерно 5 недель, по меньшей мере примерно 6 недель, по меньшей мере примерно 7 недель, или по меньшей мере примерно 8 недель.

В некоторых вариантах осуществления способов, описанных в настоящей заявке, дополнительно определяют, повышается или снижается ли экспрессия маркера во второй момент времени по сравнению с экспрессией этого маркера в первый момент времени. Повышение или снижение экспрессии по меньшей мере одного маркера указывает, что потенциальный фактор дифференцировки способен к стимуляции дифференцировки эндокринных клеток-предшественников. Подобным образом, если определяют экспрессию множества маркеров, дополнительно определяют, повышается или снижается ли экспрессия множества маркеров во второй момент времени по сравнению с экспрессией этого множества маркеров в первый момент времени. Повышение или снижение множества маркеров можно определить путем измерения или иной оценки количества, уровня или активности маркера в популяции клеток в первый и второй моменты времени. Такое определение может быть относительным по другим маркерам, например, экспрессии конститутивных генов, или абсолютным. В некоторых вариантах осуществления, где экспрессия маркера повышается во второй момент времени, по сравнению с первым моментом времени, повышение является по меньшей мере примерно 2-кратным, по меньшей мере примерно 5-кратным, по меньшей мере примерно 10-кратным, по меньшей мере примерно 20-кратным, по меньшей мере примерно 30-кратным, по меньшей мере примерно 40-кратным, по меньшей мере примерно 50-кратным, по меньшей мере примерно 60-кратным, по меньшей мере примерно 70-кратным, по меньшей мере примерно 80-кратным, по меньшей мере примерно 90-кратным, по меньшей мере примерно 100-кратным, или более чем по меньшей мере примерно 100-кратным. В некоторых вариантах осуществления повышение является менее чем 2-кратным. В вариантах осуществления, где экспрессия маркеров снижается во второй момент времени, по сравнению с первым моментом времени, снижение является по меньшей мере примерно 2-кратным, по меньшей мере примерно 5-кратным, по меньшей мере примерно 10-кратным, по меньшей мере примерно 20-кратным, по меньшей мере примерно 30-кратным, по меньшей мере примерно 40-кратным, по меньшей мере примерно 50-кратным, по меньшей мере примерно 60-кратным, по меньшей мере примерно 70-кратным, по меньшей мере примерно 80-кратным, по меньшей мере примерно 90-кратным, по меньшей мере примерно 100-кратным, или более чем по меньшей мере примерно 100-кратным. В некоторых вариантах осуществления снижение является менее чем 2-кратным.

Мониторинг получения мультипотентных или дифференцированных клеток

Развитие плюрипотентных клеток в мультипотентные клетки, другие мультипотентные клетки или дифференцированные клетки, такие как панкреатические прогениторы или эндокринные гормон-секретирующие клетки, можно контролировать путем определения экспрессии маркеров, характерных для специфических клеток, включая генетические маркеры и фенотипические маркеры, такой как экспрессия островковых гормонов и процессинг проинсулина в инсулин и С-пептид в эндокринных клетках. В некоторых способах экспрессию некоторых маркеров определяют путем детекции присутствия и отсутствия маркера. Альтернативно, экспрессию некоторых маркеров можно определить путем измерения уровня, в котором маркер присутствует в клетках или культуре клеток или популяции клеток. Например, в некоторых способах определяют экспрессию маркеров, характерных для незрелых гормон-экспрессирующих клеток панкреатических островков, а также отсутствие существенной экспрессии маркеров, характерных для плюрипотентных клеток, клеток дефинитивной энтодермы, энтодермы передней части пищеварительного тракта, PDX1-позитивной энтодермы передней части пищеварительного тракта, эндокринных предшественников, клеток экстраэмбриональной энтодермы, мезодермы, эктодермы, зрелых гормон-экспрессирующих клеток панкреатических островков и/или других типов клеток.

Как описано в связи с мониторингом получения других менее дифференцированных типов клеток линии дефинитивной энтодермы, можно применять качественные или полуколичественные методики, такие как способы блоттинга и иммунохимии, для измерения экспрессии маркера. Альтернативно, можно провести точное количественное определение экспрессии маркера с помощью такой методики, как Q-PCR. Кроме того, необходимо понимать, что на полипептидном уровне многие из маркеров гормон-экспрессирующих клеток панкреатических островков секретируют белки. Таким образом, можно применять методики для измерения содержания экстрацеллюлярного маркера, такие как ИФА.

Например, в одном варианте осуществления PDX1 является маркерным геном, ассоциированным с PDX1-позитивной энтодермой передней части пищеварительного тракта. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения определяют экспрессию PDX1. В других вариантах осуществления также определяют экспрессию других маркеров, которые экспрессируются в PDX1-позитивной энтодерме передней части пищеварительного тракта, включая SOX17, HNF6, SOX9 и PROX1, но не ограничиваясь ими. Поскольку PDX1 может также экспрессироваться некоторыми другими типами клеток (т.е. висцеральной энтодермой и определенной нейральной эктодермой), некоторые варианты осуществления настоящего изобретения относятся к демонстрации отсутствия или по существу отсутствия экспрессии маркерного гена, связанного с висцеральной энтодермой и/или нейральной эктодермой. Например, в некоторых вариантах осуществления определяют экспрессию маркеров, которые экспрессируются клетками висцеральной энтодермы и/или нервными клетками, включая SOX7, AFP, SOX1, ZIC1 и/или NFM, но не ограничиваясь ими.

В некоторых вариантах осуществления культуры PDX1-позитивных клеток передней части пищеварительного тракта, полученные посредством способов, описанных в настоящей заявке, по существу свободны от клеток, экспрессирующих SOX7, AFP, SOX1, ZIC1 или NFM маркерные гены. В некоторых вариантах осуществления культуры PDX1-позитивных клеток передней части пищеварительного тракта, полученные посредством способов, описанных в настоящей заявке, по существу свободны от клеток висцеральной энтодермы, париетальной энтодермы и/или нервных клеток.

Прогрессирование развития плюрипотентных клеток, описанных в настоящей заявке (например, клеток, полученных в результате стадий или этапов 1-5, как описано в D'Amour et al. 2006, выше), можно контролировать путем определения экспрессии маркеров, характерных для каждого из типов клеток, полученных из hES или iPS клеток по отдельности на пути развития. В некоторых способах идентификацию и характеристику типа клеток, полученных из hES или iPS клеток, осуществляют по экспрессии определенного маркера или различных уровней и характеров экспрессии более чем одного маркера. Таким образом, наличие или отсутствие, высокая или низкая экспрессия одного или нескольких маркеров определяет и идентифицирует тип клеток. Также некоторые маркеры могут иметь временную экспрессию, где маркер высоко экспрессируется на одной стадии развития, и плохо экспрессируется на другой стадии развития. Экспрессию некоторых маркеров можно определить путем измерения уровня, на котором маркер присутствует в клетках из культуры клеток или популяции клеток, по сравнению со стандартизованным или нормализованным контрольным маркером. В таких способах измерение экспрессии маркера может быть качественным или количественным. Один способ количественного определения экспрессии маркеров, продуцируемых маркерными генами, осуществляют путем применения количественной ПЦР (Q-PCR). Способы осуществления Q-PCR хорошо известны в данной области техники.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения наличие, отсутствие и/или уровень экспрессии маркера определяют путем количественной ПЦР (Q-PCR). Например, количество транскрипта, продуцируемого некоторыми генетическими маркерами, такими как SOX17, CXCR4, ОСТ4, AFP, ТМ, SPARC, SOX7, CDX2, MIXL1, GATA4, HNF3β, HNF4alpha, GSC, FGF17, VWF, CALCR, FOXQ1, CMKOR1, CRIP1 и другими маркерами, описанными в настоящей заявке, определяют путем количественной Q-PCR.

В других вариантах осуществления иммунохимию применяют для детекции белков, экспрессируемых вышеупомянутыми генами. В других вариантах осуществления Q-PCR может применяться в сочетании с иммуногистохимическими методиками или методиками проточной цитометрии для эффективной и точной характеристики и идентификации количества и относительных пропорций таких маркеров в исследуемого типа клеток. В одном варианте осуществления Q-PCR позволяет количественно определить уровень экспрессии РНК в культуре клеток, содержащей смешанную популяцию клеток. Однако Q-PCR не позволяет предположить или оценить, имеется ли совместная экспрессия маркеров или белков в одной и той же клетке. В другом варианте осуществления Q-PCR применяют в сочетании со способами проточной цитометрии для характеристики и идентификации типов клеток. Таким образом, с применением комбинации способов, описанных в настоящей заявке, и таких как те, которые описаны выше, можно осуществить и продемонстрировать полную характеристику и идентификацию различных типов клеток, включая типы клеток энтодермальной линии.

Например, в одном предпочтительном варианте осуществления панкреатические прогениторы или клетки панкреатической энтодермы или PDX-1-позитивные клетки панкреатической энтодермы, экспрессирующие по меньшей мере PDX1, Nkx6.1, PTF1A, CPA и/или cMYC, как показано Q-PCR и/или ICC, по меньшей мере совместно экспрессирующие PDX1 и Nkx6.1 как показано ICC, и не экспрессирующие другие маркеры, включая SOX17, CXCR4 или CER, идентифицируются как PDX1-позитивные экспрессирующие клетки. Подобным образом, для надлежащей идентификации зрелых гормон-секретирующих панкреатических клеток, in vitro или in vivo, например, показано, что С-пептид (продукт надлежащего процессинга проинсулина в зрелой и функционирующей β клетке) и инсулин совместно экспрессируются, посредством ICC, в инсулин-секретирующей клетке.

Другие способы, известные в данной области техники, можно также применять для количественного определения экспрессии маркерного гена. Например, можно выявить экспрессию продукта маркерного гена с применением антител, специфичных для интересующего продукта маркерного гена (например, посредством вестерн-блоттинга, проточной цитометрии, и тому подобного). В некоторых способах определяют экспрессию маркерных генов, характерных для клеток, полученных из hES, а также отсутствие существенной экспрессии маркерных генов, характерных для клеток, полученных из hES. Другие способы характеристики и идентификации типов клеток, полученных из hES, описаны в родственных заявках, как указано выше, которые полностью включены в настоящее описание посредством ссылки.

Комбинации зонда/праймера для амплификации, пригодные для применения в амплификационных тестах, включают следующее: инсулин (INS) (GenBank NM_000207): праймеры (SEQ ID №: 1); (SEQ ID NO: 2); Nkx6.1 (NM_006168): праймеры (SEQ ID №: 3); (SEQ ID №: 4); Pdx1 (NM_000209): праймеры (SEQ ID NO: 5); (SEQ ID №: 6); Ngn3 (NM_020999): праймеры (SEQ ID №: 7); (SEQ ID №: 8); FOXA2 (HNF3B) (NM_021784): праймеры (SEQ ID №: 9); (SEQ ID №: 10); глюкагон (GCG) (NM_002054): праймеры (SEQ ID №: 11); (SEQ ID №: 12); HNF6 (NM_030712): праймеры (SEQ ID №: 13); (SEQ ID №: 14); HNF4Alpha (NM_000457): праймеры (SEQ ID №: 15); (SEQ ID №: 16); Soxl7 (NM_022454): праймеры (SEQ ID №: 17); (SEQ ID №: 18); HLxB9 (NM_005515): праймеры (SEQ ID №: 19); (SEQ ID №: 20); Nkx2.2 (NM_002509): праймеры (SEQ ID №: 21); (SEQ ID №: 22); PTF1a (NM_178161): праймеры (SEQ ID №: 23) (SEQ ID №: 24); SST (NM_001048): праймеры (SEQ ID №: 25); (SEQ ID №: 26); PAX6 (NM_000280): праймеры (SEQ ID №: 27); (SEQ ID №: 28); Oct4 праймеры: (SEQ ID №: 29) (SEQ ID №: 30); MIXL1 праймеры (SEQ ID №: 31) (SEQ ID №; 32); GATA4 праймеры (SEQ ID №: 33) (SEQ ID №: 34); GSC праймеры (SEQ ID №: 35) (SEQ ID №: 36); CER праймеры (SEQ ID №: 37) (SEQ ID №: 38); AFP праймеры (SEQ ID №: 39) (SEQ ID №: 40); SOX1 праймеры (SEQ ID №: 41) (SEQ ID №: 42); ZIC1 праймеры (SEQ ID №: 43) (SEQ ID №: 44); NFM праймеры (SEQ ID №: 45) (SEQ ID №: 46). Другие праймеры доступны через ABI Taqman, включая FGF17 (Hs00182599_m1), VWF (Hs00169795_m1), CMKOR1 (Hs00604567_m1), CRIP1 (Hs00832816_g1), FOXQ1 (Hs00536425_s1), CALCR (Hs00156229_m1) и CHGA (Hs00154441_m1).

Обобщение получения PDX1-позитивной панкреатической энтодермы (Стадии 1-4) и получения инсулина in vivo

Способы получения определенных клеток энтодермальной линии и панкреатической энтодермальной линии обеспечены в настоящей заявке, и обсуждаются далее в других родственных заявках, таких как заявка США №11/773,944, озаглавленная «Способы получения панкреатических гормонов», поданная 5 июля 2007, которая является частичным продолжением патентной заявки США №11/681,687, озаглавленной «Эндокринные клетки-предшественники, панкреатические гормон-экспрессирующие клетки и способы их получения», поданной 2 марта 2007; которые полностью включены в настоящее описание посредством ссылки.

Вкратце, способы направленной дифференцировки для плюрипотентных стволовых клеток, например, hES и iPS, могут быть описаны по меньшей мере четырьмя или пятью стадиями. Стадия 1 является стадией получения дефинитивной энтодермы из плюрипотентных стволовых клеток, и занимает от 2 до 5 суток, предпочтительно от 2 до 3 суток. Плюрипотентные стволовые клетки суспендируют в средах, содержащих RPMI, фактор роста, являющийся членом суперсемейства TGFβ, такой как активин А, активин В, GDF-8 или GDF-11 (100 нг/мл), член семейства Wnt или активатор Wnt пути, такой Wnt3a (25 нг/мл), и альтернативно, ингибитор rho-киназы или ROCK, такой как Y-27632 (10 мкМ) для усиления роста, выживания и пролиферации, а также индукции адгезии клеток. Спустя примерно 24 часа среды заменяют на среды, содержащие RPMI с сывороткой, такой как 0,2% FBS, и фактор роста, являющийся членом суперсемейства TGFβ, такой как активин А, активин В, GDF-8 или GDF-11 (100 нг/мл), и альтернативно, ингибитор rho-киназы или ROCK еще на 24 (день 1) или 48 часов (день 2). Альтернативно, спустя примерно 24 часа в среде, содержащей активин/ Wnt3a, клетки культивируют еще 24 часа в среде, содержащей один активин (т.е. в среде, не содержащей Wnt3a). Важно, что получение дефинитивной энтодермы требует условий культивирования клеток с низким содержанием сыворотки, и таким образом, с низким содержанием инсулина или инсулиноподобного фактора роста. См. McLean et al. (2007) Stem Cells 25: 29-38, полностью включенную в настоящее описание посредством ссылки. McLean et al. также показали, что обеспечение контакта hES клеток с инсулином в концентрациях всего 0,2 мкг/мл на Стадии 1 может быть вредным для получения дефинитивной энтодермы. Другие специалисты в данной области техники модифицировали Стадию 1 дифференцировки плюрипотентных клеток в дефинитивную энтодерму по существу так, как описано в настоящей заявке и в D'Amour et al. (2005), например, по меньшей мере, в Agarwal et al., «Efficient Differentiation of Functional Hepatocytes from Human Embryonic Stem Cells», Stem Cells (2008) 26: 1117-1127 («Эффективная дифференцировка функциональных гепатоцитов из эмбриональных стволовых клеток человека»); Borowiak et al., «Small Molecules Efficiently Direct Endodermal Differentiation of Mouse and Human Embryonic Stem Cells», (2009) Cell Stem Cell 4: 348-358 («Малые молекулы эффективно направляют энтодермальную дифференцировку эмбриональных стволовых клеток мыши и человека»); и Brunner et al., «Distinct DNA methylation patterns characterize differentiated human embryonic stem cells and developing human fetal liver», (2009) Genome Res. 19: 1044-1056 («Отличающийся характер метилирования ДНК характеризует дифференцированные эмбриональные стволовые клетки человека и развивающуюся фетальную печень человека»). Надлежащая дифференцировка, спецификация, характеристика и идентификация определителя необходимы для получения других клеток энтодермальной линии. Клетки дефинитивной энтодермы на этой стадии совместно экспрессируют SOX17 и HNF3β (FOXA2), и не экспрессируют ощутимо по меньшей мере HNF4alpha, HNF6, PDX1, SOX6, PROX1, PTF1A, CPA, cMYC, NKX6.1, NGN3, РАХ3, ARX, NKX2.2, INS, GSC, GHRL, SST или PP.

Стадия 2 принимает культуру клеток дефинитивной энтодермы со стадии 1 и продуцирует энтодерму передней части пищеварительного тракта или PDX1-негативной энтодермы передней части пищеварительного тракта путем инкубации суспензионных культур с RPMI с низкими уровнями сыворотки, такими как 0,2% FBS, в разведении ITS 1:1000, 25 нг KGF (или FGF7), и альтернативно ROCK ингибитором в течение 24 часов (день 2 - день 3) для усиления роста, выживания, пролиферации и стимуляции адгезии клеток. Спустя 24 часа (день 3 - день 4), среду заменяют на ту же самую среду минус ингибитор TGFβ, но альтернативно с ROCKингибитором для усиления роста, выживания и пролиферации клеток, еще на 24 часа (день 4 - день 5) или 48 часов (день 6). Критическим этапом для надлежащей спецификации энтодермы передней части пищеварительного тракта является удаление факторов роста семейства TGFβ. Таким образом, ингибитор TGFβ можно добавить на Стадии 2 культур клеток, такой как 2,5 мкМ ингибитор TGFβ №4, или 5 мкМ SB431542, специфический ингибитор киназы, подобной рецептору активина (ALK), который является рецептором TGFβ I типа. Клетки энтодермы передней части пищеварительного тракта или PDX1-негативной энтодермы передней части пищеварительного тракта, полученные со Стадии 2, совместно экспрессируют SOX17, HNF1β и HNF4alpha и не проявляют выраженной совместной экспрессии по меньшей мере ни SOX17 и HNF3β (FOXA2), ни HNF6, PDX1, SOX6, PROX1, PTF1A, CPA, cMYC, NKX6.1, NGN3, РАХ3, ARX, NKX2.2, INS, GSC, GHRL, SST, или PP, которые являются отличительной чертой дефинитивной энтодермы, PDX1-позитивной панкреатической энтодермы или панкреатических прогениторных клеток или эндокринных предшественников, а также клеток одно- или полигормонального типа.

Стадия 3 (дни 5-8) принимает культуру клеток энтодермы передней части пищеварительного тракта со Стадии 2 и продуцирует клетки PDX1-позитивной энтодермы передней части пищеварительного тракта с помощью DMEM или RPMI в 1% В27, 0,25 мкМ KAAD циклопамина, ретиноида, такого как 0.2 мкМ ретиноевой кислоты (RA) или аналога ретиноевой кислоты, такого как 3 нМ TTNPB, и 50 нг/мл Noggin в течение примерно 24 (день 7) - 48 часов (день 8). В частности, авторы заявки применяли DMEM с высоким содержанием глюкозы примерно с 2003, и все патентные и не-патентные источники, раскрытые к настоящему времени, применяли DMEM с высоким содержанием глюкозы, даже если не упоминалось «DMEM с высоким содержанием глюкозы» и тому подобное. Это отчасти обусловлено тем, что производители, такие как Gibco, не называют их среду DMEM как таковую, например DMEM (Кат. №11960) и Knockout DMEM (Кат. №10829). Это заслуживает внимания, поскольку на момент подачи настоящей заявки Gibco поставляет большую часть DMEM продуктов, но еще не указывает «высокое содержание глюкозы» в некоторых из своих DMEM продуктов, содержащих высокое количество глюкозы, например, Knockout DMEM (Кат. №10829-018). Таким образом, можно предположить, что в каждом случае, когда описывается DMEM, это означает DMEM с высоким содержанием глюкозы, и это понятно другим специалистам, проводящим исследования и разработки в данной области техники. Вновь, ROCK ингибитор или ингибитор rho-киназы, такой как Y-27632, можно применять для усиления роста, выживания, пролиферации и стимуляции адгезии клеток. PDX1-позитивные клетки передней части пищеварительного тракта, полученные со Стадии 3, совместно экспрессируют PDX1 и HNF6, а также SOX9 и PROX, и не проявляют заметной экспрессии маркеров, характерных для клеток дефинитивной энтодермы или энтодермы передней части пищеварительного тракта (PDX1-негативной энтодермы передней части пищеварительного тракта) или PDX1-позитивной энтодермы передней части пищеварительного тракта, как описано на Стадиях 1 и 2.

Стадия 4 (дни 8-14) принимает среды от Стадии 3 и заменяет их на среды, содержащие DMEM с 1% о/о В27 добавки, плюс 50 нг/мл KGF и 50 нг/мл EGF и иногда также 50 нг/мл ноггина. Вновь, ROCK ингибитор, такой как Y-27632, можно применять для усиления роста, выживания, пролиферации и индукции адгезии клеток. PDX1-позитивные клетки панкреатической энтодермы, полученные со Стадии 4, совместно экспрессируют по меньшей мере PDX1 и Nkx6.1, а также PTF1A, и не проявляют существенной экспрессии маркеров, характерных для клеток дефинитивной энтодермы или энтодермы передней части пищеварительного тракта (PDX1-негативной энтодермы передней части пищеварительного тракта), как описано выше для Стадий 1, 2 и 3.

Альтернативно, клетки со Стадии 4 можно дополнительно дифференцировать на Стадии 5 для получения эндокринных предшественников или прогениторных типов клеток и/или одно- или полигормональных панкреатических эндокринных типов клеток со Стадии 4 в среде, содержащей DMEM в 1% о/о В27 в течение примерно 1-6 суток (дни 15-20). Эндокринные предшественники, полученные со Стадии 5, совместно экспрессируют по меньшей мере NGN3 и РАХ4, а также Nkx2.2, но не проявляют заметной экспрессии маркеров, характерных для клеток дефинитивной энтодермы или энтодермы передней части пищеварительного тракта (PDX1-негативной энтодермы передней части пищеварительного тракта) или PDX1-позитивной энтодермы передней части пищеварительного тракта или прогениторных клеток, как описано выше на Стадиях 1, 2, 3 и 4.

PDX1-позитивную панкреатическую энтодерму, полученную со Стадии 4, загружают и полностью содержат в устройстве для макро-инкапсулирования и трансплантируют пациенту, и клетки PDX1-позитивной панкреатической энтодермы созревают в панкреатические гормон-секретирующие клетки, например, инсулин-секретирующие клетки, in vivo. Инкапсулирование клеток PDX1-позитивной панкреатической энтодермы и получение инсулина in vivo подробно описаны в заявке США №12/618,659 («заявке '659»), озаглавленной «Инкапсулирование панкреатическойлинии клеток, полученной из плюрипотентных стволовых клеток человека», поданной 13 ноября 2009. Заявка '659 испрашивает приоритет предварительной патентной заявки 61/114,857, озаглавленной «Инкапсулирование панкреатических прогениторов, полученных из HES клеток», поданной 14 ноября 2008; и предварительной патентной заявки США №61/121,084, озаглавленной «Инкапсулирование панкреатических энтодермальных клеток», поданной 9 декабря 2008. Описания каждой из этих заявок полностью включены в настоящее описание посредством ссылки.

Способы, композиции и устройства, раскрытые в настоящей заявке, представляют предпочтительные варианты осуществления, и являются примерными, и не предназначены для ограничения объема изобретения. Изменения и другие виды применения очевидны для специалистов в данной области техники и охватываются сущностью изобретения и определены объемом описания. Соответственно, для специалиста в данной области техники понятно, что различные замены и модификации могут быть выполнены в изобретении, раскрытом в настоящей заявке, без отделения от объема и сущности настоящего изобретения.

Например, активин А, член суперсемейства факторов роста TGFβ или сигнальных белков, используют для получения дефинитивной энтодермы из плюрипотентных клеток, например, hES клеток и iPS клеток, однако, можно применять другие члены суперсемейства TGFβ, например, GDF-8 и GDF-11, для получения дефинитивной энтодермы, такие как те, которые описаны в международной заявке PCT/US 2008/065686, озаглавленной «Факторы роста для получения дефинитивной энтодермы», поданной 3 июня 2008, полностью включенной в настоящее описание посредством ссылки.

Ретиноевую кислоту (RA) применяют для дифференцировки PDX1-негативных клеток энтодермы передней части пищеварительного тракта на Стадии 2 в PDX1-позитивне клетки энтодермы передней части пищеварительного тракта на Стадии 3. Однако, можно применять другие ретиноиды или аналоги ретиноевой кислоты, такие как 4-[(Е)-2-(5,6,7,8-тетрагидро-5,5,8,8-тетраметил-2-нафталенил)-1-пропенил]-бензойная кислота (или TTNPB) и подобные аналоги (например, 4-HBTTNPB).

Noggin является белком, например, который инактивирует сигнальные белки - члены суперсемейства TGFβ, такие как костный морфогенетический белок-4 (ВМР4). Однако другие BMP; ингибиторы, такие как хордин и белок гаструляции в скрученной форме (Tsg) или анти-ВМР нейтрализующие антитела могут предотвратить связывание BMP с рецепторами поверхности клеток, таким образом, эффективно ингибируя передачу сигнала BMP. Альтернативно, ген ноггина человека был клонирован и секвенирован. См. патент США №6,075,007, который включен посредством ссылки. Анализ последовательности ноггина показал карбоксиконцевой участок, имеющий гомологию с ингибитором протеаз типа Куница, что указывает на возможность наличия у ингибиторов протеаз типа Куница схожего эффекта в ингибировании BMP.

Наконец, устройства для макро-инкасулирования, описанные в настоящей заявке и в заявке США №12/618,659, полностью включенной в настоящее описание посредством ссылки, являются лишь примерными, и не предназначены для ограничения объема настоящего изобретения. В частности, изменения конструкции устройства, такие как изменения размера устройства, множества камер или субкомпартментов в устройстве, или множестве портов, или механизмах загрузки и извлечения устройства, охвачены сущностью настоящего изобретения. Таким образом, для специалиста в данной области техники очевидно, что различные замены и модификации не только описанных способов дифференцировки, но и инкапсулирующего устройства, также могут быть выполнены в раскрытом изобретении без отделения от объема и сущности изобретения.

Получение и композиции дефинитивной энтодермы (Стадия 1)

В некоторых способах дифференцировка дефинитивной энтодермы достигается путем обеспечения культуры плюрипотентных клеток с фактором роста из суперсемейства TGFβ в количестве, достаточном для индукции дифференцировки в дефинитивную энтодерму. Факторы роста из суперсемейства TGFβ, пригодные для получения дефинитивной энтодермы, выбраны из Nodal/активина, GDF-8, -9, -10, -11 и тому подобных, или подгрупп BMP. В некоторых предпочтительных способах дифференцировки фактор роста выбран из группы, состоящей из Nodal, активина А, активина В, GDF-8, GDF-11 и ВМР4. Кроме того, фактор роста Wnt3a, другие члены семейства Wnt, и активаторы пути Wnt пригодны для получения клеток дефинитивной энтодермы. В некоторых способах дифференцировки можно применять комбинации любых из вышеупомянутых факторов роста. Эти и другие способы описаны подробно в патенте США №7,510,876, полностью включенном в настоящее описание посредством ссылки.

Что касается некоторых способов дифференцировки плюрипотентных клеток в клетки дефинитивной энтодермы, вышеупомянутые факторы роста обеспечивают для клеток так, чтобы факторы роста присутствовали в культурах в концентрациях, достаточных для индукции дифференцировки по меньшей мере части плюрипотентных клеток в клетки дефинитивной энтодермы. В некоторых способах вышеупомянутые факторы роста присутствуют в культуре клеток в концентрации по меньшей мере примерно 5 нг/мл, по меньшей мере примерно 10 нг/мл, по меньшей мере примерно 25 нг/мл, по меньшей мере примерно 50 нг/мл, по меньшей мере примерно 75 нг/мл, по меньшей мере примерно 100 нг/мл, по меньшей мере примерно 200 нг/мл, по меньшей мере примерно 300 нг/мл, по меньшей мере примерно 400 нг/мл, по меньшей мере примерно 500 нг/мл, по меньшей мере примерно 1000 нг/мл, по меньшей мере примерно 2000 нг/мл, по меньшей мере примерно 3000 нг/мл по меньшей мере примерно 4000 нг/мл, по меньшей мере примерно 5000 нг/мл или больше примерно 5000 нг/мл.

В некоторых способах дифференцировки плюрипотентных клеток в клетки дефинитивной энтодермы вышеупомянутые факторы роста удаляют из культуры клеток после их добавления. Например, факторы роста можно удалить в течение примерно одних суток, примерно двух суток, примерно трех суток, примерно четырех суток, примерно пяти суток, примерно шести суток, примерно семи суток, примерно восьми суток, примерно девяти суток или примерно десяти суток после их добавления. В предпочтительных способах факторы роста удаляют спустя примерно 4 суток после их добавления.

В некоторых вариантах осуществления способов, описанных в настоящей заявке, клетки дефинитивной энтодермы обогащают, изолируют и/или очищают перед дальнейшей дифференцировкой. В таких вариантах осуществления клетки дефинитивной энтодермы могут быть обогащены, изолированы и/или очищены с применением любого известного способа. В предпочтительных вариантах осуществления клетки дефинитивной энтодермы обогащают, изолируют и/или очищают с применением одного или нескольких способов, описанных в патентной заявке США №11/021,618, озаглавленной «Дефинитивная энтодерма», поданной 23 декабря 2004, и предварительной заявке на патент США №60/736,598, озаглавленной «Маркеры дефинитивной энтодермы», поданной 14 ноября 2005, описания которых полностью включены в настоящее описание посредством.

В предпочтительном варианте осуществления клетки дефинитивной энтодермы, полученные и описанные в настоящей заявке, могут иметь высокие уровни экспрессии генов CER, GSC, CXCR4, SOX17 и FOXA2 при нормализации и по сравнению с уровнями контрольных генов, таких как конститутивные гены.

Получение PDX1-негативной энтодермы передней части пищеварительного тракта и композиции (Стадия 2)

Клети дефинитивной энтодермы могут быть специализированы по направлению к панкреатической дифференцировке путем дальнейшей дифференцировки этих клеток до получения PDX1-негативных клеток энтодермы передней части пищеварительного тракта. В некоторых способах дифференцировки, описанных в настоящей заявке, культуры клеток, а также обогащенные или очищенные популяции клеток, содержащие клетки дефинитивной энтодермы, можно применять для дальнейшей дифференцировки до культур клеток и/или обогащенных популяций клеток, содержащих PDX1-негативные клетки энтодермы передней части пищеварительного тракта.

Как правило, клетки дефинитивной энтодермы дифференцируют в PDX1-негативные клетки энтодермы передней части пищеварительного тракта путем снижения или элиминации или удаления сигнальной системы суперсемейства факторов роста TGFβ в культуре клеток или популяции клеток SOX17-позитивных клеток дефинитивной энтодермы. В некоторых вариантах осуществления снижение или элиминация сигнальной системы суперсемейства факторов роста TGFβ опосредуется путем разбавления или удаления экзогенно добавленного фактора роста семейства TGFβ, такого как активин А, из культуры клеток или популяции клеток дефинитивной энтодермы. В других вариантах осуществления сигнальная система суперсемейства факторов роста TGFβ снижается или устраняется путем обеспечения клеток дефинитивной энтодермы соединением, блокирующим сигнальную систему суперсемейства факторов роста TGFβ, таким как фолллистатин и/или ноггин. В некоторых вариантах осуществления сигнальную систему суперсемейства факторов роста TGFββ можно уменьшить или устранить примерно на один день, примерно на два дня, примерно на три дня, примерно на четыре дня, примерно на пять дней, примерно на шесть дней, примерно на семь дней, примерно на восемь дней, примерно на девять дней, примерно на десять дней или больше чем примерно на десять дней после дифференцировки плюрипотентных клеток человека в клетки дефинитивной энтодермы.

В некоторых вариантах осуществления дифференцировку клеток дефинитивной энтодермы в клетки энтодермы передней части пищеварительного тракта усиливают путем обеспечения культуры клеток или популяции клеток дефинитивной энтодермы фактором роста семейства FGF и/или ингибитором пути хэджхог. В таких вариантах осуществления фактор роста семейства FGF и/или ингибитор пути хэджхог обеспечивают примерно на один день, примерно на два дня, примерно на три дня, примерно на четыре дня, примерно на пять дней, примерно на шесть дней, примерно на семь дней, примерно на восемь дней, примерно на девять дней, примерно на десять дней, или более чем примерно на десять дней после уменьшения или устранения сигнализации фактора роста суперсемейства TGFβ в культуре клеток дефинитивной энтодермы. В предпочтительном варианте осуществления фактор роста семейства FGF и/или ингибитор пути хэджхог обеспечивают примерно в то же самое время, что и снижение или устранение сигнализации фактора роста суперсемейства TGFβ в культуре клеток дефинитивной энтодермы.

В предпочтительном варианте осуществления фактор роста семейства FGF, обеспечиваемый в культуре клеток или популяции клеток дефинитивной энтодермы, является FGF10 и/или FGF7. Однако необходимо понимать, что иные факторы роста семейства FGF, или аналоги фактора роста семейства FGF, или миметики могут быть предоставлены вместо или в дополнение к FGF10 и/или FGF7. Например, может быть обеспечен фактор роста семейства FGF, выбранный из группы, состоящей из FGF1, FGF2, FGF3, и тому подобного, включая FGF23. В таких вариантах осуществления фактор роста семейства FGF и/или аналог фактора роста семейства FGF, или миметик обеспечивается для клетки или культуры клеток так, чтобы присутствовать в концентрации по меньшей мере примерно 10 нг/мл, по меньшей мере примерно 25 нг/мл, по меньшей мере примерно 50 нг/мл, по меньшей мере примерно 75 нг/мл, по меньшей мере примерно 100 нг/мл, по меньшей мере примерно 200 нг/мл, по меньшей мере примерно 300 нг/мл, по меньшей мере примерно 400 нг/мл, по меньшей мере примерно 500 нг/мл, или по меньшей мере примерно 1000 нг/мл.

В других предпочтительных вариантах осуществления ингибитором хеджхог является KAAD-циклопамин. Однако необходимо понимать, что можно использовать другие ингибиторы хэджхог. Такие ингибиторы включают аналоги KAAD-циклопамина, иервин, аналоги иервина; антитела, блокирующие путь хэджхог; и любые другие ингибиторы функции пути хэджхог, известные для рядового специалиста в данной области техники, но не ограничиваются ими. При использовании по отдельности или в сочетании с фактором роста семейства FGF, ингибитор хэджхог может быть обеспечен в концентрации по меньшей мере примерно от 0,01 мкМ до 50 мкМ.

В предпочтительном способе получения популяции PDX1-негативных клеток энтодермы передней части пищеварительного тракта из клеток дефинитивной энтодермы, передачу сигналов фактора роста суперсемейства TGFβ снижают или устраняют примерно на два дня после дифференцировки существенной части плюрипотентных клеток человека в дефинитивную энтодерму (например, после трех дней, четырех дней или пяти дней протокола дифференцировки, как описано в примерах ниже). Примерно в то же самое время культуру клеток или популяцию клеток дефинитивной энтодермы обеспечивают ноггином и KAAD-циклопамином, например, 50 нг/мл ноггина и 0,25 мкМ KAAD-циклопамина в среде DMEM в присутствии 2 мМ RA или 3 нМ TTNPB.

В некоторых вариантах осуществления PDX1-негативные клетки энтодермы передней части пищеварительного тракта могут быть дополнительно дифференцированы в PDX1-позитивные клетки энтодермы передней части пищеварительного тракта путем обеспечения контакта клеток или иного обеспечения клеток средой, содержащей ретиноид, такой как ретиноевая кислота (RA). В некоторых вариантах осуществления ретиноид обеспечивается для клеток в культуре клеток в концентрации по меньшей мере примерно от 1 нМ до 50 мкМ. В таких вариантах осуществления ретиноид обеспечивается для клеток примерно на один день, примерно на два дня, примерно на три дня, примерно на четыре дня, примерно на пять дней, примерно на шесть дней, примерно на семь дней, примерно на восемь дней, примерно на девять дней, примерно на десять дней, или больше чем примерно на десять дней после снижения или удаления переноса сигнала фактора роста семейства TGFβ в культуре клеток дефинитивной энтодермы. В предпочтительном варианте осуществления примерно от 0,05 мкМ RA до 2 мкМ RA обеспечивается для культуры клеток PDX-1-негативной энтодермы передней части пищеварительного тракта примерно на 2-3 дня после снижения или устранения переноса сигнала фактора роста семейства TGFβ.

В некоторых способах дифференцировки, описанных в настоящей заявке, вышеупомянутые факторы дифференцировки удаляют из культуры клеток после их добавления. Например, вышеупомянутые факторы дифференцировки можно удалить в течение примерно одного дня, примерно двух дней, примерно трех дней, примерно пяти дней, примерно шести дней, примерно семи дней, примерно восьми дней, примерно девяти дней или примерно десяти дней после их добавления.

В предпочтительном варианте осуществления PDX1-негативные клетки энтодермы передней части пищеварительного тракта, полученные и описанные в настоящей заявке, имеют относительно высокие уровни экспрессии генов SOX17, FOXA1, HNF1B и HNF4A при нормализации до уровней контрольных генов, таких как конститутивные гены. В частности, уровни экспрессии гена HNF4A по существу не повышаются до удаления системы передачи сигнала фактора роста суперсемейства TGFβ (например, активина), например, из культуры дефинитивной энтодермы.

Получение и композиции PDX1-позитивной энтодермы передней части пищеварительного тракта (Стадия 3)

Клетки PDX1-негативной энтодермы передней части пищеварительного тракта можно дополнительно специализировать по направлению к панкреатической дифференцировке путем дополнительной дифференцировки эти клеток до получения клеток PDX1-позитивной энтодермы передней части пищеварительного тракта или PDX1-позитивной панкреатической энтодермы или ее эквивалентов. В некоторых способах дифференцировки, описанных в настоящей заявке, культуры клеток, а также обогащенные или очищенные популяции клеток, содержащие клетки дефинитивной энтодермы, можно применять для дополнительной дифференцировки в культуры клетоккультуры клеток и/или обогащенные популяции клеток, содержащие клетки PDX1-позитивной энтодермы передней части пищеварительного тракта.

Как правило, клетки PDX1-негативной энтодермы передней части пищеварительного тракта дифференцируют в клетки PDX1-позитивной энтодермы передней части пищеварительного тракта путем обеспечения культуры клеток, содержащей клетки SOX17-позитивной энтодермы передней части пищеварительного тракта, ретиноидом, таким как ретиноевая кислота (RA). В некоторых способах дифференцировки клетки PDX1-негативной энтодермы передней части пищеварительного тракта также обеспечивают членом семейства факторов роста фибробластов до или примерно в то же самое время, что и добавление RA. Предпочтительным фактором роста фибробластов является FGF-7. В другом предпочтительном способе фактор роста фибробластов включает любой фактор роста фибробластов или лиганд, стимулирующий или иным образом взаимодействующий с рецептором IIIb фактора роста фибробластов 2 (FGFR2(IIIb)). В еще более предпочтительных способах фактор роста семейства FGF используют в сочетании с ингибитором пути хэджхог. Предпочтительным ингибитором пути хэджхог является KAAD-циклопамин. В особо предпочтительных способах дифференцировки FGF-10 и/или KAAD-циклопамин обеспечивают для культуры клеток, содержащей клетки PDX1-негативной дефинитивной энтодермы, в присутствии RA. В некоторых способах ВМР4 может быть включен с FGF 10 и/или KAAD-циклопамином в присутствии RA. В некоторых способах ретиноид применяют в сочетании с членом TGFβ суперсемейства факторов роста и/или средой Connaught Medical Research Labs (CRML средой) (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния).

Что касается некоторых вариантов осуществления способов дифференцировки, описанных в настоящей заявке, ретиноид и/или комбинацию вышеупомянутых факторов дифференцировки обеспечивают для клеток так, чтобы эти факторы присутствовали в культуре клеток или популяции клеток в концентрациях, достаточных для стимуляции дифференцировки по меньшей мере части культуры клеток или популяции клеток PDX1-негативной энтодермы передней части пищеварительного тракта в клетки PDX1-позитивной энтодермы передней части пищеварительного тракта.

В других способах FGF-10 обеспечивают для клеток в культуре клеток так, чтобы он присутствовал в концентрации по меньшей мере примерно 1 нг/мл, по меньшей мере примерно 2 нг/мл, по меньшей мере примерно 5 нг/мл, по меньшей мере примерно 10 нг/мл, по меньшей мере примерно 25 нг/мл и до 50 мкМ. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения фактор роста фибробластов или лиганд, стимулирующий или иным образом взаимодействующий с рецептором IIIb фактора роста фибробластов 2 (FGFR2(IIIb)), обеспечивается по отдельности или в комбинации с ингибитором пути хэджхог.

В предпочтительном способе для получения популяции клеток PDX1-позитивной энтодермы передней части пищеварительного тракта из клеток PDX1-негативной энтодермы передней части пищеварительной тракта культуру клеток или обогащенную популяцию клеток PDX1-негативной энтодермы передней части пищеварительного тракта обеспечивают FGF-7, KAAD-циклопамином и ретиноевой кислотой (RA), например, 25 нг/мл FGF-7 и 0,2 мкМ KAAD-циклопамина в среде CMRL в присутствии 2 мкМ RA.

В некоторых способах, описанных в настоящей заявке, фактор передачи сигнала TGFβ, например, активин А и/или активин В, GDF-8, GDF-11 и тому подобное обеспечивается в культуре клеток вместе с ретиноидом и/или фактором роста фибробластов и ингибитором хэджхог. Например, в таких способах активин А и/или активин В и/или GDF-8 и/или GDF-11 обеспечивают для культуры клеток в концентрации по меньшей мере примерно 5 нг/мл, по меньшей мере примерно 10 нг/мл, по меньшей мере примерно 25 нг/мл, по меньшей мере примерно 50 нг/мл, по меньшей мере примерно 75 нг/мл, по меньшей мере примерно 100 нг/мл, по меньшей мере примерно 200 нг/мл, по меньшей мере примерно 300 нг/мл, по меньшей мере примерно 400 нг/мл, по меньшей мере примерно 500 нг/мл, или по меньшей мере примерно 1000 нг/мл.

В некоторых способах факторы дифференцировки и/или среду CRML обеспечивают для клеток PDX1-негативной энтодермы передней части пищеварительного тракта примерно на один день, два дня, три дня, примерно на четыре дня, примерно на пять дней, примерно на шесть дней, примерно на семь дней, примерно на восемь дней, примерно на девять дней, примерно на десять дней, или более чем примерно на десять дней после начала дифференцировки из плюрипотентных клеток. В предпочтительных способах факторы дифференцировки и/или среду CRML обеспечивают для клеток PDX1-негативной энтодермы передней части пищеварительного тракта примерно на три, или четыре, или пять дней после начала дифференцировки из плюрипотентных стволовых клеток.

В некоторых способах, описанных в настоящей заявке, вышеупомянутые факторы дифференцировки удаляют из культуры клеток после их добавления. Например, вышеупомянутые факторы дифференцировки можно удалить в пределах примерно одного дня, примерно двух дней, примерно трех дней, примерно четырех дней, пример пяти дней, примерно шести дней, примерно семи дней, примерно восьми дней, примерно девяти дней или примерно десяти дней после их добавления.

Эти и другие способы подробно описаны в предварительной патентной заявке США №60/730,917, озаглавленной «PDX1-экспрессирующая дорзальная и вентральная энтодерма передней части пищеварительного тракта», поданной 27 октября 2005, а клетки PDX1-позитивной энтодермы передней части пищеварительного тракта описаны в патентной заявке США №11/115,868, озаглавленной «PDX1-экспрессирующая энтодерма», поданной 26 апреля 2005, описания которых полностью включены в настоящее описание посредством ссылки.

В предпочтительном варианте осуществления клетки PDX1-позитивной энтодермы передней части пищеварительного тракта, полученные и описанные в настоящей заявке, имеют относительно высокие уровни экспрессии генов PDX1, NKX6.1, PTF1A, CPA и cMYC при нормализации, по сравнению с уровнями контрольных генов, таких как конститутивные гены.

Получение и композиции PDX1-позитивной панкреатической энтодермы (Стадия 4)

Получение и композиции PDX1-позитивной панкреатической энтодермы или «панкреатического эпителия» или вообще панкреатических прогениторов подробно описаны в заявке США №12/167,227, озаглавленной «Способы получения панкреатических гормонов», поданной 2 июля 2008, изданной 19 мая 2009 как патент США №7,534,608. Заявка 12/167,227 является продолжением заявки США №11/773,944, озаглавленной «Способы получения панкреатических гормонов», поданной 5 июля 2007, которая является частичным продолжением патентной заявки США №11/681,687, озаглавленной «Эндокринные клетки-предшественники, панкреатические гормон-экспрессирующие клетки и способы их получения», поданной 2 марта 2007. Описания каждой из этих заявок полностью включены в настоящее описание посредством ссылки.

Пример 22 из заявки 12/167,227 подробно описывает различные модификации условий культуры клеток, описанные в настоящей заявке на Стадиях 1-4. В целом, на Стадии 3 типы клеток PDX1-позитивной энтодермы передней части пищеварительного тракта культивируют в средах, содержащих DMEM в 1% о/о В27 добавке плюс ноггин, или другой ВМР4 специфический ингибитор в течение примерно 1-3 дней, или примерно 1-4 дней, или 1-5 дней, или примерно 1-6 дней. В конце Стадии 4, получают PDX1-позитивную панкреатическую энтодерму, клетки которой по меньшей мере совместно экспрессируют PDX1 и Nkx6.l, а также PTF1A. Культура клеток не проявляет существенной экспрессии клеток, характерных для одно- или полигормональных эндокринных клеток со Стадии 5, или клеток дефинитивной энтодермы со Стадии 1, или клеток PDX1-негативной энтодермы передней части пищеварительного тракта со Стадии 2, или клеток PDX1-позитивной энтодермы передней части пищеварительного тракта со Стадии 3.

Получение и композиции эндокринных клеток-предшественников (Стадия 5)

Некоторые варианты осуществления, описанные в настоящей заявке, относятся к способам получения эндокринных клеток-предшественников, начиная от плюрипотентных клеток. Как описано выше, эндокринные клетки-предшественники можно получить вначале путем дифференцировки плюрипотентных клеток до получения клеток дефинитивной энтодермы, с последующей дифференцировкой клеток дефинитивной энтодермы до получения клеток PDX1-позитивной энтодермы передней части пищеварительного тракта. В таких вариантах осуществления клетки PDX1-позитивной энтодермы передней части пищеварительного тракта далее дифференцируют до мультипотентных эндокринных клеток-предшественников, способных к дифференцировке в гормон-экспрессирующие клетки панкреатических островков человека.

В одном варианте осуществления клетки PDX1-позитивной энтодермы передней части пищеварительного тракта дифференцируют в эндокринные клетки-предшественники путем продолжения инкубации клеток PDX1-позитивной энтодермы передней части пищеварительного тракта в присутствии ретиноида, такого как ретиноевая кислота, в течение времени, достаточного для получения эндокринных клеток-предшественников. В некоторых вариантах осуществления время, достаточное для получения эндокринных клеток-предшественников, находится в диапазоне примерно от 1 часа до 10 суток после экспрессии PDX1 маркера в части клеток в культуре клеток. В некоторых вариантах осуществления ретиноид сохраняют в культуре клеток в течение примерно 1 часа, примерно 2 часов, примерно 4 часов, примерно 6 часов, примерно 8 часов, примерно 10 часов, примерно 12 часов, примерно 16 часов, примерно 1 дня, примерно 2 дней, примерно 3 дней, примерно 4 дней, примерно 5 дней, примерно 6 дней, примерно 7 дней, примерно 8 дней, примерно 9 дней, примерно 10 дней, или более чем примерно 10 дней после экспрессии PDX1 маркера в части клеток из культуры клеток.

В некоторых способах, описанных в настоящей заявке, концентрация ретиноида, используемого для дифференцировки клеток PDX1-позитивной энтодермы передней части пищеварительного тракта в культуре клеток или популяции клеток в эндокринные клетки-предшественники, находится в диапазоне примерно от 1 нМ до 100 мкМ.

В некоторых предпочтительных вариантах осуществления дифференцировка из клеток PDX1-позитивной энтодермы передней части пищеварительного тракта в панкреатические клетки-предшественники опосредована путем обеспечения культуры клеток или популяции клеток, содержащих клетки человека PDX1-позитивной энтодермы передней части пищеварительного тракта, ингибитором гамма-секретазы. В предпочтительном варианте осуществления ингибитором гамма-секретазы является N-[N-(3,5-дифторфенацетил-L-аланил)]-S-фенилглицин t-бутиловый эфир (DAPT).

В других вариантах осуществления ингибитор гамма-секретазы обеспечивают в начале способа дифференцировки, например, плюрипотентной стадии, и оставляют в культуре клеток на протяжении дифференцировки гормон-экспрессирующих клеток панкреатических островков. В других вариантах осуществления ингибитор гамма-секретазы добавляют после начала дифференцировки, но перед дифференцировкой до стадии PDX1-позитивной энтодермы передней части пищеварительного тракта. В предпочтительных вариантах осуществления ингибитор гамма-секретазы обеспечивают в культуре клеток или популяции клеток примерно в то же самое время, что и обеспечение факторов дифференцировки, индуцирующих превращение дефинитивной энтодермы в PDX1-позитивную энтодерму. В других предпочтительных вариантах осуществления ингибитор гамма-секретазы обеспечивают для культуры клеток или популяции клеток после дифференцировки существенной части клеток в культуре клеток или популяции клеток в клетки PDX1-позитивной энтодермы передней части пищеварительного тракта.

Что касается некоторых вариантов осуществления, касающихся дифференцировки клеток PDX1-позитивной энтодермы передней части пищеварительного тракта в эндокринные клетки-предшественники, ингибитор гамма-секретазы обеспечивают для клеток так, чтобы он присутствовал в культуре клеток или популяции клеток в концентрациях, достаточных для стимуляции дифференцировки по меньшей мере части PDX1-позитивных клеток в эндокринные клетки-предшественники. В некоторых вариантах осуществления ингибитор гамма-секретазы присутствует в культуре клеток или популяции клеток в концентрации в диапазоне примерно от 0,01 мкМ до 1000 мкМ. В предпочтительных вариантах осуществления ингибитор гамма-секретазы присутствует в культуре клеток или популяции клеток в концентрации в диапазоне примерно от 0,1 мкМ до 100 мкМ.

В некоторых вариантах осуществления способов получения эндокринных клеток-предшественников, как описано в настоящей заявке, ингибитор гамма-секретазы обеспечивают после удаления одного или нескольких ранее обеспеченных факторов дифференцировки из культур клеток. Например, один или несколько ранее обеспеченных факторов дифференцировки могут быть удалены примерно за 1-10 дней или более чем примерно за 10 дней до добавления ингибитора гамма-секретазы. В других вариантах осуществления ингибитор гамма-секретазы обеспечивают для культур клеток или популяций клеток, содержащих один или несколько факторов дифференцировки, обеспеченных раньше или примерно в то же самое время, что и ингибитор гамма-секретазы. В предпочтительных вариантах осуществления факторы дифференцировки, которые обеспечены раньше или примерно в то же самое время, что и ингибитор гамма-секретазы, включают FGF-10, KAAD-циклопамин, активин А, активин В, GDF-8, GDF-11, ВМР4 и/или RA, но не ограничиваются ими.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, описанных в настоящей заявке, эксендин 4 обеспечивают для дифференцировки культуры клеток или популяции клеток примерно в то же самое время, что и ингибитор гамма-секретазы. В некоторых вариантах осуществления эксендин 4 обеспечивают так, чтобы он присутствовал в культуре клеток или популяции клеток в концентрации по меньшей мере примерно от 0,1 нг/мл до 1000 нг/мл.

В предпочтительном способе получения эндокринных клеток-предшественников из клеток PDX1-позитивной энтодермы передней части пищеварительного тракта культуру клеток или популяцию клеток PDX1-позитивной энтодермы передней части пищеварительного тракта обеспечивают 3 мкМ DAPT и 40 нг/мл эксендина 4. В особо предпочтительных вариантах осуществления клетки дифференцируют в CMRL. В другом особо предпочтительном способе для получения эндокринных клеток-предшественников из клеток PDX1-позитивной энтодермы передней части пищеварительного тракта культуру клеток или популяцию клеток PDX1-позитивной энтодермы передней части пищеварительного тракта обеспечивают 3 мкМ DAPT и 40 нг/мл эксендина 4 в присутствии 2 мкМ RA.

Необходимо понимать, что экспрессия маркеров NGN3, NKX2.2 и/или РАХ4 индуцируется в диапазоне различных уровней в эндокринных клетках-предшественниках, в зависимости от условий дифференцировки. Как таковая, в некоторых вариантах осуществления, описанных в настоящей заявке, экспрессия маркеров NGN3, NKX2.2 и/или РАХ4 в эндокринных клетках-предшественниках или популяциях клеток превышает по меньшей мере в 2 раза - 10000 раз экспрессию маркеров NGN3, NKX2.2 и/или РАХ4 в не-эндокринных клетках-предшественниках или популяциях клеток, например, плюрипотентных стволовых клетках, клетках дефинитивной энтодермы, клетках PDX1-позитивной энтодермы передней части пищеварительного тракта, незрелых гормон-экспрессирующих клетках панкреатических островков, зрелых гормон-экспрессирующих клетках панкреатических островков, клетках экстраэмбриональной энтодермы, клетках мезодермы и/или клетках эктодермы. В других вариантах осуществления экспрессия маркеров NGN3, NKX2.2 и/или РАХ4 в эндокринных клетках-предшественниках или популяциях клеток превышает по меньшей мере примерно в 4 раза, по меньшей мере в 6 раз - в 10000 раз экспрессию маркеров NGN3, NKX2.2 и/или РАХ4 в не-эндокринных клетках-предшественниках или популяциях клеток, например, плюрипотентных стволовых клетках, клетках дефинитивной энтодермы, клетках PDX1-позитивной энтодермы передней части пищеварительного тракта, незрелых гормон-экспрессирующих клетках панкреатических островков, зрелых гормон-экспрессирующих клетках панкреатических островков, клетках экстраэмбриональной энтодермы, клетках мезодермы и/или клетках эктодермы. В некоторых вариантах осуществления экспрессия маркеров NGN3, NKX2.2 и/или РАХ4 в эндокринных клетках-предшественниках или популяциях клеток неограниченно превышает экспрессию маркеров NGN3, NKX2.2 и/или РАХ4 в не-эндокринных клетках-предшественниках или популяциях клеток, например, плюрипотентных стволовых клетках, таких как iPS клетки и hES клетки, клетках дефинитивной энтодермы, клетках PDX1-позитивной энтодермы передней части пищеварительного тракта, незрелых гормон-экспрессирующих клетках панкреатических островков, зрелых гормон-экспрессирующих клетках панкреатических островков, клетках экстраэмбриональной энтодермы, клетках мезодермы и/или клетках эктодермы.

Другие варианты осуществления настоящего изобретения относятся к композициям, таким как культуры клеток или популяции клеток, содержащим клетки человека, включая эндокринные клетки-предшественники человека, где экспрессия маркера NGN3 превышает экспрессию маркера AFP, SOX7, SOX1, ZIC1, NFM, MAFA, SYP, CHGA, INS, GCG, SST, GHRL и/или РАХ6 по меньшей мере примерно на 2% от клеток человека. В других вариантах осуществления экспрессия маркера NGN3 превышает экспрессию маркера AFP, SOX7, SOX1, ZIC1, NFM, MAFA, SYP, CHGA, INS, GCG, SST, GHRL и/или PAX6 по меньшей мере примерно на 5%-98% от клеток человека. В некоторых вариантах осуществления процент клеток человека в культур клетоках или популяциях, где экспрессия маркера NGN3 превышает экспрессию маркера AFP, SOX7, SOX1, ZIC1, NFM, MAFA, SYP, CHGA, INS, GCG, SST, GHRL и/или PAX6, рассчитывают независимо от фидерных клеток.

Необходимо понимать, что некоторые варианты осуществления настоящего изобретения относятся к композициям, таким как культуры клеток или популяции клеток, содержащим эндокринные клетки-предшественники человека, где экспрессия маркера NKX2.2 и/или РАХ4 превышает экспрессию маркера AFP, SOX7, SOX1, ZIC1, NFM, MAFA, SYP, CHGA, INS, GCG, SST, GHRL и/или PAX6 по меньшей мере от примерно 2% до более чем примерно 98% клеток человека. В некоторых вариантах осуществления экспрессия маркера ΝΚΧ2.2 и/или РАХ4 превышает экспрессию маркера AFP, SOX7, SOX1, ZIC1, NFM, MAFA, SYP, CHGA, INS, GCG, SST, GHRL и/или PAX6 по меньшей мере от 5% до 98% клеток человека. В некоторых вариантах осуществления процент клеток человека в культурах клеток или популяциях, где экспрессия маркера NKX2.2 и/или РАХ4 превышает экспрессию маркера AFP, SOX7, SOX1, ZIC1, NFM, MAFA, SYP, CHGA, INS, GCG, SST, GHRL и/или PAX6, рассчитывают независимо от фидерных клеток.

Дополнительные варианты осуществления настоящего изобретения относятся к композициям, таким как культуры клеток или популяции клеток, содержащим клетки млекопитающих, дифференцированные из дефинитивной энтодермы in vitro, такие как клетки человека, дифференцированные из дефинитивной энтодермы in vitro, где экспрессия маркера NGN3, NKX2.2 и/или РАХ4 превышает экспрессию маркера AFP, SOX7, SOX1, ZIC1, NFM, MAFA, SYP, CHGA, INS, GCG, SST, GHRL и/или PAX6 по меньшей мере примерно на 2% от клеток, дифференцированных из дефинитивной энтодермы in vitro. В других вариантах осуществления экспрессия маркера NGN3, NKX2.2 и/или РАХ4 превышает экспрессию маркера AFP, SOX7, SOX1, ZIC1, NFM, MAFA, SYP, CHGA, INS, GCG, SST, GHRL и/или PAX6 по меньшей мере примерно на 5% от клеток, дифференцированных из дефинитивной энтодермы in vitro, до по меньшей мере примерно на 98% от клеток, дифференцированных из дефинитивной энтодермы in vitro.

С применением способов, описанных в настоящей заявке, можно получить композиции, содержащие эндокринные клетки-предшественники, по существу свободные от других типов клеток. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения популяции клеток или культуры клеток эндокринных клеток-предшественников, полученные посредством способов, описанных в настоящей заявке, по существу свободны от клеток, проявляющих значительную экспрессию маркеров AFP, SOX7, SOX1, ZIC1 и/или NFM. В некоторых вариантах осуществления популяции или культуры эндокринных клеток-предшественников, полученные способами, описанными в настоящей заявке, по существу свободны от клеток, проявляющих значительную экспрессию маркеров AFP, SOX7, SOX1, ZIC1, NFM, MAFA, SYP, CHGA, INS, GCG, SST, GHRL и/или PAX6.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения описание эндокринной клетки-предшественника на основании экспрессии маркеров является следующим: NGN3 high, NKX2.2 high, PAX4 high, AFP low, SOX7 low, SOX1 low, ZIC1 low NFM low, MAFA low; SYP low; CHGA low; INS low, GCG low, SST low, GHRL low и/или PAX6 low.

Получение незрелых гормон-экспрессирующих клеток панкреатических островков

Варианты осуществления, описанные в настоящей заявке, относятся к способам получения незрелых гормон-экспрессирующих клеток панкреатических островков из плюрипотентных клеток. Как описано выше, незрелые гормон-экспрессирующие клетки панкреатических островков можно получить сначала путем дифференцировки плюрипотентных клеток до получения клеток дефинитивной энтодермы, дифференцировки клеток дефинитивной энтодермы до получения клеток энтодермы передней части пищеварительного тракта, дифференцировки энтодермы передней части пищеварительного тракта до получения клеток PDX1-позитивной энтодермы передней части пищеварительного тракта, а затем дополнительной дифференцировки клеток PDX1-позитивной энтодермы передней части пищеварительного тракта до получения эндокринных клеток-предшественников. В некоторых вариантах осуществления способ продолжают путем обеспечения дальнейшей дифференцировки эндокринных клеток-предшественников до незрелых гормон-экспрессирующих клеток панкреатических островков.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения дифференцировку из эндокринных клеток-предшественников до незрелых гормон-экспрессирующих клеток панкреатических островков осуществляют путем продолжения инкубации культуры эндокринных клеток-предшественников с ингибитором гамма-секретазы в течение времени, достаточного, чтобы клетки по существу прекратили экспрессию NGN3, и начали экспрессию РАХ6, и чтобы клетки стали способными к экспрессии по меньшей мере одного гормона клеток панкреатических островков. В некоторых вариантах осуществления ингибитор гамма-секретазы удаляют спустя примерно 1 день, примерно 2 дня, примерно 3 дня, примерно 4 дня, примерно 5 дней. примерно 6 дней, примерно 7 дней, примерно 8 дней, примерно 9 дней, примерно 10 дней, или больше чем примерно 10 дней после индукции эндокринных клеток-предшественников. В предпочтительном варианте осуществления ингибитором гамма-секретазы является N-[N-(3,5-дифторфенацетил-L-аланил)]-S-фенилглицин t-бутиловый эфир (DAPT).

Некоторые способы получения незрелых гормон-экспрессирующих клеток панкреатических островков, раскрытые в настоящей заявке, опосредованы путем обеспечения культуры клеток или популяции клеток, содержащей эндокринные клетки-предшественники человека, с одним или несколькими факторами, выбранными из группы, состоящей из никотинамида, эксендина 4, фактора роста гепатоцитов (HGF), инсулиноподобного фактора роста-1 (IGF1). В некоторых вариантах осуществления все четыре вышеуказанных фактора обеспечиваются вместе. В некоторых вариантах осуществления один или несколько вышеуказанных факторов обеспечивают для культуры клеток перед дифференцировкой эндокринных клеток-предшественников, и оставляют в культуре клеток во время дифференцировки по меньшей мере части клеток в культуре клеток до эндокринных клеток-предшественников. В других вариантах осуществления один или несколько вышеуказанных факторов обеспечивают в культуре клеток во время или близко к времени дифференцировки существенной части клеток в эндокринные клетки-предшественники, и оставляют в культуре клеток, пока по меньшей мере существенная часть клеток не дифференцируется в незрелые гормон-экспрессирующие клетки панкреатических островков. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения один или несколько вышеописанных факторов обеспечивают в начале процесса дифференцировки, на стадии плюрипотентных стволовых клеток, и оставляют в культуре клеток на протяжении дифференцировки до незрелых гормон-экспрессирующих клеток панкреатических островков.

В некоторых способах получения незрелых гормон-экспрессирующих клеток панкреатических островков, описанных в настоящей заявке, никотинамид, никотинамид-аденин-динуклеотид (NAD) или никотиновую кислоту обеспечивают для клеток так, чтобы они присутствовали в культуре клеток или популяции клеток в концентрациях, достаточных для стимуляции дифференцировки по меньшей мере части эндокринных клеток-предшественников в незрелые гормон-экспрессирующие клетки панкреатических островков. В некоторых вариантах осуществления никотинамид присутствует в культуре клеток или популяции клеток в концентрации по меньшей мере примерно 0,1 мМ, по меньшей мере примерно 0,5 мМ, до 1000 мМ.

В других способах получения незрелых гормон-экспрессирующих клеток панкреатических островков, описанных в настоящей заявке, эксендин 4 обеспечивают для клеток так, чтобы он присутствовал в культуре клеток или популяции клеток в концентрациях, достаточных для стимуляции дифференцировки по меньшей мере части эндокринных клеток-предшественников в незрелые гормон-экспрессирующие клетки панкреатических островков. В некоторых вариантах осуществления эксендин 4 присутствует в культуре клеток или популяции клеток в концентрации по меньшей мере примерно 1 нг/мл, по меньшей мере примерно 5 нг/мл до 1000 нг/мл.

В других способах получения незрелых гормон-экспрессирующих клеток панкреатических островков, описанных в настоящей заявке, HGF обеспечивают для клеток так, чтобы он присутствовал в культуре клеток или популяции клеток в концентрациях, достаточных для стимуляции дифференцировки по меньшей мере части эндокринных клеток-предшественников в незрелые гормон-экспрессирующие клетки панкреатических островков. В некоторых вариантах осуществления HGF присутствует в культуре клеток или популяции клеток в концентрации по меньшей мере примерно 1 нг/мл, по меньшей мере примерно 5 нг/мл до 1000 нг/мл.

В других способах получения незрелых гормон-экспрессирующих клеток панкреатических островков, описанных в настоящей заявке, IGF1 обеспечивают для клеток так, чтобы он присутствовал в культуре клеток или популяции клеток в концентрациях, достаточных для стимуляции дифференцировки по меньшей мере части эндокринных клеток-предшественников в незрелые гормон-экспрессирующие клетки панкреатических островков. В некоторых вариантах осуществления IGF1 присутствует в культуре клеток или популяции клеток в концентрации по меньшей мере примерно от 1 нг/мл до 1000 нг/мл.

В некоторых вариантах осуществления способов получения незрелых гормон-экспрессирующих клеток панкреатических островков, как описано в настоящей заявке, один или несколько из никотинамида, эксендина 4, HGF и IGF1 обеспечивают после удаления из культур клеток одного или нескольких ранее обеспеченных факторов дифференцировки. В других вариантах осуществления один или несколько из никотинамида, эксендина 4, HGF и IGF1 обеспечивают для культуры клеток или популяции клеток, содержащей один или несколько факторов дифференцировки, которые обеспечены раньше, или обеспечены примерно в то же самое время, как один или несколько из никотинамида, эксендина 4, HGF и IGF1. В предпочтительных вариантах осуществления факторы дифференцировки, которые обеспечены раньше, или обеспечены примерно в то же самое время, как один или несколько из никотинамида, эксендина 4, HGF и IGF1, включают DAPT, FGF-10, KAAD-циклопамин, активин А, активин В, ВМР4 и/или RA, но не ограничиваются ими.

Другие варианты осуществления настоящего изобретения относятся к композициям, таким как культуры клеток или популяции клеток, содержащие клетки человека, включая незрелые гормон-экспрессирующие клетки панкреатических островков человека, где экспрессия маркера MAFB, SYP, CHGA, NKX2.2, ISL1, РАХ6, NEUROD, PDX1, НВ9, GHRL, IAPP, INS GCG, SST, PP и/или С-пептида превышает экспрессию маркера NGN3, MAFA, МОХ1, CER, POU5F1, AFP, SOX7, SOX1, ZIC1 и/или NFM по меньшей мере в 2% клеток человека. В других вариантах осуществления экспрессия маркера MAFB, SYP, CHGA, NKX2.2, ISL1, РАХ6, NEUROD, PDX1, НВ9, GHRL, IAPP INS GCG, SST, РР и/или С-пептида превышает экспрессию маркера NGN3, MAFA, МОХ1, CER, POU5F1, AFP, SOX7, SOX1, ZIC1 и/или NFM по меньшей мере в 5% клеток человека, по меньшей мере примерно от 10% клеток человека до 95% клеток человека, или по меньшей мере примерно в 98% клеток человека.

В некоторых вариантах осуществления процент клеток человека в культур клетоках или популяциях, где экспрессия маркера MAFB, SYP, CHGA, NKX2.2, ISL1, PAX6, NEUROD, PDX1, HB9, GHRL, IAPP, INS GCG, SST, РР и/или С-пептида превышает экспрессию маркера NGN3, MAFA, МОХ1, CER, POU5F1, AFP, SOX7, SOX1, ZIC1 и/или NFM, рассчитывают независимо от фидерных клеток.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения культуры клеток и/или популяции клеток, содержащие незрелые гормон-экспрессирующие клетки панкреатических островков, также включают среду, содержащую один или несколько секретируемых гормонов, выбранных из грелина, инсулина, соматостатина и/или глюкагона. В других вариантах осуществления среда содержит С-пептид. В предпочтительном варианте осуществления концентрация одного или нескольких секретируемых гормонов или С-пептида в среде находится в диапазоне от по меньшей мере примерно 1 пмоль грелина, инсулина, соматостатина, глюкагона или С-пептида на мкг клеточной ДНК до по меньшей мере примерно 1000 пикомоль (пмоль) грелина, инсулина, соматостатина, глюкагона или С-пептида на мкг клеточной ДНК.

Способ получения инсулина in vivo

В некоторых вариантах осуществления полученные in vitro панкреатические клетки-предшественники или типы клеток PDX-1-позитивной панкреатической энтодермы, или их эквиваленты, описанные выше, трансплантируют млекопитающему субъекту. Эти способы подробно описаны в Международной заявке PCT/US 2007/015536, озаглавленной «Способы получения панкреатических гормонов», полностью включенной в настоящее описание посредством ссылки. В предпочтительном варианте осуществления млекопитающим субъектом является субъект-человек. Особо предпочтительными субъектами являются те, кто признан имеющим состояние, ограничивающее способность субъекта к получения достаточных уровней инсулина в ответ на физиологически высокие концентрации глюкозы в крови. Диапазон уровней глюкозы в крови, представляющий физиологически высокий уровень глюкозы крови для какого-либо конкретного вида млекопитающий может легко определить рядовой специалист в данной области техники. Любой стойкий уровень глюкозы в крови, приводящий к выраженному заболеванию или состоянию, считается физиологически высоким уровнем глюкозы в крови.

Дополнительные варианты осуществления настоящего изобретения относятся к клетке, секретирующей инсулин in vivo, полученной из in vitro плюрипотентной стволовой клетки или ее потомства, например, мультипотентным клеткам, таким как клетка PDX-1 позитивной энтодермы передней части пищеварительного тракта, клетка PDX-1-позитивной панкреатической энтодермы или панкреатическая прогениторная клетка, эндокринный предшественник, такой как NGN3-позитивный эндокринный предшественник, или функциональная дифференцированная гормон-секретирующая клетка, такая как инсулин-, глюкагон-, соматостатин-, грелин- или панкреатический полипептид-секретирующая клетка. Любые из вышеописанных окончательно дифференцированных или мультипотентных клеток могут быть трансплантированы хозяину, или млекопитающему, и созревать в физиологически функциональные гормон-секретирующие клетки, такие как инсулин-секретирующие клетки, в ответ на высокие уровни глюкозы в крови хозяина. В предпочтительных вариантах осуществления клетки не образуют тератомы in vivo, и если она формируется, остаются локализованными в области трансплантата и могут легко быть отделены или удалены. В особо предпочтительных вариантах осуществления клетки не содержат какой-либо кариотипической аномалии во время процесса дифференцировки in vitro, или при трансплантации млекопитающему in vivo, или при созревании и развитии в функциональные островки in vivo.

Далее, хотя варианты осуществления, описанные в настоящей заявке, относятся к сконструированной или генетически рекомбинантной плюрипотентной клетке, мультипотентной или дифференцированной клетке, полученной из плюрипотентной клетки, такой как iPS клетка человека, на основе описания, обеспеченного в настоящей заявке, предполагается, что поскольку iPS клетки демонстрируют схожую физиологию и профили экспрессии маркерных генов с hES клетками и полученными из hES клетками, то они должны иметь схожие физиологические характеристики in vivo.

Способ инкапсулирования панкреатических прогениторов

В некоторых вариантах осуществления композиция плюрипотентных, мультипотентных и дифференцированных клеток, описанная в настоящей заявке, может быть инкапсулирована в биологическом и/или не-биологическом механическом устройстве, где инкапсулирующее устройство отделяет и/или изолирует композиции клеток от хозяина.

Способы инкапсулирования подробно описаны в заявке США №61/114,857, поданной 14 ноября 2008, озаглавленной «Инкапсулирование панкреатических прогениторов, полученных из HES клеток», и заявке США №61/121,086, поданной 12 декабря 2008, озаглавленной «Инкапсулирование клеток панкреатической энтодермы», которые полностью включены в настоящее описание посредством ссылки, и которые описывают инкапсулирование клеток панкреатической энтодермы с применением полупроницаемой мембраны, например, устройства Theracyte™ или Gore.

В одном варианте осуществления клетки, полученные из hES, инкапсулируют с применением биосовместимого полиэтиленгликоля (PEG). Инкапсулирование на основе PEG описано более подробно в патенте США №7,427,415, озаглавленной «Имплантация инкапсулированных биологических материалов для лечения заболеваний»; патенте США №6,911,227, озаглавленном «Гели для инкапсулирования биологических материалов»; и патентах США №№6,911,227, 5,529,914, 5,801,033, 6,258,870, озаглавленных «Гели для инкапсулирования биологических материалов», которые полностью включены в настоящее описание посредством ссылки, и которые описывают конформное покрытие агрегатов клеток с применением полиэтиленгликоля.

В одном варианте осуществления устройство для инкапсулирования содержит клетки, полученные из плюрипотентных, например, клетки PDX-1-позитивной энтодермы передней части пищеварительного тракта, клетки PDX-1-позитивной панкреатической энтодермы или прогениторные клетки, эндокринный предшественник, такой как NGN3-позитивный эндокринный предшественник, или функционально дифференцированные гормон-секретирующие клетки, такие как инсулин-, глюкагон-, соматостатин-, грелин-, или панкреатический полипептид-секретирующие клетки, в полупроницаемой мембране, предотвращающей проникновение трансплантированной популяции клеток, хранящейся в устройстве, и в то же самое время обеспечивающий проход некоторых секретируемых полипептидов, например, инсулина, глюкагона, соматостатина, грелина, панкреатического полипептида и тому подобного. Альтернативно, устройство имеет множество мембран, включая васкуляризованную мембрану.

Применение агентов для усиления и индукции роста, выживания, пролиферации и адгезии клеток плюрипотентных стволовых клеток человека, например, hES клеток и iPS клеток

На клеточную регуляцию можно влиять путем трансдукции экстрацеллюлярного сигнала через мембрану, что в свою очередь модулирует биохимические пути в клетке. Фосфорилирование белков представляет один вариант, при котором внутриклеточные сигналы передаются от молекулы к молекуле, в итоге приводя к клеточному ответу. Эти каскады трансдукции сигнала являются высоко регулируемыми, и часто перекрываются, о чем свидетельствует существование многих киназ, а также фосфатаз. Отмечалось, что у человека белковые тирозинкиназы, как известно, играют существенную роль в развитии многих патологических состояний, включая диабет, рак, а также связаны с широким рядом врожденных синдромов. Серин-треонин-киназы, например, Rho киназы, являются классом ферментов, ингибирование которых может быть пригодным для лечения заболеваний человека, включая диабет, рак и множество сердечнососудистых заболеваний и СПИД. Большинство ингибиторов, идентифицированных на сегодняшний день, действуют на участок связывания АТФ. Такие конкурирующие с АТФ ингибиторы продемонстрировали селективность благодаря своей способности к нацеливанию на менее консервативные области участка связывания АТФ.

Семейство Rho киназы малых ГТФ-связывающих белков содержит по меньшей мере 10 членов, включая Rho A-E и G, Rac 1 и 2, Cdc42, и ТС10. Ингибиторы часто обозначаются как ROK или ROCK ингибиторы, или ингибиторы Rho-киназы, и термины применяются взаимозаменяемо в настоящей заявке. Эффекторные домены RhoA, RhoB, и RhoC имеют одну и ту же аминокислотную последовательность, и по-видимому, имеют схожие внутриклеточные мишени. Rho киназа действует в качестве первичного медиатора, регулирующего последующие звенья каскада Rho, и существует в двух изоформах: α (ROCK2) и β (ROCK1). Белки семейства Rho киназы имеют каталитический (киназный) домен в их N-концевом домене, суперспиральный домен в средней части, и гипотетический плекстрин-гомологичный (РН) домен в С-концевом участке. Rho-связывающий домен ROCK локализован в С-концевой части суперспирального домена, и связывание ГТФ-связанной формы Rho приводит к повышению киназной активности. Rho/Rho-киназа-опосредованный путь играет важную роль в передаче сигнала, инициированной многими агонистами, включая ангиотензин II, серотонин, тромбин, эндотелии-1, норадреналин, тромбоцитарный фактор роста, АТФ/АДФ и экстрацеллюлярные нуклеотиды, и уротензин II. Через модуляцию своих целевых эффекторов/субстратов Rho киназа играет важную роль в различных функциях клетки, включая сокращение гладких мышц, организацию актинового цитоскелета, адгезию клеток и подвижность, и экспрессию генов. Благодаря роли, которую Rho киназные белки играют в опосредовании ряда функций клеток, считающихся связанными с патогенезом атеросклероза, ингибиторы этих киназ могут также быть пригодными для лечения или профилактики различных атеросклеротических сердечнососудистых заболеваний, и вовлечены в сокращение эндотелия.

В некоторых вариантах осуществления агенты, которые стимулируют и/или поддерживают рост клеток, выживание, пролиферацию и адгезию клеток, добавляют в различные среды для культивирования клеток, включая ингибиторы Rho-киназы Y-27632, Fasudil (также обозначаемый как НА1077), Н-1152Р и ITS (инсулин/трансферрин/селен; Gibco), Wf-536, Y-30141 (описан в патенте США №5,478,838, полностью включенном в настоящее описание посредством ссылки) и их производные, и антисмысловую нуклеиновую кислоту для ROCK; нуклеиновую кислоту, индуцирующую интерференцию РНК (например, миРНК), конкурирующие пептиды, пептиды-антагонисты, ингибирующие антитела, ScFV-фрагменты антител, доминантно-негативные варианты, и их векторы экспрессии, но не ограничиваясь ими. Далее, поскольку другие низкомолекулярные соединения известны как ингибиторы ROCK, такие соединения или их производные также можно применять в настоящем изобретении (например, см. патентные заявки США №№20050209261, 20050192304, 20040014755, 20040002508, 20040002507, 20030125344 и 20030087919, и Международные патентные публикации №№2003/062227, 2003/059913, 2003/062225, 2002/076976 и 2004/039796, которые полностью включены в настоящее описание посредством ссылки).

В настоящем изобретении можно также применять комбинацию одного или двух или более ингибиторов ROCK. Эти агенты функционируют, в свою очередь, путем стимуляции pe-ассоциации диссоциированных hES клеток, iPS или дифференцированных культур клеток, например, дефинитивной энтодермы, энтодермы передней части пищеварительного тракта, панкреатической энтодермы, панкреатического эпителия, популяций панкреатических прогениторов, эндокринных прогениторов и популяций, и тому подобного. Подобным образом, агенты могут функционировать, когда диссоциация клеток не происходит. Увеличение роста, выживания, пролиферации и адгезии клеток плюрипотентных стволовых клеток человека достигалось независимо от того, были ли клетки получены из агрегатов клеток в суспензии или из адгезионных культур (с компонентами экстрацеллюлярного матрикса или без низ, с сывороткой или без нее, с фидерными фибробластами или без них, с FGF или без него, с активином или без него). Повышение выживания этих популяций клеток облегчает и улучшает системы очистки с применением сортера клеток, таким образом, повышает выход клеток. Применение ингибиторов Rho киназы, таких как Y27632, может обеспечивать экспансию дифференцированных типов клеток, а также стимуляцию их выживания во время пассажей диссоциированных единичных клеток или криоконсервирования. Хотя ингибиторы Rho киназы, такие как Y27632, тестировали на плюрипотентных стволовых клетках человека (например, hES и iPS клетках), и клетках, дифференцированных из них, ингибиторы Rho киназы можно применять для других типов клеток, например, в целом, эпителиальных клеток, включая клетки тонкой кишки, легких, тимуса, почки, но не ограничиваясь ими, а также нервных типов клеток, таких как пигментный эпителий сетчатки.

Концентрация ингибитора ROCK в среде для культивирования клеток не ограничивается той, что описана в примерах ниже, с условием, что концентрация позволяет достичь необходимых эффектов, таких как усиление, повышение и/или стимуляция роста, выживания, пролиферации и адгезии клеток. Специалисту в данной области техники понятно, что может быть необходима оптимизация различных ингибиторов ROCK в различных условиях. Например, при использовании Y-27632 предпочтительная концентрация может быть в диапазоне примерно от 0,01 до 1000 мкМ, более предпочтительно примерно от 0,1 до 100 мкм, и еще более предпочтительно примерно от 1,0 до 50 мкМ, и наиболее предпочтительно примерно от 5 до 20 мкМ. Когда применяют Fasudil/HA1077, его можно использовать в концентрации, превышающей примерно в два или три раза концентрацию вышеупомянутого Y-27632. Когда применяют Н-1152, его можно применять в концентрации, составляющей, например, около 1/10, 1/20, 1/30, 1/40, 1/50 или 1/60 от концентрации вышеупомянутого Y-27632. Концентрация используемого ингибитора ROCK зависит отчасти от биологической активности и мощности ингибитора, и условий, в которых его применяют.

Время и период лечения ингибитором ROCK может быть ограниченным или не ограниченным, в зависимости от необходимых эффектов, таких как усиление, повышение и/или стимуляция роста, выживания, пролиферации (клеточной массы) и адгезии клеток. Однако добавление ингибитора ROCK может также влиять на дифференцировку необычным образом, как лучше описано в Примере 7. Примеры внизу описывают культуры плюрипотентных стволовых клеток человека и/или культуры дифференцированных клеток, обработанных в течение примерно 12 часов, 24 часов, 48 часов или больше.

Плотность культур плюрипотентных стволовых клеток человека, обработанных ингибитором ROCK, также не ограничена, если при этой плотности достигаются необходимые эффекты, такие как усиление, повышение и/или стимуляция роста, выживания, пролиферации и адгезии клеток. Плотность засеянных клеток можно регулировать в зависимости от множества факторов, включая применение адгезионных или суспензионных культур, специфическую рецептуру используемой среды для культивирования, условия роста и предполагаемое применение культивируемых клеток, но не ограничиваясь ими. Примеры плотности культур клеток включают 0,01×10⁵ клеток/мл, 0,05×10⁵ клеток/мл, 0,1×10⁵ клеток/мл, 0,5×10⁵ клеток/мл, 1,0×10⁵ клеток/мл, 1,2×10⁵ клеток/мл, 1,4×10⁵ клеток/мл, 1,6×10⁵ клеток/мл, 1,8×10⁵ клеток/мл, 2,0×10⁵ клеток/мл, 3,0×10⁵ клеток/мл, 4,0×10⁵ клеток/мл, 5,0×10⁵ клеток/мл, 6,0×10⁵ клеток/мл, 7,0×10⁵ клеток/мл, 8,0×10⁵ клеток/мл, 9,0×10⁵ клеток/мл, или 10,0×10⁵ клеток/мл, или больше, например, до 5×10⁷ клеток/мл, или любое значение между ними, но не ограничиваясь ими, при культивировании с хорошим ростом клеток, выживанием, пролиферацией и адгезией.

Применение агентов, активирующих члены семейства рецептора TGFβ

В другом варианте осуществления агенты, активирующие член семейства рецептора TGFβ, включают члены TGFβ суперсемейства факторов роста, как описано в настоящей заявке. Термин «член суперсемейства TGFβ», использующийся в настоящей заявке, или его эквиваленты означают более 30 структурно связанных белков, включая субсемейства, включающие TGFβ1, TGFβ2, TF-β3, GDF-15, GDF-9, BMP-15, BMP-16, BMP-3, GDF-10, BMP-9, BMP-10, GDF-6, GDF-5, GDF-7, BMP-5, BMP-6, BMP-7, BMP-8, BMP-2, BMP-4, GDF-3, GDF-1, GDF11, GDF8, активины βC, βE, βA и βB, BMP-14, GDF-14, MIS, ингибин-альфа, Lefty1, Lefty2, GDNF, нейротурин, персефин и артемин. См. Chang et al. (2002) Endocrine Rev. 23(6): 787-823.

Член семейства TGFβ может быть замещен, или использован в сочетании с активатором пути передачи сигналов TGFβ, который является соединением, стимулирующим один или несколько полипептидов или взаимодействий, участвующих в трансдукции или ином осуществлении изменений свойств клетки в ответ на член семейства TGFβ. Путь передачи сигнала TGFβ включает сами члены семейства TGFβ. Члены суперсемейства TGFβ передают сигналы к ядру путем передачи сигнала через рецепторы серин-треонин-киназы II и I типа и внутриклеточные эффекторы, известные как Smad. Эти рецепторы относятся к двум субсемействам, известным как рецепторы I и II типа, которые совместно действуют для связывания лиганда и передачи сигнала (Attisano et al., Mol Cell Biol 16 (3), 1066-1073 (1996)). Лиганды связывают рецепторы I и II типа на поверхности клеток, стимулируя активацию рецептора I типа через фосфорилирование. Этот активированный комплекс, в свою очередь, активирует внутриклеточные Smad, которые собирают мульти-субъединичные комплексы, регулирующие транскрипцию. Члены суперсемейства TGFβ разделяются на две подгруппы передачи сигнала: те, чья функция связана с TGFβ/активином, и те, чья функция связана с субсемейством BMP/GDF. Считают, что большинство лигандов TGFβ связываются вначале с рецептором II типа, и этот комплекс лиганд/рецептор II типа затем рекрутирует или фосфорилирует рецептор I типа (Mathews, LS, Endocr Rev 15: 310-325 (1994); Massague, Nature Rev: Mol Cell Biol. 1, 169-178 (2000)). Киназа рецептора II типа фософрилирует и активирует киназу рецептора I типа, которая затем фосфорилирует и активирует белки Smad. Лиганды TGFβ/активин связываются с рецепторами II типа TGFβ и активина, и могут активировать Smad-2 и -3, Nodal и Lefty сигнал посредством этого пути активинового типа. BMP/GDF лиганды связываются рецепторами BMP II типа, и могут активировать Smad 1, 5, и 8. См. Derynck, R et al. Cell 95, 737-740 (1998)). При стимуляции лигандом Smad перемещаются к ядру и функционируют в качестве компонентов комплексов транскрипции.

Передача сигнала TGFβ регулируется позитивно и негативно через различные механизмы. Позитивная регуляция усиливает сигнал до уровня, достаточного для биологической активности. Лиганды суперсемейства TGFβ связываются с рецептором II типа, который привлекает и фосфорилирует рецептор I типа. Рецептор I типа затем фосфорилирует SMAD, регулируемые рецептором (R-SMAD, например, SMAD1, SMAD2, SMAD3, SMAD5, и SMAD8) которые связывают общий медиатор Smad или coSMAD. Комплексы R-SMAD/coSMAD аккумулируются в ядре, где они действуют, как факторы транскрипции, и участвуют в регуляции экспрессии целевого гена. Например, факторы роста и дифференцировки включают 1, 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 и 15. В одном предпочтительном варианте осуществления GDF8 и GDF11 являются членами семейства TGFβ, которые также являются активаторами пути передачи сигнала TGFβ (позитивной регуляции), и действуют путем связывания с экстрацеллюлярной частью лиганд-связывающего домена ActRII рецептора, а затем образуют комплекс с ActRI, приводя к ингибированию Smad7 негативного регулятора и фосфорилированию комплекса Smad2/Smad3. Комплекс Smad2/Smad3 ассоциируется с Smad4 для регуляции экспрессии некоторых генов.

Негативная регуляция передачи сигнала TGFβ осуществляется на экстрацеллюлярном, мембранном, цитоплазматическом и ядерном уровне. Передача сигнала может быть прервана для подавления передачи сигналов, инициированных TGFβ. Это может осуществляться любыми средствами, известными в данной области техники, при которых взаимодействие между рецептором(ами) TGFβ и белком SMAD антагонизируется или предотвращается, включая белки, которые блокируют или конкурируют за взаимодействие с рецептором TGFβ и белком SMAD. Альтернативно, транскрипция или трансляция TGFβ рецептора или SMAD белка может быть изменена любыми средствами, известными в данной области техники, для предотвращения передачи сигнала по пути передачи сигнала. Дополнительные примеры позитивной и негативной регуляции различных белков членов семейства TGFβ приведены в более подробном описании некоторых факторов ниже.

Как с применением любого агента, концентрация любого члена суперсемейства TGFβ в среде для культивирования клеток не ограничивается описанной в примерах ниже, если концентрация позволяет достичь необходимых эффектов, например, чтобы активировать член семейства рецептора TGFβ. Например, при использовании активинов, например, активина А и/или В, или GDF8 and GDF-11, предпочтительная концентрация может быть в диапазоне примерно от 10 до 300 нМ, более предпочтительно, примерно от 50 до 200 нМ, и еще более предпочтительно примерно от 75 до 150 нМ, и наиболее предпочтительно примерно от 100 до 125 нМ. Рядовой специалист в данной области техники сможет легко протестировать любую концентрацию, и с применением стандартных методик в данной области техники определить эффективность такой концентрации, например, оценить дифференцировку путем определения экспрессии и отсутствии экспрессии панели генетических маркеров для любого типа клеток.

Эти и другие факторы роста, используемые для дифференцировки плюрипотентных стволовых клеток человека, описаны более подробно в заявке США №12/132,437, озаглавленной «Факторы роста для получения дефинитивной энтодермы», поданной 3 июня 2008, полностью включенной в настоящее описание посредством ссылки.

После общего описания настоящего изобретения можно получить дополнительные разъяснения со ссылкой на определенные конкретные примеры, которые приведены в настоящей заявке в целях иллюстрации, и не предназначены для ограничения.

Примеры

Необходимо также понимать, что вышеизложенное относится к предпочтительным вариантам осуществления настоящего изобретения, и многочисленные изменения могут быть выполнены без выхода за рамки, определяющие объем настоящего изобретения. Изобретение далее иллюстрировано следующими примерами, которые не должны рассматриваться как ограничивающие объем изобретения. Напротив, необходимо ясно понимать, что изобретение может выполняться в различных других вариантах осуществления, модификациях и эквивалентах, которые после прочтения описания могут быть предложены специалистом в данной области техники без выхода за рамки, определяющие сущность настоящего изобретения и/или объем формулы изобретения.

Пример 1

Дифференцировка iPS клеток человека в панкреатические прогениторные и эндокринные клетки через дефинитивную энтодерму и энтодермальные промежуточные формы

Индуцированные плюрипотентные стволовые (iPS) клетки человека дифференцировали в суспензионных агрегатах с применением четырех (4) этапной процедуры в течение примерно 2 недель (или 14 дней) для генерации популяции панкреатических типов клеток, включая панкреатические прогениторы, эндокринные прогениторы и гормон-экспрессирующие эндокринные клетки. Линии iPS клеток человека, применяемые в настоящей заявке, были предоставлены S. Yamanaka, Университет Киото, Япония, и Cellular Dynamics International, Inc. (CDI).

Эти iPS клетки, описанные в настоящей заявке, вначале получали от Shinja Yamanaka, а позднее от CDI. Недифференцированные iPS клетки выращивали на митотически инактивированных эмбриональных фибробластах мыши, или предпочтительно без фидеров (без фидерного слоя фибробластов) в DMEM/F12, содержащей 20% замены нокаутной сыворотки. Дифференцировку инициировали путем диссоциации недифференцированных iPS клеток на отдельные клетки с применением аккутазы, образцы клеток отбирали на выделение и анализ РНК. Клетки ресуспендировали по 1-2 миллиона клеток на миллилитр в RPMI + 0,2% о/о FBS, содержащей 1:5000 разведение инсулина-трансферрина-селена (ITS), активин А (100 нг/мл), wnt3a (50 нг/мл), и ингибитор rho-киназы или ROCK ингибитор, Y-27632 в 10 мкМ, помещая в 6-луночный планшет с ультранизким прикреплением, помещая на ротационную платформу и вращая примерно при 100 об./мин. Культуры вращали при 100 об./мин в оставшейся части процесса дифференцировки с ежедневной заменой среды. Рост, пассирование и пролиферация iPSC были по существу такими, как описано в патентах США №№7,961,402 и 8,211,699, описания которых полностью включены в настоящее описание посредством ссылки.

Способы, описанные в настоящей заявке для получения агрегатных суспензионных культур плюрипотентных клеток, например, hES или iPS клеток, и клеток, полученных из плюрипотентных клеток, являются по существу такими, как описано в PCT/US 2007/062755, поданной 23 февраля 2007 и озаглавленной «Композиции и способы для культивирования различных клеток» и PCT/US 2008/080516, поданной 20 октября 2008 и озаглавленной «Способы и композиции для бесфидерных сред для плюрипотентных стволовых клеток, содержащих сыворотку человека», которые полностью включены в настоящее описание посредством ссылки.

Способы, описанные в настоящей заявке, можно упростить, прежде всего, покрытием сосуды для культивирования экстрацеллюлярным матриксом, например, как описано в патенте США 6,800,480 от Bodnar et al., принадлежащем Geron Corporation. Эти способы, а также другие способы культивирования других плюрипотентных стволовых клеток, например, hES и iPS клеток, можно осуществить с применением растворимой сыворотки человека, по существу, как описано в заявке США PCT/US 2008/080516, поданной 20 октября 2008 и озаглавленной «Способы и композиции для бесфидерных сред для плюрипотентных стволовых клеток, содержащих сыворотку человека», которые полностью включены в настоящее описание посредством ссылки.

Способы, описанные в настоящей заявке, можно упростить с помощью экзогенно добавленного фактора роста фибробластов (FGF), полученного из иного источника, чем просто фидерный слой фибробластов, как описано в патенте США №7,005,252, Thomson, J., принадлежащем Wisconsin Alumni Research Foundation (WARF), который полностью включен в настоящее описание посредством ссылки.

В течение примерно первых 24 часов вращения, отдельные клетки, прилипающие друг к другу, образуют агрегаты клеток, и достаточные образцы клеток были взяты для изоляции и анализа РНК. Агрегаты клеток находились в диапазоне примерно от 60 микрон до 120 микрон в диаметре. Спустя примерно 1 день (24 часа) после помещения образцов iPS клеток на ротационную платформу, в культуры подавали RPMI + 0,2% о/о FBS, содержащей 1:5000 разведение ITS, активин А (100-200 нг/мл), и Wnt3a (50-100 нг/мл), или примерно на один день (время 0 до 1 дня) и дополнительный день, или в ту же самую среду, но без Wnt3a (день 1 - день 2). Ежедневно образцы клеток отбирали для выделения и анализа РНК. После двух дней дифференцировки в культуры вносили RPMI+0,2% о/о FBS, содержащую 1:1000 разведение ITS, KGF (или FGF7, 25 нг/мл), и ингибитор TGFβ №4 (2,5 мкМ) на один день (или 24 часа, день 2 - день 3). На следующие два дня (день 3 - день 5) в агрегатные суспензии iPS клеток вносили те же самые коктейли из среды и факторов роста, за тем исключением, что ингибитор TGFβ удаляли из среды для культивирования. Вновь, образцы клеток отбирали для выделения РНК в конце этой стадии (стадия 2, или день 5). Для стадии 3 (день 5 - день 8) среду для культивирования клеток заменяли на DMEM + 1% о/о В27 добавки, содержащей TTNPB [4-[Е-2-(5,6,7,8-тетрагидро-5,5,8,8-тетраметил-2-нафталенил)-1-пропенил] бензойную кислоту] (3 нМ), KAAD-циклопамин (0,25 мкМ) и ноггин (50 нг/мл). Вновь, образцы клеток отбирали для выделения и анализа РНК в конце этой стадии (стадия 3, день 8). Для стадии 4 (день 8 - день 14) среды меняли на DMEM + 1% о/о В27 добавку, содержащую ноггин (50 нг/мл), KGF (50 нг/мл) и EGF (50 нг/мл). Вновь, образцы клеток отбирали для выделения и анализа РНК в конце стадии 4 (или дня 14).

ПЦР в режиме реального времени проводили для определения экспрессии гена для различных маркерных генов в течение курса дифференцировки. Экспрессия генов специфических маркеров вначале нормализовалась до среднего уровня экспрессии конститутивных генов, экспрессии циклофилина G и ТАТА-связывающего белка (ТВР). Нормализованную относительную экспрессию генов затем отображали на диаграммах относительно уровня экспрессии в недифференцированных iPS клетках, и показывали кратность возрастания различных маркеров дифференцировки. Для ОСТ4 экспрессия генов была нормализована для установки самого низкого образца в наборе данных (день 14), и таким образом, представляющего кратность снижения в ходе дифференцировки.

Фигуры 2A-L являются диаграммами, демонстрирующими относительную экспрессию идентифицированного гена (например, Oct4, Brachyury, Cer1, GSC, FOXA2, FOXA1, HNF6, PDX1, PTF1A, NKX6.1, NGN3 и INS) относительно уровня экспрессии того же самого гена в недифференцированных iPS клетках. Уровень экспрессии генов был нормализован для установки конститутивных генов (контроль), а сравнение уровня экспрессии генов в два различных момента времени показало, имеется ли повышающая или понижающая регуляция гена или маркера экспрессии. Для ОСТ4 (Фиг. 2А) экспрессия гена была нормализована, и образец с самым низким уровнем экспрессии был установлен на 1 (день 14). Таким образом, как показано на Фиг. 2, относительные уровни экспрессии ОСТ4 представляют кратность понижающей регуляции (ось Y) в течение курса дифференцировки (ось X, стадия 0-4, или день 0 - день 14).

Как показано на Фигуре 2А, ОСТ4 (POU5F1) экспрессируется на высоких уровнях в недифференцированных iPS клетках, и проявляет последующую понижающую регуляцию в ходе дифференцировки (день 0 - день 14). В день 14 уровни экспрессии ОСТ4 более чем в 3000 раз снижаются по сравнению с уровнями экспрессии, наблюдавшимися в недифференцированных клетках. Напротив, имеется временная повышающая регуляция экспрессии гена brachyury (BRACHYURY, Фиг. 2В) в течение первых 2 дней (день 1 и день 2). Временная повышающая регуляция гена brachyury была результатом направленной дифференцировки плюрипотентных / iPS клеток в мезоэнтодермы путем применения активина А и wnt3a. Мезоэнтодерма была дополнительно дифференцирована в дефинитивную энтодерму во время дней 2-3 путем длительного воздействия активина А, на что указывала повышающая регуляция CER1, GSC и FOXA2 в конце стадии 1 в день 3 (Фиг. 2С-Е). Во время стадии 2 дефинитивную энтодерму дальше подвергали направленной дифференцировке в энтодерму кишечной трубки, как показано повышающей регуляцией FOXA1, сохранением экспрессии FOXA2 и понижающей регуляцией CER1 и GSC на день 6 дифференцировки (Фиг. 2С-F). Во время стадии 3, при воздействии ретиноида, циклопамина и ноггина, энтодерму кишечной трубки далее подвергали направленной дифференцировке в заднюю часть передней кишки / PDX1-экспрессирующую энтодерму, на что указывала повышающая регуляция HNF6 и PDX1 в день 8 (Фиг. 2G-Н). Во время стадии 4, при воздействии KGF и EGF, задняя часть передней кишки / PDX1-экспрессирующая энтодерма дополнительно направлялась к дифференцировке в панкреатические прогениторы, эндокринные прогениторы, и гормон-экспрессирующие эндокринные клетки, на что указывала повышающая регуляция PTF1A, NKX6-1, NGN3 и INS в день 14 (Фигура 2I-L).

Пример 2

Ингибиторы Rho-киназы стимулируют рост, выживание, пролиферацию и адгезию iPS клеток

Способы дифференцировки различных hES и iPS линий клеток были по существу такими же, как описано в настоящей заявке и в Примере 1. В дополнение к условиям культивирования, как описано для стадий 1, 2, 3, 4 и 5, ингибитор апоптоза и/или ингибитор Rho-киназы или ROCK добавляли в среды для культивирования для повышения и активизации роста, выживания, пролиферации и адгезии клеток во время дифференцировки. Как правило, примерно 10 мкМ ингибитора Rho-киназы, например, Y-27632, добавляли в культуры клеток на каждой из стадий. Альтернативно, ингибитор Rho-киназы добавляли по меньшей мере на стадиях 1 и 2 и стадиях 4 и 5, или любой их комбинации. Морфология и профили экспрессии генетических маркеров суспензионных (агрегатных) культур дифференцированных iPS клеток были по существу схожими с суспензионными культурами клеток, полученными из hES клеток.

На Фигурах 3 и 4 показаны результаты иммуноцитохимии (ICC) iPS культур клеток со стадий 4 и 5, соответственно. На Фигуре 3 показаны агрегаты клеток со Стадии 4, экспрессирующие типичные генетические маркера, характерные для PDX1-позитивной панкреатической энтодермы (также обозначаемой как панкреатический эпителий или панкреатические прогениторы), включая PDX1/ NKX6.1 со-позитивные клетки. Хотя это не показано на Фиг. 3, на Стадии 4 клетки не экспрессируют гормон-секретирующих белковых или генетических маркеров, более типичных для клеток Стадии 5, таких как инсулин (INS), глюкагон (GCG), соматостатин (SST) и панкреатический полипептид (РР). На Фигуре 4 показаны агрегаты клеток гормон-экспрессирующих клеток со Стадии 5. Результаты ICC были дополнительно подтверждены с применением QPCR. Однако поскольку QPCR является общим популяционным исследованием общего уровня РНК, экспрессируемой в образце или культуре клеток, нельзя определенно показать, что любая клетка экспрессирует множество маркеров.

Пример 3

Инкапсулирование панкреатических предшественников, полученных из IPS

На сегодняшний день описаны способы получения IPS клеток и источники для получения IPS клеток. Однако нет достаточного описания дифференцировки каких-либо IPS клеток в какие-либо дифференцированные клетки для потенциального применения в клеточной терапии для лечения конкретного заболевания, например, диабета.

Чтобы определить, действительно ли культуры PDX1-позитвной панкреатической энтодермы или культуры панкреатических клеток-предшественников со Стадии 4, полученные из iPS клеток человека, полностью способны к развитию и созреванию in vivo в чувствительные к глюкозе инсулин-секретирующие клетки, популяции панкреатических предшественников, по существу, как описано в Примерах 1 и 2, загружали в макро-инкапсулирующие устройства, по существу подобные тем, которые описаны в заявке США №12/618,659, озаглавленной «Инкапсулирование панкреатических линий клеток, полученных из плюрипотентных стволовых клеток человека», поданной 13 ноября 2009; и патентах США №№7,534,608 и 7,695,965, озаглавленных «Способы получения панкреатических гормонов», полностью включенных в настоящее описание посредством ссылки. Вкратце, примерно 5-10-20 мкл осажденных под действием гравитации агрегатов суспензий клеток загружали в каждое устройство, содержащее по существу примерно 3×10⁶ клеток.

Инкапсулированные клетки в устройстве затем готовили к имплантации млекопитающему, например, мыши с иммунной недостаточностью SCID/Bg, но могли имплантировать более крупным животным, включая крыс, свиней, обезьян или людей. Способы имплантации инкапсулированных клеток и устройства являются по существу такими, как описано в патентной заявке США №12/618,659, патентах США №№7,534,608 и 7,695,965, включая панкреатические клетки-предшественники, имплантированные на GELFOAM матрикс и введенные под эпидидимальную жировую ткань (EFP).

Для данных исследований не была нужна иммуносупрессия, однако иммуносупрессия может требоваться для некоторых млекопитающих в начальный переходный период, пока предшественники внутри устройства не созреют полностью и не станут отвечать на глюкозу. У некоторых млекопитающих режим иммуносупрессии может занимать примерно 1, 2, 3, 4, 5, 6 или больше недель, и будет зависеть от млекопитающего.

Трансплантированным клеткам позволяли дифференцироваться и дополнительно созревать in vivo. Чтобы определить, действительно ли трансплантированные клетки обладают нормальной физиологической функцией, например, как натуральные бета-клетки, нужно определить уровни инсулина человека путем тестирования уровней С-пептида человека. С-пептид человека отщепляется или процессируется из проинсулина человека, таким образом, специфическое определение С-пептида человека, а не эндогенного С-пептида указывает на секрецию инсулина из пересаженных (экзогенных) клеток. У животных с имплантатами определяли уровни С-пептида человека примерно каждые две, три или четыре недели путем инъекции болюса аргинина или глюкозы, предпочтительно глюкозы. Созревшие бета-клетки (полученные из дифференцированных плюрипотентных iPS клеток) должны быть физиологически функциональными и чувствительными к глюкозе, подобно натуральным или эндогенным бета-клеткам. Как правило, количества С-пептида человека выше 50 пМ или среднего базового (порогового) уровня, являются индикатором функции бета-клеток из трансплантированных предшественников.

Подобно описанным в Kroon et al. (2008) выше, заявке США №12/618,659, патентах США №№7,534,608; 7,695,965 и 7,993,920, полностью включенных в настоящее описание посредством ссылки, инкапсулированные панкреатические прогениторы, полученные из hIPS клеток, как ожидается, созревают в функционирующие кластеры панкреатических островков, содержащие эндокринные, ацинарные и дуктальные клетки, подобно натуральным островкам. Также предполагается, что очищенные или обогащенные панкреатические прогениторы, полученные из hIPS клеток перед трансплантацией, также созревают и развиваются в функциональные панкреатические островки и продуцируют инсулин in vivo. Некоторые варианты осуществления для очистки и обогащения различных дифференцированных популяций клеток описаны более подробно в заявке США №12/107,020, озаглавленной «Способы очистки энтодермальных и панкреатических энтодермальных клеток, полученных из hES клеток», поданной 8 апреля 2008, теперь патенте США 8,338,170, полностью включенном в настоящее описание посредством ссылки. Также предполагается, что панкреатические прогениторы, полученные из hIPS клеток, которые были подвергнуты криоконсервации, могут оттаивать и адаптировать в культуре перед трансплантацией, и созревать и продуцировать инсулин in vivo, соответственно. Гипогликемия может быть облегчена у животных с индуцированным диабетом, которым трансплантировали панкреатические прогениторы, полученные из hIPS клеток.

В итоге, полностью инкапсулированные панкреатические прогениторные клетки, полученные из hIPS клеток в макро-инкапсулирующем устройстве, созревают в физиологически функциональные панкреатические островки, и как ожидается, продуцируют инсулин в ответ на глюкозу in vivo.

Пример 4

Композиции панкреатических клеток-предшественников и гормон-секретирующих клеток

Популяции дифференцированных hIPS клеток анализировали с применением проточной цитометрии для определения содержания клеток PDX1-позитивной панкреатической энтодермы или панкреатических клеток-предшественников (на стадии 4); и эндокринных клеток или эндокринных клеток-предшественников (на стадии 5), как показано в Таблицах 5а, 5b и 6, соответственно. В таблице 5b представлены те же данные, что и в Таблице 5а, но представлены подобно данным из Таблицы 9 для сравнения. Популяции из таблицы 5а перекрываются, например, общее число клеток превышает 100%, поскольку общее число PDX1+ и NKX6.1+ перекрывается с NKX6.1+/PDX1+/CHGA- популяциями клеток (5-я колонка из Таблицы 5а). Таблица 5b включает только данные PDX1+ и тройные негативные, что не показано в Таблице 5а. Некоторые из этих iPEC трансплантатов, а также другие, с применением по существу схожих рецептур, имплантировали животным для определения функции in vivo, однако, уровни сывороточного С-пептида человека были недостаточно стойкими для какой либо потенциальной терапевтической цели (данные не показаны). Показанные значения являются процентами от общих клеток, принадлежащих к данной популяции. Ряд панкреатических прогениторов (NKX6.1(+) / PDX1(+) /Хромогранин А(-)) и очень маленькая популяция NKX6.1+/PDX1-/CHGA- находятся в агрегатах суспензий клеток, что согласуется с тем, что наблюдалось в агрегатах суспензий панкреатических прогениторных клеток, полученных из hES клеток и агрегировавших на стадии ESC, как описано в заявке США №12/264,760, озаглавленной «Композиции агрегатных суспензий стволовых клеток, и способы их дифференцировки», поданной 4 ноября 2008 и полностью включенной в настоящее описание посредством ссылки. Уровни эндокринных клеток и/или эндокринных клеток-предшественников также по существу согласовались с полученными в культур клетоках, полученных из hES клеток из заявки США 12/107,020, озаглавленной «Способы очистки клеток энтодермы и клеток панкреатической энтодермы, полученных из hES клеток», поданной 8 апреля 2008, полностью включенной в настоящее описание посредством ссылки. Подобно агрегатам суспензий, полученных из hES клеток, изменение концентраций различных факторов роста в среде для культивирования на определенных стадиях дифференцировки (например, стадии 4), должно повышать и/или снижать определенные популяции клеток панкреатической энтодермы, эндокринных клеток, клеток PDX1-позитивной энтодермы или не-панкреатических типов клеток.

Пример 5

Тирозинкиназы PEC рецептора

Вышеописанные примеры по существу подобны тем, что описаны в Таблице 7 ниже, адаптированным из Schulz et al., (2012), выше. Эти и другие способы, описанные в настоящей заявке, можно найти во многих патентных и не-патентных публикациях заявителя, включая патенты США №№7,964,402; 8,211,699; 8,334,138; 8,008,07; и 8,153,429, описания которых полностью включены в настоящее описание посредством ссылки.

Когда вышеуказанные способы применяли к iPS клеткам и панкреатическим предшественникам, трансплантированным животным, автор заявки не смог впоследствии получить ту же самую устойчивую функцию in vivo, по сравнению с тем, когда те же самые способы применяли к hESC и панкреатическим - предшественникам, полученным из hES. Это было удивительно, поскольку iPS клетки являются плюрипотентными стволовыми клетками человека, которые имеют морфологию и характеристики экспрессии генов hESC, и могут формировать как эмбриоидные тельца in vitro, так и тератомы in vivo, что указывает, что они могут формировать клетки из всех трех зародышевых слоев. См., по меньшей мере, например, Yu et al. (2007); патентную публикацию США №2009/0047263, Международную патентную публикацию №WO 2005/80598; патентную публикацию США №2008/0233610; и Международную патентную публикацию №WO 2008/11882, выше. Эти ссылки описывают, что iPS клетки удовлетворяют критериям определения для ESC. Таким образом, ожидается, что iPS клетки могут заменять ESC в протоколе дифференцировки in vitro для получения панкреатических прогениторных клеток, полученных из hES, которые дальше созревают и развиваются в полностью функциональные чувствительные к глюкозе клетки in vivo. Однако, с учетом не согласующихся данных по функциональности in vivo с применением вышеуказанных способов, автор заявки предложил использовать рецептуру сред для дифференцировки, уникальную для панкреатических предшественников и/или панкреатических энтодермальных клеток (РЕС), т.е. клеток, полученных на стадии 4 из hiPSC (или «iPEC»), которые способны к обеспечению по существу схожих устойчивых уровней функции in vivo, которая впоследствии наблюдалась для РЕС, полученных из hESC.

Авторы настоящей заявки ранее сообщали, что эндокринные (CHGA+) клетки, присутствующие в РЕС, являются полигормональными эндокринными клетками, и не являются субпопуляцией клеток РЕС, которые дают начало островкам, содержащим чувствительные к глюкозе инсулин-секретирующие клетки in vivo. См. Kelly et. al. (2011) выше. Скорее, они являются популяцией не-эндокринных клеток (CHGA-клеток), особенно тех, которые совместно экспрессируют NKX6.1 и PDX-1, которые считаются РЕС, которые действительно дают начало функциональным островкам in vivo. Таким образом, авторы заявки исследовали, действительно ли модуляция, изменение или сдвиг взаимных соотношений эндокринных и не-эндокринных субпопуляций может влиять впоследствии на функцию in vivo.

Предыдущие попытки расшифровки передачи сигналов рецептор-лиганд в hESC привели к успешной идентификации факторов роста, стимулирующих самообновление и обеспечивающих разработку определенных условий среды для культивирования. См. Wang et al (2007) выше. Wang et al. идентифицировали херегулин-1β в качестве лиганда, связывающегося с ERBB3 и индуцирующего димеризацию с ERBB2 для влияния на самообновление hESC в этом контексте. ERBB является рецепторной тирозинкиназой (RTK), a RTK является широко экспрессируемыми мембранными белками, которые действуют в качестве рецепторов для факторов роста и других экстраклеточных сигнальных молекул. При связывании лиганда они подвергаются фосфорилированию тирозина в специфических участках в цитоплазматическом хвосте и выделяют сигнальный каскад для связывания других белковых субстратов, вовлеченных в RTK-опосредованную трансдукцию сигнала. Функция RTK в некоторых процессах развития, включая регуляцию выживания клеток, пролиферацию и подвижность, и ее роль в образовании рака хорошо документирована. Также известно, что рецепторы ERBB тирозинкиназы экспрессируются на протяжении развития фетальной поджелудочной железы человека, хотя специфическая роль некоторых ERBB рецепторов и их лигандов неизвестна. См. Mari-Anne Huotari et al. (2002) «ERRB Signaling Regulates Lineage Determination of Developing Pancreatic Islet Cells in Embryonic Organ Culture», Endocrinology 143(11): 4437-4446 («Передача сигналов с помощью ERRB регулирует дифференцировку линий при развитии клеток панкреатических островков в эмбриональной органной культуре»).

Благодаря роли передачи сигналов с помощью ERBB RTK в самообновлении плюрипотентных стволовых клеток и их экспрессии в фетальной поджелудочной железе человека, как показано Wang et al. (2007) выше, и ERBB RTK экспрессии в фетальной поджелудочной железе человека, авторы настоящей заявки стали исследовать потенциальную активацию RTK in vitro в клетках панкреатической энтодермы (РЕС), полученных из hES, в попытке идентифицировать рецепторы и лиганды, которые могут улучшать специализацию РЕС во время дифференцировки, или экспансию путем стимуляции самообновления, или каких-либо других неизвестных механизмов, которые стимулируют созревание до физиологически функциональных островковых гормон-секретирующих клеток in vivo. РЕС генерировали в суспензии в дифференцированных агрегатах, по существу как описано в Таблице 7, за исключением следующих модификаций.

Четыре образца РЕС генерировали для RTK блоттинг-анализа. «Равновесный» образец РЕС агрегатов в db-N50 K50 Е50 собирали в конце стадии 4 (или d13). «Обедненный» образец представляли d12 РЕС агрегаты с добавлением db (DMEM с высоким содержанием глюкозы или DMEM с высоким содержанием глюкозы с добавлением 0,5х В-27 добавки (Life Technologies)) среды по отдельности (без факторов роста), и собирали в d13. Два «активированных» образца питали и культивировали в средах db на d12, затем на d13 питали либо db-K50 Е50 средами, либо db средами, содержащими 2% FBS, в течение 15 минут до сбора. Такие условия были предназначены для выявления RTK, которые были активными в условиях стадии 4, и чей ответ мог быть выявлен с импульсом KGF, EGF и инсулина (присутствовавшего в добавке В27), или сыворотке. Активация сывороткой предназначалась в качестве стимула факторов роста широкого спектра действия, потенциально идентифицирующего RTK, которые присутствовали на РЕС и могли быть активированы, но не стимулированы представленными условиями стадии 4.

Анализ RTK проводили по существу так, как описано ранее в Wang et al, (2007) выше. Вкратце, Proteome Profiler™ фосфо-RTK матрицы антител человека (R&D Systems) применяли в соответствии с инструкциями производителя. Белковые лизаты готовили в 1% NP-40, 20 мМ Трис-HCl (рН 8,0), 137 мМ NaCl, 10% глицерине, 2,0 мМ ЭДТА, 1,0 мМ натрия ортованадата, 10 мкг/мл апротинина, и 10 мкг/мл лейпептина. 50 мкг свежих белковых лизатов инкубировали в течение ночи с нитроцеллюлозными мембранами, на которые наносили двойные пятна с 42 анти-RTK антителами и 5 негативными контрольными антителами, а также 8 анти-фосфотирозин-позитивных контрольных пятен (Фигура 5А). Матричные антитела улавливали экстрацеллюлярные домены фосфорилированных и нефосфорилированных RTK, а связанные фосфо-RTK выявляли с универсальным анти-фосфо-тирозиновым антителом, конъюгированным с пероксидазой хрена (HRP) с применением хемилюминесценции. См. фигуру 5 для размещения RTK матрицы, а также Таблицу 8 внизу для перечисления RTK в матрице.

Анализ пятен RTK (Фигура 6А) показал, что инсулин- и IGF1-рецепторы (IR, IGF1R, соответственно) были фосфорилированы и активированы во всех условиях, подобно тому, что наблюдалось раньше с hESC. См. Wang et al (2007) выше. EGF рецептор (EGFR, также известный как ERBB1) был фосфорилирован в равновесных состояниях, которые ожидались с учетом присутствия EGF в среде на стадии 4. Действительно, низкоуровневое фосфорилирование ERBB2 наблюдалось как в равновесном состоянии, так и в обедненных условиях. Фосфорилирование и EGFR, и ERBB2 было повышено в каждом из активированных условий, что подтверждало способность анализа к выявлению активации в ответ на импульс лиганда. Фосфорилированный VEGFR3 был также выявлен во всех условиях, и был повышен в активированных образцах. Это позволило предположить, что РЕС продуцируют эндогенный VEGFR3 лиганд, возможными кандидатами являются VEGF-C и D. Сывороточный стимул, как оказалось, активировал дополнительные рецепторы, включая низкие уровни ERBB3 фосфорилирования. Обнаружение фосфорилированного ERBB2/3 показывает, что херегулин-подобный член семейства EGF может активировать передачу сигналов в PEC. TIE-2 является одним из двух рецепторов ангиопоэтина, и как кажется, фосфорилируется в низких уровнях в ответ на сыворотку. Ангиопоэтин 1 и ангиопоэтин 4, как известно, являются активирующими лигандами TIE-2, в то время как ангиопоэтин 2 и ангиопоэтин 3 функционируют как контекстно-зависимые конкурентные антагонисты. HGF-рецептор (HGFR) также фосфорилировался в ответ на сывороточный стимул, что позволило предположить, что фактор роста гепатоцитов может также вызывать передачу сигналов в РЕС. Наконец, в то время как был выявлен низкий уровень фосфорилирования эфрин В 2 RTK (ЕРНВ2), передача сигналов с помощью эфрин/Eph является мембрано-связанной системой передачи сигналов между клетками, и вряд ли легко используется в дифференцировке РЕС. Интересно, что ERBB4 не был фосфорилирован. Таким образом, анализ RTK выделил некоторые рецепторы, которые фосфорилировались в РЕС, или могли быть фосфорилированы в ответ на различные условия, например, сыворотку. Эти результаты позволили предположить, что некоторые растворимые лиганды могут вызывать передачу сигналов с помощью RTK в РЕС и возможно, воздействовать на пролиферацию клеток, дифференцировку и/или специализацию, и таким образом, возможно, влиять на последующее созревание в функционирующие панкреатические островки in vivo.

Пример 6.

Херегулин и FGF2 факторы роста влияют на РЕС, полученные из композиций hESC

С учетом анализов RTK, которые показали, что некоторые RTK были активированы (или фосфорилированы) в определенных условиях, как описано выше в Примере 5, и поскольку было выявлено, что по меньшей мере ERBB2 и ERBB3 были активированы в РЕС (спустя 13 дней дифференцировки из стадий 1-4), автор настоящей заявки решил определить эффект херегулина при применении для клеток на стадии 3 и 4.

Предварительные исследования проводили с применением херегулина и FGF. В некоторых из этих исследований включали ингибитор Rho-киназы, Y-27632. Эти предварительные исследования показали, что обработка плюрипотентных стволовых клеток в течение одного дня на стадии 1 с 10 нг/мл херегулина-1β (той же самой концентрацией и изомером херегулина, как описано в Wang et al. (2007)) повышала размер агрегатов клеток, полученных их hES клеток в суспензионной культуре, по сравнению с размером агрегатов, полученных их hES клеток в суспензионной культуре без херегулина-1β (Ηrg1β). Повышение размера агрегатов клеток является предпочтительным в том, что приводит к более высокой массе клеток для последующей имплантации и анализа функций у животных. Кроме того, размер диска агрегатов повышался при увеличении Ηrg1β от 10 нг/мл до 50 нг/мл на стадии 3. Этот результат также наблюдался, когда 50 нг/мл другого фактора роста, FGF2, использовали на стадии 3, по сравнению с культурами при отсутствии FGF2. Повышение размера агрегатов клеток также наблюдалось, когда культуры на стадии 3 подвергали дополнительным дням воздействия FGF2, например, 3 дня с 50 нг/мл FGF2, по сравнению с двумя днями.

В Таблице 9 приведено краткое изложение анализа проточной цитометрией РЕС клеток, обработанных Hrg1β и FGF2 на стадии 3 и/или 4. Эндокринные клетки обозначались как CHGA позитивные (или CHGA+) клетки, а не-эндокринные клетки обозначались как CHGA негативные (или CHGA-) клетки. Эндокринные (CHGA+) и не-эндокринные клетки (CHGA-) могли позитивно окрашиваться на другие маркеры, например, позитивные на PDX1 и/или NKX6.1. Клетки, которые не окрашивались на какие-либо из тестируемых маркеров, обозначались как тройные негативные клетки или остальные клетки (CHGA-/NKX6.1-/PDX1).

Чтобы определить, действительно ли повышение размера агрегатов клеток влияет на субпопуляции РЕС, композиции из РЕС популяций анализировали проточной цитометрией. По сравнению с контрольными культурами, где не применяли ни Hrg1β, ни FGF2 для дифференцировки клеток, не-эндокринная субпопуляция РЕС (CHGA-) повышалась от 54,01% до 61,2% при добавлении 10 нг/мл Hrg1β на стадии 3, и повышалась от 54,01% до 64,2% при добавлении 50 нг/мл Hrg1β на стадии 3. На эндокринную субпопуляцию (CHGA+) не оказывала существенного влияния обработка 10 нг/мл Hrg1β, тем более с 50 нг/мл. При этом относительные уровни остальных клеток снижались, и тем более с 50 нг/мл Hrg1β. Таким образом, повышение размера агрегатов клеток при обработке Hrg1β связано главным образом с повышением неэндокринных субпопуляций, относительно эндокринных и остальных субпопуляций.

Влияние FGF2 на культуры стадии 3 было схожим, но более выраженным, чем для Hrg1β. Например, не-эндокринная субпопуляция РЕС (CHGA-) повышалась, как с Hrg1β. Основным эффектом FGF2 в этих культурах было существенное снижение эндокринной субпопуляции. В некоторых случаях эти клетки почти не выявлялись за 3 дня обработки (от 32,9% до 0,33%). Таким образом, повышение размера агрегатов клеток для культур, обработанных FGF2, было главным образом связано с повышением не-эндокринных, а в некоторых случаях остальных субпопуляций (от 13,1% до 22,7% в течение 3 дней на стадии 3).

Таким образом, херегулин и/или FGF2, как кажется, играют роль в специализации клеток в популяциях РЕС. Это было неожиданным с учетом того, что Wang et al (2007) выше сообщали, что херегулин по отдельности играет роль в обновлении клеток при использовании в среде с плюрипотентными стволовыми клетками.

Пример 7

Способы улучшения функции трансплантата из РЕС in vivo путем обработки культур клеток, полученных из iPSC, херегулином

Поскольку способы в соответствии с Таблицей 7 при применении к iPSC для получения iPEC не обеспечивали устойчивой функции in vivo у животных, авторы настоящей заявки разработали другие способы для получения iPEC. Изменения стандартного способа, указанного в Таблице 7, включают: оптимизацию числа пассажей iPSC; модуляцию уровней BMP сигналинга; модуляцию параметров агрегации суспензии iPSC во время экспансии и дифференцировки (например, скорости сдвига, скорости вращения, и тому подобное); оптимизацию концентраций, времени применения и продолжительности применения факторов роста, таких как Wnt, активин и ингибиторы rho-киназы; и обработку другими факторами роста на различных стадиях 1-4 протокола дифференцировки в качестве кандидатов для улучшения массы клеток, пролиферации, дифференцировки, выживания и тому подобного (например, ERBB лиганды), но не ограничиваются ими. Многие повторные эксперименты были проведены по отдельности, или в комбинации, для определения того, какие способы дифференцировки для iPSC на стадиях 1-4 могут быть оптимизированы. Такие оптимизированные способы дифференцировки, продуцирующие iPEC популяции, которые затем трансплантировали, привели к устойчивым чувствительным к глюкозе инсулин-секретирующим клеткам in vivo, подобным тем, что наблюдалось и сообщалось для hESC. В Таблице 10 ниже описаны базовые условия, с херегулином и без него, которые, как было показано, дифференцируют iPSC в iPEC, которые позднее созревают в чувствительные к глюкозе островковые клетки in vivo. Базовые условия были подобны тем, которые описаны в Примерах 1, 2 и 5, а также в Таблице 7, за тем исключением, что херегулин добавляли на стадиях 3 и 4. Хотя использовали 30 нг/мл Hrg1β, пригодны концентрации в диапазоне от 10 нг/мл до 50 нг/мл, или даже больше 50 нг/мл. Кроме того, добавление ингибитора rho-киназы, Y-27632, поддерживали в дифференцирующих культурах, как описано в Примере 2.

Для определения эффекта добавления херегулина, или херегулина и ингибитора rho-киназы в субпопуляции клеток на стадии 3 и 4, iPEC популяции анализировали проточной цитометрией. В Таблице 11 приведено краткое изложение анализа посредством проточной цитометрии различных популяций iPEC с применением набора рецептур, приведенных в Таблице 10, а также таких рецептур, модифицированных путем повышения концентрации активина до 200 нг/мл. Кроме того, в Таблице 11 показаны общие условия, установленные для каждого набора экспериментов (базовые условия с херегулином или без него), и относительные проценты типов клеток в популяции iPEC (эндокринных, не-эндокринных, только PDX1 и тройных негативных или остальных субпопуляций клеток). В Таблице 11 также описаны данные, касающиеся функции in vivo клеток, полученных в каждом эксперименте.

При определенных условиях отношение субпопуляций клеток в РЕС (hESC, Е2354) и iPEC (Е2314, Е2344, Е2347) популяциях изменялось. Например, иногда процент эндокринных (CHGA+) клеток снижался, а процент не-эндокринных клеток (CHGA-/NKX6.1+/PDX1+) повышался, по сравнению с базовыми условиями (без херегулина). Хотя кажется, что херегулин был ответственным за изменение пропорций эндокринных клеток относительно не-эндокринных клеток в этих РЕС и iPEC популяциях, в эксперименте #2380 (Е2380), уровень эндокринных (CHGA+) скорее повышался, чем снижался с добавлением херегулина.

Чтобы определить, действительно ли изменение в составе РЕС и iPEC популяций влияет на функцию in vivo, РЕС и iPEC трансплантаты из большинства экспериментов, описанных в Таблице 11, трансплантировали мышам подкожно, как описано ранее в другом патенте автора настоящей заявки и не-патентных публикациях, включая Schulz et al. (2012) и Kroon et al (2008), выше, и патенты США №№7,534,608; 7,695,965; 7,993,920 и 8,278,106, выше. Вкратце, РЕС и iPEC полностью инкапсулировали биодеградируемым полупроницаемым устройством для инкапсулирования клеток, некоторая часть которого включала микроперфорации. Устройства были произведены автором настоящей заявки и описаны подробно в патенте США №8,278,106, озаглавленном «Инкапсулирование панкреатических клеток из плюрипотентных стволовых клеток человека», поданной 13 ноября 2009, описание которой полностью включено в настоящее описание посредством ссылки. Анализы стимулированной глюкозой секреции инсулина (GSIS) проводили, начиная примерно 56 дней после имплантации. Кровь собирали до (натощак) и спустя 30 и/или 60 минут после применения глюкозы. Функцию трансплантата оценивали путем измерения концентраций С-пептида в сыворотке в ответ на применение глюкозы.

Количество С-пептида человека, высвобождаемого в сыворотку, является показателем количества высвобождаемого инсулина. С-пептид является коротким пептидом из 31 аминокислоты, соединяющим или связывающим А и В-цепи проинсулина и препроинсулина, который секретируется функциональными бета- или инсулин-секретирующими клетками. Как обсуждалось раньше Kroon et al. (2008) выше и другими, анализ С-пептида человека пригоден для оценки высвобождения инсулина, генерируемого de novo имплантированными клетками. Таким образом, уровни С-пептида человека в сыворотке этих животных являются мерой функции in vivo зрелых РЕС и iPEC трансплантатов. С-пептид человека определялся в сыворотке по меньшей мере спустя 8 недель после имплантации. С дополнительными неделями после имплантации и натощак, уровни стимулированного глюкозой С-пептида повышались со сдвигом пиковых уровней С-пептида от 60 минут до 30 минут после применения глюкозы, что является показателем более быстрого ответа на глюкозную нагрузку, когда инсулиновые клетки созревают. У некоторых мышей не проявлялась функция, или их умерщвляли из-за плохого состояния здоровья; однако, эти мыши относились к группам, которые в остальном были животными с высоким проявлением функции, что, таким образом, скорее указывает на недостаточность приживления, чем на неспособность имплантированных клеток к дифференцировке и функционированию.

Фигуры 7А-С демонстрируют уровни С-пептида человека в сыворотке после применения глюкозы для всех экспериментов, указанных в таблице 11, за исключением Е2344. Фигуры 7А-С показывают, что по сравнению с контролями базового уровня, эти трансплантаты, полученные при обработке херегулином, в целом обеспечивали более высокие уровни сывороточного С-пептида человека. Например, на Фигуре 7А в эксперименте 2380 отмечалось примерно 5-кратное повышение (933 пМ: 200 пМ спустя 60 минут после применения глюкозы) для трансплантатов, полученных при обработке херегулином, по сравнению с трансплантатами, полученными без херегулина (базовый уровень). Херегулин, как кажется, оказывает меньшее влияние на РЕС, полученные из hESC, поскольку эксперимент 2354 (Фиг. 7С) не показал более высоких уровней сывороточного С-пептида в трансплантатах, полученных при обработке херегулином, по сравнению с контролями базового уровня. Далее, при сравнении РЕС, полученных из iPSC, iPEC трансплантаты имели сопоставимую функцию in vivo с РЕС трансплантатами (например, сравните Фиг. 7А и Фиг. 7В (iPSC трансплантаты) с Фиг. 7С (СуТ203 hESC). По существу, iPEC трансплантаты являются такими же устойчивыми, как РЕС трансплантаты. Кроме того, взаимные отношения эндокринных и не-эндокринных клеток, которые, как кажется, влияют на некоторые популяции iPEC (например, Е2314, Е2347 и Е2354), не влияют на функцию in vivo, поскольку iPEC из Е2380, которые не имеют того же самого сдвига в эндокринной и неэндокринной субпопуляции, также показали хорошую функцию (см. Фиг. 7А-С).

В дополнение к анализу стимулированной глюкозой секреции инсулина, трансплантаты зрелых iPEC тестировали, чтобы определить, действительно ли они по отдельности способны поддержать эугликемию, подобно эугликемии, поддерживаемой РЕС, полученными из hESC, если бета-клетки животного-хозяина разрушены. Это включало разрушение бета-клеток мыши, которой проводили имплантацию, с применением бета-клеточного токсина, стрептозотоцина (STZ), который проявляет большую цитотоксичность против бета-клеток мыши, по сравнению с бета-клетками человека. Произвольные измерения глюкозы крови не-натощак проводили для каждой мыши до и после обработки STZ. При удалении iPEC трансплантата на 13 день после обработки STZ гипергликемия восстанавливалась (отмечался подъем уровня глюкозы), что демонстрировало контроль гликемии iPEC трансплантатом, а не собственной поджелудочной железой мыши (см. Фиг. 8А и Фиг. 8В).

Кроме того, выражен синергетический эффект, когда херегулин и ингибитор rho-киназы были обеспечены во время 1-4 стадий дифференцировки (см. Таблицу 10). Например, iPSC, обработанные херегулином на стадиях 3 и 4 без ингибитора rho-киназы, приводили к ощутимо меньшей массе клеток, что делало имплантацию невозможной. Дополнительное доказательство синергизма херегулина и ингибитора rho-киназы было приведено в некоторых экспериментах, например, Е2356, Е2380, в то время как базовые условия с ингибитором rho-киназы по отдельности не обеспечивали устойчивой функции, как у трансплантата с ингибитором rho-киназы и херегулином (см. Фигуры 7А и В). Как кажется, обработка херегулином и ингибитором rho-киназы не была дополнительной, поскольку добавление херегулина по отдельности обеспечивало недостаточную массу клеток для трансплантации, а добавление ингибитора rho-киназы по отдельности (базовые условия) вызывало плохую функцию in vivo. Таким образом, обеспечение херегулина по отдельности или ингибитора rho-киназы по отдельности по существу не является схожим с суммой эффектов двух комбинированных веществ. Таким образом, по отдельности ни один из них не обеспечивает устойчивого ответа на глюкозу in vivo, но при объединении они обеспечивают ответ на глюкозу, схожий с ответом клеток, полученных из hES клеток. Соответственно, представляется, что обеспечение и херегулина, и ингибитора rho-киназы является синергетическим, поскольку их комбинированный эффект превышает сумму этих эффектов каждого из них по отдельности. Таким образом, iPEC, обработанные ингибитором rho-киназы и херегулином, созревают in vivo, проявляя стимулированную глюкозой секрецию инсулина, и являясь способными к сохранению эугликемии на модели диабета мыши (см. Фиг. 7А-В и Фиг. 8А-В).

Функция ERBB требует связывания лиганда, димеризации рецепторов, и миграции рецептора. Вариабельность каждого процесса может привести к дифференциальной регуляции рецепторов и нисходящих сигналов, которые они контролируют. Например, различные ERBB лиганды связываются с ERBB рецепторами с различной аффинностью, таким образом, изменяя характеристики и динамику образования ERBB димеров. В Таблице 12 показано множество различных комбинаций лигандов и комплексов, связывающих рецепторы. Обзоры, касающиеся сложности этой системы, обеспечены Oda, et al. (2005) «A comprehensive pathway map of epidermal growth factor receptor signaling», Mol. Syst. Biol., 1 (2005) («Исчерпывающая карта пути сигналинга рецептора эпидермального фактора роста») и Lazzara et al. (2009) «Quantitative modeling perspectives on the ERBB system of cell regulatory processes», Experimental Cell Research 315(4): 717-725 («Перспективы количественного модулирования на системе ERBB регуляторных клеточных процессов»), описания которых полностью включены в настоящее описание посредством ссылки.

Huotari et al. предположил, что нейрегулин-4 может модулировать относительные уровни субпопулций эндокринных клеток путем повышения числа соматостатиновых (дельта) клеток при расходе глюкагоновых (альфа) клеток, и что нейрегулин-4 не влияет на отношение экзокринных (например, секретирующих амилазу) и эндокринных (например, секретирующих β-инсулин, α-глюкагон, δ-соматостатин, РР-панкреатический полипептид) клеток. Однако эти исследования выполняли путем инкубации нейрегулина 4 на тотальных органных культурах тканей, полученных от мышей в день Е12.5. Эти популяции клеток после эксплантации у мышей были дифференцированы дальше популяций клеток со стадии 3 (например, PDX1 негативной энтодермы передней части пищеварительного тракта) и/или стадии 4 (PDX1 позитивной энтодермы передней части пищеварительного тракта, описанных в настоящей заявке. Нейрегулин-4 связывает только ERBB4 RTK, так что только эндокринная субпопуляция тотальной органной культуры мыши может быть модулирована нейрегулином-4 в этом контексте. Таким образом, не ожидается, что обработка на стадии 3 (PDX1 негативной энтодермы передней части пищеварительного тракта) и/или стадии 4 (PDX1 позитивной энтодермы передней части пищеварительного тракта) клеток, как описано в настоящей заявке с лигандом, иным чем ERBB, например, Hrg1, будет модулировать относительные эндокринные субпопуляции как в Huotari, поскольку уже было показано, что Hrg1 связывается с ERBB3 и индуцирует димеризацию ERBB2/3. Однако, из-за низкоуровневого экспрессии ERBB2 и 3 в РЕС, как показано на Фиг. 6, неясно, будут ли типы клеток на стадии 3 и 4 экспрессировать низкие или высокие уровни ERBB2 и 3 для связывания с Hrg1.

Далее, в другом контексте, автор настоящей заявки описали, что Hrg1 связывается ERRB 2/3 и стимулирует самообновление плюрипотентных стволовых клеток (см. Wang et al (2007)). Хотя возможно, что Hrg1 может действовать с той же самой емкостью в контексте стадии 3 и 4, автор настоящей заявки ранее описывал, что большая часть экспансии клеток для получения РЕС осуществляется на стадии плюрипотентных стволовых клеток (стадия 0). Во время стадии 0 hESC выращивали, пассировали и подвергали экспансии в течение примерно двух (2) недель. Таким образом, большая часть экспансии клеток или самообновления для обеспечения экспансии клеток не происходит во время стадий 1-4. См. Schulz et al. (2012) выше. Также, если предположить, что ERRB2/3 присутствует во время стадий 3 и 4, можно ожидать, что херегулин будет проявлять тот же самый эффект, как с плюрипотентными стволовыми клетками (самообновление), в отличие от влияния на направленную дифференцировку. Различие в функции, как кажется, зависит от контекста, т.е. плюрипотентные стволовые клетки против типа клеток энтодермы или панкреатической линии.

В целом, обеспечивая херегулин, или херегулин и ингибитор rho-киназы in vitro для клеток энтодермы передней части пищеварительного тракта (стадия 3) и PDX1 экспрессирующих клеток панкреатической энтодермы (конец стадии 3 и стадия 4), получают популяции РЕС и iPEC, которые после трансплантации созревают и развиваются в чувствительные к глюкозе инсулин-секретирующие клетки in vivo (см. Фигуры 7 и 8). Такое применение херегулина, или херегулина и ингибитора rho-киназы указано нами в первый раз. Такое применение и эффект не отличаются от ранее описанных в патентной или не-патентной литературе.

Необходимо понимать, что результаты Q-PCR, описанные в настоящей заявке, могут быть дополнительно подтверждены с помощью иммуноцитохимии (ICC), и могут быть легко получены рядовым специалистом в данной области техники.

Способы, композиции и устройства, описанные в настоящей заявке, представляют предпочтительные варианты осуществления, и являются примерными и не предназначены для ограничения объема изобретения. Изменения и другие виды применения очевидны для специалистов в данной области техники и охватываются сущностью настоящего изобретения и определяются объемом описания. Соответственно, для специалиста в данной области техники очевидно что различные замены и модификации могут быть выполнены в раскрытом изобретении без отделения от объема и сущности изобретения.

Выражение «по существу состоящий из», использующееся в формуле изобретения и в описании, означает включение любых элементов, перечисленных после выражения, и ограничено другими элементами, которые не мешают или способствуют активности или действию, указанному в описании для перечисленных элементов. Таким образом, выражение «по существу состоящий из» указывает, что перечисленные элементы являются необходимыми или обязательными, но что другие элементы являются необязательными и могут присутствовать или не присутствовать, в зависимости от того, влияют или не влияют они на активность или действие перечисленных элементов. Далее, подразумевается, что в вариантах осуществления, где приведены численные величины, такие как количества, концентрации, проценты, пропорции или диапазоны, обозначенная величина может быть «по меньшей мере примерно» численным значением, «примерно» численным значением или «по меньшей мере» численным значением.

Варианты осуществления

Вариант осуществления 1. Культура панкреатических энтодермальных клеток человека in vitro.

Вариант осуществления 2. Культура клеток из варианта 1, где панкреатические энтодермальные клетки получены из плюрипотентных клеток.

Вариант осуществления 3. Культура клеток из варианта 1 или 2, где культура клеток находится в контакте с агентом, активирующим тирозинкиназный рецептор ERBB.

Вариант осуществления 4. Культура клеток из варианта 3, где агент, активирующий тирозинкиназный рецептор ERBB, является EGF (эпидермальным фактором роста), AREG (амфирегулином), TGF-альфа (трансформирующим фактором роста альфа), Btc (бетацеллюлином), HBEGF (гепарин-связывающим EGF), Ereg (эпирегулином), нейрегулинами или херегулинами.

Вариант осуществления 5. Культура клеток по любому из вариантов 1-4, где панкреатические энтодермальные клетки включают панкреатические прогениторные клетки и полигормональные эндокринные клетки.

Вариант осуществления 6. Культура клеток из варианта 5, где панкреатические прогениторные клетки экспрессируют NKX6.1, но не экспрессируют CHGA.

Вариант осуществления 7. Культура клеток из варианта 5, где полигормональные эндокринные клетки экспрессируют CHGA.

Вариант осуществления 8. Культура клеток из любого из вариантов 1-4, где панкреатические энтодермальные клетки включают CHGA-позитивные и CHGA-негативные клетки.

Вариант осуществления 9. Культура клеток по любому из вариантов 1-8, где по меньшей мере 30% панкреатических энтодермальных клеток являются CHGA-негативными клетками.

Вариант осуществления 10. Культура клеток по любому из вариантов 1-9, где по меньшей мере 50% панкреатических энтодермальных клеток являются PDX1-позитивными клетками.

Вариант осуществления 11. Культура клеток из варианта 3, где агент, активирующий тирозинкиназный рецептор ERBB, является херегулином-4.

Вариант осуществления 12. Культура клеток по любому из вариантов 1-11, где культура клеток находится в контакте с фактором роста фибробластов (FGF).

Вариант осуществления 13. Культура клеток из варианта 12, где FGF является FGF-7.

Вариант осуществления 14. Культура клеток по любому из вариантов 1-13, где культура клеток находится в контакте с агентом, активирующим рецептор ERBB тирозинкиназы, и FGF.

Вариант осуществления 15. Культура клеток по любому из вариантов 1-15, где культура клеток находится в контакте с агентом, активирующим тирозинкиназный рецептор ERBB, и ингибитором rho-киназы.

Вариант осуществления 16. Культура клеток по любому из вариантов 1-16, где культура клеток находится в контакте с агентом, активирующим рецептор ERBB тирозинкиназы, FGF и ингибитором rho-киназы.

Вариант осуществления 17. Популяция панкреатической энтодермы человека in vitro.

Вариант осуществления 18. Популяция клеток из варианта 17, где панкреатические энтодермальные клетки получены из плюрипотентных клеток.

Вариант осуществления 19. Популяция клеток из варианта 18, где плюрипотентные клетки являются эмбриональными стволовыми клетками человека или дедифференцированными генетически перепрограммированными клетками.

Вариант осуществления 20. Популяция клеток по любому из вариантов 17-19, где культура клеток находится в контакте с агентом, активирующим тирозинкиназный рецептор ERBB.

Вариант осуществления 21. Популяция клеток из варианта 20, где агент, активирующий тирозинкиназный рецептор ERBB, является EGF (эпидермальным фактором роста), AREG (амфирегулином), TGF-альфа (трансформирующим фактором роста альфа), Btc (бетацеллюлином), HBEGF (гепарин-связывающим EGF), Ereg (эпирегулином), нейрегулинами или херегулинами.

Вариант осуществления 22. Популяция клеток по любому из вариантов 17-21, где панкреатические энтодермальные клетки включают панкреатические прогениторные клетки и полигормональные эндокринные клетки.

Вариант осуществления 23. Популяция клеток из варианта 22, где панкреатические прогениторные клетки экспрессируют NKX6.1, но не экспрессируют CHGA.

Вариант осуществления 24. Популяция клеток из варианта 22, где полигормональные эндокринные клетки экспрессируют CHGA.

Вариант осуществления 25. Популяция клеток по любому из вариантов 17-24, где панкреатические энтодермальные клетки включают CHGA-позитивные и CHGA-негативные клетки.

Вариант осуществления 26. Популяция клеток по любому из вариантов 17-25, где по меньшей мере 30% панкреатических энтодермальных клеток являются CHGA-негативными клетками.

Вариант осуществления 27. Популяция клеток по любому из вариантов 17-26, где по меньшей мере 50% панкреатических энтодермальных клеток являются PDX1-позитивными.

Вариант осуществления 28. Популяция клеток из варианта 20, где агент, активирующий тирозинкиназный рецептор ERBB, является херегулином-4.

Вариант осуществления 29. Популяция клеток по любому из вариантов 17-28, где культура клеток находится в контакте с фактором роста фибробластов (FGF).

Вариант осуществления 30. Популяция клеток из варианта 29, где FGF является FGF-7.

Вариант осуществления 31. Популяция клеток по любому из вариантов 17-30, где культура клеток находится в контакте с агентом, активирующим рецептор ERBB тирозинкиназы, и FGF.

Вариант осуществления 32. Популяция клеток по любому из вариантов 17-30, где культура клеток находится в контакте с агентом, активирующим тирозинкиназный рецептор ERBB, и ингибитором rho-киназы.

Вариант осуществления 33. Популяция клеток по любому из вариантов 17-20, где культура клеток находится в контакте с агентом, активирующим рецептор ERBB тирозинкиназы, FGF и ингибитором rho-киназы.

Вариант осуществления 34. Популяция клеток in vitro, включающая панкреатические энтодермальные клетки человека в контакте с агентом, активирующим рецептор ERBB тирозинкиназы.

Вариант осуществления 35. Популяция клеток из варианта 34, где панкреатические энтодермальные клетки получены из плюрипотентных клеток.

Вариант осуществления 36. Популяция клеток из варианта 35, где плюрипотентные клетки являются эмбриональными стволовыми клетками человека или дедифференцированными генетическим перепрограммированными клетками.

Вариант осуществления 37. Популяция клеток по любому из вариантов 34-36, где агент, активирующий рецептор ERBB тирозинкиназы, является EGF (эпидермальным фактором роста), AREG (амфирегулином), TGF-альфа (трансформирующим фактором роста альфа), Btc (бетацеллюлином), HBEGF (гепарин-связывающим EGF), Ereg (эпирегулином), нейрегулинами или херегулинами.

Вариант осуществления 38. Популяция клеток по любому из вариантов 34-37, где панкреатические энтодермальные клетки включают панкреатические прогениторные клетки и полигормональные эндокринные клетки.

Вариант осуществления 39. Популяция клеток из варианта 38, где панкреатические прогениторные клетки экспрессируют NKX6.1, но не экспрессируют CHGA.

Вариант осуществления 40. Популяция клеток из варианта 38, где полигормональные эндокринные клетки экспрессируют CHGA.

Вариант осуществления 41. Популяция клеток по любому из вариантов 34-40, где панкреатические энтодермальные клетки включают CHGA-позитивные и CHGA-негативные клетки.

Вариант осуществления 42. Популяция клеток по любому из вариантов 34-41, где по меньшей мере 30% панкреатических энтодермальных клеток являются CHGA-негативными клетками.

Вариант осуществления 43. Популяция клеток по любому из вариантов 34-42, где по меньшей мере 50% панкреатических энтодермальных клеток являются PDX1-позитивными.

Вариант осуществления 44. Популяция клеток по любому из вариантов 34-36, где агент, активирующий рецептор ERBB тирозинкиназы, является херегулином-4.

Вариант осуществления 45. Популяция клеток по любому из вариантов 34-44, где панкреатические энтодермальные клетки человека находятся в контакте с фактором роста фибробластов (FGF).

Вариант осуществления 46. Популяция клеток из варианта 45, где FGF является FGF-7.

Вариант осуществления 47. Популяция клеток по любому из вариантов 34-46, где панкреатические энтодермальные клетки человека находятся в контакте с агентом, активирующим рецептор ERBB тирозинкиназы, и FGF.

Вариант осуществления 48. Популяция клеток по любому из вариантов 34-47, где панкреатические энтодермальные клетки человека находятся в контакте с агентом, активирующим тирозинкиназный рецептор ERBB, и ингибитором rho-киназы.

Вариант осуществления 49. Популяция клеток по любому из вариантов 34-48, где панкреатические энтодермальные клетки человека находятся в контакте с агентом, активирующим рецептор ERBB тирозинкиназы, FGF и ингибитором rho-киназы.

Вариант осуществления 50. Способ получения инсулина, включающий этапы:

(a) обеспечения контакта клеток энтодермы передней части пищеварительного тракта с агентом, активирующим тирозинкиназный рецептор ERBB, с получением популяции клеток, включающей панкреатическую энтодерму; и

(b) трансплантации и созревания панкреатической энтодермы, полученных на этапе (a), in vivo, с получением инсулин-секретирующих клеток, где инсулин-секретирующие клетки секретируют инсулин в ответ на стимуляцию глюкозой.

Вариант осуществления 51. Способ получения инсулина, включающий этапы:

(a) обеспечения контакта клеток энтодермы передней части пищеварительного тракта, полученных из дедифференцированных генетически перепрограммированных клеток in vitro с агентом, активирующим тирозинкиназный рецептор ERBB, с получением популяции клеток, включающей эндокринную и не-эндокринную субпопуляции; и

(b) трансплантации и созревания субпопуляций, полученных на этапе (a), in vivo, с получением инсулин-секретирующих клеток, где инсулин-секретирующие клетки секретируют инсулин в ответ на стимуляцию глюкозой.

Вариант осуществления 52. Способ получения инсулина, включающий этапы:

(а) трансплантации и созревания панкреатических энтодермальных клеток in vivo, с получением инсулин-секретирующих клеток, где инсулин-секретирующие клетки секретируют инсулин в ответ на стимуляцию глюкозой.

Вариант осуществления 53. Способ из варианта 52, где панкреатические энтодермальные клетки получены путем обеспечения контакта клеток энтодермы передней части пищеварительного тракта с агентом, активирующим тирозинкиназный рецептор ERBB.

Вариант осуществления 54. Способ по любому из вариантов 50-52 и 53, где агент, активирующий рецептор ERBB тирозинкиназы, является EGF (эпидермальным фактором роста), AREG (амфирегулином), TGF-альфа (трансформирующим фактором роста альфа), Btc (бетацеллюлином), HBEGF (гепарин-связывающим EGF), Ereg (эпирегулином), нейрегулинами или херегулинами.

Вариант осуществления 55. Способ по любому из вариантов 50-52 и 53-54, где клетки энтодермы передней части пищеварительного тракта дополнительно находятся в контакте с фактором роста фибробластов (FGF).

Вариант осуществления 56. Способ из варианта 55, где FGF является FGF-7.

Вариант осуществления 57. Способ по любому из вариантов 50-52 и 53-56, где клетки энтодермы передней части пищеварительного тракта дополнительно находятся в контакте с ингибитором rho-киназы.

Вариант осуществления 58. Способ по любому из вариантов 50-52 и 53-57, где клетки энтодермы передней части пищеварительного тракта дополнительно находятся в контакте с ингибитором rho-киназы и FGF.

Вариант осуществления 59. Способ по любому из вариантов 57-58, где ингибитор rho-киназы выбран из группы, состоящей из Y-27632, Fasudil, Н-1152Р, Wf-536, Y-30141, антисмысловых нуклеиновых кислот для ROCK; нуклеиновой кислоты, индуцирующей интерференцию РНК; конкурирующих пептидов, пептидов антагонистов, ингибирующих антител, ScFV-фрагментов антител, доминантно-негативных вариантов, и их производных и векторов экспрессии.

Вариант осуществления 60. Способ по любому из вариантов 57-59, где ингибитор rho-киназы выбран из группы, состоящей из Y-27632, Fasudil, Н-1152Р, Wf-536 и Y-30141, и их производных.

Вариант осуществления 61. Способ по любому из вариантов 57-60, где ингибитор rho-киназы выбран из группы, состоящей из Y-27632, Fasudil и Н-1152Р, и их производных.

Вариант осуществления 62. Способ из варианта 50, где панкреатическая энтодерма содержит эндокринную и не-эндокринную субпопуляции.

Вариант осуществления 63. Способ из варианта 62, где эндокринная субпопуляция клеток является CHGA-позитивными (CHGA+) клетками.

Вариант осуществления 64. Способ из варианта 62, где не-эндокринная субпопуляция клеток является CHGA-негативной (CHGA-).

Вариант осуществления 65. Способ из варианта 62, где не-эндокринная субпопуляция клеток экспрессирует NKX6.1.

Вариант осуществления 66. Способ из варианта 50, где по меньшей мере 30% панкреатической энтодермы является CHGA-негативной.

Вариант осуществления 67. Способ из варианта 50, где по меньшей мере 50% панкреатической энтодермы является PDX1-позитивной.

Вариант осуществления 68. Способ получения инсулина, включающий этапы:

(a) обеспечения контакта дедифференцированных генетически перепрограммированных клеток in vitro с первой средой, содержащей агент, активирующий член семейства рецептора TGFβ;

(b) культивирования in vitro клеток, полученных на этапе (а), во второй среде, не содержащей агент, активирующий член семейства рецептора TGFβ, с получением клеток энтодермы передней части пищеварительного тракта;

(c) обеспечения контакта клеток энтодермы передней части пищеварительного тракта, полученных на этапе (b), с агентом, активирующим тирозинкиназный рецептор ERBB, с образованием популяции клеток, включающей эндокринную и неэндокринную популяции клеток; и

(d) трансплантации и созревания панкреатической энтодермы, полученных на этапе (с), in vivo, с получением инсулин-секретирующих клеток, где инсулин-секретирующие клетки секретируют инсулин в ответ на стимуляцию глюкозой.

Вариант осуществления 69. Способ из варианта 68, где не-эндокринная клетка является CHGA-негативной (CHGA-) клеткой.

Вариант осуществления 70. Способ по любому из вариантов 68-69, где эндокринная клетка является CHGA-позитивной (CHGA+) клеткой.

Вариант осуществления 71. Способ из варианта 69, где CHGA-негативная (CHGA-) клетка экспрессирует NKX6.1.

Вариант осуществления 72. Способ из варианта 69, где клетки энтодермы передней части пищеварительного тракта, полученных на этапе (b), контактируют с ингибитором rho-киназы.

Вариант осуществления 73. Способ из варианта 69, где клетки энтодермы передней части пищеварительного тракта, полученных на этапе (b), контактируют с FGF.

Вариант осуществления 74. Способ из варианта 69, где клетки энтодермы передней части пищеварительного тракта, полученных на этапе (b), контактируют с ингибитором rho-киназы и FGF.

Вариант осуществления 75. Способ по любому из вариантов 72-74, где ингибитор rho-киназы выбран из группы, состоящей из Y-27632, Fasudil, Н-1152Р, Wf-536, Y-30141, антисмысловых нуклеиновых кислот для ROCK; нуклеиновой кислоты, индуцирующей интерференцию РНК; конкурирующих пептидов, пептидов-антагонистов, ингибирующих антител, ScFV-фрагментов антител, доминантно-негативных вариантов, и их производных и векторов экспрессии.

Вариант осуществления 76. Способ повышения процентного содержания не-эндокринных клеток в популяции клеток панкреатической энтодермы, по сравнению с эндокринными клетками, включающий:

- обеспечение контакта клеток энтодермы передней части пищеварительного тракта с агентом, активирующим тирозинкиназный рецептор ERBB, с повышением процента не-эндокринных клеток в популяции клеток панкреатической энтодермы.

Вариант осуществления 77. Способ из варианта 76, где клетки энтодермы передней части пищеварительного тракта контактируют с FGF.

Вариант осуществления 78. Способ из варианта 76, где клетки энтодермы передней части пищеварительного тракта контактируют с ингибитором rho-киназы.

Вариант осуществления 79. Способ из варианта 76, где клетки энтодермы передней части пищеварительного тракта контактируют с FGF и ингибитором rho-киназы.

Вариант осуществления 80. Способ повышения чувствительности к глюкозе имплантированной панкреатической энтодермы, включающий:

- обеспечение контакта клеток энтодермы передней части пищеварительного тракта с агентом, активирующим тирозинкиназный рецептор ERBB, с генерацией популяции клеток, включающей панкреатическую энтодерму; и

- трансплантацию и созревание панкреатической энтодермы in vivo, с получением инсулин-секретирующих клеток, где инсулин-секретирующие клетки секретируют инсулин лучше, чем инсулин-секретирующие клетки, полученные из панкреатической энтодермы, полученной без контакта клеток энтодермы передней части пищеварительного тракта с агентом, активирующим тирозинкиназный рецептор ERBB.

Вариант осуществления 81. Способ из варианта 80, где панкреатические энтодермальные клетки получены из дедифференцированных генетически перепрограммированных клеток.

Вариант осуществления 82. Способ получения инсулина, включающий (а) обеспечение контакта живых клеток с агентом, активирующим тирозинкиназный рецептор ERBB, и (b) трансплантацию и созревание клеток в конце этапа (а), с получением инсулин-секретирующих клеток, где инсулин-секретирующие клетки секретируют инсулин в ответ на стимуляцию глюкозой.

Вариант осуществления 83. Способ из варианта 82, где живые клетки являются энтодермой передней части пищеварительного тракта или PDX1-негативной энтодермой передней части пищеварительного тракта.

Вариант осуществления 84. Способ по любому из вариантов 82-83, где живые клетки получены из дедифференцированных генетически перепрограммированных клеток.

Вариант осуществления 85. популяция клеток, включающая эндокринную и неэндокринную субпопуляции клеток.

Вариант осуществления 86. Популяция клеток из варианта 85, где эндокринная и неэндокринная субпопуляции клеток получены из плюрипотентных клеток.

Вариант осуществления 87. Популяция клеток из варианта 86, где плюрипотентные клетки являются эмбриональными стволовыми клетками человека или дедифференцированными генетически перепрограммированными клетками.

Вариант осуществления 88. Популяция клеток по любому из вариантов 85-87, где агент, активирующий тирозинкиназный рецептор ERBB, является EGF (эпидермальным фактором роста), AREG (амфирегулином), TGF-альфа (трансформирующим фактором роста-альфа), Btc (бетацеллюлином), HBEGF (гепарин-связывающим EGF), Ereg (эпирегулином), нейрегулинами или херегулинами.

Вариант осуществления 89. Популяция клеток по любому из вариантов 85-88, где не-эндокринные клетки экспрессируют NKX6.1, но не экспрессируют CHGA.

Вариант осуществления 90. Популяция клеток по любому из вариантов 85-89, где эндокринные клетки экспрессируют CHGA.

Вариант осуществления 91. Популяция клеток по любому из вариантов 85-90, где по меньшей мере 30% клеток являются CHGA-негативными клетками.

Вариант осуществления 92. Популяция клеток по любому из вариантов 85-91, где по меньшей мере 50% клеток являются PDX1-позитивными.

Вариант осуществления 93. Популяция клеток по любому из вариантов 85-92, где агент, активирующий тирозинкиназный рецептор ERBB, является херегулином-4.

Вариант осуществления 94. Популяция клеток по любому из вариантов 85-93, где культура клеток находится в контакте с фактором роста фибробластов (FGF).

Вариант осуществления 95. Популяция клеток из варианта 94, где FGF является FGF-7.

Вариант осуществления 96. Популяция клеток по любому из вариантов 85-95, где культура клеток находится в контакте с агентом, активирующим рецептор ERBB тирозинкиназы, и FGF.

Вариант осуществления 97. Популяция клеток по любому из вариантов 85-96, где культура клеток находится в контакте с агентом, активирующим тирозинкиназный рецептор ERBB, и ингибитором rho-киназы.

Вариант осуществления 98. Популяция клеток по любому из вариантов 85-97, где культура клеток находится в контакте с агентом, активирующим рецептор ERBB тирозинкиназы, FGF и ингибитором rho-киназы.

Вариант осуществления 99. Способ получения инсулина, включающий этапы: (а) обеспечения контакта дедифференцированных генетически перепрограммированных клеток in vitro с первой средой, содержащей агент, активирующий член семейства рецепторов TGFβ; (b) культивирования in vitro клеток, полученных на этапе (а), во второй среде, не содержащей агент, активирующий член семейства рецепторов TGFβ, с получением, таким образом, по меньшей мере энтодермы передней части пищеварительного тракта или по меньшей мере PDX1-негативных клеток энтодермы передней части пищеварительного тракта; (с) обеспечения контакта клеток, полученных на этапе (b), с агентом, активирующим тирозинкиназный рецептор ERBB, с получением, таким образом, популяции клеток, содержащей эндокринную и не эндокринную субпопуляции клеток; и (d) трансплантации и созревания популяции клеток, полученных на этапе (с), in vivo, с получением, таким образом, инсулин-секретирующих клеток, где инсулин-секретирующие клетки секретируют инсулин в ответ на стимуляцию глюкозой.

Вариант осуществления 100. Способ получения инсулина, включающий этапы: (а) обеспечения контакта PDX1-позитивных клеток с агентом, активирующим тирозинкиназный рецептор ERBB; и (b) трансплантации и созревания популяции клеток in vivo, с получением, таким образом, инсулин-секретирующих клеток, где инсулин-секретирующие клетки секретируют инсулин в ответ на стимуляцию глюкозой.

Вариант осуществления 101. Способ из вариантов осуществления 68 или 99, где ингибитор rho-киназы добавляют на этапе (а), (b) или (с).

Вариант осуществления 102. Способ из вариантов осуществления 68 или 99, где ингибитор rho-киназы добавляют на этапе (а), (b) и (с).

Вариант осуществления 103. Способ из вариантов осуществления 68 или 99-100, где ингибитор rho-киназы добавляют на этапе (а) и (b).

Вариант осуществления 104. Способ из вариантов осуществления 68 или 99, где агент, активирующий тирозинкиназный рецептор ERBB, добавляют на этапе (а) или (с).

Вариант осуществления 105. Способ из вариантов осуществления 68 или 99, где агент, активирующий тирозинкиназный рецептор ERBB, добавляют на этапе (а) и (с).

Вариант осуществления 106. Способ генерации популяции клеток, способной к созреванию в чувствительные к глюкозе инсулин-секретирующие клетки in vivo, включающий: обеспечение контакта популяции по меньшей мере энтодермы передней части пищеварительного тракта, по меньшей мере PDX1-негативной энтодермы передней части пищеварительного тракта, или по меньшей мере популяции PDX1-позитивных клеток панкреатической энтодермы с агентом, активирующим тирозинкиназный рецептор ERBB, с генерацией, таким образом, популяции клеток, способной к созреванию в чувствительные к глюкозе инсулин-секретирующие клетки in vivo.

Вариант осуществления 107. Способ получения панкреатической энтодермы, включающий этапы:

(а) обеспечения контакта клеток энтодермы передней части пищеварительного тракта с агентом, активирующим тирозинкиназный рецептор ERBB, с получением, таким образом, популяции клеток, включающей панкреатическую энтодерму.

Вариант осуществления 108. Способ из варианта 107, дополнительно включающий обеспечение контакта клеток энтодермы передней части пищеварительного тракта с фактором роста фибробластов (FGF).

Вариант осуществления 109. Способ из варианта 108, где FGF является FGF-7.

Вариант осуществления 110. Способ по любому из вариантов 107-109, дополнительно включающий обеспечение контакта клеток энтодермы передней части пищеварительного тракта с ингибитором rho-киназы.

Вариант осуществления 111. Способ по любому из вариантов 107-109, дополнительно включающий обеспечение контакта клеток энтодермы передней части пищеварительного тракта с ингибитором rho-киназы и FGF.

Вариант осуществления 112. Способ по любому из вариантов 107-111, где по меньшей мере 30% панкреатической энтодермы является CHGA-негативной.

Вариант осуществления 113. Способ по любому из вариантов 107-111, где по меньшей мере 50% панкреатической энтодермы является PDX1-позитивной.

Вариант осуществления 114. Способ по любому из вариантов 50, 76, 107-113, где клетки энтодермы передней части пищеварительного тракта получены из плюрипотентных клеток.

Вариант осуществления 115. Способ по любому из вариантов 50, 76, 107-114, где плюрипотентные клетки являются эмбриональными стволовыми клетками человека или дедифференцированными генетически перепрограммированными клетками.

Вариант осуществления 116. Культура клеток из варианта 1, где плюрипотентные клетки являются эмбриональными стволовыми клетками человека или дедифференцированными генетически перепрограммированными клетками.

Вариант осуществления 117. Популяция панкреатических энтодермальных клеток человека in vitro, включающая дифференцированные клетки, полученные из дедифференцированных генетически перепрограммированных клеток, и агент, активирующий тирозинкиназный рецептор ERBB.

Вариант осуществления 118. Популяция панкреатических энтодермальных клеток из варианта 117, где агент, активирующий тирозинкиназный рецептор ERBB, включает фактор роста или лиганд EGF.

Вариант осуществления 119. Популяция панкреатических энтодермальных клеток из варианта 118, где фактор роста или лиганд EGF включает изоформу херегулина, выбранного из группы, состоящей из херегулина-1, херегулина-2, херегулина 3 и херегулина-4.

Вариант осуществления 120. Популяция панкреатических энтодермальных клеток из варианта 119, где изоформа херегулина включает херегулин-1 и херегулин-4.

Вариант осуществления 121. Популяция панкреатических энтодермальных клеток из варианта 119, где изоформа херегулина включает херегулин-4.

Вариант осуществления 122. Способ получения инсулина, включающий этапы:

(a) обеспечения контакта культуры клеток энтодермы передней части пищеварительного тракта, полученных из дедифференцированных генетически перепрограммированных клеток in vitro с агентом, активирующим тирозинкиназный рецептор ERBB, с получением, таким образом, популяции клеток, включающей эндокринную и не-эндокринную субпопуляции клеток; и

(b) созревания субпопуляций, полученных на этапе (a), in vivo, с получением, таким образом, инсулин-секретирующих клеток, где инсулин-секретирующие клетки секретируют инсулин в ответ на стимуляцию глюкозой.

Вариант осуществления 123. Способ из варианта 122, дополнительно включающий обеспечение контакта культуры клеток энтодермы передней части пищеварительного тракта с ингибитором rho-киназы.

Вариант осуществления 124. Способ из варианта 123, где ингибитор rho-киназы выбран из группы, состоящей из Y-27632, Fasudil, Н-1152Р, Wf-536, Y-30141, антисмысловых нуклеиновых кислот для ROCK; нуклеиновой кислоты, индуцирующей интерференцию РНК; конкурирующих пептидов, пептидов-антагонистов, ингибирующих антител, ScFV-фрагментов антител, доминантно-негативных вариантов, и их производных и векторов экспрессии.

Вариант осуществления 125, где ингибитор rho-киназы выбран из группы, состоящей из Y-27632, Fasudil, Н-1152Р, Wf-536, Y-30141, и их производных.

Вариант осуществления 126, где ингибитор rho-киназы выбран из группы, состоящей из Y-27632, Fasudil, Н-1152Р, и их производных.

Вариант осуществления 127. Способ получения инсулина, включающий этапы:

(a) обеспечения контакта дедифференцированных генетически перепрограммированных клеток in vitro с первой средой, содержащей агент, активирующий член семейства рецепторов TGFβ;

(b) культивирования in vitro клеток, полученных на этапе (а), во второй среде, не содержащей агент, активирующий член семейства рецепторов TGFβ, с получением, таким образом, клеток энтодермы передней части пищеварительного тракта;

(c) обеспечения контакта клеток энтодермы передней части пищеварительного тракта, полученных на этапе (b), с агентом, активирующим тирозинкиназный рецептор ERBB, с получением, таким образом, популяции клеток, содержащей эндокринную и не-эндокринную субпопуляции клеток; и

(d) созревания субпопуляций клеток, полученных на этапе (с), in vivo, с получением, таким образом, инсулин-секретирующих клеток, где инсулин-секретирующие клетки секретируют инсулин в ответ на стимуляцию глюкозой.

Вариант осуществления 128. Способ из варианта 127, где не-эндокринные клетки являются CHGA-негативными (CHGA-) клетками.

Вариант осуществления 129. Способ из варианта 127, где эндокринные клетки являются CHGA-позитивными (CHGA+) клетками.

Вариант осуществления 130. Способ из варианта 127, где CHGA-негативные (CHGA-) клетки дополнительно экспрессируют NKX6.1.

Вариант осуществления 131. Способ из варианта 127, дополнительно включающий обеспечение контакта клеток энтодермы передней части пищеварительного тракта с ингибитором rho-киназы.

Вариант осуществления 132. Способ из варианта 131, где ингибитор rho-киназы выбран из группы, состоящей из Y-27632, Fasudil, Н-1152Р, Wf-536, Y-30141, антисмысловых нуклеиновых кислот для ROCK; нуклеиновой кислоты, индуцирующей интерференцию РНК; конкурирующих пептидов, пептидов-антагонистов, ингибирующих антител, ScFV-фрагментов антител, доминантно-негативных вариантов, и их производных и векторов экспрессии.

1. Способ получения инсулина, включающий этапы:

(a) обеспечения контакта популяции клеток человека, содержащей клетки энтодермы передней части пищеварительного тракта, с агентом, активирующим рецептор ERBB тирозинкиназы, с получением, таким образом, субпопуляции клеток, включающей эндокринные клетки и неэндокринные клетки; и

(b) созревания субпопуляций, полученных на этапе (a), in vivo, с получением, таким образом, инсулин-секретирующих клеток, которые секретируют инсулин в ответ на стимуляцию глюкозой,

отличающийся тем, что из указанной популяции клеток человека исключены клетки, которые получены из эмбриональных стволовых клеток человека, полученных исключительно способом, требующим разрушения эмбриона.

2. Способ по п. 1, дополнительно включающий обеспечение контакта клеток энтодермы передней части пищеварительного тракта с ингибитором rho-киназы.

3. Способ по п. 2, где ингибитор rho-киназы выбран из группы, состоящей из Y-27632, Fasudil, Н-1152Р, Wf-536, Y-30141, антисмысловых нуклеиновых кислот для ROCK; нуклеиновой кислоты, индуцирующей интерференцию РНК; конкурирующих пептидов, пептидов-антагонистов, ингибирующих антител, ScFV-фрагментов антител, доминантно-негативных вариантов, их производных и векторов экспрессии.

4. Способ по п. 2, где ингибитор rho-киназы выбран из группы, состоящей из Y-27632, Fasudil, Н-1152Р, Wf-536, Y-30141 и их производных.

5. Способ по п. 4, где ингибитор rho-киназы выбран из группы, состоящей из Y-27632, Fasudil, Н-1152Р и их производных.

6. Способ получения инсулина, включающий этапы:

(a) обеспечения контакта индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека in vitro с первой средой для выращивания клеток, содержащей агент, активирующий член семейства рецепторов TGFβ, выбранный из группы, включающей Активин А, Активин В, Nodal, GDF-8, GDF-9, GDF-10, GDF-11 и костный морфогенетический белок (BMP);

(b) культивирования in vitro клеток, полученных на этапе (а), во второй среде для выращивания клеток, не содержащей агент, активирующий член семейства рецепторов TGFβ, с получением, таким образом, клеток энтодермы передней части пищеварительного тракта;

(c) обеспечения контакта клеток энтодермы передней части пищеварительного тракта, полученных на этапе (b), с агентом, активирующим рецептор ERBB тирозинкиназы, с получением, таким образом, популяции клеток, содержащей субпопуляции эндокринных клеток и неэндокринных клеток; и

(d) созревания субпопуляций клеток, полученных на этапе (с), in vivo, с получением, таким образом, инсулин-секретирующих клеток, где инсулин-секретирующие клетки секретируют инсулин в ответ на стимуляцию глюкозой,

отличающийся тем, что из указанных индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека исключены клетки, которые получены из эмбриональных стволовых клеток человека, полученных исключительно способом, требующим разрушения эмбриона.

7. Способ по п. 6, где неэндокринные клетки являются CHGA-негативными (CHGA-) клетками.

8. Способ по п. 6, где эндокринные клетки являются CHGA-позитивными (CHGA+) клетками.

9. Способ по п. 6, где CHGA-негативные (CHGA-) клетки дополнительно экспрессируют NKX6.1.

10. Способ по п. 6, дополнительно включающий обеспечение контакта клеток энтодермы передней части пищеварительного тракта с ингибитором rho-киназы.

11. Способ по п. 10, где ингибитор rho-киназы выбран из группы, состоящей из Y-27632, Fasudil, Н-1152Р, Wf-536, Y-30141, антисмысловых нуклеиновых кислот для ROCK; нуклеиновой кислоты, индуцирующей интерференцию РНК; конкурирующих пептидов, пептидов-антагонистов, ингибирующих антител, ScFV-фрагментов антител, доминантно-негативных вариантов, их производных и векторов экспрессии.