Антитела, специфичные к клаудину 6 (cldn6)

Изобретение относится к области биохимии, в частности к антителу для осуществления взаимодействия антиген-антитело с клаудином 6 (CLDN6), находящимся на поверхности клеток, экспрессирующих CLDN6, при этом по существу неспособному к взаимодействию антиген-антитело с другими высокогомологичными клаудинами, а также к иммуноконъюгату, фармацевтической композиции, содержащим вышеуказанное антитело. Также раскрыты гибридомы для продуцирования вышеуказанного антитела. Изобретение также относится к способу ингибирования роста клетки, экспрессирующей CLDN6, к способу уничтожения клетки, экспрессирующей CLDN6, к способу лечения или предотвращения рака, вовлекающего клетку, экспрессирующую CLDN6, а также к способу ингибирования метастатического распространения клетки, экспрессирующей CLDN6, предусматривающим использование вышеуказанного антитела и/или иммуноконъюгата. Изобретение позволяет эффективно уничтожать клетки, экспрессирующие CLDN6. 11 н. и 21 з.п. ф-лы, 26 ил., 1 табл., 9 пр.

 

В течение последнего десятилетия в клинику для лечения рака успешно внедрены антитела, представляющие собой наиболее обещающие терапевтические средства в онкологии. Основанное на использовании антител лечение рака имеет более высокую специфичность и дает меньше побочных эффектов по сравнению с традиционными лекарственными средствами. Причина заключается в том, что антитела точно различают нормальные и неопластические клетки, а также в том, что их способ действия основывается на менее токсичных иммунологических противоопухолевых механизмах действия, таких как активация комплемента и рекрутирование цитотоксических иммунных клеток.

Клаудины представляют собой интегральные мембранные белки, расположенные в плотных контактах эпителия и эндотелия. Известно, что клаудины имеют четыре трансмембранных сегмента с двумя внеклеточными петлями, при этом N и С-концы располагаются в цитоплазме. Семейство трансмембранных белков клаудинов (CLDN) играет решающую роль в сохранении эпителиальных и эндотелиальных плотных контактов, а также в поддержании цитоскелета и в сигнальной системе клетки. Разница в экспрессии этих белков опухолевыми и нормальными клетками, в дополнение к их мембранной локализации, делает их привлекательной целью для иммунотерапии рака, а применение при лечении рака терапевтических средств на основе антител для нацеливания на CLDN обещает высокий уровень терапевтической специфичности.

Однако клиническое применение терапевтических средств, нацеленных на CLDN, сталкивается с некоторыми препятствиями. При повсеместной экспрессии CLDN в организме и решающей роли CLDN в сохранении плотных контактов, для того, чтобы увеличить до предела специфичность лечения и свести к минимуму общую токсичность, требуется специфичность мишени для терапевтических средств, нацеленных на CLDN.

WO 2009/087978 имеет отношение к aнти-CLDN6 антителам и их применению в качестве противоопухолевых средств. В частности, описываются моноклональные антитела, обозначенные АВ3-1, АЕ1-16, АЕ49-11 и АЕ3-2О. Однако ни одно из этих антител не было специфично к CLDN6, как показано с помощью FACS-анализа в примере 5. Антитело АЕ3-20 вступало в реакцию с CLDN9, в то время как антитела АЕ1-16 и АЕ49-11 показали значительную способность вступать в реакцию с CLDN9 и также вступали в реакцию с CLDN4. Связывание антитела АВ3-1 с CLDN6 было таким же сильным, как его связывание с CLDN9. В Примере 7 описано, что при введении антител АЕ49-11 на мышиной опухолевой модели наблюдается тенденция к ингибированию опухолевого роста и увеличению продолжительности жизни. Однако принимая во внимание неспецифичность использованного антитела, остается неясным, являются ли описанные эффекты результатом связывания антитела с CLDN6.

Таким образом, до сих пор не описано СLDN6-специфическое антитело, которое селективно связывается с поверхностью клеток, экспрессирующих CLDN6. Тем не менее, такое специфическое антитело было бы необходимо для терапевтических подходов на основе антител, использующих CLDN6 в качестве мишени.

Выравнивание последовательностей CLDN3, CLDN4, CLDN6 и CLDN9, показанное на фиг.1, иллюстрирует, что существует высокая степень консервативности CLDN6 по отношению к другим белкам клаудинам. Эта высокая гомология CLDN6 с другими белками клаудинами, в частности CLDN9 и CLDN4, и тот факт, что WO 2009/087978 оказался не в состоянии обеспечить СLDN6-специфические антитела, показывают, что может быть невозможным получение антител, специфически связывающихся с CLDN6.

Раскрытие изобретения

Экспериментальные результаты, раскрытые в описании, подтверждают, что CLDN6 экспрессируется в разных раковых клетках человека, тогда как экспрессия в нормальных тканях ограничивается плацентой.

Кроме того, настоящее изобретение впервые описывает успешное получение CLDN6-специфических антител, способных связываться с поверхностью интактных клеток, экспрессирующих CLDN6. FACS-анализ интактных клеток, экспрессирующих CLDN6, показал специфическое связывание анти-CLDN6 антител, тогда, как не наблюдалось связывания с клетками, экспрессирующими другие белки-клаудины, в частности, CLDN3, CLDN4 и CLDN9, или клетками, не экспрессирующими любые из этих CLDN-белков. Таким образом, настоящее изобретение неожиданно показывает, что может быть получено антитело, осуществляющее специфическое взаимодействие антиген-антитело с CLDN6 на поверхности клеток, экспрессирующих CLDN6, но практически не показывающее взаимодействия антиген-антитело с другими высокогомологичными клаудинами.

В общем, настоящее изобретение предоставляет антитела, пригодные в качестве терапевтических средств, для лечения и/или предотвращения болезней, имеющих отношение к клеткам, экспрессирующим CLDN6, и характеризующиеся соединением CLDN6 с клеточной поверхностью, включая опухолевые заболевания, в частности рак, например, рак яичника, в частности аденокарциному яичника и тератокарциному яичника, рак легких, включая мелкоклеточный рак легкого (SCLC) и немелкоклеточный рак легкого (NSCLC), в частности плоскоклеточный рак легкого и аденокарциному, рак желудка, рак молочной железы, рак печени, рак поджелудочной железы, рак кожи, в частности базальноклеточную карциному и плоскоклеточную карциному, злокачественную меланому, рак головы и шеи, в частности злокачественную плеоморфную аденому, саркому, в частности синовиальную саркому и карциносаркому, рак желчного протока, рак мочевого пузыря, в частности переходно-клеточную карциному и папиллярный рак, рак почки, в частности почечноклеточный рак, включая светлоклеточный рак почки и папиллярную карциному почки, рак толстой кишки, рак тонкой кишки, включая рак подвздошной кишки, в частности аденокарциному тонкой кишки и аденокарциному подвздошной кишки, эмбриональную карциному яичка, плацентарную хориокарциному, рак шейки матки, рак яичка, в частности семиному яичка, тератому яичка и эмбриональный рак яичка, рак матки, герминому, такую как, тератокарцинома или эмбриональная карцинома, в частности эмбрионально-клеточную опухоль яичка, и их метастатические формы.

В одном аспекте изобретение имеет отношение к антителу, способному связываться с CLDN6, связанным с поверхностью клетки, экспрессирущей CLDN6. Предпочтительно антитело практически неспособно связываться с CLDN9, связанным с поверхностью клетки, экспрессирующей CLDN9. Предпочтительно антитело практически неспособно связываться с CLDN4, связанным с поверхностью клетки, экспрессирующей CLDN4, и/или практически неспособно связываться с CLDN3, связанным с поверхностью клетки, экспрессирующей CLDN3. Наиболее предпочтительно антитело практически неспособно связываться с CLDN-белком, отличным от CLDN6, связанным с поверхностью клетки, экспрессирующей указанный CLDN-белок, и является специфическим для CLDN6. Предпочтительно указанная клетка, экспрессирующая указанный CLDN-белок, является интактной клеткой, в частности непермеабилизированной клеткой (клеткой с ненарушенной проницаемостью мембраны), и указанный CLDN-белок, связанный с поверхностью клетки, имеет нативную, т.е. неденатурированную конформацию. Предпочтительно антитело способно связываться с одним или более эпитопами CLDN6, в их нативной конформации.

В одном варианте осуществления антитело способно связываться с эпитопом, расположенным на внеклеточном участке CLDN6, причем указанный внеклеточный участок CLDN6 предпочтительно содержит любую аминокислотную последовательность из числа SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 14 и SEQ ID NO: 15, предпочтительно аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6 или SEQ ID NO: 7, более предпочтительно аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6. Предпочтительно антитело способно связываться с эпитопом, расположенным в пределах любой аминокислотной последовательности из числа SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 14 и SEQ ID NO: 15, предпочтительно аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 6 или SEQ ID NO: 7.

В одном варианте осуществления антитело способно связываться с CLDN6 путем взаимодействия, по меньшей мере, с одной, предпочтительно более чем одной, например, 2, 3, 4 или 5, предпочтительно со всеми аминокислотами, выбранными из группы, состоящей из Thr33, Phe35, Gly37, Ser39, Ilе40 и Leul51, предпочтительно путем взаимодействия, по меньшей мере, с одной, предпочтительно более чем одной, предпочтительно со всеми аминокислотами, выбранными из группы, состоящей из Тhr33, Phe35, Gly37, Ser39 и Ilе40, более предпочтительно путем взаимодействия, по меньшей мере, с одной, предпочтительно более чем одной, предпочтительно со всеми аминокислотами, выбранными из группы, состоящей из Phe35, Gly37, Ser39 и Ilе40 или состоящей из Thr33, Phe35, Gly37 и Ser39, и в частности, путем взаимодействия, по меньшей мере, с одной, предпочтительно более чем одной, предпочтительно со всеми аминокислотами, выбранными из группы, состоящей из Phe35, Gly37 и Ser39. Предпочтительно антитело не взаимодействует с одной или более, предпочтительно со всеми аминокислотами, выбранными из группы, состоящей из Glul54, А1а155, Arg158 и Gly161, и предпочтительно не взаимодействует с одной или более, предпочтительно со всеми аминокислотами, выбранными из группы, состоящей из Arg158 и Gly161.

Взаимодействие между антителом и CLDN6, в частности в его нативной конформации, может быть исследовано с помощью сканирующего аланином мутагенеза аминокислот. Мутанты CLDN6 можно определить по их способности связываться со специфическими моноклональными антителами. Уменьшенное связывание специфического моноклонального антитела с CLDN6-мутантом означает, что мутировавшая (видоизмененная) аминокислота является важным связывающим остатком. Связывание можно проанализировать, например, с помощью проточной цитометрии.

В одном варианте осуществления антитело получают способом, включающим стадию иммунизации животного пептидом, имеющим любую аминокислотную последовательность из числа SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 14 и SEQ ID NO: 15, предпочтительно аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6 или SEQ ID NO: 7, или иммунологически эквивалентным пептидом или нуклеиновой кислотой или клеткой-хозяином, экспрессирующей указанный пептид.

В различных вариантах осуществления CLDN6, с которым антитело способно связаться, имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2 или аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8. Особенно предпочтительно, что антитело способно связаться с CLDN6, имеющим аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, и способно связаться с CLDN6, имеющим аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8.

В одном варианте осуществления антитело изобретения содержит тяжелую цепь, содержащую, по меньшей мере, одну, предпочтительно две, более предпочтительно все три CDR-последовательности тяжелой цепи антитела, выбранные из числа SEQ ID NO: 34, 36, 38 и 40 или их варианта. В вышеупомянутых последовательностях тяжелой цепи антитела, приведенных на фиг.25, CDR-последовательности помечены прямоугольником.

В одном варианте осуществления антитело изобретения содержит тяжелую цепь, включающую CDR3 последовательность Xaa1 Gly Хаа2 Val ХааЗ, где Xaa1 является любой аминокислотой, предпочтительно ароматической аминокислотой, более предпочтительно Phe или Туг, наиболее предпочтительно Туr, Хаа2 является любой аминокислотой, предпочтительно ароматической аминокислотой, более предпочтительно Phe или Туr, наиболее предпочтительно Туr, и ХааЗ является любой аминокислотой, предпочтительно Leu или Phe, более предпочтительно Leu. В одном варианте осуществления антитело изобретения содержит тяжелую цепь, включающую CDR3 последовательность Asp Xaa1 Gly Хаа2 Val ХааЗ или Xaa1 Gly Хаа2 Val ХааЗ Asp, где Xaa1, Хаа2 и ХааЗ представляют собой, как описано выше. В одном варианте осуществления антитело изобретения содержит тяжелую цепь, включающую CDR3 последовательность Asp Xaa1 Gly Хаа2 Val ХааЗ Asp, где Xaa1, Хаа2 и ХааЗ представляют собой, как описано выше. В одном варианте осуществления антитело изобретения содержит тяжелую цепь, включающую CDR3 последовательность Ala Arg Asp Xaa1 Gly Xaa2 Val ХааЗ Asp Туr, где Xaa1, Xaa2 и ХааЗ представляют собой, как описано выше.

В одном варианте осуществления антитело согласно вышеприведенным вариантам осуществления содержит тяжелую цепь антитела, включающую CDR1 последовательность в соответствии с SEQ ID NO: 47 или ее вариантом и/или CDR2 последовательность в соответствии с SEQ ID NO: 48 или ее вариантом.

В одном варианте осуществления антитело изобретения содержит тяжелую цепь, включающую последовательность тяжелой цепи, выбранную из SEQ ID NO: 34, 36, 38 и 40 или их варианта.

В одном варианте осуществления антитело изобретения содержит легкую цепь, содержащую, по меньшей мере, одну, предпочтительно две, более предпочтительно все три CDR-последовательности легкой цепи антитела, выбранные из SEQ ID NO: 35, 37, 39 и 41 или их варианта. В вышеупомянутых последовательностях тяжелой цепи антитела, приведенные на фиг.26 CDR-последовательности, помечены прямоугольником.

В одном варианте осуществления антитело изобретения содержит легкую цепь, включающую CDR3 последовательность Arg Xaa1 Хаа2 ХааЗ Pro, где Xaa1 является любой аминокислотой, предпочтительно Ser или Asn, наиболее предпочтительно Ser, Хаа2 является любой аминокислотой, предпочтительно Туr, Ser, Ilе, Asn или Thr, более предпочтительно Туr, Ser, или Asn, наиболее предпочтительно Asn, и ХааЗ является любой аминокислотой, предпочтительно Ser или Туr, более предпочтительно Туr. В одном варианте осуществления антитело изобретения содержит легкую цепь, включающую CDR3 последовательность Gln Arg Xaa1 Хаа2 ХааЗ Pro Pro, где Xaa1, Хаа2 и ХааЗ представляют собой, как определено выше. В одном варианте осуществления антитело изобретения содержит легкую цепь, включающую CDR3 последовательность Gln Gln Arg Xaa1 Xaa2 ХааЗ Pro Pro Trp Thr, где Xaa1, Xaa2 и ХааЗ представляют собой, как определено выше. В одном варианте осуществления антитело согласно вышеприведенным вариантам осуществления содержит легкую цепь антитела, включающую CDR1 последовательность в соответствии с SEQ ID NO: 52 или ее вариант и/или CDR2 последовательность в соответствии с SEQ ID NO: 53 или ее вариант.

В одном варианте осуществления антитело изобретения содержит легкую цепь, содержащую последовательность легкой цепи, выбранную из SEQ ID NO: 35, 37, 39 и 41 или их варианта.

В различных вариантах осуществления антитело изобретения содержит тяжелую цепь, как обсуждалось выше, и легкую цепь, как также обсуждалось выше. В одном варианте осуществления антитело изобретения содержит:

(i) тяжелую цепь антитела, содержащую, по меньшей мере, одну, предпочтительно две, более предпочтительно все три CDR-последовательности последовательности тяжелой цепи антитела SEQ ID NO: х, или их вариант, и

(ii) легкую цепь антитела, содержащую, по меньшей мере, одну, предпочтительно две, более предпочтительно все три CDR-последовательности последовательности легкой цепи антитела SEQ ID NO: х+1, или их вариант; где х выбирают из 34, 36, 38 и 40.

CDR-последовательности в вышеупомянутых последовательностях тяжелой цепи антитела и последовательностях легкой цепи антитела, приведенных на фиг.25 и фиг.26, соответственно, помечены прямоугольником.

В одном варианте осуществления антитело изобретения содержит:

(i) тяжелую цепь антитела, содержащую CDR3 последовательность, выбранную из группы, состоящей из Xaa1 Gly Хаа2 Val ХааЗ, Asp Xaa1 Gly Xaa2 Val ХааЗ, Xaa1 Gly Xaa2 Val ХааЗ Asp, Asp Xaa1 Gly Xaa2 Val ХааЗ Asp и Ala Arg Asp Xaa1 Gly Xaa2 Val ХааЗ Asp Туr, где Xaal является любой аминокислотой, предпочтительно ароматической аминокислотой, более предпочтительно Phe или Туr, наиболее предпочтительно Туr, Хаа2 является любой аминокислотой, предпочтительно ароматической аминокислотой, более предпочтительно Phe или Туr, наиболее предпочтительно Туr, и ХааЗ является любой аминокислотой, предпочтительно Leu или Phe, более предпочтительно Leu, и

(ii) легкую цепь антитела, содержащую CDR3 последовательность, выбранную из группы, состоящей из Arg Xaa1 Хаа2 ХааЗ Pro, Gln Arg Xaa1 Xaa2 ХааЗ Pro Pro, Gln Gin Arg Xaa1 Xaa2 ХааЗ Pro Pro Trp Thr, где Xaa1 является любой аминокислотой, предпочтительно Ser или Asn, наиболее предпочтительно Ser, Хаа2 является любой аминокислотой, предпочтительно Туr, Ser, Не, Asn или Thr, более предпочтительно Туr, Ser или Asn, наиболее предпочтительно Asn, и ХааЗ является любой аминокислотой, предпочтительно Ser или Туr, более предпочтительно Туr.

В одном варианте осуществления антитело согласно вышеприведенным вариантам осуществления содержит (i) тяжелую цепь, включающую CDR1 последовательность в соответствии с SEQ ID NO: 47 или ее вариантом и/или CDR2 последовательность в соответствии с SEQ ID NO: 48 или ее вариантом и/или (ii) легкую цепь, включающую CDR1 последовательность в соответствии с SEQ ID NO: 52 или ее вариантом и/или CDR2 последовательность в соответствии с SEQ ID NO: 53 или ее вариантом.

В одном варианте осуществления антитело изобретения содержит:

(i) тяжелую цепь антитела, содержащую последовательность тяжелой цепи SEQ ID NO: х или ее вариант, и

(ii) легкую цепь антитела, содержащую последовательность легкой цепи SEQ ID 5 NO: х+1 или ее вариант;

где х выбирают из 34, 36, 38 и 40.

В предпочтительных вариантах осуществления антитело оказывает одно или более из следующих действий: (i) уничтожение клеток, экспрессирующих CLDN6, (ii) ингибирование пролиферации клеток, экспрессирующих CLDN6, (iii) ингибирование колониеобразования клеток, экспрессирующих CLDN6, (iv) опосредование ремиссии, т.е. уменьшение размера, предпочтительно полной ремиссии, т.е. полного исчезновения развившихся опухолей, (v) предотвращение образования или повторного образования опухолей и (vi) ингибирование метастазирования клеток, экспрессирующих CLDN6. Соответственно, антитело может использоваться для получения одного или более из перечисленного выше, в частности, при введении пациенту. Такое уничтожение клеток и/или ингибирование одной или более функций клеток может использоваться с терапевтической целью, как описано здесь. В частности, уничтожение клеток, ингибирование пролиферации клеток и/или ингибирование колониеобразования клеток может использоваться для лечения или предотвращения рака, включая метастазы рака. Ингибирование пролиферации, колониеобразования и/или метастазирования клеток может использоваться, в частности, для лечения или предотвращения метастазов рака и метастатического распространения раковых клеток. Предпочтительно антитело изобретения опосредует уничтожение клеток, вызывая лизис, опосредованный комплементзависимой цитотоксичностью (CDC), лизис, опосредованный антителозависимой клеточной цитотоксичностью (ADCC), апоптоз, гомотипическую адгезию и/или фагоцитоз, предпочтительно, вызывая CDC-опосредованный лизис и/или ADCC-опосредованный лизис. Однако настоящее изобретение также включает варианты осуществления, в которых антитело оказывает описанное здесь действие, такое как уничтожение клеток и/или ингибирование одной или более функций клеток, например, клеточной пролиферации и/или колониеобразования, без индуцирования лизиса, опосредованного комплементзависимой цитотоксичностью (CDC), лизиса, опосредованного антителозависимой клеточной цитотоксичностью (ADCC), апоптоза, гомотипической адгезии и/или фагоцитоза. Например, антитело изобретения также может оказывать действие просто путем связывания с CLDN6 на клеточной поверхности, таким образом, например, останавливая пролиферацию клеток. В одном варианте осуществления антитело изобретения не вызывает CDC-опосредованный лизис клеток.

Предпочтительно ADCC-опосредованный лизис клеток происходит в присутствии эффекторных клеток, которые в отдельных вариантах осуществления выбирают из группы, состоящей из моноцитов, мононуклеарных клеток, NK-клеток и PMN (полиморфноядерных нейтрофилов), а фагоцитоз осуществляется макрофагами.

Активность, связанную с ингибированием или уменьшением пролиферации клеток, экспрессирующих CLDN6, предпочтительно раковых клеток, можно измерить in vitro путем определения пролиферации CLDN6-экспрессирующих клеток с помощью метода, использующего бромдезоксиуридин (5-бром-2-дезоксиуридин, BrdU). BrdU представляет собой синтетический нуклеозид, являющийся аналогом тимидина, который может включаться во вновь синтезированную ДНК воспроизводящихся путем клеточного деления клеток (во время S-фазы клеточного цикла), замещая тимидин во время репликации ДНК. Обнаружение включенного химического вещества, например, с помощью антител, специфических к BrdU, укажет на клетки, которые активно воспроизводили свою ДНК.

Активность, связанную с ингибированием или уменьшением колониеобразования клеток, экспрессирующих CLDN6, предпочтительно раковых клеток, можно измерить in vitro с помощью исследования колониеобразования. Оценка способности образования колоний представляет собой микробиологическую методику для изучения эффективности воздействия отдельных веществ на выживание и пролиферацию клеток. Эта методика часто используется в лабораториях, изучающих рак, для определения действия лекарственных препаратов или облучения на пролиферирующие опухолевые клетки. Эксперимент включает три основных этапа: (i) обработку образца клеток, в частности раковых клеток, (ii) высевание клеток в сосуд для культивирования и (iii) этап роста клеток. Полученные колонии фиксируют, окрашивают и подсчитывают. Колониеобразование имеет большое значение для образования метастазов, если отдельные опухолевые клетки проникают в органы. Ингибирующая активность антител показывает их возможность подавлять образование метастазов. Антитела, продемонстрировавшие активность, связанную с ингибированием или уменьшением колониеобразования, при исследовании методом колониеобразования, являются в частности пригодными для лечения или предотвращения метастазов и метастатического распространения раковых клеток, в частности, упомянутых в описании видов рака.

В предпочтительных вариантах осуществления антитело проявляет одну или более иммунных эффекторных функций в отношении клеток, несущих CLDN6 в нативной конформации, при этом одну или более иммунные эффекторные функции предпочтительно выбирают из группы, состоящей из комплементзависимой цитотоксичности (CDC), антителозависимой клеточной цитотоксичности (ADCC), индукции апоптоза и ингибирования пролиферации, предпочтительно эффекторными функциями являются ADCC и/или CDC.

Предпочтительно указанная одна или более активностей или одна или более иммунных эффекторных функций, проявляемых указанным антителом, вызываются связыванием указанного антитела с CLDN6, предпочтительно с эпитопом, расположенным на внеклеточном участке CLDN6, причем указанный внеклеточный участок CLDN6 предпочтительно содержит любую аминокислотную последовательность из числа SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 14 и SEQ ID NO: 15, предпочтительно аминокислотную последовательность SEQ ID: 6 или SEQ ID NO: 7, более предпочтительно аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6.

Согласно изобретению клетка, экспрессирующая CLDN6, предпочтительно характеризуется соединением CLDN6 с клеточной поверхностью. Клетка, экспрессирующая CLDN6, или клетка, несущая CLDN6 в нативной конформации, предпочтительно является опухолевой клеткой, такой как раковая клетка, предпочтительно клеткой злокачественной опухоли, выбранной из группы, состоящей из рака яичника, в частности аденокарциномы яичника и тератокарциномы яичника, рака легкого, включая мелкоклеточный рак легкого (SCLC) и немелкоклеточный рак легкого (NSCLC), в частности плоскоклеточного рака легкого и аденокарциномы, рака желудка, рака молочной железы, рака печени, рака поджелудочной железы, рака кожи, в частности базальноклеточной карциномы и плоскоклеточной карциномы, злокачественной меланомы, рака головы и шеи, в частности злокачественной плеоморфной аденомы, саркомы, в частности синовиальной саркомы и карциносаркомы, рака желчного протока, рака мочевого пузыря, в частности переходно-клеточной карциномы и папиллярного рака, рака почки, в частности почечноклеточного рака, включая светлоклеточный рак почки и папиллярную карциному почки, рака толстой кишки, рака тонкой кишки, включая рак подвздошной кишки, в частности аденокарциномы тонкой кишки и аденокарциномы подвздошной кишки, эмбриональной карциномы яичка, плацентарной хориокарциномы, рака шейки матки, рака яичка, в частности семиномы яичка, тератомы яичка и эмбрионального рака яичка, рака матки, герминомы, такой как, тератокарцинома или эмбриональная карцинома, в частности эмбрионально-клеточной опухоли яичка, и их метастатических форм.

Антитело изобретения может быть присоединено к одному или более терапевтическим эффекторным фрагментам (частицам, молекулам), например, радиоактивным меткам, цитотоксинам, терапевтическим ферментам, агентам, вызывающим апоптоз, и тому подобному, для того, чтобы обеспечить прицельную цитотоксичность, т.е. уничтожение опухолевых клеток.

В одном варианте осуществления антитело изобретения (i) связывается с клетками, экспрессирующими CLDN6 и характеризующимися соединением CLDN6 с клеточной поверхностью, и (и) не связывается с клетками, неэкспрессирующими CLDN6 и нехарактеризующимися соединением CLDN6 с клеточной поверхностью. Антитело изобретения предпочтительно (i) опосредует уничтожение и/или ингибирует пролиферацию клеток, экспрессирующих CLDN6 и характеризующихся соединением CLDN6 с клеточной поверхностью, и (ii) не опосредует уничтожение и/или не ингибирует пролиферацию клеток, неэкспрессирующих CLDN6 и нехарактеризующихся соединением CLDN6 с клеточной поверхностью.

В отдельных предпочтительных вариантах осуществления антитело изобретения связывается с нативными эпитопами CLDN6, присутствующими на поверхности живых клеток, такими как SEQ ID NO: 6 или 7. В дополнительных предпочтительных вариантах осуществления антитело изобретения является специфическим в отношении CLDN6-экспрессирующих раковых клеток и не связывается с раковыми клетками, неэкспрессирующими CLDN6.

Антитела изобретения можно получить от разных видов животных, включая, но не ограничиваясь этим, мышь, крысу, кролика, морскую свинку и человека. Антитела изобретения также включают химерные молекулы, в которых константная область антитела, полученная от одного вида, предпочтительно человека, объединена с участком связывания антигена, полученным от другого вида. Более того, антитела изобретения включают гуманизированные молекулы, в которых антигенсвязывающие участки, полученные от вида, не являющегося человеком, объединяются с константными и каркасными участками человеческого происхождения.

Антитела изобретения включают поликлональные и моноклональные антитела и включают антитела к IgG2a (например, IgG2a, к, λ), IgG2b (например, IgG2b, к, λ), IgG3 (например, IgG3, к, λ) и IgM. Однако, также рассматриваются другие изотипы антител изобретения, включая IgG1, IgA1, IgA2, секреторные IgA, IgD и IgE антитела. Антитела могут быть целыми антителами или их антигенсвязывающими фрагментами, включая, например, Fab, F(ab')2, Fv, одноцепочечные Fv фрагменты или биспецифические антитела. Кроме того, антигенсвязывающие фрагменты включают домен связывания иммуноглобулиновых гибридных белков, содержащий (i) полипептид-связывающий домен (такой как вариабельная область тяжелой цепи или вариабельная область легкой цепи), который соединяется с иммуноглобулиновым шарнирным участком полипептида, (ii) константную область СН2 тяжелой цепи иммуноглобулина, соединенную с шарнирным участком и (iii) константную область СНЗ тяжелой цепи иммуноглобулина, соединенную с СН2 константной областью. Такие домены связывания иммуноглобулиновых гибридных белков дополнительно раскрываются в US 2003/0118592 и US 2003/0133939.

Антитело изобретения предпочтительно является моноклональным, химерным человеческим или гуманизированным антителом или фрагментом антитела. Антитела изобретения включают полностью человеческие антитела. Такие антитела могут быть получены в трансгенном животном, не являющимся человеком, например, трансгенной мыши, способной продуцировать множество изотипов человеческих моноклональных антител к CLDN6 с помощью проведения V-D-J рекомбинации и переключения изотипа. Такое трансгенное животное также может быть трансгенным кроликом для получения поликлональных антител, например, раскрытых в US 2003/0017534.

Предпочтительно антитела настоящего изобретения отделяются от CLDN6 с равновесной константой диссоциации (KD) приблизительно 1-100 нМ или менее. Предпочтительно антитела изобретения не реагируют перекрестно с родственными антигенами клеточной поверхности и таким образом не ингибируют их функцию.

В предпочтительных вариантах осуществления антитела настоящего изобретения могут характеризоваться одним или более из следующих свойств:

a) специфичностью к CLDN6;

b) родством связывания с CLDN6 около 100 нМ или менее, предпочтительно около 5-10 нМ или менее и более предпочтительно около 1-3 нМ или менее,

c) способностью вызывать CDC клеток, экспрессирующих CLDN6 и характеризующихся соединением CLDN6 с клеточной поверхностью;

d) способностью ингибировать рост клеток, экспрессирующих CLDN6 и характеризующихся соединением CLDN6 с клеточной поверхностью;

e) способностью вызывать апоптоз клеток, экспрессирующих CLDN6 и характеризующихся соединением CLDN6 с клеточной поверхностью;

f) способностью вызывать гомотопическую адгезию клеток, экспрессирующих CLDN6 и характеризующихся соединением CLDN6 с клеточной поверхностью;

g) способностью вызывать ADCC клеток, экспрессирующих CLDN6 и характеризующихся соединением CLDN6 с клеточной поверхностью в присутствии эффекторных клеток;

h) способностью увеличивать выживаемость субъекта, имеющего опухолевые клетки, экспрессирующие CLDN6 и характеризующиеся соединением CLDN6 с клеточной поверхностью;

i) способностью уничтожать клетки, экспрессирующие CLDN6 и характеризующиеся соединением CLDN6 с клеточной поверхностью;

j) способностью агрегировать CLDN6 на поверхности живых клеток.

Предпочтительное антитело, описанное здесь, является антителом, выработанным клеткой гибридомой или полученным от клетки гибридомы, депонированной в DSMZ (Inhoffenstr. 7В, 38124 Braunschweig, Германия) и имеющей одно из следующих обозначений и регистрационных номеров:

1. GT512muMAB 59А, регистрационный номер DSM АСС3067, депонирована 21 июня 2010;

2. GT512muMAB 60А, регистрационный номер DSM АСС3068, депонирована 21 июня 2010;

3. GT512muMAB 61D, регистрационный номер DSM АСС3069, депонирована 21 июня 2010;

4. GT512muMAB 64A, регистрационный номер DSM АСС3070, депонирована 21 июня 2010;

5. GT512muMAB 65А, регистрационный номер DSM АСС3071, депонирована 21 июня 2010;

6. GT512muMAB 66В, регистрационный номер DSM АСС3072, депонирована 21 июня 2010;

7. GT512muMAB 67А, регистрационный номер DSM АСС3073, депонирована 21 июня 2010;

8. GT512muMAB 55А, регистрационный номер DSM АСС3089, депонирована 31 августа 2010; или

9. GT512muMAB 89А, регистрационный номер DSM АСС3090, депонирована 31 августа 2010.

Антитела изобретения обозначаются в описании путем отсылки к обозначению антитела и/или путем отсылки к клону, продуцирующему антитело, например, muMAB 59А.

Кроме того, предпочтительными антителами являются антитела, имеющие специфичность антител, выработанных гибридомой или полученных от описанной выше гибридомы, и в частности, антитела, содержащие антигенсвязывающий участок или антигенсвязывающий центр, в частности вариабельный участок, идентичный или высокогомологичный участку антитела, выработанного или полученного от вышеописанной гибридомы. Предусматривается, что предпочтительными антителами являются антитела, имеющие CDR участки или идентичные или высокогомологичные участкам антител, продуцированных или полученных от описанной выше гибридомы. Под "высокогомологичным" имеется в виду, что может быть сделано от 1 до 5, предпочтительно от 1 до 4, например от 1 до 3, или 1 или 2 замены в каждом CDR участке. Особенно предпочтительными являются химерные и гуманизированные формы антител, продуцированные гибридомой или полученные от нее.

Таким образом, антитело изобретения можно выбрать из группы, состоящей из (i) антитела, продуцированного или полученного от клона, депонированного под регистрационным номером DSM АСС3067 (GT512muMAB 59А), DSM АСС3068 (GT512muMAB 60А), DSM ACC3069 (GT512muMAB 61D), DSM ACC3070 (GT512muMAB 64A), DSM ACC3071 (GT512muMAB 65A), DSM ACC3072 (GT512muMAB 66B), DSM ACC3073 (GT512muMAB 67A), DSM ACC3089 (GT512muMAB 55A) или DSM ACC3090 (GT512muMAB 89A), (ii) антитела, которое представляет собой химерную или гуманизированную форму антитела согласно (i), (iii) антитела, имеющего специфичность антитела согласно (i), и (iv) антитела, содержащего антигенсвязывающий участок или антигенсвязывающий центр антитела согласно (i). Антигенсвязывающий участок или антигенсвязывающий центр антитела согласно (i) может содержать вариабельный участок антитела согласно (i).

Настоящее изобретение также имеет отношение к клетке, такой как клетка гибридомы, продуцирующая антитело, как описано здесь.

Предпочтительными клетками гибридомы являются те, которые депонированы в DSMZ (Inhoffenstr. 7В, 38124 Braunschweig, Германия) и имеют одно из следующих обозначений и регистрационных номеров:

1. GT512muMAB 59А, регистрационный номер DSM АСС3067, депонирована 21 июня 2010;

2. GT512muMAB 60А, регистрационный номер DSM АСС3068, депонирована 21 июня 2010;

3. GT512muMAB 61D, регистрационный номер DSM АСС3069, депонирована 21 июня 2010;

4. GT512muMAB 64А, регистрационный номер DSM АСС3070, депонирована 21 июня 2010;

5. GT512muMAB 65А, регистрационный номер DSM АСС3071, депонирована 21 июня 2010;

6. GT512muMAB 66В, регистрационный номер DSM АСС3072, депонирована 21 июня 2010;

7. GT512muMAB 67А, регистрационный номер DSM АСС3073, депонирована 21 июня 2010;

8. GT512muMAB 55А, регистрационный номер DSM АСС3089, депонирована 31 августа 2010; или

9. GT512muMAB 89А, регистрационный номер DSM АСС3090, депонирована 31 августа 2010.

Aнти-CLDN6 антитела настоящего изобретения могут образовывать производные, связываться или совместно экспрессироваться с другими специфичностями связывания. В отдельном варианте осуществления изобретение предоставляет биспецифическую или мультиспецифическую молекулу, содержащую, по меньшей мере, первую специфичность связывания для CLDN6 (например, анти-CLDN6-антитело или его миметик) и вторую специфичность связывания для эффекторной клетки, например, специфичность связывания для рецептора Fc (например, Fc-гамма-рецептора, такого как Fc-гамма-RI, или любого другого Fc-рецептора) или Т-клеточного рецептора, например, CD3.

Соответственно, настоящее изобретение включает биспецифические и мультиспецифические молекулы, которые связываются и с CLDN6 и с Fc-рецептором или Т-клеточным рецептором, например, CD3. Примерами Fc-рецепторов являются рецептор IgG, Fc-гамма рецептор (FcγR), такой как FcγRI (CD64), FcγRII (CD32) и FcγRIII (CD16). Другие Fc-рецепторы, такие как рецепторы IgA (например, FcαRJ), также могут являться целью. Рецептор Fc предпочтительно располагается на поверхности эффекторной клетки, например, моноцита, макрофага или активированной мононуклеарной клетки. В предпочтительном варианте осуществления биспецифические и мультиспецифические молекулы связываются с Fc-рецептором на участке, отличном от иммуноглобулинового Fc (например, IgG или IgA) участка связывания рецептора. Следовательно, связывание биспецифических и мультиспецифических молекул не блокируется физиологическими уровнями иммуноглобулинов.

В другом аспекте aнти-CLDN6 антитела изобретения являются производными, связанными с или совместно экспрессированными с другими функциональными молекулами, например, другим пептидом или белком (например, Fab¹ фрагментом). Например, антитело изобретения может быть функционально связано (например, с помощью химического соединения, генетического слияния, нековалетного соединения или иного способа) с одной или более другими молекулярными частицами, например, другим антителом (например, для получения биспецифического или мультиспецифического антитела), цитотоксином, клеточным лигандом или антигеном (например, чтобы получить иммуноконъюгат, такой как иммунотоксин). Антитело настоящего изобретения может быть связано с другими терапевтическими частицами, например, радиоизотопом, небольшой молекулой противоопухолевого лекарственного средства, рекомбинантным цитокином или хемокином. Соответственно, настоящее изобретение включает целый ряд конъюгатов антител, биспецифические и мультиспецифические молекулы и гибридные белки, которые связываются с клетками, экспрессирующими CLDN6, и/или с клетками, характеризующимися соединением CLDN6 с клеточной поверхностью, и которые можно использовать для нацеливания других молекул на эти клетки.

В целом, для целей настоящего изобретения все производные антител, такие как конъюгаты антител, биспецифические и мультиспецифические молекулы и гибридные белки, описанные здесь, охватываются термином "антитело".

В дополнительном аспекте изобретение также предусматривает CLDN6-связывающие белки, полученные из доменов, не являющихся иммуноглобулиновыми, в частности одноцепочечные белки. Такие связывающие белки и способы их получения описаны, например, в работе Binz et al. (2005) Nature Biotechnology 23 (10): 1257-1268, включенной в описание путем отсылки. Следует понимать, что приведенная в описании идея в отношении иммуноглобулина или производных от иммуноглобулина связывающих молекул, соответственно также применима к связывающим молекулам, полученным из неиммуноглобулиновых доменов. В частности, используя такие связывающие молекулы, полученные из неиммуноглобулиновых доменов, возможно блокировать CLDN6 клеток, экспрессирующих указанную мишень и характеризующихся соединением указанной мишени с клеточной поверхностью, и таким образом, как раскрыто в описании в отношении антител изобретения, осуществить терапевтические эффекты, в частности ингибирование одной или более функций опухолевых клеток, раскрытых в описании, например, ингибирование пролиферации. Хотя не обязательно, но возможно, придать эффекторные функции антител таким неиммуноглобулиновым связывающим молекулам, например, путем слияния с Fc участком антител.

Настоящее изобретение в целом включает лечение и/или диагностирование болезней, в частности опухолевых заболеваний, путем «нацеливания» на CLDN6, экспрессированный клетками и соединенный с поверхностью клеток. Эти способы обеспечивают селективное обнаружение и/или уничтожение таких клеток, тем самым сводя к минимуму вредные воздействия на нормальные клетки, неэкспрессирующие CLDN6 и нехарактеризующиеся соединением CLDN6 с клеточной поверхностью. Предпочтительными болезнями для лечения и диагностирования являются болезни, при которых затронуты клетки, экспрессирующие CLDN6 и характеризующиеся соединением CLDN6 с клеточной поверхностью, например, опухолевые заболевания, в частности раковые заболевания, такие как описанные здесь.

В одном аспекте изобретение предоставляет композиции, например, фармацевтические и диагностические композиции/наборы, содержащие антитело или комбинацию антител изобретения. Фармацевтическая композиция изобретения может содержать фармацевтически приемлемый носитель и может необязательно содержать один или более адьювантов, стабилизирующих веществ и т.д. В отдельном варианте осуществления композиция включает комбинацию антител, которые связываются с разными эпитопами или которые обладают разными функциональными характеристиками, например, вызывают CDC и/или ADCC и вызывают апоптоз. В этом варианте осуществления изобретения антитела могут использоваться в комбинации, например, как фармацевтическая композиция, содержащая два или более анти-CLDN6 моноклональных антитела. Например, анти-CLDN6 антитела, имеющие различные, но комплементарные активности, могут быть объединены в единое лечение для достижения желаемого терапевтического эффекта. В предпочтительном варианте осуществления композиция включает анти-CLDN6 антитело, опосредующее CDC, в комбинации с другим aнти-CLDN6 антителом, вызывающим апоптоз. В другом варианте осуществления композиция включает анти-CLDN6 антитело, опосредующее высокоэффективное уничтожение клеток-мишеней в присутствии эффекторных клеток, в комбинации с другим анти-CLDN6 антителом, ингибирующим рост клеток, экспрессирующих CLDN6 и характеризующихся соединением CLDN6 с клеточной поверхностью.

Настоящее изобретение также включает одновременное или последовательное введение двух или более анти-CLDN6 антител изобретения, причем предпочтительно, по меньшей мере, одно из указанных антител является химерным анти-CLDN6 антителом и, по меньшей мере, одно дополнительное антитело является человеческим анти-CLDN6 антителом, при этом антитела связываются с одним и тем же или разными эпитопами CLDN6. Предпочтительно химерное CLDN6 антитело изобретения вводится первым, с последующим введением человеческого анти-CLDN6 антитела изобретения, причем человеческое анти-CLDN6 антитело предпочтительно вводится в течение длительного периода времени, т.е. как поддерживающая терапия.

Антитела, конъюгаты, биспецифические/мультиспецифические молекулы и композиции настоящего изобретения могут использоваться в ряде способов ингибирования роста клеток, экспрессирующих CLDN6 и характеризующихся соединением CLDN6 с клеточной поверхностью, и/или селективного уничтожения клеток, экспрессирующих CLDN6 и характеризующихся соединением CLDN6 с клеточной поверхностью, путем контактирования клеток с эффективным количеством антитела, конъюгата, биспецифической/мультиспецифической молекулы или композиции, так что рост клеток ингибируется и/или клетка уничтожается. В одном варианте осуществления способ включает уничтожение клеток, экспрессирующих CLDN6 и характеризующихся соединением CLDN6 с клеточной поверхностью, необязательно в присутствии эффекторных клеток, например, путем CDC, апоптоза, ADCC, фагоцитоза или с помощью комбинации двух или более из этих механизмов. Клетки, экспрессирующие CLDN6 и характеризующиеся соединением CLDN6 с клеточной поверхностью, которые можно ингибировать или уничтожить, используя антитела изобретения, включают раковые клетки.

Антитела, конъюгаты, и биспецифические/мультиспецифические молекулы и композиции настоящего изобретения можно использовать для лечения и/или предотвращения целого ряда болезней, затрагивающих клетки, экспрессирующие CLDN6 и характеризующиеся соединением CLDN6 с клеточной поверхностью, путем введения антител пациентам, страдающим от таких болезней. Примеры болезней, которые можно лечить (например, улучшить) или предотвратить, включают, но не ограничиваются этим, онкологические болезни. Примеры онкологических болезней, которые можно лечить и/или предотвратить, включают злокачественные заболевания, такие как рак яичника, в частности аденокарциному яичника и тератокарциному яичника, рак легких, включая мелкоклеточный рак легкого (SCLC) и немелкоклеточный рак легкого (NSCLC), в частности плоскоклеточный рак легкого и аденокарциному, рак желудка, рак молочной железы, рак печени, рак поджелудочной железы, рак кожи, в частности базальноклеточную карциному и плоскоклеточную карциному, злокачественная меланома, рак головы и шеи, в частности злокачественную плеоморфную аденому, саркому, в частности синовиальную саркому и карциносаркому, рак желчного протока, рак мочевого пузыря, в частности переходно-клеточную карциному и папиллярный рак, рак почки, в частности почечноклеточный рак, включая светлоклеточный рак почки и папиллярную карциному почки, рак толстой кишки, рак тонкой кишки, включая рак подвздошной кишки, в частности аденокарциному тонкой кишки и аденокарциному подвздошной кишки, эмбриональную карциному яичка, плацентарную хориокарциному, рак шейки матки, рак яичка, в частности семиному яичка, тератому яичка и эмбриональный рак яичка, рак матки, герминома, такую как, тератокарцинома или эмбриональная карцинома, в частности эмбрионально-клеточная опухоль яичка, и их метастатические формы.

В дополнительном аспекте изобретение имеет отношение к способу лечения или предотвращения болезни или нарушения, затрагивающего клетки, экспрессирующие CLDN6 и характеризующиеся соединением CLDN6 с клеточной поверхностью, включающему введение субъекту антитела, конъюгата, биспецифической /мультиспецифической молекулы или композиции изобретения. Предпочтительно болезнь или нарушение является болезнью, связанной с опухолью, и в конкретных вариантах осуществления ее выбирают из группы, состоящей из рака яичника, в частности аденокарциномы яичника и тератокарциномы яичника, рака легких, включая мелкоклеточный рак легкого (SCLC) и немелкоклеточный рак легкого (NSCLC), в частности плоскоклеточный рак легкого и аденокарциному, рака желудка, рака молочной железы, рака печени, рака поджелудочной железы, рака кожи, в частности базальноклеточной карциномы и плоскоклеточной карциномы, злокачественной меланомы, рака головы и шеи, в частности злокачественной плеоморфной аденомы, саркомы, в частности синовиальной саркомы и карциносаркомы, рака желчного протока, рака мочевого пузыря, в частности переходно-клеточной карциномы и папиллярного рака, рака почки, в частности почечноклеточного рака, включая светлоклеточный рак почки и папиллярную карциному почки, рака толстой кишки, рака тонкой кишки, включая рак подвздошной кишки, в частности аденокарциному тонкой кишки и аденокарциному подвздошной кишки, эмбриональной карциномы яичка, плацентарной хориокарциномы, рака шейки матки, рака яичка, в частности семиномы яичка, тератомы яичка и эмбрионального рака яичка, рака матки, герминомы, такой как, тератокарцинома или эмбриональная карцинома, в частности эмбрионально-клеточной опухоли яичка, и их метастатических форм. Предпочтительно на поверхности указанных клеток экспрессируется CLDN6.

Изобретение затрагивает применение описанных здесь средств и композиций для профилактического и/или терапевтического лечения опухолевых болезней, т.е. для лечения пациента, имеющего опухолевое заболевание или имеющего риск развития опухолевого заболевания. В одном аспекте изобретение предоставляет способы ингибирования роста опухоли, включающие введение одного или более из описанных здесь средств и композиций.

Предпочтительно описанные здесь средства и композиции вводятся таким способом, что терапевтически активная субстанция не доставляется или практически не доставляется в ткань или орган, в котором клетки экспрессируют CLDN6 и характеризуются соединением CLDN6 с клеточной поверхностью, в то время как ткань или орган свободны от опухолей, например в ткань плаценты или плаценту. Для этого средства и композиции, описанные здесь, вводятся местно.

В одном аспекте изобретение предоставляет описанное здесь антитело для применения в описанных здесь способах лечения. В одном варианте осуществления изобретение предоставляет описанную здесь фармацевтическую композицию для применения в описанных здесь способах лечения.

В отдельном варианте осуществления изобретения субъекта, которому вводится антитело, дополнительно лечат с помощью химиотерапевтического средства, облучения или средства, модулирующего, например, усиливающего или ингибирующего, экспрессию или активность Fc-рецептора, например, Fc-гамма рецептора, такого как цитокин. Типичные цитокины для введения во время лечения включают гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (G-CSF), гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF), интерферон-γ (IFN-γ) и фактор некроза опухоли (TNF). Типичные терапевтические средства включают, в числе прочих, противоопухолевые средства, такие как доксорубицин, цисплатин, таксотер, 5-фторурацил, метотрексат, гемцитабин и циклофосфамид.

В следующем аспекте изобретение имеет отношение к иммунизации животных, не являющихся человеком, например, мышей, человеческим CLDN6 или его пептидным фрагментом, для получения антител. Предпочтительными пептидами для иммунизации являются пептиды, выбранные из группы, состоящей из SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 14 и SEQ ID NO: 15 и иммунологически эквивалентных пептидов.

Также как и трансгенные животные, не являющиеся человеком, животные дикого типа могут быть иммунизированы очищенным или обогащенным препаратом CLDN6 антигена или его пептидным фрагментом и/или нуклеиновыми кислотами и/или клетками, экспрессирующими CLDN6 или его пептидный фрагмент. Предпочтительно трансгенное животное, не являющееся человеком, способно продуцировать множество изотипов человеческих моноклональных антител к CLDN6 (например, IgG, IgA и/или IgM) с помощью проведения V-D-J рекомбинации и переключения изотипа. Переключение изотипа может происходить с помощью, например, классического или неклассического переключения изотипа.

Соответственно, в еще одном аспекте изобретение предоставляет выделенные из животного, не являющегося человеком, В-клетки, как описано выше. Затем выделенные В-клетки можно иммунизировать путем слияния с иммортализованной клеткой для получения источника (например, гибридомы) антител изобретения. Такие гибридомы (т.е. продуцирующие антитела изобретения) также включаются в рамки изобретения.

В дополнительном аспекте настоящее изобретение имеет отношение к методам диагностирования, обнаружения и мониторинга опухолевой болезни, включающим установление и/или определение количества CLDN6 или клеток, экспрессирующих CLDN6 и характеризующихся соединением CLDN6 с клеточной поверхностью, в биологическом образце, взятом у пациента, с помощью антитела изобретения. Биологический образец может быть взят у пациента, имеющего опухолевое заболевание, находящегося на подозрении по поводу заболевания или заболевающего или имеющего возможность развития опухолевого заболевания.

В одном варианте осуществления способа диагностирования, обнаружения или мониторинга опухолевой болезни согласно изобретению биологический образец и/или контрольный/эталонный образец происходит из ткани или органа, соответствующих ткани или органу, который следует продиагностировать, обнаружить или проконтролировать в отношении поражения опухолевым заболеванием, например, злокачественной болезнью, которую следует диагностировать, обнаружить или проконтролировать, является карцинома яичника, а биологический образец и/или контрольный/эталонный образец является тканью яичника. Такие ткани и органы описываются здесь, например, в связи с различными опухолевыми заболеваниями и видами рака.

В одном варианте осуществления способов диагностирования, обнаружения и мониторинга опухолевой болезни биологический образец является образцом ткани или органа, в котором клетки, в том случае, когда в ткани или органе отсутствует опухоль, практически не экспрессируют CLDN6 и не характеризуются значительным соединением CLDN6 с клеточной поверхностью. Предпочтительно указанная ткань является тканью, отличной от ткани плаценты.

Как правило, уровень молекулы-мишени в биологическом образце сравнивается с эталонным уровнем, причем отклонение от указанного эталонного уровня указывает на наличие и/или стадию опухолевого заболевания у субъекта. Эталонный уровень может быть таким же, как уровень, определенный в контрольном образце (например, образце здоровой ткани или от здорового субъекта), или средним уровнем у здоровых субъектов. "Отклонение" от указанного эталонного уровня означает любое значимое изменение, например, увеличение или уменьшение, по меньшей мере, на 10%, 20%, или 30%, предпочтительно, по меньшей мере, на 40% или 50%, или даже более. Предпочтительно наличие CLDN6 или клеток, экспрессирующих CLDN6 и характеризующихся соединением CLDN6 с клеточной поверхностью, в указанном биологическом образце или увеличенное количество CLDN6 или клеток, экспрессирующих CLDN6 и характеризующихся соединением CLDN6 с клеточной поверхностью, в биологическом образце по сравнению с эталонным уровнем указывает на наличие опухолевого заболевания.

В большинстве случаев обнаружение и/или определение количества в способах изобретения включает использование меченых антител, специфически связывающихся с молекулой-мишенью.

В отдельном аспекте изобретение имеет отношение к способу обнаружения, т.е. определения положения или места расположения опухоли, например, в конкретной ткани или органе, включающему введение антитела настоящего изобретения, которое соединяется с детектируемой меткой у пациента. Мечение ткани или органа у указанного пациента может показывать присутствие опухоли или наличие риска развития опухолевой болезни в указанной ткани или органе.

Например, антитела изобретения можно непосредственно получить от гибридомы, экспрессирующей антитело, или можно клонировать и рекомбинантно экспрессировать в клетке-хозяине (например, СНО клетке или лимфоцитарной клетке). Дополнительными примерами клеток-хозяев являются микроорганизмы, такие как Е. coli, и грибы, например, дрожжи. Альтернативно, они могут производиться рекомбинантно в трансгенных, не являющихся человеком, животных и растениях. Однако настоящее изобретение также предусматривает варианты осуществления, в которых антитела вырабатываются in situ путем иммунизации или вакцинации пациента, как раскрыто в описании.

Настоящее изобретение также имеет отношение к нуклеиновым кислотам, содержащим гены или нуклеиновокислотные последовательности, кодирующие антитела или их участки, например, цепь антитела, как описано здесь. Нуклеиновые кислоты могут входить в состав вектора, например, плазмиды, космиды, вируса, бактериофага или другого используемого вектора, например, принятого в генной инженерии. Кроме того, вектор может содержать гены, например, маркерные гены, дающие возможность отобрать вектор в подходящей клетке-хозяине и в подходящих условиях. Кроме того, вектор может содержать элементы контроля экспрессии, обеспечивающие надлежащую экспрессию закодированных участков в подходящих хозяевах. Такие элементы контроля известны специалисту и могут включать промотор, кассеты сплайсинга и кодон инициации трансляции.

Предпочтительно нуклеиновая кислота изобретения функционально прикрепляется к вышеупомянутой последовательности, контролирующей экспрессию, обеспечивая экспрессию в эукариотических и прокариотических клетках. Элементы контроля, обеспечивающие экспрессию в эукариотических и прокариотических клетках, хорошо известны специалистам в данной области техники.

Способы конструирования нуклеиновокислотных молекул согласно настоящему изобретению с целью создания векторов, содержащих вышеуказанные нуклеиновокислотные молекулы, введения векторов в соответствующие выбранные клетки-хозяева, индуцирования (вызывания) или достижения экспрессии хорошо известны в данной области техники.

Дополнительный аспект настоящего изобретения имеет отношение к клетке-хозяину, содержащей нуклеиновую кислоту или вектор, раскрытые здесь.

Другие признаки и преимущества настоящего изобретения станут понятны из следующего подробного описания и пунктов формулы изобретения.

Краткое описание чертежей

Фиг.1. Выравнивание последовательностей CLDN3, CLDN4, CLDN6 и CLDN9.

Фиг.2. Иммунофлуоресцентный анализ сыворотки, полученной от мышей, иммунизированных с целью получения CLDN6-специфических антител.

(А) Неприкрепленные СНО-К1 клетки, котрансфицированные нуклеиновыми кислотами, кодирующими человеческие CLDN6 и GFP, соответственно, были исследованы с помощью анти-CLDN6 моноклональных мышиных антител (R&D Systems, МАВ3656). CLDN6 располагается на плазматической мембране трансфицированных клеток и может являться целью для специфических антител на живых клетках.

(В) Сыворотка мышей, на основе которой была получена гибридома F3-6C3-H8, содержала антитела, связывающиеся с CLDN6 на поверхности неприкрепленных СНО-К1 клеток, котрансфицированных нуклеиновыми кислотами, кодирующими человеческий CLDN6 и GFP.

Фиг.3. Анализ эндогенной экспрессии белков-клаудинов в клетках НЕК293Т методом Вестерн-блоттинга.

Белковые лизаты НЕК293Т-клеток, трансфицированных нуклеиновыми кислотами, кодирующими CLDN3, CLDN4, CLDN6 и CLDN9, соответственно, или фиктивно трансфицированные (контроль) были исследованы с помощью Вестерн-блоттинга с использованием коммерчески доступных анти-CLDN4 (А) (Invitrogen, Cat No. 34-1700), aнти-CLDN4(A) (Zymed, 32-9400), анти-CLDN6(А) (ARP, 01-8865) и анти-CLDN9(А) (Santa Cruz, sc-17672) антител. Антитела обнаруживали экспрессию своих соответствующих мишеней только в соответствующих НЕК293Т трансфектантах. В нетрансфицированных НЕК293Т клетках не наблюдалось эндогенной экспрессии каких-либо из этих клаудинов.

Фиг.4. Оценка специфичности коммерчески доступных aнти-CLDN-антител с помощью проточной цитометрии.

Связывание коммерчески доступных aнти-CLDN-антител с клетками НЕК293Т, трансфицированными нуклеиновыми кислотами, кодирующими CLDN3, CLDN4, CLDN6 и CLDN9, соответственно, или нетрансфицированными клетками определяли с помощью проточной цитометрии. Для этой мишени специфическим является только коммерчески доступное анти-CLDN3-антитело.

Фиг.5. Оценка специфичности aнти-CLDN-антител, полученных согласно изобретению, с помощью проточной цитометрии.

С помощью проточной цитометрии было определено связывание антител в супернатантах от моноклональных субклонов гибридомы с НЕК293Т клетками, котрансфицированными вектором, кодирующим CLDN6, CLDN3, CLDN4 5 или CLDN9, и вектором, кодирующим флуоресцентный маркер.

(А) Антитела в супернатанте от моноклонального субклона гибридомы F3-6С3-Н8 специфически связывались с CLDN6-трансфицированными клетками, но не с клетками, трансфицированными CLDN3, CLDN4 и CLDN9, соответственно. Наоборот, антитела в супернатанте от моноклонального субклона гибридомы F4-4F7-F2 связывались с клетками, трансфицированными CLDN6 или CLDN9. Антитела в супернатанте от моноклонального субклона гибридомы F3-6C3-H8 также связывались с клетками, трансфицированными (I143V)-SNP вариантом CLDN6.

(В) Антитела в супернатанте от моноклонального субклона гибридомы F3-7В3-В4 связывались с клетками, трансфицированными CLDN6, CLDN3 или CLDN9. Антитела в супернатанте от моноклонального субклона гибридомы F3-3F7-A5 связывались с клетками, трансфицированными CLDN6, CLDN4 или CLDN9.

Фиг.6. Специфичность связывания анти-CLDN6 мышиных моноклональных антител muMAB 59А, 60А, 61D, 64А, 65А, 66 В и 67А.

Связывание анти-CLDN6-антител с человеческими CLDN6, 3, 4, 9 и CLDN6 SNP (одиночный нуклеотидный полиморфизм) вариантом 1143V было проанализировано проточной цитометрией с помощью НЕК293Т клеток, кратковременно экспрессирующих соответствующий человеческий клаудин. НЕК293Т были котрансфицированы флуоресцентным маркером, чтобы различить нетрансфицированные (Q1 и Q3 популяция) и трансфицированные (Q2 и Q4 популяция) клетки. Использовали концентрацию антител, которая насыщала связывание с CLDN6 (25 мкг/мл). Экспрессию человеческих CLDN6, 3, 4, 9 и CLDN6-SNP(H43V) подтверждали с помощью коммерчески доступных моноклональных антител к человеческому Клаудину-6 (R&D Systems, МАВ3656), человеческому Клаудину-3 (R&D Systems, МАВ4620) и человеческому Клаудину-4 (R&D Systems, МАВ 4219).

Фиг.7. Относительное сродство анти-CLDN6 мышиных моноклональных антител muMAB 59А, 60А, 61D, 64А, 65А, 66 В и 67А.

Для определения относительного сродства с помощью проточной цитометрии исследовали связывание анти-CLDN6-антител с человеческим LDN6, стабильно экспрессируемым на поверхности НЕК293-клеток. В эксперименте по насыщению связывания концентрацию антител наносили на график против FACS-сигналов (средняя интенсивность флуоресценции). ЕС50 (концентрация антитела, которая связывается с половиной мест связывания при равновесии) вычисляли с помощью нелинейной регрессии. CLDN6-специфические антитела muMAB 59А, 60А, 61D, 64А, 65А, 66В и 67А показали очень низкие значения ЕС50 (ЕС50 200-500 нг/мл), причем насыщение связывания достигалось при низких концентрациях.

Фиг.8. Активность, связанная с комплементзависимой цитотоксичностью (CDC), aнти-CLDN6 мышиных моноклональных антител muMAB 59А, 60А, 61D, 64А, 65А, 66В и 67А.

CDC-активность анти-CLDN6 антител проанализировали, используя люцифераза-зависимый метод анализа для определения эндогенной АТФ в нелизированных клетках. Для этого СНО-К1 клетки, стабильно экспрессирующие человеческий CLDN6, обработали разными концентрациями muMAB 59А, 60А, 61D, 64А, 65А, 66В и 67А. MuMAB 59А, 60А, 6ID, 64А, 65А, 66В и 67А продемонстрировали дозозависимую CDC-активность и вызывали CDC при низких концентрациях.

Фиг.9. Активность, связанная с комплементзависимой цитотоксичностью (CDC), анти-CLDN6 мышиных моноклональных антител muMAB 65А и 66В на эндогенно экспрессирующие CLDN6 клетки NEC8 и NEC8 LVTS2 54 (CLDN6 нокаутные).

Анти-CLDN6-антитела muMAB 65А и 66В вызывали CDC на клетках NEC8 дозозависимым образом. Мишень-специфичность muMAB 65А и 66В обеспечивалась использованием NEC8 LVTS2 54 клеток (CLDN6 нокаутные).

Фиг.10. Терапевтический эффект раннего лечения антителами muMAB 59А, 60А, 61D, 64А, 65А, 66В и 67А на модели ксенотрансплантата мышей с привитой линией опухолевых клеток NEC8.

Использовали модель эндогенно экспрессирующих CLDN6 ксенографтов NEC8 на бестимусных Nude-Faxni^nu мышах. По сравнению с контрольной группой (физраствор) muMAB 59А, 60A, 61D, 64А, 65А, 66В и 67А показали ингибирование роста опухоли у мышей с привитыми клетками NEC8.

Фиг.11. Специфичность связывания анти-CLDN6 химерных моноклональных антител chimAB 6Ш, 64А, 67А и 89А.

Связывание анти-CLDN6-антител с человеческим CLDN6, 3, 4 и 9, соответственно, проанализировали с помощью проточной цитометрии, используя клетки НЕК293, стабильно экспрессирующие соответствующий человеческий клаудин. Использованной концентрацией антител была концентрация, насыщающая связывание (25 мкг/мл). Экспрессию человеческих CLDN3, 4, 6 и 9 подтверждали с помощью коммерчески доступных моноклональных антител к человеческому Клаудину-3 (R&D Systems, МАВ4620) и человеческому Клаудину-4 (R&D Systems, МАВ 4219) и CLDN6/9-реактивных мышиных моноклональных антител muMAB 5F2D2, соответственно. Отрицательный контроль осуществлялся при идентичных условиях без первичного антитела.

Фиг.12. Относительное сродство анти-CLDN6 химерных моноклональных антител chimAB 61D, 64А, 67А и 89А к клеткам HEK293-CLDN6.

Для определения относительного сродства связывание анти-CLDN6 антител с человеческим CLDN6, стабильно экспрессированным на поверхности НЕК293, клетки исследовали с помощью проточной цитометрии. В экспериментах по насыщению связывания концентрацию антител наносили против FACS-сигналов (средняя интенсивность флуоресценции). ЕС50 (концентрация антител, которая связывает половину мест связывания в равновесии) вычисляли с помощью нелинейной регрессии. CLDN6-специфические антитела chimAB 64А и 89А показали очень низкие значения ЕС50 (ЕС50 450-600 нг/мл), при этом насыщение связывания достигалось при низких концентрациях. ChimAB 67А и 61D показали низкие (ЕС50 1000 нг/мл) и средние (ЕС50 2300 нг/мл) значения ЕС50, соответственно.

Фиг.13. Относительное сродство анти-CLDN6 химерных моноклональных антител chimAB 61D, 64А, 61А и 89А к клеткам NEC8.

Для определения относительного сродства aнти-CLDN6 антител к опухолевым клеткам, которые эндогенно экспрессировали CLDN6, связывание с линией клеток рака яичка NEC8 исследовали с помощью проточной цитометрии. Антитела chimAB 64А и 89А показали очень низкие значения ЕС50 (ЕС50 600-650 нг/мл), причем насыщение связывания достигалось при низких концентрациях, тогда как chimAB 6ID и 67А показали средние (ЕС50 1700 нг/мл) и высокие (ЕС50 6100 нг/мл) ЕС50 значения, соответственно.

Фиг.14. Относительное сродство анти-CLDN6 химерных моноклональных антител chimAB 61D, 64А, 67А и 89А к клеткам OV90.

Для определения аффинности связывания анти-CLDN6-антител с опухолевыми клетками, эндогенно экспрессирующими человеческий CLDN6, исследовали связывание с линией клеток карциномы яичника OV90 с помощью проточной цитометрии. CLDN6-специфические антитела chimAB 64А и 89А показали очень низкие значения ЕС50 (ЕС50 550-600 нг/мл) и насыщение связывания достигалось при низких концентрациях. ChimAB 6ID и 67А показали средние значения ЕС50 (ЕС50 1500 нг/мл и ЕС50 2300 нг/мл, соответственно).

Фиг.15. Активность, связанная с комплементзависимой цитотоксичностью (CDC), анти-CLDN6 химерных моноклональных антител chimAB 61D, 64А, 67А и 89А на клетках дикого типа NEC8 и нокаутных клетках NEC8.

CDC-активность анти-CLDN6-антител проанализировали с помощью люцифераза-зависимого метода анализа для определения эндогенной АТФ в нелизированных клетках. Для этого клетки дикого типа NEC8 (NEC8 LVTS2 77), эктопически экспрессирующие люциферазу, обработали разными концентрациями chimAB 6ID, 64А, 67А и 89А. На клетках NEC-8 chimAB 61D, 64А, 67А и 89А показали дозозависимую CDC-активность, тогда как ни одни из этих антител не вызывали неспецифический лизис CLDN6 нокаутных клеток NEC-8 (NEC8 LVTS2 54). Этот результат продемонстрировал мишень-специфические эффекторные функции chimAB 61D, 64А, 67А и 89А.

Фиг.16. Активность, связанная с антителозависимой клеточной цитотоксичностью (ADCC), aнти-CLDN6 химерных моноклональных антител chimAB 61D, 64А, 67А и 89А на клетках дикого типа NEC8 и нокаутных клетках NEC8.

ADCC-активность анти-CLDN6 антител проанализировали с помощью люцифераза-зависимого метода анализа для определения эндогенной АТФ в нелизированных клетках. Для этого клетки NEC-8 дикого типа (NEC8 LVTS2 77) обработали разными концентрациями chimAB 61D, 64А, 67А и 89А. ChimAB 61D, 64А, 67А и 89А показали дозозависимую ADCC-активность, и вызывали ADCC даже при низких концентрациях антител. Чтобы продемонстрировать мишень-специфичность использовали клетки NEC8 со стабильно нокаутным CLDN6 (NEC8 LVTS2 54).

Фиг.17. Долгосрочный терапевтический эффект раннего лечения анти-CLDN6 мышиными моноклональными антителами muMAB 61D, 64А и 67А на модели ксенотрансплантата у мышей с привитой опухолевой линией клеток NEC8.

Использовали модель эндогенно экспрессирующих CLDN6 ксенотрансплантатов NEC8 на бестимусных Nude-Foxnl^nu мышах. В течение 46 дней мышей лечили CLDN6-специфическими антителами. После лечения контролировали рост опухоли в течение 60 дней. Даже после прекращения иммунотерапии у мышей, которых лечили мышиными моноклональными антителами muMAB 61D, 64А и 67А, не наблюдался рост опухоли.

Фиг.18. Терапевтический эффект раннего лечения анти-CLDN6 мышиными моноклональными антителами muMAB 89А на модели ксенотрансплантата у мышей с привитой опухолевой линией клеток NEC8.

Использовали модель эндогенно экспрессирующих CLDN6 ксенотрансплантатов NEC8 на бестимусных Nude-Foxnl^nu мышах. Диаграммы рассеивания представляют объемы привитых опухолей в различные моменты времени в течение раннего лечения NEC8 ксенотрансплантатов у бестимусных мышей Nude-Foxnl^nu. По сравнению с контрольной группой (физраствор) muMAB 89А показали ингибирование роста опухоли у мышей с привитыми клетками NEC8 (А). В течение 47 дней мышей обрабатывали PBS в качестве контроля и CLDN6-специфическими антителами, соответственно. Рост опухоли контролировали в течение 51 дня. По сравнению с PBS-контролем у мышей, леченых muMAB89A, в конце исследования (В) опухоли не были обнаружены.

Фиг.19. Терапевтический эффект aнти-CLDN6 мышиных моноклональных антител muMAB 64А на модели ксенотрансплантата у мышей с привитой опухолевой линией клеток NEC8.

Диаграммы рассеивания представляют объемы привитых опухолей в различные моменты времени во время лечения развитых ксенотрансплантатов NEC8 у бестимусных мышей Nude-Foxnl^nu. Иммунотерапия мышиными моноклональными анти-CLDN6 антителами muMAB 64А продемонстрировала ингибирование роста солидных NEC8-ксенотрансплантатов по сравнению с контрольными группами и с антителом и с физраствором.

Фиг.20. Долгосрочный терапевтический эффект лечения анти-СЫЖб мышиными моноклональными антителами muMAB 64А на модели ксенотрансплантата у мышей с привитой опухолевой линией клеток NEC8.

Через 15 дней после приживления трансплантата в течение 45 дней мышей лечили CLDN6-специфическим антителом muMAB 64А. Рост опухоли контролировали в течение дополнительных 49 дней (А). На графике видно увеличение продолжительности жизни мышей, леченых CLDN6-специфическим антителом muMAB 64А (В).

Фиг.21. Терапевтический эффект анти-CLDN6 мышиных моноклональных антител muMAB 61D, 67А и 89А на модели ксенотрансплантата у мышей с привитой опухолевой линией клеток NEC8.

Диаграммы рассеивания представляют объемы привитых NEC8 опухолей в различные моменты времени во время лечения развитых NEC8 ксенотрансплантатов. С помощью мышиных моноклональных анти-CLDN6 антител muMAB 61D, 67А и 89А было достигнуто ингибирование роста опухоли по сравнению с контрольными группами (физраствор и антитело).

Фиг.22. Долгосрочный терапевтический эффект анти-CLDN6 мышиных моноклональных антител muMAB 61D, 67А и 89А на модели ксенотрансплантата у мышей с привитой опухолевой линией клеток NEC8.

Через 17 дней после приживления трансплантата в течение 42 дней мышей лечили CLDN6-специфическими антителами muMAB 61D, 67А и 89А. Рост опухоли контролировали в течение дополнительных 49 дней (А). На графике видно увеличение продолжительности жизни мышей, леченых CLDN6-специфическими антителами muMAB 61D и 67A (B).

Фиг.23. Терапевтический эффект анти-CLDN6 мышиных моноклональных антител muMAB 64А и 89А на модели ксенотрансплантата у мышей с привитой опухолевой линией клеток дикого типа NEC8 и NECS-клетками со стабильно нокаутным CLDN6.

MuMAB 64А и 89А показали терапевтическое действие только у мышей с привитой опухолью дикого типа NEC8, но не у мышей с привитыми клетками NEC8 с нокаутным CLDN6, что показывает специфичность антител к мишени in vivo.

Фиг.24. Картирование эпитопов chimMAB 61D, 64А, 67А и 89А с высоким разрешением.

Аланиновые мутанты называются 'остаток дикого типа число аланин' или 'остаток дикого типа число глицин' в случае аланина дикого типа, где аминокислоты даются в виде однобуквенного кода. Аминокислоты F35, G37, S39 и возможно ТЗЗ первого внеклеточного домена CLDN6 важны для взаимодействия с CLDN6-специфическими химерными антителами chimAB 6ID, 64А, 67А и 89А. Остаток 140 необходим для связывания chimAB 89А, причем он способствует связыванию chimAB 61D и 67А. Кроме того, L151 второго внеклеточного домена CLDN6 способствует взаимодействию с chimAB 67А. Хотя эксперименты с применением иммунофлуоресценции подтвердили экспрессию CLDN6 у мутантов Р28А, W30A, G49A, L50A, W51A, С54А и С64А, они не показали окрашивания мембран. По этой причине мы не могли исключить взаимодействие наших антител с этими аминокислотами. В общем, как установлено здесь, эпитоп соответствует нашей стратегии иммунизации с помощью ДНК и пептидов ECl-домена CLDN6.

Фиг.25. Выравнивание вариабельной области тяжелой цепи аминокислотных последовательностей CLDN6-специфических антител изобретения.

CDR-последовательности (HCDR1, HCDR2 и HCDR3) выделены прямоугольником.

Фиг.26. Выравнивание вариабельной области легкой цепи аминокислотных последовательностей CLDN6-специфических антител изобретения.

CDR-последовательности (LCDR1, LCDR2 и LCDR3) выделены прямоугольником.

Определения терминов

Для того чтобы настоящее изобретение было более понятно, сначала даются определения терминов. Дополнительные определения излагаются на всем протяжении подробного описания.

На всем протяжении этого подробного описания и последующих пунктов формулы изобретения, если контекст не требует иного, следует понимать, что слово "содержать" и его варианты, такие как "содержит" и "содержащий", предполагает включение определенного члена, целого числа или стадии или группы членов, целых чисел или стадий, а не исключение любого другого члена, целого числа или стадии или группы членов, целых чисел или стадий. Термины в единственном числе, использованные в контексте описания изобретения (особенно в контексте формулы изобретения) следует истолковывать как включающие и единственное и множественное число, если в описании не указано иначе или иное явно не продиктовано контекстом. Перечисление пределов значений в описании служит только как способ сокращения упоминания в отдельности каждого отдельного значения, попадающего в предел. Если не указано иное, каждое индивидуальное значение включается в подробное описание, как если бы оно было отдельно перечислено в описании. Все описанные здесь методы могут осуществляться в любом подходящем порядке, если в описании не указано иначе или иным образом явно не противоречит контексту. Использование всех без исключения примеров или характерных выражений (например, "такой как"), предоставленных в описании, имеет целью только лучше иллюстрировать изобретение и не ограничивает рамки изобретения, заявленные в иной форме. Формулировки подробного описания не должны быть истолкованы, как означающие какой-либо незаявленный элемент, существенный для осуществления изобретения на практике.

Клаудины представляют собой белки, являющиеся наиболее важными компонентами плотных контактов, где они создают трансклеточный барьер, контролирующий поток молекул в межклеточном пространстве между клетками эпителия. Клаудины являются трансмембранными белками, пересекающими мембрану 4 раза, при этом и N-конец и С-конец располагаются в цитоплазме. Первая внеклеточная петля состоит в среднем из 53 аминокислот и вторая петля около 24 аминокислот.CLDN6 и CLDN9 являются наиболее сходными членами семейства CLDN.

Термин "CLDN" при использовании в описании означает клаудин и включает CLDN6, CLDN9, CLDN4 и CLDN3. Предпочтительно CLDN является человеческим CLDN.

Термин "CLDN6" предпочтительно имеет отношение к человеческому CLDN6 и в частности к (i) нуклеиновой кислоте, содержащей нуклеиновокислотную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2 или кодирующую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8, например, нуклеиновой кислоте, содержащей нуклеиновокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, или (ii) белку, содержащему аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2 или содержащему аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8. Первая внеклеточная петля CLDN6 предпочтительно содержит аминокислоты с 28 по 80, более предпочтительно аминокислоты с 28 по 76 аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO: 2, или аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO: 8, например, аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 7. Вторая внеклеточная петля CLDN6 предпочтительно содержит аминокислоты с 138 по 160, предпочтительно аминокислоты с 141 по 159, более предпочтительно аминокислоты с 145 по 157 аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO: 2, или аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO: 8, такой как аминокислотная последовательность, указанная в SEQ ID NO: 6. Указанные первая и вторая внеклеточные петли предпочтительно образуют внеклеточный участок CLDN6.

Термин "CLDN9" предпочтительно имеет отношение к человеческому CLDN9 и, в частности, к (i) нуклеиновой кислоте, содержащей нуклеиновокислотную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9, или (ii) белку, содержащему аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9. Первая внеклеточная петля CLDN9 предпочтительно содержит аминокислоты с 28 по 76 аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO: 9. Вторая внеклеточная петля CLDN9 предпочтительно содержит аминокислоты с 141 по 159 аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO: 9. Указанные первая и вторая внеклеточные петли предпочтительно образуют внеклеточный участок CLDN9.

Термин "CLDN4" предпочтительно имеет отношение к человеческому CLDN4 и в частности к (i) нуклеиновой кислоте, содержащей нуклеиновокислотную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10, или (ii) белку, содержащему аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10. Первая внеклеточная петля CLDN4 предпочтительно содержит аминокислоты с 28 по 76 аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO: 10. Вторая внеклеточная петля CLDN4 предпочтительно содержит аминокислоты с 141 по 159 аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO: 10. Указанные первая и вторая внеклеточные петли предпочтительно образуют внеклеточный участок CLDN4.

Термин "CLDN3" предпочтительно имеет отношение к человеческому CLDN3 и, в частности, к (i) нуклеиновой кислоте, содержащей нуклеиновокислотную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11, или (ii) белку, содержащему аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11. Первая внеклеточная петля CLDN3 предпочтительно содержит аминокислоты с 27 по 75 аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO: 11. Вторая внеклеточная петля CLDN4 предпочтительно содержит аминокислоты с 140 по 158 аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO: П. Указанные первая и вторая внеклеточные петли предпочтительно образуют внеклеточный участок CLDN3.

Описанные выше последовательности CLDN включают любые варианты указанных последовательностей, в частности мутанты, сплайс-варианты, конформации, изоформы, аллельные варианты, видовые варианты и видовые гомологи, в частности присутствующие в природе. Аллельный вариант имеет отношение к изменению в нормальной последовательности гена, значение которого часто непонятно. Полное генетическое секвенирование часто определяет многочисленные аллельные варианты для данного гена. Видовой гомолог представляет собой нуклеиновокислотную или аминокислотную последовательность с другим видовым происхождением по сравнению с происхождением данной нуклеиновокислотной или аминокислотной последовательности. Термин "CLDN" включает (i) CLDN сплайс-варианты, (ii) CLDN-посттрансляционно модифицированные варианты, в частности включая варианты с разным гликозилированием, например статусом N-гликозилирования, (iii) CLDN конформационные варианты, (iv) варианты CLDN, связанного с раком, и CLDN не связанного с раком. Предпочтительно CLDN находится в его нативной конформации.

Было обнаружено, что CLDN6 экспрессируется при раке, например, раке яичника, раке легкого, раке желудка, раке молочной железы, раке печени, раке поджелудочной железы, раке кожи, меланоме, раке головы и шеи, саркоме, раке желчных путей, почечноклеточном раке и раке мочевого пузыря. В частности, CLDN6 является предпочтительной мишенью для предотвращения и/или лечения рака яичника, в частности аденокарциномы яичника и тератокарциномы яичника, рака легкого, включая мелкоклеточный рак легкого (SCLC) и немелкоклеточный рак легкого (NSCLC), в частности плоскоклеточного рака легкого и аденокарциномы, рака желудка, рака молочной железы, рака печени, рака поджелудочной железы, рака кожи, в частности базальноклеточной карциномы и плоскоклеточной карциномы, злокачественной меланомы, рака головы и шеи, в частности злокачественной плеоморфной аденомы, саркомы, в частности синовиальной саркомы и карциносаркомы, рака желчного протока, рака мочевого пузыря, в частности переходно-клеточной карциномы и папиллярного рака, рака почки, в частности почечноклеточного рака, включая светлоклеточный рак почки и папиллярную карциному почки, рака толстой кишки, рака тонкой кишки, включая рак подвздошной кишки, в частности аденокарциному тонкой кишки и аденокарциному подвздошной кишки, эмбриональной карциномы яичка, плацентарной хориокарциномы, рака шейки матки, рака яичка, в частности семиномы яичка, тератомы яичка и эмбрионального рака яичка, рака матки, герминомы, такой как, тератокарцинома или эмбриональная карцинома, в частности эмбрионально-клеточной опухоли яичка, и их метастатических форм. В одном варианте осуществления раковое заболевание, связанное с экспрессией CLDN6, выбирают из группы, состоящей из рака яичника, рака легкого, метастатического рака яичника и метастатического рака легкого. Предпочтительно рак яичника является карциномой или аденокарциномой. Предпочтительно рак легкого является карциномой или аденокарциномой, и предпочтительно является бронхиолярным раком, например, бронхиолярной карциномой или бронхиолярной аденокарциномой. В одном варианте осуществления опухолевая клетка, связанная с экспрессией CLDN6, является клеткой такого рака.

Термин "часть" относится к участку. В отношении отдельной структуры, например, аминокислотной последовательности или белка, термин их "часть" может обозначать непрерывный или прерывистый участок указанной структуры. Предпочтительно часть аминокислотной последовательности содержит, по меньшей мере, 1%, по меньшей мере 5%, по меньшей мере 10%, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 30%, предпочтительно, по меньшей мере, 40%, предпочтительно, по меньшей мере, 50%, более предпочтительно, по меньшей мере, 60%, более предпочтительно, по меньшей мере, 70%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 80% и наиболее предпочтительно, по меньшей мере, 90% аминокислот указанной аминокислотной последовательности. Предпочтительно, если часть является прерывистым участком, указанный прерывистый участок состоит из 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или более частей структуры, причем каждая часть является непрерывным элементом структуры. Например, прерывистый участок аминокислотной последовательности может состоять из 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или более, предпочтительно не более чем 4 частей указанной аминокислотной последовательности, при этом каждая часть предпочтительно содержит, по меньшей мере, 5 непрерывных аминокислот, по меньшей мере, 10 непрерывных аминокислот, предпочтительно, по меньшей мере, 20 непрерывных аминокислот, предпочтительно, по меньшей мере, 30 непрерывных аминокислот аминокислотной последовательности.

Термины "часть" и "фрагмент" используются здесь взаимозаменяемым образом и относятся к непрерывному элементу. Например, часть структуры, такая как аминокислотная последовательность или белок относится к непрерывному элементу указанной структуры. Участок, часть или фрагмент структуры предпочтительно заключает в себе одно или более функциональных свойств указанной структуры. Например, участок, часть или фрагмент эпитопа или пептида предпочтительно является иммунологически эквивалентным (равнозначным) эпитопу или пептиду, из которого он получен.

Термин "внеклеточный участок CLDN" в контексте настоящего изобретения относится к части CLDN, обращенной к внеклеточному пространству клетки и предпочтительно являющейся доступной с наружной части указанной клетки, например, для антител, располагающихся снаружи клетки. Предпочтительно термин относится к одной или более внеклеточным петлям или их части или любой другой внеклеточной части CLDN, которая предпочтительно является специфической для указанного CLDN. Предпочтительно указанная часть содержит, по меньшей мере 5, по меньшей мере 8, по меньшей мере 10, по меньшей мере 15, по меньшей мере 20, по меньшей мере 30, или по меньшей мере 50 аминокислот или более.

Необходимо понимать, что термин "CLDN, связанный с поверхностью клетки" относится к нативному CLDN, т.е. CLDN в его неденатурированном, предпочтительно естественно свернутом состоянии. Предпочтительно термин "CLDN, связанный с поверхностью клетки" означает, что CLDN связывается с и располагается на плазматической мембране указанной клетки, при этом, по меньшей мере, часть CLDN, предпочтительно внеклеточный участок, обращен к внеклеточному пространству указанной клетки и является доступным с наружной части указанной клетки, например, для антител, располагающихся снаружи клетки. Соединение может быть прямым или непрямым (опосредованным). Например, соединение может совершаться одним или более трансмембранными доменами, одним или более липидными якорями и/или путем взаимодействия с любым другим белком, липидом, сахаридом или другой структурой, находящейся на внешней стороне плазматической мембраны клетки. Например, CLDN, связанный с поверхностью клетки, может быть трансмембранным белком, т.е. интегральным мембранным белком, имеющим внеклеточный участок, или может быть белком, связанным с поверхностью клетки, посредством взаимодействия с другим белком, который является трансмембранным белком.

CLDN6 является соединенным с поверхностью клетки, если он располагается на поверхности указанной клетки и является доступным для связывания CLDN6-специфическими антителами, добавленными к клетке. В предпочтительных вариантах осуществления клетка, характеризующаяся соединением CLDN6 с клеточной поверхностью, является клеткой, экспрессирующей CLDN6. Следует понимать, что в случае, когда клетки экспрессируют CLDN6, соединенный с поверхностью указанных клеток, CLDN6 может являться только частью экспрессированного CLDN6.

Термин "клетка, несущая CLDN" предпочтительно означает, что указанная клетка несет CLDN на своей поверхности, т.е. что CLDN соединяется с поверхностью указанной клетки.

Термин "клеточная поверхность" или "поверхность клетки" используется в соответствии с его обычным значением в данной области и соответственно включает внешнюю поверхность клетки, доступную для связывания с белками и другими молекулами.

Выражение "CLDN, экспрессированный на поверхности клетки" означает, что CLDN, экспрессированный клеткой, входит в состав поверхности указанной клетки.

Согласно изобретению CLDN6 является незначительно экспрессированным в клетке и является незначительно соединенным с клеточной поверхностью, если уровень экспрессии и соединения является более низким по сравнению с экспрессией и соединением в клетках плаценты или в ткани плаценты. Предпочтительно уровень экспрессии и соединения является менее чем на 10%, предпочтительно менее чем на 5%, 3%, 2%, 1%, 0,5%, 0,1% или 0,05% экспрессии и соединения в клетках плаценты или в ткани плаценты или даже ниже. Предпочтительно, CLDN6 является незначительно экспрессированным в клетке и является незначительно соединенным с клеточной поверхностью, если уровень экспрессии и соединения превышает уровень экспрессии и соединения в неканцерогенной, доброкачественной ткани, отличной от ткани плаценты, не более чем в 2-раза, предпочтительно 1,5-раза и предпочтительно не превышает уровень экспрессии и соединения в указанной неканцерогенной, доброкачественной ткани. Предпочтительно CLDN6 является незначительно экспрессированным в клетке и является незначительно соединенным с клеточной поверхностью, если уровень экспрессии и соединения является уровнем ниже предела обнаружения и/или если уровень экспрессии и соединения является слишком низким для осуществления связывания CLDN6-специфическими антителами, добавленными к клеткам.

Согласно изобретению CLDN6 экспрессируется в клетке и соединяется с клеточной поверхностью, если уровень экспрессии и соединения превышает уровень экспрессии и соединения в неканцерогенной, доброкачественной ткани иной, чем ткань плаценты, предпочтительно более чем в 2-раза, предпочтительно в 10-раз, 100-раз, 1000-раз или 10000-раз. Предпочтительно CLDN6 экспрессируется в клетке и соединяется с клеточной поверхностью, если уровень экспрессии и соединения находится выше предела обнаружения и/или если уровень экспрессии и соединения является достаточно высоким для осуществления связывания CLDN6-специфическими антителами, добавленными к клеткам. Предпочтительно CLDN6, экспрессированный в клетке, экспрессируется или экспонируется на поверхности указанной клетки.

Термин "плот" относится к микродоменам мембраны, богатым сфинголипидом и холестерином, располагающимся в пространстве внешнего «листка» (слоя) плазматической мембраны клетки. Способность некоторых белков соединяться внутри таких доменов и их способность образовывать "агрегаты" или "фокальные агрегаты" может влиять на функцию белков. Например, перемещение молекул CLDN6 в такие структуры после связывания антителами настоящего изобретения, создает высокую плотность комплексов CLDN6-антиген-антитело в плазматических мембранах. Такая высокая плотность комплексов CLDN6-антиген-антитело может дать толчок эффективной активации системы комплемента во время CDC.

Согласно изобретению термин "болезнь" относится к любому патологическому состоянию, включая рак, в частности, описанные здесь формы рака.

"Болезни, затрагивающие клетки, экспрессирующие CLDN6 и характеризующиеся соединением CLDN6 с клеточной поверхностью" означает согласно изобретению, что экспрессия и соединение в клетках пораженной ткани или органа предпочтительно является увеличенным по сравнению с состоянием в здоровой ткани или органе. Увеличение относится к увеличению, по меньшей мере, на 10%, в частности, по меньшей мере, 20%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 100%, по меньшей мере 200%, по меньшей мере 500%, по меньшей мере 1000%, по меньшей мере 10000% или даже более. В одном варианте осуществления экспрессия и соединение с клеточной поверхностью обнаруживается только в пораженной ткани, тогда как экспрессия в здоровой ткани подавляется. Согласно изобретению болезни, связанные с клетками, экспрессирующими CLDN6 и характеризующимися соединением CLDN6 с их клеточной поверхностью, включают опухолевые заболевания, такие как раковые заболевания. Более того, согласно изобретению опухолевые заболевания, такие как раковые заболевания предпочтительно являются теми болезнями, при которых опухолевые клетки или раковые клетки экспрессируют CLDN6 и характеризуются соединением CLDN6 с их клеточной поверхностью.

При использовании в описании "опухолевая болезнь", "болезнь, связанная с опухолью" или "онкогенная болезнь" включает болезнь, отличающуюся неправильно регулируемым клеточным ростом, пролиферацией, дифференцировкой, адгезией и/или миграцией, что может приводить к появлению или склонности к появлению опухоли и/или опухолевых метастазов. Под "опухолевой клеткой" имеется в виду клетка, которая размножается путем быстрого, неконтролируемого клеточного деления и продолжает расти после прекращения поступления стимула, инициирующего новый рост.

Под "опухолью" имеется в виду аномальная группа клеток или ткань, растущая посредством быстрой неконтролируемой клеточной пролиферации и продолжающая расти после прекращения поступления стимула, инициирующего новый рост. У опухолей наблюдается частичное или полное отсутствие структурной организации и функциональной согласованности с нормальной тканью и обычно формируется отдельная масса ткани, которая может являться доброкачественной, предзлокачественной или злокачественной.

Предпочтительно "опухолевая болезнь", "болезнь, связанная с опухолью" или "онкогенная болезнь" согласно изобретению является раком, т.е. злокачественным заболеванием, а опухолевая клетка является раковой клеткой. Предпочтительно "опухолевая болезнь", "болезнь, связанная с опухолью" или "онкогенная болезнь" характеризуется наличием клеток, экспрессирующих CLDN6 и характеризующихся соединением CLDN6 с клеточной поверхностью, причем опухолевая клетка экспрессирует CLDN6 и характеризуется соединением CLDN6 с клеточной поверхностью.

Клетка, экспрессирующая CLDN6 и характеризующаяся соединением CLDN6 с клеточной поверхностью, предпочтительно является опухолевой клеткой или раковой клеткой, предпочтительно клеткой опухолей и видов рака, описанных здесь. Предпочтительно такая клетка является иной, чем клетка плаценты.

Предпочтительно раковые болезни или виды рака согласно изобретению выбирают из группы, состоящей из рака яичника, в частности аденокарциномы яичника и тератокарциномы яичника, рака легких, включая мелкоклеточный рак легкого (SCLC) и немелкоклеточный рак легкого (NSCLC), в частности плоскоклеточный рак легкого и аденокарциному, рака желудка, рака молочной железы, рака печени, рака поджелудочной железы, рака кожи, в частности базальноклеточной карциномы и плоскоклеточной карциномы, злокачественной меланомы, рака головы и шеи, в частности злокачественной плеоморфной аденомы, саркомы, в частности синовиальной саркомы и карциносаркомы, рака желчного протока, рака мочевого пузыря, в частности переходно-клеточной карциномы и папиллярного рака, рака почки, в частности почечноклеточного рака, включая светлоклеточный рак почки и папиллярную карциному почки, рака толстой кишки, рака тонкой кишки, включая рак подвздошной кишки, в частности аденокарциному тонкой кишки и аденокарциному подвздошной кишки, эмбриональной карциномы яичка, плацентарной хориокарциномы, рака шейки матки, рака яичка, в частности семиномы яичка, тератомы яичка и эмбрионального рака яичка, рака матки, герминомы, такой как, тератокарцинома или эмбриональная карцинома, в частности эмбрионально-клеточной опухоли яичка, и их метастатических форм.

Основными видами рака легкого являются мелкоклеточный рак легкого (SCLC) и немелкоклеточный рак легкого (NSCLC). Существует три основных подтипа немелкоклеточного рака легкого: плоскоклеточный рак легкого, аденокарцинома и крупноклеточный рак легкого. Аденокарциномы составляют приблизительно 10% раков легкого. Обычно этот вид рака наблюдается на периферии легких, в противоположность мелкоклеточному раку легкого и плоскоклеточному раку легкого, которые имеют тенденцию располагаться более центрально.

Рак кожи является злокачественным образованием на коже. Самыми распространенными видами рака кожи являются базальноклеточный рак, плоскоклеточная карцинома и меланома. Вызывающим опасения типом рака кожи является злокачественная меланома. Она связана с неконтролируемым ростом пигментных клеток - меланоцитов.

Согласно изобретению "карцинома" является раком, начинающимся в выстилающем слое (эпителиальных клетках) органов.

"Бронхиолярная карцинома" представляет собой карциному легкого и, как считается, возникает в эпителии терминальных бронхиол, где неопластическая ткань тянется по ходу альвеолярных стенок и растет в небольших количествах внутри альвеолы. Муцин может быть виден в некоторых клетках и в веществе в альвеоле, куда также включаются голые клетки.

"Аденокарцинома" представляет собой рак, возникающий в железистой ткани. Эта ткань к тому же является частью большой группы тканей, известных как эпителиальная ткань. Эпителиальная ткань включает кожу, железы и целый ряд других тканей, выстилающих полости и органы тела. С точки зрения эмбриологии эпителий происходит из эктодермы, эндодермы и мезодермы. Чтобы относиться к аденокарциноме, клетки необязательно должны быть частью железы, если только они обладают секреторными свойствами. Эта форма карциномы может возникать у некоторых высших животных, включая людей. Хорошо дифференцированные аденокарциномы имеют тенденцию походить на железистую ткань, из которой они происходят, в то время как плохо дифференцированные не могут. С помощью окрашивания клеток из биопсийного материала патолог определяет, является ли опухоль аденокарциномой или другим типом рака. Аденокарциномы могут возникать во многих тканях организма вследствие повсеместного распространения желез в организме. Наряду с тем, что каждая железа не может секретировать одно и то же вещество, когда у клетки существует внешнесекреторная функция, она считается железистой, и поэтому ее злокачественная форма называется аденокарциномой. Злокачественные аденокарциномы вторгаются в другие ткани и дают метастазы, также проникающие в другие ткани. Аденокарцинома яичника является наиболее распространенным типом карциномы яичника. Сюда включаются серозные и слизистые аденокарциномы, светлоклеточная аденокарцинома и эндометриоидная аденокарцинома.

"Цистаденокарцинома" представляет собой злокачественную форму поверхностной эпителиально-стромальной опухоли, типа карциномы яичника.

Полагают, что поверхностные эпителиально-стромальные опухоли являются классом новообразований, происходящих из поверхностного эпителия яичника (измененного peritoneum (брюшина)) или из эктопического эндометрия или ткани фаллопиевой (маточной) трубы. Эта группа опухолей составляет большинство всех опухолей яичника.

Тератокарцинома относится к герминогенной опухоли, которая является смесью тератомы с эмбриональной карциномой или с хориокарциномой или с обеими. Хориокарцинома является злокачественным трофобластическим и быстро развивающимся раком, обычно плаценты. Он характеризуется ранним распространением в легкие с током крови.

Саркома является раком соединительной ткани (костной, хрящевой, жировой), приводящим к пролиферации мезодермы. Этот вид рака противоположен карциномам, которые имеют эпителиальное происхождение. Синовиальная саркома является редкой формой рака, обычно встречающейся около суставов рук и ног. Она является одним из видов сарком мягких тканей.

Почечно-клеточная карцинома, известная также как почечно-клеточный рак или почечно-клеточная аденокарцинома, является раком почки, происходящим из выстилки проксимальных извитых канальцев, очень маленьких трубочек в почке, которые фильтруют кровь и удаляют продукты жизнедеятельности. Почечно-клеточная карцинома является вне всяких сомнений наиболее распространенным типом рака почки у взрослых и наиболее летальным из всех урогенитальных опухолей. Отдельными подтипами почечно-клеточной карциномы являются светлоклеточный рак почки и папиллярный рак почки. Светлоклеточный рак почки является наиболее распространенной формой почечно-клеточной карциномы. Под микроскопом клетки светлоклеточного рака кажутся очень бледными или светлыми. Папиллярный рак почки является вторым наиболее распространенным подтипом. При некоторых, если не при большинстве, из этих форм рака образуются небольшие пальцеподобные выросты (называемые сосочками, папилломами).

Герминогенная опухоль является новообразованием, происходящим из эмбриональных клеток. Герминогенные опухоли могут быть раковыми и нераковыми опухолями. Обычно эмбриональные клетки встречаются внутри гонад (яичника и яичка). Герминогенные опухоли, возникающие снаружи гонад (например, на голове, во рту, на шее, почечной лоханке; в зародышах, у младенцев и маленьких детей чаще всего обнаруживаются на средней линии тела, в частности на кончике копчика) могут быть врожденными пороками развития, возникающими вследствие ошибок во время развития эмбриона.

Двумя основными классами герминогенных опухолей являются семиномы и несеминомы, при этом несеминомы включают тератокарциному, эмбриональную карциному, опухоли желточного мешка, хориокарциному и дифференцированную тератому. Большинство клеточных линий от несемином равноценны эмбриональным карциномам, то есть они почти полностью состоят из стволовых клеток, которые не дифференцируются при исходных условиях, хотя некоторые могут реагировать на индуцирующие факторы дифференцировки, такие как ретиноевая кислота.

Под "метастазированием" имеется в виду распространение раковых клеток из первоначального местоположения в другую часть организма. Образование метастаза является очень сложным процессом и зависит от отделения злокачественных клеток от первичной опухоли, инвазии внеклеточного матрикса, проницаемости эндотелиальных базальных мембран для проникновения в полость тела и сосудов, а затем, после транспортировки кровотоком, инфильтрации органов-мишеней. Наконец, рост новой опухоли в месте-мишени зависит от ангиогенеза. Метастазы опухоли могут возникать даже после удаления первичной опухоли, так как опухолевые клетки или компоненты могут остаться и развить метастатический потенциал. В одном варианте осуществления термин "метастаз" согласно изобретению имеет отношение к "отдаленному метастазу", т.е. метастазу, удаленному от первичной опухоли и системы региональных лимфатических узлов.

Клетки вторичной или метастатической опухоли являются такими же, как в первоначальной опухоли. Это означает, например, что, если карцинома яичника метастазирует в печень, вторичная опухоль состоит из анормальных клеток яичника, а не из анормальных клеток печени. Опухоль в печени потом называют метастатической карциномой яичника, а не раком печени.

Под термином "лечить" имеется в виду введение субъекту соединения или композиции, раскрытых здесь, для предотвращения или устранения болезни, включая уменьшение размеров опухоли или количества опухолей у субъекта; задержки или замедления болезни у субъекта; ингибирования или замедления развития новой болезни у субъекта; уменьшения частоты и тяжести симптомов и/или рецидивов у субъекта, имеющего в настоящее время или ранее имевшего заболевание; и/или удлинения, т.е. увеличения продолжительности жизни субъекта.

Термин "лечение болезни" включает исцеление, сокращение продолжительности, улучшение, предотвращение, замедление или подавление прогрессирования или ухудшения или предотвращение или задержку начала болезни или ее симптомов.

Под "имеющим риск" подразумевается субъект, т.е. пациент, имеющий более высокий, чем обычно, шанс развития болезни, в частности рака, по сравнению с основной популяцией. Кроме того, субъект, имевший или в настоящее время имеющий болезнь, в частности рак, является субъектом с повышенным риском развития болезни, так как болезнь у субъекта может продолжать развиваться. У субъектов, имеющих рак в настоящее время или имевших рак, также имеется повышенный риск образования метастазов рака.

Термин "иммунотерапия" имеет отношение к лечению, затрагивающему специфическую иммунную реакцию. В контексте настоящего изобретения такие термины как "предохранить (защитить)", "предотвратить", "профилактический", "превентивный" или "предохранительный" имеют отношение к предотвращению или лечению и возникновения и/или распространения опухоли у индивидуума. Термин "иммунотерапия" в контексте настоящего изобретения предпочтительно относится к активной опухолевой иммунизации или противоопухолевой вакцинации. Профилактическое введение иммунотерапии, например профилактическое введение композиции изобретения, предпочтительно предохраняет реципиента от развития опухолевого роста. Терапевтическое введение иммунотерапии, например терапевтическое введение композиции изобретения, может привести к подавлению прогрессии/роста опухоли. Сюда включается уменьшение скорости прогрессии/роста опухоли, в частности прерывание прогрессии опухоли, что предпочтительно ведет к устранению опухоли. Терапевтическое введение иммунотерапии может защитить индивидуум, например, от распространения или метастазирования существующих опухолей.

Термин "иммунизация" или "вакцинация" описывает процесс введения антигена субъекту с целью вызвать иммунный ответ в силу терапевтических или профилактических причин.

Термины "субъект", "индивидуум", "организм" или "пациент" используются взаимозаменяемым образом и имеют отношение к позвоночным, предпочтительно млекопитающим. Например, млекопитающие в контексте настоящего изобретения являются людьми, приматами, не являющимися людьми, домашними животными, такими как собаки, кошки, овцы, крупный рогатый скот, козы, свиньи, лошади и т.д., лабораторными животными, такими как мыши, крысы, кролики, морские свинки и т.д., а также плененными животными, например, животными в зоопарке. Термин "животное" при использовании в описании также включает людей. Термин "субъект" также может включать пациента, т.е. животного, предпочтительно человека, имеющего болезнь, предпочтительно болезнь, связанную с экспрессией CLDN6, предпочтительно онкогенную болезнь, такую как рак.

Термин "адъювант" относится к соединениям, удлиняющим или усиливающим или ускоряющим иммунный ответ. Композиция настоящего изобретения предпочтительно оказывает свое влияние без добавления адьювантов. Тем не менее, композиция настоящей заявки может содержать любой известный адъювант. Адъюванты включают разнородную группу соединений, таких как масляные эмульсии (например, адъюванты Фрейнда), минеральные соединения (такие как квасцы), бактериальные продукты (такие как токсин Bordeiella pertussis), липосомы и иммуностимулирующие комплексы. Примерами адьювантов являются монофосфорил-липид-А (MPL SmithKline Beecham), сапонины, такие как QS21 (SmithKline Beecham), DQS21 (SmithKline Beecham; WO 96/33739), QS7, QS17, QS18 и QS-L1 (So et al., 1997, Mol. Cells 7: 178-186), неполные адъюванты Фрейнда, полные адъюванты Фрейнда, витамин Е, монтанид, квасцы, CpG олигонуклеотиды (Kxieg et al., 1995, Nature 374: 546-549) и различные эмульсии вода-в-масле, которые получают из поддающихся биологическому разложению масел, таких как сквален и/или токоферол.

Согласно изобретению образец может быть любым образцом, пригодным согласно настоящему изобретению, в частности, биологическим образцом, например образцом ткани, включая жидкости организма, и/или клеточным образцом, и может быть получен обычным способом, например путем биопсии ткани, включая пункционную биопсию, и путем взятия крови, бронхиального аспирата, слюны, мочи, кала или других жидкостей организма. Согласно изобретению термин "биологический образец" также включает фракции биологических образцов.

Термин "антитело" относится к гликопротеину, содержащему, по меньшей мере, две тяжелые (Н) цепи и две легкие (L) цепи, взаимно-соединенные дисульфидными связями, и включает любую молекулу, содержащую антигенсвязывающий участок. Термин "антитело" включает моноклональные антитела и их фрагменты или производные, включая, без ограничения, человеческие моноклональные антитела, гуманизированные моноклональные антитела, химерные моноклональные антитела, одноцепочечные антитела, например, scFv’s и антигенсвязывающие фрагменты антител, такие как Fab и Fab¹ фрагменты, а также включает все рекомбинантные формы антител, например, антитела, экспедированные в прокариотах, негликозилированные антитела и любые антигенсвязывающие фрагменты антител и производные, как описывается здесь. Каждая тяжелая цепь состоит из вариабельной области тяжелой цепи (обозначается в описании VH) и константной области тяжелой цепи. Каждая легкая цепь состоит из вариабельной области легкой цепи (обозначается в описании VL) и константной области легкой цепи. Области VH и VL можно дополнительно подразделить на области гипервариабельности, называемые участками, определяющими комплементарность (CDR), чередующиеся с участками, являющимися более консервативными, называемыми каркасными участками (FR). Каждая VH и VL состоит из трех CDR и четырех FR, располагающихся от аминоконца до карбоксиконца в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Вариабельные области тяжелой и легкой цепи содержат домен связывания, взаимодействующий с антигеном. Константные области антител могут опосредовать связывание иммуноглобулина с тканью-«хозяином» или факторами, включая разные клетки иммунной системы (например, эффекторные клеток) и первый компонент (Clq) классической системы комплемента.

Согласно изобретению термин "по меньшей мере, одна из CDR последовательностей" предпочтительно означает, по меньшей мере, CDR3 последовательность. Термин "CDR последовательности цепи антитела" предпочтительно имеет отношение к CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи или легкой цепи антитела.

Согласно изобретению ссылка на цепь антитела, содержащую конкретную CDR-последовательность, такую как отдельная CDR3-последовательность, означает, что указанная отдельная CDR-последовательность или образует CDR-участок, такой как CDR3-участок указанной цепи антитела, т.е. CDR-участок состоит из указанной отдельной CDR-последовательности, или образует часть CDR-участка, такую как CDR3-участок указанной цепи антитела, т.е. CDR-участок содержит указанную конкретную CDR-последовательность.

Если согласно изобретению делается ссылка на антитело, содержащее отдельную тяжелую цепь антитела и/или отдельную легкую цепь антитела, например, цепь, содержащую конкретные CDR-последовательности, является предпочтительным, что обе тяжелые цепи и/или обе легкие цепи антитела каждая состоят из отдельной тяжелой цепи антитела и/или отдельной легкой цепи антитела.

Термин "гуманизированное антитело" относится к молекуле, имеющей участок связывания антигена, полученный в основном от иммуноглобулина животного, не являющегося человеком, при этом остальная структура иммуноглобулиновой молекулы основывается на структуре и/или последовательности человеческого иммуноглобулина. Участок связывания антигена может или содержать полные вариабельные домены, присоединенные к константным доменам, или только гипервариабельные участки (CDR), присоединенные к подходящим каркасным участкам в вариабельных доменах. Участки связывания антигена могут быть дикого типа или модифицированными одной или более аминокислотными заменами, например, модифицированными, чтобы быть больше похожим на человеческий иммуноглобулин. Некоторые формы гуманизированных антител сохраняют все CDR-последовательности (например, гуманизированное мышиное антитело, содержащее все шесть CDR от мышиного антитела). Другие формы имеют один или более CDR, измененных относительно первоначального антитела.

Термин "химерное антитело" относится к антителам, в которых одна часть каждой из аминокислотных последовательностей тяжелой и легкой цепей является гомологичной соответствующим последовательностям в антителе, полученном от конкретного вида или принадлежащего к определенному классу, тогда как остальной сегмент цепи является гомологичным соответствующим последовательностям другого вида. Обычно вариабельный участок и легкой и тяжелой цепей копирует вариабельные участки антител, полученных от одного вида млекопитающих, тогда как константные части являются гомологичными последовательностям антител, полученных от другого вида. Одним очевидным преимуществом таких химерных форм является то, что вариабельный участок можно легко получить от известных в настоящее время источников, используя легкодоступные В-клетки или гибридомы от организмов-хозяев, не являющихся человеком, в комбинации с константными областями, полученными, например, из препаратов клеток человека. Притом, что вариабельная область имеет преимущество легкости получения, а источник не оказывает действия на специфичность, константная область, будучи человеческой, менее вероятно вызовет иммунный ответ у субъекта-человека при введении антител, чем вызвала бы константная область из источника, не являющегося человеком. Однако определение не ограничивается этим отдельным примером.

Термин "антигенсвязывающий участок" антитела (или просто "участок связывания") при использовании в описании относится к одному или более фрагментам антитела, которые сохраняют способность к специфическому связыванию с антигеном. Показано, что антигенсвязывающая функция антитела может осуществляться фрагментами полноразмерного антитела. Примеры связывающих фрагментов, охваченные термином "антигенсвязывающий участок" антитела, включают (i) Fab фрагменты, одновалентные фрагменты, состоящие из VL, VH, CL и СН доменов; (ii) F(ab')2 фрагменты, двухвалентные фрагменты, содержащие два Fab-фрагмента, соединенные дисульфидным мостиком в шарнирной области; (iii) Fd фрагменты, состоящие из VH и СН доменов; (iv) Fv фрагменты, состоящие из VL и VH доменов одноцепочечных антител, (v) dAb фрагменты (Ward et al, (1989) Nature 341: 544-546), состоящие из VH домена; (vi) изолированные гипервариабельные участки (CDR) и (vii) комбинации двух или более изолированных CDR, которые необязательно могут соединяться синтетическим линкером. Кроме того, хотя два домена Fv фрагмента, VL и VH, кодируются отдельными генами, их можно соединить, используя рекомбинантные методы, с помощью синтетических линкеров, что дает им возможность представлять собой единую белковую цепь, в которой VL и VH области располагаются парами, чтобы образовать одновалентные молекулы (известные как одноцепочечный Fv (scFv); смотри, например, Bird et al. (1988) Science 242: 423-426; и Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883). Такие одноцепочечные антитела также включаются в термин "антигенсвязывающий участок" антитела. Дополнительным примером являются домен-связывающие гибридные иммуноглобулины, содержащие (i) полипептидный домен связывания, который присоединяется к шарнирной области иммуноглобулина, (ii) константную область СН2 тяжелой цепи иммуноглобулина, присоединенную к шарнирной области и (iii) константную область СН3 тяжелой цепи иммуноглобулина, присоединенную к константной области СН2. Связывающий домен полипептида может быть вариабельной областью тяжелой цепи или вариабельной областью легкой цепи. Домен-связывающие иммуноглобулиновые гибридные белки дополнительно раскрываются в US 2003/0118592 и US 2003/0133939. Эти фрагменты антител получают с помощью обычных методов, известных специалистам в данной области техники, при этом фрагменты подвергаются скринингу в отношении пригодности, также, как и интактные антитела.

Термин "эпитоп" относится к антигенной детерминанте в молекуле, т.е. части в молекуле, которая распознается иммунной системой, например, которая распознается антителом. Например, эпитопы являются отдельными, трехмерными участками на антигене, которые распознаются иммунной системой. В контексте настоящего изобретения эпитоп предпочтительно происходит от белка CLDN. Обычно эпитопы состоят из химически активных поверхностных группировок молекул, таких как аминокислоты или боковые цепи Сахаров, и обычно имеют специфические трехмерные структурные характеристики, а также специфические характеристики заряда. Конформационные и неконформационные эпитопы различаются тем, что связывание с первым, но не со вторым, утрачивается в присутствии денатуриующих растворителей. Эпитоп белка, такого как CLDN, предпочтительно содержит непрерывную или прерывистую часть указанного белка и составляет предпочтительно от 5 до 100, предпочтительно от 5 до 50, более предпочтительно от 8 до 30, наиболее предпочтительно от 10 до 25 аминокислот в длину, например, эпитоп может иметь предпочтительно 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 аминокислот в длину.

Термин "прерывистый эпитоп" при использовании в описании означает конформационный эпитоп на белковом антигене, который образуется, по меньшей мере, из двух отдельных областей в первичной последовательности белка.

Термин "биспецифическая молекула" включает любой агент, например, белок, пептид, или белковый или пептидный комплекс, который имеет две разных специфичности связывания. Например, молекула может связываться с или взаимодействовать с (а) антигеном клеточной поверхности, и (b) Fc-рецептором на поверхности эффекторной клетки. Термин "мультиспецифическая молекула" или "гетероспецифическая молекула" включает любой агент, например, белок, пептид, или белковый или пептидный комплекс, который имеет более чем две разных специфичности связывания. Например, молекула может связываться с или взаимодействовать с (а) антигеном клеточной поверхности и (b) Fc-рецептором на поверхности эффекторной клетки и (с), по меньшей мере, с одним другим компонентом. Соответственно, изобретение включает, но не ограничивается этим, биспецифические, триспецифические, тетраспецифические и другие мультиспецифические молекулы, направленные к CLDN6, и к другим мишеням, таким как Fc-рецепторы на эффекторных клетках. Термин "биспецифические антитела" также включает диабоди (diabodies). Диабоди являются двухвалентными биспецифическими антителами, в которых VH и VL домены экспрессируются на одной полипептидной цепи, но с использованием линкера, который является слишком коротким, чтобы дать возможность образовать пару двум доменам на одной и той же цепи, таким образом, вынуждая домены образовывать пару с комплементарными доменами другой цепи и порождая два антигенсвязывающих участка (смотри, например,, Holliger, P., et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448; Poljak, R. J., et al. (1994) Structure 2: 1121-1123).

При использовании в описании термин "гетероантитела" относится к двум или более антителам, их производным или антигенсвязывающим участкам, соединенным вместе, по меньшей мере, два из которых имеют разные специфичности. Эти разные специфичности включают специфичность связывания для Fc-рецептора на эффекторной клетке и специфичность связывания для антигена или эпитопа на клетке-мишени, например, опухолевой клетке.

Антитела, описанные здесь, могут быть человеческими антителами. Термин "человеческое антитело", при использовании в описании, включает антитела, имеющие вариабельную и константную области, полученные от иммуноглобулиновых последовательностей человеческих зародышевых линий (germline). Человеческие антитела изобретения могут включать аминокислотные остатки, некодированные иммуноглобулиновыми последовательностями человеческих зародышевых линий (например, мутации, введенные с помощью случайного или сайт-специфического мутагенеза in vitro или с помощью соматической мутации in vivo).

Термин "моноклональное антитело" при использовании в описании относится к препарату молекул антител с единообразным молекулярным составом. Моноклональное антитело проявляет одну специфичность связывания и сродство к отдельному эпитопу. В одном варианте осуществления моноклональные антитела вырабатываются с помощью гибридомы, которая включает В-клетку, полученную от животного, не являющегося человеком, например, мыши, соединенную с иммортализованной клеткой.

Термин "рекомбинантные антитела" при использовании в описании включает все антитела, которые получаются, экспрессируются, создаются или выделяются с помощью рекомбинантных способов, например, (а) антитела, выделенные из животного (например, мыши), являющегося трансгенным или трансхромосомным в отношении генов иммуноглобулинов, или гибридомы, полученной из них, (b) антитела, выделенные из клетки-хозяина, трансформированной для того, чтобы она экспрессировала антитела, например, из трансфектомы, (с) антитела, выделенные из комбинаторной библиотеки рекомбинантных антител, и (d) антитела полученные, экспрессированные, созданные или выделенные любыми другими способами, которые затрагивают сплайсинг последовательностей генов иммуноглобулинов с другими ДНК-последовательностями.

Термин "трансфектома" при использовании в описании включает рекомбинантные эукариотичечские клетки-хозяева, экспрессирующие антитело, такие как клетки СНО, клетки NS/0, клетки НЕК293, клетки НЕК293Т, растительные клетки или клетки грибов, включая клетки дрожжей.

При использовании в описании "гетерологичное антитело" определяется с точки зрения трансгенного организма, продуцирующего такое антитело. Этот термин относится к антителу, имеющему аминокислотную последовательность или кодированному нуклеиновокислотной последовательностью, соответствующей последовательности, обнаруженной в организме, не являющимся трансгенным организмом, и как правило, полученному от вида иного, чем трансгенный организм.

При использовании в описании "гетерогибридное антитело" относится к антителу, имеющему легкую и тяжелую цепи от разных организмов. Например, антитело, имеющее человеческую тяжелую цепь, соединенную с мышиной легкой цепью, является гетерогибридным антителом.

Изобретение включает все антитела и производные антител, описанные здесь, которые для целей изобретения охватываются термином "антитело". Термин "производные антител" относится к любой модифицированной форме антитела, например, конъюгату антитела и другого агента или антитела или фрагмента антитела.

Описанные здесь антитела предпочтительно являются изолированными. "Изолированное антитело" при использовании в описании относится к антителу, которое в основном свободно от других антител, имеющих другие антигенные специфичности (например, изолированное антитело, которое специфично связывается с CLDN6, является в основном свободным от антител, специфично связывающих антигены, отличные от CLDN6). Однако изолированное антитело, которое специфически связывается с эпитопом, изоформой или вариантом человеческого CLDN6, может иметь перекрестную реактивность к другим родственным антигенам, например, от других видов (например, видовыми гомологами CLDN6). Более того, изолированное антитело может быть в основном свободно от другого клеточного материала и/или химических веществ. В одном варианте осуществления изобретения комбинация "изолированных" моноклональных антител имеет отношение к антителам, имеющим разные специфичности и объединенным в четко определенную композицию.

Согласно настоящему изобретению антитело является способным связываться с предопределенной мишенью, если оно имеет значительное сродство с указанной предопределенной мишенью и связывается с указанной предопределенной мишенью в стандартных методах исследования, таких, которые описываются здесь. Предпочтительно антитело является способным связываться с мишенью, если его связывание с указанной мишенью можно обнаружить с помощью проточной цитометрии (с помощью FACS анализа), посредством которой определяют связывание указанного антитела с указанной мишенью, экспрессированной на поверхности интактных клеток. Предпочтительно антитело обнаружимо связывается с указанной мишенью, если присутствует в концентрации 10 мкг/мл или ниже, 5 мкг/мл или ниже или 2 мкг/мл или ниже. Предпочтительно антитело обнаружимо связывается с указанной мишенью, если присутствует в концентрации 50 нМ или ниже, 30 нМ или ниже или 15 нМ или ниже. "Сродство" или "сродство связывания" часто оценивается равновесной константой диссоциации (KD). Предпочтительно термин "значительное сродство" относится к связыванию с предопределенной мишенью с константой диссоциации (К_D) 10^-5 М или ниже, 10^-6 М или ниже, 10^-7 М или ниже, 10^-8 М или ниже, 10^-9 М или ниже, 10^-10 М или ниже, 10^-11 М или ниже или 10^-12 М или ниже. Антитела настоящего изобретения предпочтительно имеют значение ЕС50 для связывания с CLDN6 6500 нг/мл или ниже, 3000 нг/мл или ниже, 2500 нг/мл или ниже, 2000 нг/мл или ниже, 1500 нг/мл или ниже, 1000 нг/мл или ниже, 500 нг/мл или ниже, 400 нг/мл или ниже, 300 нг/мл или ниже, 200 нг/мл или ниже, или 100 нг/мл или ниже.

Антитело не является способным (значительно) связываться с мишенью, если оно не обладает значительным сродством к указанной мишени и не связывается значительно с указанной мишенью в стандартных методах. Предпочтительно антитело не является способным (значительно) связываться с мишенью, если его связывание с указанной мишенью не обнаруживается с помощью проточной цитометрии (с помощью FACS анализа), посредством которой определяют связывание указанного антитела с указанной мишенью, экспрессированной на поверхности интактных клеток. Предпочтительно антитело необнаружимо связывается с указанной мишенью, если присутствует в концентрации до 2 мкг/мл, предпочтительно до 5 мкг/мл, предпочтительно до 10 мкг/мл, предпочтительно до 20 мкг/мл, более предпочтительно до 50 мкг/мл, в частности до 100 мкг/мл или до 150 мкг/мл, до 200 мкг/мл или выше. Предпочтительно антитело необнаружимо связывается с указанной мишенью, если присутствует в концентрации до 15 нМ, предпочтительно до 30 нМ, предпочтительно до 50 нМ, предпочтительно до 100 нМ, предпочтительно до 150 нМ или до 170 нМ, до 300 нМ, до 600 нМ, до 1000 нМ, до 1300 нМ или выше. Предпочтительно антитело необнаружимо связывается с указанной мишенью, если присутствует в концентрации, насыщающей связывание с мишенью, с которой связывается антитело, т.е. CLDN6. Предпочтительно антитело не имеет значительного сродства к мишени, если оно связывается с указанной мишенью с К_D, которая является, по меньшей мере, в 10-раз, 100-раз, 10³-раз, 10⁴-раз, 10⁵-раз или 10⁶-раз выше, чем КD связывания с предопределенной мишенью, с которой способно связываться антитело. Например, если KD связывания антитела с мишенью, с которой способно связываться антитело, составляет 10^-7 М, тогда KD связывания с мишенью, к которой антитело не имеет значительного сродства, составляло бы, по меньшей мере, 10^-6 М, 10^-5 М, 10^-4 М, 10^-3 М, 10^-2 М или 10^-1 М.

Антитело является специфическим для предопределенной мишени, если оно способно связываться с указанной предопределенной мишенью, тогда как оно не способно связываться с другими мишенями, т.е. обладает незначительным сродством к другим мишеням и незначительно связывается с другими мишенями при стандартных методах анализа. Согласно изобретению антитело является специфическим к CLDN6, если оно способно связываться с CLDN6, но неспособно связываться с другими мишенями, в частности, белками клаудинами, отличными от CLDN6, такими как CLDN9, CLDN4, CLDN3 и CLDN1. Предпочтительно антитело является специфическим к CLDN6, если сродство и связывание с белком клаудином, отличным от CLDN6, таким как CLDN9, CLDN4, CLDN3 и CLDN1, не превышает значительно сродство к или связывание с белками, неродственными клаудину, такими как бычий сывороточный альбумин (BSA), казеин, человеческий сывороточный альбумин (HSA) или трансмембранные белки, не являющиеся клаудинами, такие как молекулы МНС или рецептор трансферрина или любой другой специфический полипептид. Предпочтительно антитело является специфическим для предопределенной мишени, если оно связывается с указанной мишенью с KD, являющейся, по меньшей мере, в 10-раз, 100-раз, 10³-раз, 10⁴-раз, 10⁵-раз или 10⁶-раз ниже, чем KD связывания с мишенью, не являющейся специфической. Например, если KD связывания антитела с мишенью, являющейся специфической составляет 10^-7 М, тогда KD связывания с мишенью, не являющейся специфической, должно быть, по меньшей мере, 10^-6 М, 10^-5 М, 10^-4 М, 10^-3 М, 10^-2 М или 10^-1 М.

Связывание антитела с мишенью можно определить экспериментально, используя любой подходящий метод, см., например, Berzofsky et al., "Antibody-Antigen Interactions" In Fundamental Immunology, Paul, W. E., Ed., Raven Press New York, N Y (1984), Kuby, Jam's Immunology, W. H. Freeman и Company New York, N Y (1992), и описанные здесь методы. Сродство можно легко определить с помощью обычных методов, таких как равновесный диализ; с помощью прибора BIAcore 2000, используя общие методы, предложенные производителем; с помощью радиоиммунологического анализа с использованием меченого радиоактивным изотопом целевого антигена или другими методами, известными специалистам. Данные по сродству можно проанализировать, например, с помощью метода Scatchard et al., Ann N.Y. Acad. ScL, 51: 660 (1949). Измеренное сродство отдельного взаимодействия антитело-антиген может варьировать, если измерение проводилось при разных условиях, например, концентрации соли, рН. Таким образом, измерения сродства и других параметров связывания антигена, например, KD, IC50, предпочтительно проводятся с помощью стандартизированных растворов антитела и антигена и стандартизированного буфера.

Уникальным свойством антитела настоящего изобретения является способность связываться с клаудином 6 на клеточной поверхности. Это продемонстрировано с помощью проточной цитометрии на клетках, экспрессирующих клаудин 6.

Для проверки связывания моноклональных антител с живыми клетками, экспрессирующими клаудины, использовали проточную цитометрию. Коротко, клеточные линии, экспрессирующие мембраносвязанные клаудины (выращенные при стандартных условиях роста), смешиваются с разными концентрациями антител в PBS, содержащем 2% инактивированной нагреванием FCS и 0,1% NaN₃ при 4°С в течение 30 минут. После промывки клетки вступали в реакцию с вторичным антителом, меченым флуоресцентной меткой при тех же самых условиях, при которых проводилось окрашивание первичного антитела. Образцы исследовали методом FACS с использованием освещения и параметров бокового светорассеяния для пропускания единичных клеток, при этом определяется связывание меченых антител.

Термин "связывание" согласно изобретению предпочтительно имеет отношение к специфическому связыванию, как определено здесь.

При использовании в описании "изотип" относится к классу антител (например, IgM или IgG 1), которые кодируются генами константной области тяжелой цепи.

При использовании в описании "переключение изотипа" относится к явлению, посредством которого класс или изотип антитела изменяется от одного класса Ig к одному из других классов Ig.

Термин "природный" при использовании в описании применительно к объекту относится к тому обстоятельству, что объект может быть найден в природе. Например, полипептидная или полинуклеотидная последовательность, присутствующая в организме (включая вирусы), которая может быть выделена из природного источника, и которая не была намеренно модифицирована человеком в лаборатории, является природной.

Термин "перегруппированная" при использовании в описании относится к конфигурации тяжелой цепи или легкой цепи иммуноглобулинового локуса, в котором V сегмент располагается непосредственно рядом с D-J или J сегментом в конформации, кодирующей фактически полный VH или VL домен, соответственно. Перегруппированный генный локус иммуноглобулина (антитела) может быть установлен путем сравнения с зародышевой ДНК; перегруппированный локус будет иметь, по меньшей мере, один рекомбинированный семичленный/девятичленный гомологичный элемент.

Термин "перегруппированная" или "зародышевая конфигурация" при использовании в описании в отношении V сегмента относится к конфигурации, в которой V сегмент является нерекомбинированным для того, чтобы быть непосредственно рядом с D или J сегментом.

Термин "нуклеиновокислотная молекула" при использовании в описании включает молекулы ДНК и молекулы РНК. Нуклеиновокислотная молекула может быть одноцепочечной или двухцепочечной, но предпочтительно является двухцепочечной ДНК. Нуклеиновокислотная молекула может использоваться для введения в клетку, т.е. трансфекции клетки, например, в форме РНК, которую можно получить с помощью транскрипции in vitro из матрицы ДНК. Более того, РНК может быть модифицирована перед использованием путем стабилизации последовательности, кэппинга и полиаденилирования.

Нуклеиновые кислоты, описанные согласно изобретению, предпочтительно являются изолированными. Термин "изолированная нуклеиновая кислота" означает согласно изобретению, что нуклеиновая кислота была (i) амплифицирована in vitro, например, с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), (ii) получена рекомбинантно путем клонирования, (iii) очищена, например, с помощью расщепления и гель электрофоретического фракционирования или (iv) синтезирована, например, с помощью химического синтеза. Изолированная нуклеиновая кислота является нуклеиновой кислотой, которая является доступной для манипуляций с помощью технологии рекомбинантных ДНК.

Нуклеиновые кислоты согласно изобретению присутствуют отдельно или в комбинации с другими нуклеиновыми кислотами, которые могут быть гомологичными или гетерологичными. В предпочтительных вариантах осуществления нуклеиновые кислоты являются функционально связанными с последовательностями, контролирующими экспрессию, которые могут быть гомологичными или гетерологичными в отношении указанной нуклеиновой кислоты, при этом термин "гомологичные" означает, что нуклеиновая кислота также является функционально связанной с последовательностью, контролирующей экспрессию, естественным образом, а термин "гетерологичные" означает, что нуклеиновая кислота не является функционально связанной с последовательностью, контролирующей экспрессию, естественным образом.

Нуклеиновая кислота, такая как нуклеиновая кислота, экспрессирующая РНК и/или белок или пептид, и последовательность, контролирующая экспрессию, являются "функционально" связанными друг с другом, если они ковалентно связаны друг с другом таким образом, что экспрессия или транскрипция указанной нуклеиновой кислоты находится под контролем или под влиянием указанной последовательности, контролирующей экспрессию. Если нуклеиновая кислота должна транслироваться в функциональный белок, тогда, при наличии последовательности, контролирующей экспрессию, связанной с кодирующей последовательностью, индукция указанной последовательности, контролирующей экспрессию, вызывает транскрипцию указанной нуклеиновой кислоты, без вызывания сдвига рамки в кодирующей последовательности или указанная кодирующая последовательность является неспособной транслироваться в желательный белок или пептид.

Термин "последовательность, контролирующая экспрессию" включает согласно изобретению промоторы, участки связывания рибосом, энхансеры и другие элементы контроля, регулирующие транскрипцию гена или трансляцию мРНК. В отдельных вариантах осуществления изобретения последовательности, контролирующие экспрессию, могут регулироваться. Точная структура последовательности, контролирующей экспрессию, может варьировать в зависимости от вида или клеточного типа, но как правило, содержит 5'-нетранскибируемую и 5'- и 3'-нетранслируемые последовательности, которые вовлечены в инициацию транскрипции и трансляцию, соответственно, такие как ТАТА-бокс, кэппинг-последовательность, СААТ последовательность и т.п. Конкретнее, 5'-нетранскибируемые последовательности, контролирующие экспрессию, содержат промоторную область, включающую промоторную последовательность для транскрипционного контроля функционально связанной нуклеиновой кислоты. Последовательности, контролирующие экспрессию, также могут содержать энхансерные последовательности или активирующие последовательности.

Согласно изобретению термин "промотор" или "промоторная область" имеет отношение к нуклеиновокислотной последовательности, которая располагается выше (upstream) (51) относительно экспрессированной нуклеиновокислотной последовательности и контролирует экспрессию последовательности, обеспечивая распознавание и сайт связывания для РНК-полимеразы. "Промоторная область" может включать дополнительные сайт распознавания и связывания для дополнительных факторов, вовлекаемых в регуляцию транскрипции гена. Промотор может контролировать транскрипцию прокариотического или эукариотического гена. Кроме того, промотор может быть "индуцибельным" и может инициировать транскрипцию в ответ на индуцирующий агент или может быть "конститутивным", если транскрипция не контролируется индуцирующим агентом. Ген, находящийся под контролем индуцибельного промотора, не экспрессируется или экспрессируется только в небольшой степени, если отсутствует индуцирующий агент. В присутствии индуцирующего агента включается ген или увеличивается уровень транскрипции. В общем, это опосредуется связыванием специфического фактора транскрипции.

Промоторы, являющиеся предпочтительными согласно изобретению, включают промоторы для SP6, Т3 и Т7 полимеразы, человеческий U6 РНК промотор, CMV-промотор и их искусственные гибридные промоторы (например, CMV), где часть или части соединяются с частью или частями промоторов генов других клеточных белков, например, таких как человеческий GAPDH (глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназа), и включая или не включая дополнительный интрон(ы).

Согласно изобретению термин "экспрессия" используется в его наиболее общем значении и включает выработку РНК или РНК и белка/пептида. Он также включает частичную экспрессию нуклеиновых кислот. Более того, экспрессия может осуществляться временно или стабильно. Согласно изобретению термин экспрессия также включает "аберрантную экспрессию" или "аномальную экспрессию".

"Аберрантная экспрессия" или "аномальная экспрессия" означает согласно изобретению, что экспрессия является измененной, предпочтительно повышенной, по сравнению с эталонной, предпочтительно по сравнению с состоянием в неонкогенной нормальной клетке или у здорового индивидуума. Увеличение экспрессии относится к увеличению, по меньшей мере, на 10%, в частности, по меньшей мере, на 20%, по меньшей мере, на 50% или, по меньшей мере, на 100%. В одном варианте осуществления экспрессия обнаруживается только в затронутой болезнью ткани, в то время как экспрессия в здоровой ткани подавляется.

В предпочтительном варианте осуществления нуклеиновокислотная молекула согласно изобретению присутствует в векторе, в соответствующих случаях с промотором, который контролирует экспрессию нуклеиновой кислоты. Термин "вектор" используется здесь в его самом общем значении и включает любой промежуточный переносчик нуклеиновой кислоты, который дает возможность указанной нуклеиновой кислоте, например, быть внесенной в прокариотические и/или эукариотические клетки и, при необходимости, интегрироваться в геном. Векторы этого сорта предпочтительно являются реплицируемыми и/или экспрессируются в клетках. Векторы включают плазмиды, фагмиды, бактериофаги или вирусные геномы. Термин "плазмида" при использовании в описании, в общем, имеет отношение к конструкту экстрахромосомного генетического материала, обычно дуплекса кольцевой ДНК, который может реплицироваться независимо от хромосомной ДНК.

В качестве вектора для экспрессии антитела может использоваться или тип вектора, в котором тяжелая цепь антитела и легкая цепь присутствуют в разных векторах, или тип вектора, в котором тяжелая цепь и легкая цепь присутствуют в одном и том же векторе.

Предложенную в описании идею в отношении нуклеиновокислотной и аминокислотной последовательностей, например, указанных в списке последовательностей, следует также относить к модификациям (т.е. вариантам) указанных специфических последовательностей, дающим в результате последовательности, которые являются функционально эквивалентными указанным специфическим последовательностям, например, аминокислотные последовательности, проявляющие свойства, идентичные или подобные свойствам специфических аминокислотных последовательностей, и нуклеиновокислотные последовательности, кодирующие аминокислотные последовательности, проявляющие свойства, идентичные или подобные свойствам аминокислотных последовательностей, кодированных специфическими нуклеиновокислотными последовательностями. Одним важным свойством является сохранение связывания антитела с его мишенью или обеспечение эффекторных функций антитела, таких как CDC и/или ADCC. Предпочтительно последовательность, модифицированная по отношению к специфической последовательности, когда она заменяет специфическую последовательность в антителе, сохраняет связывание указанного антитела с мишенью и предпочтительно функции указанного антитела, как описано здесь.

Подобным образом, приведенную здесь идею в отношении специфических антител или гибридом, продуцирующих специфические антитела, следует истолковывать так, чтобы также относить к антителу, характеризующемуся аминокислотной последовательностью и/или нуклеиновокислотной последовательностью, которая является модифицированной по сравнению с аминокислотной последовательностью и/или нуклеиновокислотной последовательностью специфических антител, но является функционально эквивалентной. Одним важным свойством является сохранение связывания антитела с его мишенью или осуществления эффекторных функций антитела. Предпочтительно последовательность, модифицированная относительно специфической последовательности, когда она заменяет специфическую последовательность в антителе, сохраняет связывание указанного антитела с мишенью и предпочтительно функции указанного антитела, как описано здесь, например, CDC-опосредованный лизис или ADCC-опосредованный лизис.

В частности, специалистам ясно, что последовательности CDR, гипервариабельные и вариабельные области могут быть модифицированы без потери способности связываться с мишенью. Например, CDR-участки будут или идентичными или высокогомологичными областям антител, перечисленным здесь. Под "высокогомологичной" подразумевается, что в CDR может быть сделано от 1 до 5, предпочтительно от 1 до 4, например, от 1 до 3 или 1 или 2 замены. В дополнение к этому гипервариабельные и вариабельные участки могут быть модифицированы таким образом, чтобы они показывали значительную гомологию с участками антител, специально раскрытых здесь.

Следует понимать, что описанные здесь специфические нуклеиновые кислоты также включают нуклеиновые кислоты, модифицированные ради оптимизации частоты использования кодона в отдельной клетке-хозяине или организме. Различия в частоте использования кодона между организмами может приводить к ряду проблем, касающихся гетерологичной генной экспрессии. Оптимизация кодона изменением одного или более нуклеотидов первоначальной последовательности может дать в результате оптимизацию экспрессии нуклеиновой кислоты, в частности, оптимизацию эффективности трансляции, в гомологичном или гетерологичном хозяине, в котором должна экспрессироваться указанная нуклеиновая кислота.

Согласно изобретению вариант, производное, модифицированная форма или фрагмент нуклеиновокислотной последовательности, аминокислотная последовательность или пептид предпочтительно обладает функциональным свойством нуклеиновокислотной последовательности, аминокислотной последовательности или пептида, соответственно, из которого он был получен. Такие функциональные свойства включают взаимодействие с или связывание с другими молекулами. В одном варианте осуществления вариант, производное, модифицированная форма или фрагмент нуклеиновокислотной последовательности, аминокислотная последовательность или пептид является иммунологически эквивалентным нуклеиновокислотной последовательности, аминокислотной последовательности или пептиду, соответственно, из которого он был получен.

Предпочтительно степень идентичности между специфической нуклеиновокислотной последовательностью и нуклеиновокислотной

последовательностью, которая является модифицированной в отношении или которая является вариантом указанной специфической нуклеиновокислотной последовательности, составляет, по меньшей мере, 70%, предпочтительно, по меньшей мере, 75%, более предпочтительно, по меньшей мере, 80%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 90% или наиболее предпочтительно, по меньшей мере, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%. Что касается CLDN6-нуклеиновокислотных вариантов, степень идентичности предпочтительно составляет, по меньшей мере, около 300, по меньшей мере, около 400, по меньшей мере, около 450, по меньшей мере, около 500, по меньшей мере, около 550, по меньшей мере, около 600 или, по меньшей мере, около 630 нуклеотидов. В предпочтительных вариантах осуществления степень идентичности дается для полной длины эталонной нуклеиновокислотной последовательности, например, нуклеиновокислотных последовательностей, приведенных в перечне последовательностей. Предпочтительно две последовательности являются способными гибридизоваться и образовывать стабильный дуплекс друг с другом, когда гибридизацию предпочтительно проводят при условиях, которые обеспечивают специфическую гибридизацию между полинуклеотидами (жесткие условия). Жесткие условия описываются, например, в Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook et al., Editors, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989 или Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., Editors, John Wiley & Sons, Inc., New York и касаются, например, гибридизации при 65°С в буфере для гибридизации (3,5 х SSC, 0,02% фиколла, 0,02% поливинилпирролидона, 0,02% бычьего сывороточного альбумина, 2,5 мМ NaH₂PO₄ (рН 7), 0,5% SDS, 2 мМ EDTA). SSC представляет собой 0,15 М хлорид натрия/0,15 М цитрат натрия, рН 7. После гибридизации мембрану, на которую была перенесена ДНК, промывают, например, в 2 х SSC при комнатной температуре, а затем в 0,1-0,5 х SSC/0,1 х SDS при температурах до 68°С.

Термин "вариант" согласно изобретению также включает мутанты, сплайс-варианты, конформации, изоформы, аллельные варианты, видовые варианты и видовые гомологи, в частности те, которые присутствуют от природы. Аллельный вариант имеет отношение к изменению в нормальной последовательности гена, значение которой часто является неясным. Полное генетическое секвенирование часто устанавливает многочисленные аллельные варианты для данного гена. Видовой гомолог является нуклеиновой кислотой или аминокислотной последовательностью происходящей от других видов, чем данная нуклеиновокислотная или аминокислотная последовательность.

Для целей настоящего изобретения "варианты" аминокислотной последовательности включают варианты аминокислотных вставок, варианты аминокислотных добавок, варианты аминокислотных делеций и/или варианты аминокислотных замен. Варианты аминокислотных делеций, содержащие делецию на N-конце и/или С-конце белка, также называются N-концевыми и/или С-концевыми укороченными вариантами.

Варианты аминокислотных вставок включают вставки одной или двух или более аминокислот в отдельную аминокислотную последовательность. В случае имеющих вставку вариантов аминокислотной последовательности в отдельный участок аминокислотной последовательности вставляется один или более аминокислотных остатков, хотя при соответствующем скрининге полученного продукта также можно обнаружить случайные вставки.

Варианты аминокислотных добавок включают амино- и/или карбокси-концевые слияния одной или более аминокислот, такие как 1, 2, 3, 5, 10, 20, 30, 50 или более аминокислот.

Варианты аминокислотных делеций характеризуются удалением одной или более аминокислот из последовательности, например, удалением 1, 2, 3, 5, 10, 20, 30, 50 или более аминокислот. Делеций могут происходить в любом месте белка.

Варианты аминокислотных замен характеризуются, по меньшей мере, удалением одного остатка в последовательности и вставкой другого остатка на его место. Предпочтение дается модификациям, находящимся в положениях аминокислотной последовательности, которые не являются консервативными между гомологичными белками или пептидами, и/или заменам аминокислот на другие аминокислоты, имеющие сходные свойства. Предпочтительно аминокислотные изменения в белковых вариантах являются консервативными аминокислотными изменениями, т.е. заменами так же заряженных или незаряженных аминокислот. Консервативное изменение аминокислоты касается замены одной из семейства аминокислот, которые являются родственными по структуре боковой цепи. Природные аминокислоты подразделяются на четыре семейства: кислые (аспартат, глутамат), основные (лизин, аргинин, гистидин), неполярные (аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан) и незаряженные полярные (глицин, аспарагин, глутамин, цистеин, серии, треонин, тирозин) аминокислоты. Фенилаланин, триптофан и тирозин иногда классифицируются вместе как ароматические аминокислоты.

Предпочтительно степень сходства, предпочтительно идентичности между специфической аминокислотной последовательностью и аминокислотной последовательностью, которая является модифицированной в отношении к или которая является вариантом указанной специфической аминокислотной последовательности, например, между аминокислотными последовательностями, показывающими существенную гомологию, будет составлять, по меньшей мере, 70%, предпочтительно, по меньшей мере, 80%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 90% или наиболее предпочтительно, по меньшей мере, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%. Степень сходства или идентичность предпочтительно предоставляется для аминокислотной области, которая составляет, по меньшей мере, около 10%, по меньшей мере, около 20%, по меньшей мере, около 30%, по меньшей мере, около 40%, по меньшей мере, около 50%, по меньшей мере, около 60%, по меньшей мере, около 70%, по меньшей мере, около 80%, по меньшей мере, около 90% или около 100% полной длины эталонной аминокислотной последовательности. Например, если эталонная аминокислотная последовательность состоит из 200 аминокислот, степень сходства или идентичность предпочтительно предоставляется, по меньшей мере, примерно для 20, по меньшей мере, примерно 40, по меньшей мере, примерно 60, по меньшей мере, примерно 80, по меньшей мере, примерно 100, по меньшей мере, примерно 120, по меньшей мере, примерно 140, по меньшей мере, примерно 160, по меньшей мере, примерно 180 или примерно для 200 аминокислот, предпочтительно непрерывных аминокислот. Что касается CLDN6-полипептидных вариантов, степень сходства или идентичность предоставляется предпочтительно для участка, по меньшей мере, около 100, по меньшей мере, около 120, по меньшей мере, около 140, по меньшей мере, около 160, по меньшей мере, около 180, по меньшей мере, около 200 или, по меньшей мере, около 210 аминокислот. В предпочтительных вариантах осуществления степень сходства или идентичность предоставляется для полной длины эталонной аминокислотной последовательности, например, аминокислотных последовательностей, приведенных в списке последовательностей. Выравнивание для определения сходства последовательности, предпочтительно идентичности последовательности, можно выполнить известными в данной области техники способами, предпочтительно с использованием самого лучшего способа выравнивания последовательности, например, Align с использованием стандартных настроек, предпочтительно EMBOSS:: needle, Матрица: Blosum62, Штраф за открытие пробела 10.0, Штраф за продолжение пробела 0.5.

"Сходство последовательности" указывает процент аминокислот, которые или являются идентичными или которые представляют консервативные аминокислотные замены. "Идентичность последовательности" между двумя полипептидными или нуклеиновокислотными последовательностями указывает процент аминокислот или нуклеотидов, которые являются идентичными между последовательностями.

"Процент идентичности" получают после выполнения лучшего выравнивания, этот процент является чисто статистическим, а различия между двумя последовательностями распределяются случайно и на протяжении их полной длины. Сравнение последовательности между двумя нуклеотидными или аминокислотными последовательностями обычно осуществляется путем сравнения этих последовательностей после их оптимального выравнивания, указанное сравнение проводится посредством сегмента или "окна сравнения" для того, чтобы установить и сравнить локальные области сходства последовательности. Оптимальное выравнивание последовательностей для сравнения может быть проведено, кроме способа вручную, посредством алгоритма локальной гомологии Smith и Waterman, 1981, Ads Арр. Math. 2, 482, посредством алгоритма локальной гомологии Neddleman и Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48, 443, посредством метода поиска сходства Pearson and Lipman, 1988, Proc. Natl Acad. Sci. USA 85, 2444, или посредством компьютерных программ с применением этих алгоритмов (GAP, BESTFIT, FASTA, BLAST Р, BLAST N и TFASTA in Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wis.).

Процент идентичности вычисляется путем определения числа идентичных положений между двумя последовательностями при сравнении, делением этого числа на число сравниваемых положений и умножением полученного результата на 100 для того, чтобы получить процент идентичности между этими двумя последовательностями.

"Консервативные замены" могут быть сделаны, например, на основе сходства полярности, заряда, растворимости, гидрофобности, гидрофильности и/или алифатической природы вовлеченных остатков. Например, (а) неполярные (гидрофобные) аминокислоты включают аланин, лейцин, изолейцин, валин, пролин, фенилаланин, триптофан и метионин; (b) полярные нейтральные аминокислоты включают глицин, серии, треонин, цистеин, тирозин, аспарагин и глутамин; (с) положительно заряженные (основные) аминокислоты включают аргинин, лизин и гистидин; и (d) отрицательно заряженные (кислые) аминокислоты включают аспарагиновую кислоту и глутаминовую кислоту. Как правило, замены могут быть сделаны в группах (a)-(d). Кроме того, глицин и пролин могут быть замещены друг другом, исходя из их способности разрывать α-спирали. Некоторые предпочтительные замены могут быть сделаны среди следующих групп: (i) S и Т; (ii) Р и G; и (iii) А, V, L и I. Если имеется известный генетический код, с помощью технологии рекомбинантных и синтетических ДНК квалифицированный ученый легко может создать ДНК, кодирующие консервативные аминокислотные варианты.

Настоящее изобретение включает антитела, в которых могут быть сделаны изменения в Fc-участке для изменения функциональных и фармакокинетических свойств антител. Такие изменения могут привести к уменьшению или увеличению Clq-связывания и CDC или FcγR-связывания и ADCC. Замены могут быть сделаны, например, в одном или более аминокислотных остатках константной области тяжелой цепи, тем самым вызывая изменение эффекторной функции, и одновременно сохраняя способность связываться с антигеном по сравнению с модифицированным антителом, см. US 5,624,821 и US 5,648,260.

Время полужизни антитела in vivo может быть улучшено путем модификации эпитопа спасательного (salvage) рецептора константного домена Ig или Ig-подобного константного домена, так что молекула не содержит интактный СН2 домен или интактный Ig Fc участок, см. US 6,121,022 и US 6,194,551. Время полужизни in vivo может быть дополнительно увеличено с помощью осуществления мутаций на Fc участке, например, путем замены треонина на лейцин в положении 252, путем замены треонина на серии в положении 254, или путем замены треонина на фенилаланин в положении 256, см. US 6,27,375.

Более того, с целью изменения эффекторной функции антител может быть модифицирован гликозилированный вариант антител. Например, антитела могут экспрессироваться в трансфектоме, которая не присоединяет фукозную единицу, обычно присоединенную к Asn в положении 297 Fc-участка, для того, чтобы усилить сродство Fc-участка к Fc-рецепторам, которое, в свою очередь, будет приводить к повышенной ADCC антител в присутствии NK-клеток, см. Shield et al. (2002) JBC, 277: 26733. Более того, галактозилирование может быть сделано с целью модифицировать CDC.

Альтернативно, в другом варианте осуществления мутации могут быть введены случайно вдоль всей или части последовательности, кодирующей анти-CLDN6 антитело, например, с помощью насыщающего мутагенеза, и может быть проведен скрининг полученных модифицированных анти-CLDN6 антител в отношении активности связывания.

Согласно изобретению термин "клетка" или "клетка-хозяин" предпочтительно имеет отношение к интактной клетке, т.е. клетке с интактной мембраной, которая не высвобождает нормальные внутриклеточные компоненты, такие как ферменты, органеллы или генетический материал. Интактная клетка предпочтительно является живой клеткой, т.е. живой клеткой, способной выполнять свои нормальные метаболические функции. Предпочтительно указанный термин согласно изобретению имеет отношение к любой клетке, которая может быть трансформирована или трансфицирована экзогенной нуклеиновой кислотой. Термин "клетка" включает согласно изобретению прокариотические клетки (например, Е. coli) или эукариотические клетки (например, дендритные клетки, В-клетки, СНО клетки, COS клетки, К562 клетки, НЕК293 клетки, клетки HELA, дрожжевые клетки и клетки насекомого). Внутри клетки можно обнаружить экзогенную нуклеиновую кислоту (i) саму по себе в свободно диспергированном виде, (ii) введенную в рекомбинантный вектор или (iii) интегрированную в геном клетки-хозяина или митохондриальную ДНК. Особенно предпочтительными являются клетки млекопитающих, например, клетки человека, мышей, хомяков, свиней, коз и приматов. Клетки могут быть получены из целого ряда типов тканей и включают первичные клетки и клеточные линии. Конкретные примеры включают кератиноциты, лейкоциты периферической крови, стволовые клетки костного мозга и эмбриональные стволовые клетки. В дополнительных вариантах осуществления клетка является антиген-презентирующей клеткой, в частности дендритной клеткой, моноцитом или макрофагом. Термин "клетка-хозяин" при использовании в описании предпочтительно предназначается для упоминания клетки, в которую может быть введен рекомбинантный вектор экспрессии.

Клетка, содержащая нуклеиновокислотную молекулу, предпочтительно экспрессирует пептид или белок, закодированный нуклеиновой кислотой.

Термин "трансгенное животное" относится к животному, имеющему геном, содержащий один или более трансгенов, предпочтительно трансгенов тяжелой и/или легкой цепи, или трансхромосом (или интегрированных или неинтегрированных в природную геномную ДНК животного), предпочтительно способных экспрессировать трансгены. Например, трансгенная мышь может иметь трансген человеческой легкой цепи и или трансген человеческой тяжелой цепи или трансхромосому человеческой тяжелой цепи, так что мышь продуцирует человеческие анти-CLDN6 антитела, когда она иммунизирована CLDN6-антигеном и/или клетками, экспрессирующими CLDN6.

Трансген человеческой тяжелой цепи может быть интегрирован в хромосомную ДНК мыши, как в случае трансгенной мыши, например, HuMAb мыши, например НСо7 или НСо12 мыши, или трансген человеческой тяжелой цепи может быть сохранен экстрахромосомно, как в случае трансхромосомных (например, КМ) мышей, как описано в WO 02/43478. Такие трансгенные и трансхромосомные мыши могут быть способны продуцировать множество изотипов человеческих моноклональных антител к CLDN6 (например, IgG, IgA и/или IgE) при проведении V-D-J рекомбинации и переключения изотипа.

"Уменьшить" или "ингибировать" при использовании в описании означает способность вызывать полное уменьшение, предпочтительно на 5% или больше, 10% или больше, 20% или больше, более предпочтительно 50% или больше и наиболее предпочтительно на 75% или больше в уровне, например, в уровне пролиферации клеток. Термин "ингибировать" или подобные фразы включают полное или практически полное ингибирование, т.е. уменьшение до нуля или практически до нуля.

Такие термины как "увеличение" или "усиление" предпочтительно относятся к увеличению или усилению, по меньшей мере, примерно на 10%, предпочтительно, по меньшей мере, на 20%, предпочтительно, по меньшей мере, на 30%, более предпочтительно, по меньшей мере, на 40%, более предпочтительно, по меньшей мере, на 50%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, на 80% и наиболее предпочтительно, по меньшей мере, на 100%. Эти термины также могут иметь отношение к обстоятельствам, при которых во время начала отсчета (в точке ноль) не существует различимого сигнала в отношении определенного соединения или условия, а в определенный момент времени, позже, чем начало отсчета, имеется различимый сигнал или условие.

Термин "иммунологически эквивалентный" означает, что иммунологически эквивалентная молекула, например, иммунологически эквивалентная аминокислотная последовательность, проявляет одинаковые или в основном одинаковые иммунологические свойства и/или оказывает одинаковые или в основном одинаковые иммунологические действия, например, в отношении типа иммунологического действия, такого как индукция гуморального и/или клеточного иммунного ответа, силы и/или продолжительности индуцированной иммунной реакции или специфичности иммунной реакции. В контексте настоящего изобретения термин "иммунологически эквивалентный" предпочтительно используется в отношении иммунологических действий или свойств пептида или пептидного варианта, использованного для иммунизации. Конкретным иммунологическим свойством является способность связываться с антителами и, если потребуется, вызывать иммунный ответ, предпочтительно путем стимулирования выработки антител. Например, аминокислотная последовательность является иммунологически эквивалентной эталонной аминокислотной последовательности, если указанная аминокислотная последовательность при встрече с иммунной системой субъекта вызывает иммунную реакцию, предпочтительно выработку антител, обладающих специфичностью вступления в реакцию с эталонной аминокислотной последовательностью, такой как эталонная аминокислотная последовательность, образующая часть CLDN6.

Термин "иммунные эффекторные функции" в контексте настоящего изобретения включает любые функции, опосредованные компонентами иммунной системы, приводящие к ингибированию роста опухоли и/или ингибированию развития опухоли, включая ингибирование распространения опухоли и метастазирования. Предпочтительно иммунные эффекторные функции приводят к уничтожению опухолевых клеток. Предпочтительно иммунные эффекторные функции в контексте настоящего изобретения являются антитело-опосредованными эффекторными функциями. Такие функции включают комплементзависимую цитотоксичность (CDC), антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC), индукцию апоптоза в клетках, несущих ассоциированный с опухолью антиген, например, путем соединения антитела с поверхностью антигена, и/или ингибирование пролиферации клеток, несущих ассоциированный с опухолью антиген, предпочтительно ADCC и/или CDC. Таким образом, антитела, способные опосредовать один или более иммунных эффекторных функций предпочтительно являются способными опосредовать уничтожение клеток, вызывая CDC-опосредованный лизис, ADCC-опосредованный лизис, апоптоз, гомотипическую адгезию и/или фагоцитоз, предпочтительно вызывая CDC-опосредованный лизис и/или ADCC-опосредованный лизис. Кроме того, антитела могут оказывать действие просто путем связывания с опухоль-ассоциированными антигенами на поверхности опухолевой клетки. Например, антитела могут блокировать функцию антигена, ассоциированного с опухолью, или вызывать апоптоз только путем связывания с опухоль-ассоциированным антигеном на поверхности опухолевой клетки.

Подробное описание изобретения

Механизмы действия mAb

Несмотря на то, что следующее описание предоставляет анализ, касающийся механизма, лежащего в основе терапевтической эффективности антител изобретения, оно не должно рассматриваться как ограничивающее изобретение каким бы то ни было образом.

Описанные здесь антитела могут взаимодействовать с компонентами иммунной системы, предпочтительно через ADCC или CDC. Антитела изобретения также могут использоваться для «целевой нагрузки» (например, радиоизотопами, лекарственными средствами или токсинами), для того, чтобы непосредственно уничтожать опухолевые клетки, или могут использоваться синергически вместе с традиционными химиотерапевтическими средствами, воздействуя на опухоли с помощью дополнительных механизмов действия, включая противоопухолевые иммунные ответы, которые могут быть нарушены из-за побочных цитотоксических эффектов химиотерапевтических препаратов на Т-лимфоциты. Однако антитела изобретения также могут оказывать действие просто путем связывания с CLDN6 на клеточной поверхности, таким образом, например, блокируя пролиферацию клеток.

Антителозависимая клеточная цитотоксичность

ADCC представляет собой способность эффекторных клеток (в частности лимфоцитов) уничтожать клетки, при этом для функционирования лимфоцитов необходимо, чтобы клетка-мишень была помечена антителом.

Предпочтительно ADCC наблюдается, когда антитела связываются с антигенами на опухолевых клетках, а Fc-домены антител связывают Fc-рецепторы (FcR) на поверхности иммунных эффекторных клеток. Было установлено несколько семейств Fc-рецепторов, при этом характерно, что специфические популяции клеток экспрессируют определенные Fc-рецепторы. ADCC можно рассматривать как механизм прямого индуцирования разрушения (различной степени) опухоли, который приводит к презентации антигена и индукции Т-клеточных ответов, направленных на опухоль. Предпочтительно индукция ADCC in vivo приводит к Т-клеточному ответу, направленному на опухолевые клетки, и ответу антител хозяина.

Комплементзависимая цитотоксичность.

Другим способом уничтожения клеток, который может опосредоваться антителами, является CDC. Самым эффективным изотипом для активации комплемента является IgM. Также очень эффективными при направлении CDC через классический путь активации комплемента являются IgGl и IgG3. Предпочтительно, образование комплексов антиген-антитело в этом каскаде приводит к раскрытию многочисленных мест связывания Clq в непосредственной близости на СН2 доменах участвующих молекул антител, например, молекул IgG (Clq является одним из трех субкомпонентов комплемента С1). Предпочтительно эти раскрытые места связывания Clq превращают взаимодействие Clq-IgG до этого с низким сродством в сродство с высокой авидностью, что запускает каскад событий, вовлекающих ряд других белков комплемента, и приводит к протеолитическому высвобождению хемотаксических/активирующих агентов эффекторных клеток С3а и С5а. Предпочтительно каскад комплемента оканчивается образованием мембрано-атакующего комплекса, который создает поры в клеточной мембране, что способствуют свободному прохождению воды и растворенных веществ в клетки и из клеток. Выработка антител

Антитела изобретения можно получить с помощью ряда методов, включая обычную методику получения моноклональных антител, например, методом гибридизации стандартных соматических клеток Kohler и Milstein, Nature 256: 495 (1975). Несмотря на то, что методы гибридизации соматических клеток являются предпочтительными, в принципе можно использовать другие методы получения моноклональных антител, например, путем вирусной или онкогенной трансформации В-лимфоцитов, или метод фагового дисплея с использованием библиотек генов антител.

Предпочтительной животной системой для получения гибридомы, секретирующей моноклональные антитела, является мышиная система. Получение гибридомы в мыши является общепринятым методом. Протоколы иммунизации и методики выделения иммунизированных спленоцитов для слияния хорошо известны в данной области техники. Сливающиеся клетки (например, мышиные клетки миеломы) и процедуры слияния также хорошо известны.

Другими предпочтительными животными системами для получения гибридом, секретирующих моноклональные антитела, являются крысы или кролики (например, система, описанная в Spieker-Polet et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:9348 (1995), смотри также Rossi et al., Am. J. Clin. 35 Pathol. 124:295 (2005)).

В другом предпочтительном варианте осуществления человеческие моноклональные антитела, направленные к CLDN6, можно получить с помощью трансгенных или трансхромосомных мышей, несущих части человеческой иммунной системы, а не мышиной системы. Эти трансгенные или трансхромосомные мыши включают мышей, известных как мыши HuMAb и мыши КМ, соответственно, и вместе упоминаются в описании как "трансгенные мыши". Получение человеческих антител в таких трансгенных мышах можно осуществить, как подробно описано для CD20 в WO 2004 035607

Другой стратегией получения моноклональных антител является прямое выделение генов, кодирующих антитела, из лимфоцитов, продуцирующих антитела, например, см. Babcock et el, 1996; A novel strategy for generating monoclonal antibodies from single, isolated lymphocytes producing antiboies of defined strategy. Подробности разработки рекомбинантных антител смотри также в Welschof и Kraus, Recombinant antibodes for cancer therapy ISBN-0-89603-918-8 и Benny K.C. Lo Антитело Engineering ISBN 1-58829-092-1.

Иммунизация

Для получения антител к CLDN6, мышей можно иммунизировать конъюгированными с носителем пептидами, полученными из CLDN6-последовательности, препаратом, обогащенным рекомбинантно экспрессированным CLDN6-антигеном или его фрагментами и/или клетками, экспрессирующими CLDN6 или его фрагменты, как описано. Альтернативно, мышей можно иммунизировать ДНК, кодирующей человеческий полноразмерный CLDN6 или его фрагменты. В том случае, когда иммунизация с использованием очищенного или обогащенного препарата антигена CLDN6 не приводит к образованию антител, мышей также можно иммунизировать клетками, экспрессирующими CLDN6, например, клеточной линией, чтобы содействовать иммунному ответу.

Иммунный ответ можно контролировать на протяжении выполнения протокола иммунизации, отбирая образцы плазмы и сыворотки из хвостовой вены или ретроорбитально. Мыши с достаточным титром aнти-CLDN6 иммуноглобулина могут использоваться для слияния. Мышей можно подвергнуть стимуляции внутрибрюшинно и внутривенно клетками, экспрессирующими CLDN6, и за 3-5 дней до забоя и удаления селезенки для того, чтобы увеличить скорость секретирования специфических антител гибридомами.

Получение гибридом, продуцирующих моноклональные антитела

Для получения гибридом, продуцирующих моноклональные антитела к CLDN6, из лимфатических узлов или селезенки, полученных от иммунизированных мышей, могут быть выделены клетки и слиты с подходящей иммортализованной клеточной линией, например, линией клеток миеломы мыши. Затем можно отобрать полученные гибридомы по выработке антиген-специфических антител. В таком случае с помощью метода ELISA можно отобрать отдельные лунки с гибридомами, секретирующими антитела. С помощью иммунофлуоресценции и FACS-анализа с использованием клеток, экспрессирующих CLDN6, можно установить антитела со специфичностью к CLDN6. Гибридомы, секретирующие антитела, можно вновь высеять, провести отбор и положительные по анти-CLDN6 моноклональным антителам можно субклонировать с помощью серийного разведения. Затем стабильные субклоны культивируют in vitro в среде для культуры ткани, чтобы получить и охарактеризовать антитела.

Получение трансфектом, продуцирующих моноклональные антитела

Антитела изобретения также можно получить в клетках-хозяевах, таких как, трансфектомы, используя, например, комбинацию методов рекомбинантных ДНК и методов трансфекции генов, хорошо известных в данной области техники (Morrison, S. (1985) Science 229: 1202).

Например, в одном варианте осуществления представляющие интерес гены(ген), например, гены антител, могут быть лигированы в вектор экспрессии, такой как эукариотическая экспрессирующая плазмида, например, используемая системой экспрессии гена GS, раскрытой в WO 87/04462, WO 89/01036 и ЕР 338 841, или другие системы экспрессии, хорошо известные в данной области. Очищенная плазмида с клонированными генами антитела может быть введена в эукариотическую клетку-хозяина, такую как СНО клетки, NS/0 клетки, НЕК293Т клетки или НЕК293 клетки или альтернативно другие эукариотические клетки, подобные клеткам растений, грибов или дрожжей. Используемым методом для введения этих генов могут быть методы, описанные в данной области техники, такие как электропорация, липофектин, липофектамин или другие. После введения этих генов антител в клетки-хозяева, клетки, экспрессирующие антитело могут быть опознаны и отобраны. Эти клетки представляют собой трансфектомы, которые затем можно амплифицировать и масштабировать для выработки антител. Рекомбинантные антитела могут быть изолированы и очищены из этих культуральных супернатантов и/или клеток.

Альтернативно, клонированные гены антитела могут быть экспрессированы в другие системы экспрессии, включая прокариотические клетки, такие как микроорганизмы, например, Е. coli. Более того, антитела могут продуцироваться в трансгенных организмах, не являющихся человеком, и присутствовать, например, в молоке овец и кроликов или в яйцах кур, или в трансгенных растениях; смотри, например, Verma, R., et al. (1998) J. Immunol. Meth. 216: 165-181; Pollock, et al. (1999) J. Immunol. Meth. 231: 147-157; и Fischer, R., et al. (1999) Biol. Chem. 380: 825-839.

Использование частичных последовательностей антител для экспрессии интактных антител (т.е. гуманизация и химеризация).

а) Химеризация

Мышиные моноклональные антитела могут использоваться как терапевтические антитела для людей, в том случае, когда к ним прикрепляется токсин, или когда их метят радиоактивными изотопами. При повторном применении немеченые мышиные антитела являются высоко иммуногенными для человека, что приводит к уменьшению терапевтического эффекта. Основная иммуногенность опосредуется константными областями тяжелой цепи. Иммуногенность мышиных антител у человека можно уменьшить или полностью ее избежать, если соответствующие антитела сделать химерными или гуманизированными. Химерные антитела являются антителами, разные части которых происходят от разных видов животных, например, антитела имеют вариабельную область, полученную от мышиного антитела, и константную область человеческого иммуноглобулина. Химеризация антител достигается соединением вариабельных областей тяжелой и легкой цепей мышиных антител с человеческой константной областью тяжелой и легкой цепи (например, как описано Kraus et al., в Methods in Molecular Biology series, Recombinant antibodies for cancer therapy ISBN-0-89603-918-8). В предпочтительном варианте осуществления химерные антитела получают соединением человеческой константной области каппа-легкой цепи с мышиной вариабельной областью легкой цепи. В предпочтительном варианте осуществления химерные антитела получают соединением человеческой константной области лямбда-легкой цепи с мышиной вариабельной областью легкой цепи. Предпочтительными константными областями тяжелой цепи для получения химерных антител являются IgGl, IgG3 и IgG4. Другими предпочтительными константными областями тяжелой цепи для получения химерных антител являются IgG2, IgA, IgD и IgM.

b) Гуманизация

Антитела взаимодействуют с целевыми антигенами преимущественно через аминокислотные остатки, расположенные в шести гипервариабельных участках (CDR) тяжелой и легкой цепи. По этой причине аминокислотные последовательности в CDR являются более разными между отдельными антителами, чем последовательности вне CDR. Поскольку CDR-последовательности отвечают за большинство взаимодействий антитело-антиген, является возможной экспрессия рекомбинантных антител, подражающих свойствам специфических природных антител, путем конструирования векторов экспрессии, которые включают CDR-последовательности от специфических природных антител, пересаженные на каркасные последовательности от другого антитела с другими свойствами (см., например, Riechmann, L, et al. (1998) Nature 332: 323-327; Jones, P. et ai. (1986) Nature 321: 522-525; и Queen, С et al. (1989) Proc. Natl Acad. Sci. U.S.A. 86: 10029-10033). Такие каркасные последовательности можно получить из публичных баз данных ДНК, которые включают зародышевые последовательности генов антител. Эти зародышевые последовательности будут отличаться от зрелых последовательностей генов антител, так как они не включают полностью собранные изменчивые гены, которые формируются при V (D) J соединении во время созревания В-клетки. Зародышевые генные последовательности также будут отличаться от последовательностей высокоаффинного антитела из вторичного репертуара отдельной равномерной вариабельной областью. Например, соматические мутации являются относительно редкими в аминоконцевой части каркасного участка 1 и в карбоксиконцевой части каркасного участка 4. Более того, многие соматические мутации значительно не изменяют связывающие свойства антитела. По этой причине, необходимо получить полную последовательность ДНК отдельного антитела, для того чтобы заново создать (восстановить) интактное рекомбинантное антитело, имеющее свойства, сходные со свойствами первичного антитела (см. WO 99/45962). Для этой цели, как правило, достаточно частичных последовательностей тяжелой и легкой цепи, соединяющих CDR участки. Частичная последовательность используется, чтобы определить какие зародышевые вариабельные и соединяющие генные сегменты способствуют рекомбинированию изменчивых генов антитела. Затем используется зародышевая последовательность, чтобы заполнить недостающие части вариабельных участков. Лидерные последовательности тяжелой и легкой цепи расщепляются во время созревания белка и не вносят вклад в свойства антитела. Чтобы добавить отсутствующие последовательности, клонированные кДНК-последовательности можно соединить с синтетическими олигонуклеотидами с помощью лигирования или ПЦР-амплификации. Альтернативно, полная вариабельная область может быть синтезирована как набор коротких, перекрывающихся олигонуклеитидов, и объединена с помощью ПЦР-амплификации, чтобы создать клон с полностью синтетической вариабельной областью. Этот процесс имеет определенные преимущества, такие как элиминация, или включение, или отдельные сайты рестрикции, или оптимизация отдельных кодонов.

Нуклеотидные последовательности транскриптов тяжелой и легкой цепи из гибридом используются для составления перекрывающего набора синтетических олигонуклеотидов, чтобы создать синтетические V-последовательности с возможностью кодирования тех же самых аминокислот, как в природной последовательности. Последовательности синтетической тяжелой и каппа-цепи могут трояко отличаться от природных последовательностей: нити повторных нуклеиновых оснований прерываются, чтобы облегчить синтез олигонуклеотидов и ПЦР амплификацию; оптимальные сайты инициации трансляции включаются согласно правилам Kozak (Kozak, 1991, J. Biol. 5 Chem. 266: 19867-19870); и сайты HindIII создаются выше сайтов инициации трансляции.

Что касается вариабельных областей и тяжелой и легкой цепей, оптимизированные кодирующие и соответствующие некодирующие участки последовательностей разделяются на 30-50 нуклеотидов приблизительно в срединной точке соответствующего некодирующего олигонуклеотида. Таким образом, для каждой цепи олигонуклеотиды могут быть собраны в перекрывающиеся двунитевые наборы, которые охватывают сегменты из 150-400 нуклеотидов. Эти пулы (кластеры, группы) затем используются как матрицы для получения продуктов ПЦР-амплификации из 150-400 нуклеотидов. Как правило, одна вариабельная область олигонуклеотидного набора будет разделяться на два пула, которые отдельно амплифицируются, чтобы выработать два перекрывающихся ПЦР-продукта. Затем эти перекрывающиеся продукты затем объединяют с помощью ПЦР-амплификации, чтобы создать полную вариабельную область. Также может быть желательно включение перекрывающегося фрагмента вариабельной области тяжелой или легкой цепи в ПЦР-амплификацию для создания фрагментов, которые можно легко клонировать в конструкты векторов экспрессии.

Затем реконструированные химерную и гуманизированную вариабельные области тяжелой и легкой цепи объединяют с клонированными последовательностями промоторного участка, лидерного участка, участка инициации трансляции, константной области, 3' нетранслируем ого участка, участка полиаденилирования и участка терминации транскрипции, чтобы образовать конструкты вектора экспрессии. Конструкты экспрессии тяжелой и легкой цепи могут быть объединены в один вектор, котрансфицированы, последовательно трансфицированы или отдельно трансфицированы в клетки-хозяева, которые затем сливаются с образованием клетки-хозяина, экспрессирующей обе цепи. Описаны плазмиды, использующиеся в создании векторов экспрессии для человеческого IgGic. Плазмиды могут быть созданы так, что ПЦР-амплифицированные кДНК-последовательности V тяжелой и V каппа легкой цепи могут использоваться для реконструирования минигенов полной тяжелой и легкой цепи. Эти плазмиды могут использоваться для экспрессии полностью человеческого или химерного IgG1, каппа или IgG4, каппа антител. Могут быть созданы подобные плазмиды для экспрессии других изотипов тяжелой цепи или для экспрессии антител, содержащих лямбда-легкие цепи.

Таким образом, в другом аспекте изобретения структурные признаки анти-CLDN6 антител изобретения используются для создания структурно-родственных гуманизированных анти-CLDN6 антител, которые сохраняют, по меньшей мере, одно функциональное свойство антител изобретения, например, связывание с CLDN6. Конкретнее, один или более CDR-участков мышиного моноклонального антитела может быть рекомбинантно объединено с известными человеческими каркасными участками и CDR для создания дополнительных рекомбинантно-сконструированных гуманизированных aнти-CLDN6 антител изобретения.

Связывание с клетками, экспрессирующими антиген

Способность антитела связываться с CLDN6 можно определить с помощью стандартных методов анализа, таких как, методы, представленные в примерах (например, ELISA, Вестерн-блоттинг, иммунофлуоресценция и проточная цитометрия).

Изолирование и характеристика антител

С целью очистки моноклональных aнти-CLDN6 антител отобранные гибридомы выращивают в двухлитровой роллерной колбе. Альтернативно aнти-CLDN6 антитела можно получить в биореакторе на основе диализа. При необходимости супернатанты можно профильтровать, концентрировать перед проведением аффинной хроматографии с протеин-G-сефарозой или протеин-А-сефарозой. Чистоту элюированного IgG можно проконтролировать с помощью гель-электрофореза и высокоэффективной жидкостной хроматографии. Буферный раствор можно поменять на PBS, а концентрацию можно определить при OD280 с использованием коэффициента экстинции 1,43. Моноклональные антитела можно разделить на аликвоты и хранить при -80°С.

Для того чтобы определить, связываются ли отобранные aнти-CLDN6 моноклональные антитела с единственным эпитопом, может быть применен сайт-направленный или мульти-сайт-направленный мутагенез.

Установление изотипа

Для установления изотипа очищенных антител проводили анализ ELISA с разными коммерческими наборами (например, Zymed, Roche Diagnostics). Лунки титрационных микропланшетов покрывают анти-мышиным Ig. После блокирования проводили реакцию с моноклональными антителами или очищенными изотипными контролями при комнатной температуре в течение двух часов. Затем проводили реакцию или с мышиным IgG1, IgG2a, IgG2b или IgG3, IgA или со специфическим мышиным IgM, конъюгированным с пероксидазой. После промывки планшеты обрабатывают ABTS субстратом (1 мг/мл) и исследуют при OD 405-650. Альтернативно, можно использовать набор для изотипирования IsoStrip Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit (Roche, Cat. No. 1493027), как описано производителем.

Проточный цитометрический анализ

Для того, чтобы продемонстрировать наличие aнти-CLDN6 антител в сыворотке иммунизированных мышей или связывание моноклональных антител с живыми клетками, экспрессирующими CLDN6, можно использовать проточную цитометрию. Линии клеток, экспрессирующие CLDN6 в норме или после трансфекции, и отрицательные контроли, утратившие экспрессию CLDN6 (выращенные при стандартных условиях), смешивают с разными концентрациями моноклональных антител в супернатантах от гибридомы или в PBS, содержащем 1% FBS, и инкубируют при 4°С в течение 30 мин. После промывки меченые АРС или А1еха647 анти-IgG антитела могут связываться с CLDN6-связанными моноклональными антителами при таких же условиях, как условия для окрашивания первичных антител. Образцы можно проанализировать с помощью проточной цитометрии на приборе FACS, используя параметры прямого и бокового рассеяния света, чтобы пропускать отдельные живые клетки. Для того, чтобы отличить CLDN6-специфические моноклональные антитела от неспецифических связующих веществ в одном измерении, можно использовать метод ко-трансфекции. Клетки временно трансфицированные плазмидами, кодирующими CLDN6, и флуоресцентным маркером, можно окрасить, как описано выше. Трансфицированные клетки можно установить в другом диапазоне флуоресценции, чем антитело-окрашенные клетки. Так как большинство трансфицированных клеток экспрессирует оба трансгена, CLDN6-специфические моноклональные антитела связываются предпочтительно с клетками, экспрессирующими флуоресцентный маркер, тогда как неспецифические антитела связываются в сравнимом соотношении с нетрансфицированными клетками. Можно применять альтернативный метод анализа с использованием флуоресцентной микроскопии в дополнение к или вместо проточной цитометрии. Клетки можно окрасить так, как описано выше, и исследовать с помощью флуоресцентной микроскопии.

Иммунофлуоресцентная микроскопия

Для того чтобы продемонстрировать наличие анти-СЫЖб антител в сыворотке иммунизированных мышей или связывание моноклональных антител с живыми клетками, экспрессирующими CLDN6, можно использовать иммунофлуоресцентную микроскопию. Например, клеточные линии, экспрессирующие CLDN6 или спонтанно или после трансфекции, и отрицательные контроли, утратившие экспрессию CLDN6, выращивают в предметных стеклах при стандартных условиях роста в среде DMEM/F12 с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FCS), 2 мМ L-глутамина, 100 мкг/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина. Затем клетки фиксируют метанолом или параформальдегидом или оставляют необработанными. Затем проводят реакцию клеток с моноклональными антителами к CLDN6 в течение 30 минут при 25°С.После промывки проводят реакцию клеток с мечеными А1еха555 анти-мышиными IgG вторичными антителами (Molecular Probes) при тех же самых условиях. После этого можно исследовать клетки с помощью флуоресцентной микроскопии.

Общие уровни CLDN6 в клетках можно наблюдать, когда клетки зафиксированы метанолом или зафиксированы параформальдегодим и пермеабилизированы Тритоном X-100. В живых клетках и непермеабилизированных, фиксированных параформальдегидом клетках можно исследовать поверхностную локализацию CLDN6. Кроме того, нацеливание CLDN6 на плотные контакты можно изучать с помощью совместного окрашивания с маркерами плотных контактов, например, ZO-1. Более того, можно изучать результаты связывания антител и локализацию CLDN6 в клеточной мембране.

Вестерн-блоттинг

Aнти-CLDN6 IgG можно дополнительно протестировать на реакционную способность с CLDN6 антигеном с помощью Вестерн-блоттинга. Коротко, можно приготовить клеточные экстракты клеток, экспрессирующих CLDN6, и соответствующие отрицательные контроли и провести электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (SDS). После электрофореза отделенные антигены переносят на нитроцеллюлозные мембраны, блокируют и исследуют с помощью тестируемых моноклональных антител. IgG-связывание можно определить с помощью анти-мышь IgG меченого пероксидазой и обнаружить с помощью ECL субстрата.

Иммуногистохимия

Анти-CLDN6 мышиные IgG можно дополнительно протестировать на реакционную способность с CLDN6 антигеном с помощью иммуногистохимического анализа хорошо известным специалисту в данной области способом, например, с использованием крио-срезов, фиксированных параформальдегидом или ацетоном, или фиксированных параформальдегидом парафиновых срезов образцов нераковых тканей или раковых тканей, взятых у пациента во время обычных хирургических процедур, или у мышей с ксенотрансплантатом опухолей, инокулированных с помощью линий клеток, экспрессирующих CLDN6 спонтанно или после трансфекции. Для иммуноокрашивания антитела, реагирующие с CLDN6, могут быть проикубированы, а затем конъюгированы с мечеными пероксидазой хрена козьими анти-мышь или козьими анти-кролик антителами (DAKO) согласно инструкциям продавца.

Активность антител in vitro, связанная с фагоцитозом и способностью уничтожать клетки

В дополнение к специфичности связывания с CLDN6, анти-CLDN6 антитела можно проверить относительно их способности опосредовать фагоцитоз и уничтожение клеток, экспрессирующих CLDN6 и характеризующихся соединением CLDN6 с клеточной поверхностью. Проверка активности моноклональных антител in vitro обеспечивает первоначальный скрининг до тестирования на моделях in vivo.

Антителозависимая клеточная цитотоксичность (ADCC):

Коротко, полиморфноядерные клетки (PMN), NK-клетки, моноциты, мононуклеарные клетки или другие эффекторные клетки от здоровых доноров можно очистить центрифугированием в градиенте плотности фиколл-гипака, с последующим разрушением загрязняющих эритроцитов. Промытые эффекторные клетки суспендируют в RPMI с добавлением 10% инактивированной нагреванием эмбриональной телячьей сыворотки или альтернативно с 5% инактивированной нагреванием человеческой сыворотки и смешивают с ⁵¹Сr-мечеными клетками-мишенями, экспрессирующими CLDN6 и характеризующимися соединением CLDN6 с клеточной поверхностью, в различных соотношениях эффекторных клеток к клеткам-мишеням. Альтернативно, клетки-мишени можно пометить лигандом, усиливающим флуоресценцию (BATDA). Высоко флуоресцентный хелат европия с усиливающим лигандом, который высвобождается из мертвых клеток, можно определить с помощью флуориметра. В другом альтернативном способе может использоваться трансфекция клеток-мишеней люциферазой. При этом добавленный люцифер желтый может окисляться только живыми клетками. Затем можно добавить очищенные aнти-CLDN6IgG в разных концентрациях. В качестве отрицательного контроля можно использовать нерелевантный человеческий IgG. Исследование проводится в течение от 4 до 20 часов при 37°С в зависимости от типа используемых эффекторных клеток. Цитолиз в образцах можно оценить путем измерения высвобождения ⁵¹Сr или наличия хелата EuTDA в культуральном супернатанте. Альтернативно, можно измерить люминесценцию живых клеток, являющуюся результатом окисления люцифера желтого.

Также можно проверить различные комбинации анти-CLDN6 моноклональных антител, чтобы определить усиливается ли цитолиз при действии составов моноклональных антител.

Комплементзависимая цитотоксичность (CDC):

Моноклональные анти-CLDN6 антитела можно проверить на их способность опосредовать CDC с помощью ряда известных методов. Например, сыворотку для получения комплемента можно получить из крови известным специалистам способом. Для определения CDC-активности моноклональных антител можно использовать разные методы. Например, можно измерить высвобождение ⁵¹Сr или можно оценить повышенную проницаемость мембран с помощью метода исключения пропидиум иодидом (PI). Коротко, целевые клетки промывают 5×10⁵ / мл и инкубируют с разными концентрациями mMAb в течение 10-30 минут при комнатной температуре или при 37°С. Затем добавляют сыворотку или плазму до окончательной концентрации 20% (об./об.) и клетки инкубируют при 37°С в течение 20-30 минут.Ко всем клеткам каждого образца добавляют раствор PI в пробирку для FACS-анализа. После этого смесь немедленно анализируют с помощью проточной цитометрии, используя FACS-набор.

В альтернативном способе исследования индукцию CDC можно установить на прикрепленных клетках. В одном варианте осуществления этого метода анализа клетки высевают за 24 часа до исследования с плотностью 3×10⁴ / лунку в плоскодонные титрационные микропланшеты для культур тканей. На следующий день ростовую среду удаляют и клетки инкубируют с антителами (три повтора). Контрольные клетки инкубируют в ростовой среде или ростовой среде, содержащей 0,2% сапонина для определения фонового лизиса и максимального лизиса, соответственно. После инкубации в течение 20 минут при комнатной температуре супернатант удаляют и добавляют к клеткам 20% (об./об.) человеческой плазмы или сыворотки в DMEM (предварительно нагретой до 37°С) и инкубируют в течение следующих 20 минут при 37°С.К клеткам добавляют раствор пропидий иодида (10 мкг/мл). Затем супернатанты заменяют PBS, содержащим 2,5 мкг/мл этидиум бромида и измеряют испускание флуоресценции после возбуждения при 520 нм при 600 нм с помощью Tecan Satire. Процент специфического лизиса вычисляют как указано далее: % специфического лизиса = (флуоресценция образца - фоновая флуоресценция) / (флуоресценция при максимальном лизисе- фоновая флуоресценция) х 100.

Ингибирование клеточной пролиферации моноклональными антителами: Например, чтобы проверить способность моноклональных aнти-CLDN6 антител инициировать апоптоз, их инкубируют с опухолевыми клетками, положительными по CLDN6, или CLDN6-трансфицированными опухолевыми клетками при 37°С в течение примерно 20 часов. Клетки собирают, промывают в аннексин-V связывающем буфере (BD biosciences), и инкубируют с аннексином V, соединенным с FITC или АРС (BD biosciences) в течение 15 минут в темноте. Ко всем клеткам каждого образца добавляют раствор PI (10 мкг/мл в PBS) в пробирку для FACS-анализа и сразу оценивают с помощью проточной цитометрии (как описано выше). Альтернативно, общее ингибирование клеточной пролиферации моноклональными антителами можно определить с помощью коммерчески доступных наборов. С помощью набора для определения клеточной пролиферации DELFIA (Perkin-Elmer, Cat. No. AD0200) можно провести неизотопный иммуноанализ в микропланшетах, основанный на измерении включения 5-бром-2'-дезоксиуридина (BrdU) во время синтеза ДНК пролиферирующими клетками. Включенный BrdU определяют с помощью меченых европием моноклональных антител. Чтобы сделать возможным обнаружение антител, клетки фиксируют и проводят денатурацию ДНК, используя Fix (фиксирующий) раствор. Несвязанные антитела смывают и добавляют в раствор индуктор DELFIA, чтобы отделить ионы европия от меченых антител, где они образуют высоко флуоресцентные хелаты с компонентами индуктора DELFIA. Флуоресценция, измеренная в каждой лунке с помощью флуориметрии с временным разрешением, является пропорциональной синтезу ДНК в клетке.

Доклинические исследования

Моноклональные антитела, которые связываются с CLDN6, также могут быть проверены на модели in vivo (например, на иммунодефицитных мышах с ксенотрансплантатом опухолей, инокулированных клеточными линиями, экспрессирующими CLDN6, возможно после трансфекции) для установления их эффективности при контролировании роста CLDN6-экспрессирующих опухолевых клеток.

Исследование антител изобретения in vivo можно провести после ксенотрансплантации опухолевых клеток, экспрессирующих CLDN6, иммунодефицитным мышам или другим животным. Чтобы определить действие антител на предотвращение образования опухолей или симптомов, связанных с опухолью, антитела можно ввести мышам, свободным от опухоли, с последующей инъекцией опухолевых клеток. Чтобы установить терапевтическую эффективность соответствующих антител в отношении уменьшения опухолевого роста или симптомов, связанных с опухолью, антитела можно ввести мышам-опухоленосителям. Применение антител можно комбинировать с применением других веществ, таких как цитостатические средства, ингибиторы факторов роста, блокаторы клеточного цикла, ингибиторы ангиогенеза или другими антителами, чтобы определить синергическую эффективность и потенциальную токсичность комбинаций. Чтобы проанализировать токсичные побочные явления, опосредованные антителами изобретения, животным можно инокулировать антитела или контрольные реагенты и тщательно изучить симптомы, возможно связанные с терапией антителами к CLDN6. В частности, возможные побочные явления от применения in vivo CLDN6-антител включают токсическое влияние на ткани, экспрессирующие CLDN6, включая плаценту. Антитела, распознающие CLDN6 у человека и у других видов, например, мышей, являются, в частности, пригодными для предсказания возможных побочных явлений, опосредованных применением моноклональных CLDN6-антител, у людей.

Картирование эпитопов

Картирование эпитопов, распознаваемых антителами изобретения, можно провести, как подробно описано в "Epitope Mapping Protocols (Methods in Molecular Biology) by Glenn E. Morris ISBN-089603-375-9 и в "Epitope Mapping: A Practical Approach" Practical Approach Series, 248 by Olwyn M. R. Westwood, Frank C. Hay.

I. Биспецифические / мультиспецифические молекулы, связывающиеся с CLDN6

В другом варианте осуществления изобретения антитела к CLDN6 могут образовывать производное или могут соединяться с другой функциональной молекулой, например, другим пептидом или белком (например, Fab¹ фрагментом), чтобы образовать биспецифическую или мультиспецифическую молекулу, которая связывается с различными сайтами связывания или целевыми эпитопами. Например, антитело изобретения может быть функционально связано (например, путем химического соединения, генетического объединения (слияния), нековалентной связи или иным образом) с одной или более другими связывающими молекулами, такими как другое антитело, пептид или связывающий миметик.

Соответственно, настоящее изобретение включает биспецифические и мультиспецифические молекулы, содержащие, по меньшей мере, одну первую специфичность связывания для CLDN6 и вторую специфичность связывания для второго целевого эпитопа. В отдельном варианте осуществления изобретения второй целевой эпитоп является Fc-рецептором, например, человеческим Fc-гаммаRI (CD64) или человеческим Fc-альфа рецептором (CD89) или Т-клеточным рецептором, например, CD3. Следовательно, изобретение включает биспецифические и мультиспецифические молекулы, способные связываться с эффекторными клетками, экспрессирующими Fc-гаммаR, Fc-альфаR или Fc-эпсилонR (например, моноцитами, макрофагами или полиморфноядерными клетками (PMN)), и с клетками-мишенями, экспрессирующими CLDN6 и характеризующимися соединением CLDN6 с клеточной поверхностью. Эти биспецифические и мультиспецифические молекулы могут нацеливать эффекторные клетки на клетки, экспрессирующие CLDN6 и характеризующиеся соединением CLDN6 с клеточной поверхностью, и могут инициировать активность эффекторных клеток, опосредованную Fc-рецептором, например, фагоцитоз клеток, экспрессирующих CLDN6 и характеризующихся соединением CLDN6 с клеточной поверхностью, антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC), высвобождение цитокинов или выработку супероксид-аниона.

Биспецифические и мультиспецифические молекулы изобретения могут дополнительно включать третью специфичность связывания, в дополнение к анти-Fc-специфичности связывания и анти-CLDN6-специфичности связывания. В одном варианте осуществления третья специфичность связывания является частью анти-усиливающего фактора (EF), например, молекулой, которая связывается с поверхностью белка, вовлеченного в цитотоксическую активность, и таким образом увеличивает иммунный ответ против клетки-мишени. "Часть анти-усиливающего фактора" может быть антителом, функциональным фрагментом антитела или лигандом, который связывается с данной молекулой, например, антиген или рецептор, и таким образом приводит к усилению эффекта связывания детерминант для Fc-рецептора или антигена клетки-мишени. "Часть анти-усиливающего фактора" может связывать Fc-рецептор или антиген клетки-мишени. Альтернативно, часть анти-усиливающего фактора может связываться с частицей (entity), которая является отличной от частицы, с которой связываются первая и вторая специфичности связывания. Например, часть анти-усиливающего фактора может связываться с цитотоксической Т-клеткой (например, через CD2, CD3, CD8, CD28, CD4, CD40, ICAM-1 или другой иммунной клеткой, приводящей к повышению иммунного ответа против клетки-мишени).

В одном варианте осуществления биспецифические и мультиспецифические молекулы изобретения содержат в качестве специфичности связывания, по меньшей мере, одно антитело, включая, например, Fab, Fab', F(ab')2, Fv или одну цепь Fv. Антитело также может быть димером легкой цепи или тяжелой цепи, или любым минимальным его фрагментом, таким как Fv или одноцепочечный конструкт, как описано в Ladner et al., US 4,946,778. Антитело также может быть доменом связывания химерного белка иммуноглобулина, как раскрыто в US 2003/0118592 и US 2003/0133939.

В одном варианте осуществления биспецифические и мультиспецифические молекулы изобретения содержат специфичность связывания для Fc-гаммаR или Fc-aльфaR, присутствующих на поверхности эффекторной клетки, и вторую специфичность связывания для антигена клетки-мишени, например, CLDN6.

В одном варианте осуществления специфичность связывания для Fc-рецептора обеспечивается моноклональным антителом, связывание которого не блокируется человеческим иммуноглобулином G (IgG). При использовании в описании термин "IgG рецептор" относится к любому из восьми генов гамма-цепи, расположенных на хромосоме 1. Эти гены кодируют все двенадцать трансмембранных или растворимых изоформ рецептора, которые разделены на три класса Fc-гамма рецепторов: Fc-гаммаRI (CD64), Fc-гаммаRII (CD32) и Fc-гаммаIII (CD16). В одном предпочтительном варианте осуществления Fc-гамма рецептор является человеческим высокоаффинным Fc-гаммаRI.

В других предпочтительных вариантах осуществления специфичность связывания для Fc-рецептора обеспечивается антителом, которое связывается с человеческим IgA-рецептором, например, Fc-альфа рецептором (Fc-aльфaR1 (CD89)), связывание которого предпочтительно не блокируется человеческим иммуноглобулином A (IgA). Термин "IgA рецептор" включает генный продукт одного альфа-гена (Fс-альфаRI), расположенного на хромосоме 19. Известно, что этот ген кодирует несколько альтернативных трансмембранных сплайс-изоформ от 55 до 110 KDа. Рс-альфаRI (CD89) конститутивно экспрессируется на моноцитах/макрофагах, эозинофильных и нейтрофильных гранулоцитах, но не экспрессируется на популяциях неэффекторных клеток. Fс-альфаRI имеет среднюю аффинность и к IgA1 и к IgA2, которая увеличивается после воздействия цитокинов, таких как G-CSF или GM-CSF (Morton, Н. С. et al. (1996) Critical Reviews in Immunology 16: 423-440). Были описаны четыре Fc-альфаRI-специфических моноклональных антитела, названные A3, А59, А62 и А77, связывающие Fc-aльфaRI снаружи IgA лиганд-связывающего домена (Monteiro, R. С et al. (1992) J.Immunol. 148: 1764).

В другом варианте осуществления биспецифическая молекула состоит из двух моноклональных антител согласно изобретению, которые имеют комплементарные функциональные активности, например, одно антитело преимущественно индуцирует CDC, а другое антитело преимущественно индуцирует апоптоз.

"Антитело, специфическое к эффекторной клетке" при использовании в описании относится к антителу или функциональному фрагменту антитела, который связывается с Fc-рецептором эффекторных клеток. Предпочтительные антитела для применения в изобретении связываются с Fc-рецептором эффекторных клеток в сайте, который не связывается эндогенным иммуноглобулином.

При использовании в описании термин "эффекторная клетка" относится к иммунной клетке, которая вовлекается в эффекторную фазу иммунного ответа, в отличие от фазы распознавания и фазы активации иммунного ответа. Примеры иммунных клеток включают клетки миелоидного и лимфоидного происхождения, например, лимфоциты (например, В-клетки и Т-клетки, включая цитолитические Т-клетки (CTL), клетки-киллеры, клетки естественные (натуральные) киллеры, макрофаги, моноциты, эозинофилы, нейтрофилы, полиморфноядерные клетки, мастоциты и базофилы. Некоторые эффекторные клетки экспрессируют специфические Fc-рецепторы и выполняют специфические иммунные функции. В предпочтительных вариантах осуществления эффекторная клетка способна индуцировать антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC), например, нейтрофил, способный индуцировать ADCC. Например, моноциты, макрофаги, экспрессирующие FcR, участвуют в специфическом уничтожении клеток-мишеней и презентировании антигенов другим компонентам иммунной системы или связываются с клетками, которые презентируют антигены. В других вариантах осуществления эффекторная клетка может фагоцитировать антиген-мишень, клетку-мишень или микроорганизм. Экспрессия конкретного FcR на эффекторной клетке может регулироваться гуморальными факторами, такими как цитокины. Например, было обнаружено, что экспрессия Fc-raMMaRI регулируется с повышением интерфероном гамма (IFN-γ). Эта усиленная экспрессия увеличивает цитотоксическую активность Fc-гаммаRI-несущих клеток против мишеней. Эффекторная клетка может фагоцитировать или лизировать антиген-мишень или клетку-мишень.

"Клетка-мишень" означает любую нежелательную клетку у субъекта (например, человека или животного), на которую может нацеливаться антитело изобретения. В предпочтительных вариантах осуществления клетка-мишень является клеткой, экспрессирующей или сверхэкспрессирующей CLDN6 и характеризующейся соединением CLDN6 с клеточной поверхностью. Клетки, экспрессирующие CLDN6 и характеризующиеся соединением CLDN6 с клеточной поверхностью, как правило, включают опухолевые клетки.

II. Иммуноконъюгаты

В другом аспекте настоящее изобретение определяет свойство анти-CLDN6 антитела, конъюгированного с терапевтической частицей или средством, таким как цитотоксин, лекарственное средство (например, иммуносупрессор) или радиоизотоп.Такие конъюгаты называются в описании "иммуноконъюгаты". Иммуноконъюгаты, включающие один или более цитотоксинов, называются "иммунотоксины". Цитотоксин или цитотоксическое средство включает любое средство, оказывающее неблагоприятное влияние на клетки, в частности, убивает клетки. Примеры включают таксол, цитохалазин В, грамицидин D, этидиум бромид, эметин, митомицин, этопозид, тенипозид, винкристин, винбластин, колхицин, доксорубицин, даунорубицин, дигидроксиантрациндион, митоксантрон, митрамицин, актиномицин D, 1-дегидротестостерон, глюкокортикоиды, прокаин, тетракаин, лидокаин, пропранолол, пуромицин и их аналоги или гомологи.

Подходящие терапевтические средства для образования иммуноконъюгатов изобретения включают, но не ограничиваются этим, антиметаболиты (например, метотрексат, 6-меркаптопурин, 6-тиогуанин, цитарабин, флударабин, 5-фторурацил, декарбазин), алкилирующие средства (например, хлорметин, тиотепа, хлорамбуцил, мелфалан, кармустин (BSNU) и ломустин (CCNU), циклофосфамид, бусулфан, дибромманнитол, стрептозотоцин, митомицин С и цис-дихлордиаминплатина (II) (DDP) цисплатин), антрациклиновые антибиотики (например, даунорубицин (ранее дауномицин) и доксорубицин), антибиотики (например, дактиномицин (ранее актиномицин), блеомицин, митрамицин и антрамицин (АМС), и антимитотические средства (например, винкристин и винбластин). В предпочтительном варианте осуществления терапевтическое средство является цитотоксическим средством или радиотоксическим средством. В другом варианте осуществления терапевтическое средство является иммуносупрессором. В другом варианте осуществления терапевтическое средство является GM-CSF (гранулоцитарно-макрофагальным колониестимулирующим фактором). В предпочтительном варианте осуществления терапевтическое средство является доксорубицином, цисплатином, блеомицином, сульфатом (sulfate), кармустином, хлорамбуцилом, циклофосфамидом или рицином А.

Антитела настоящего изобретения также можно соединить с радиоизотопом, например, иодом-131, иттрием-90 или индием-111, чтобы получить цитотоксические радиофармацевтические средства для лечения нарушения, связанного с CLDN6, такого как рак. Конъюгаты антител изобретения можно использовать для того, чтобы модифицировать данный биологический ответ, при этом лекарственная частица не должна рассматриваться как ограничивающая классические химические терапевтические лекарственные средства. Например, лекарственная частица может быть белком или полипептидом, обладающим желательной биологической активностью. Такой белок может включать, например, ферментативно активный токсин, или его активный фрагмент, такой как абрин, рицин А, экзотоксин синегнойной палочки или дифтерийный токсин; белок, такой как фактор некроза опухоли или интерферон-γ; или модификаторы биологического ответа такие как, например, лимфокины, интерлейкин-1 ("IL-1"), интерлейкин-2 ("IL-2"), интерлейкин-6 ("IL-6"), гранулоцитарно-моноцитарный колониестимулирующий фактор ("GM-CSF"), гранулоцитарный колониестимулирующий фактор ("G-CSF") или другие факторы роста.

Методы конъюгирования (соединения) такой терапевтической частицы с антителом хорошо известны, см., например, Arnon et al, "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp.243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), pp.623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", in Monoclonal Antibodies '84: Biological and Clinical Applications, Pincheraet al. (eds.), pp.475-506 (1985); "Analysis, Results, and Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection and Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp.303-16 (Academic Press 1985) и Thorpe et al., "The Preparation and Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev., 62: 119-58 (1982).

В дополнительном варианте осуществления антитела согласно изобретению присоединяется к линкеру-хелатору, например, тиуксетану, который позволяет антителу конъюгировать с радиоизотопом.

III. Фармацевтические композиции

В другом аспекте настоящее изобретение предоставляет композицию, например, фармацевтическую композицию, содержащую одно или комбинацию антител настоящего изобретения. Фармацевтические композиции могут быть заключены в состав с фармацевтически приемлемыми носителями или разбавителями, а также любыми другими хорошо известными адъювантами (вспомогательными средствами) и эксципиентами в соответствии с обычными методами, раскрытыми в Remington: The Science и Practice of Pharmacy, 19th Edition, Gennaro, Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1995. В одном варианте осуществления композиции включают комбинацию нескольких (например, двух или более) изолированных антител изобретения, действующих с помощью разных механизмов действия, например, одно антитело, которое преимущественно действует, вызывая CDC, в комбинации с другим антителом, которое преимущественно действует, вызывая апоптоз.

Кроме того, фармацевтические композиции изобретения могут вводиться при комбинированной терапии, т.е., в сочетании с другими средствами. Например, комбинированная терапия может включать композицию настоящего изобретения, по меньшей мере, с одним противовоспалительным средством или, по меньшей мере, с одним иммуносупрессорным средством. В одном варианте осуществления такие терапевтические средства включают одно или более противовоспалительных средств, таких как стероидное лекарственное средство или NSAID (нестероидное противовоспалительное лекарственное средство). Предпочтительные средства включают, например, аспирин и другие салицилаты, ингибиторы Сох-2, такие как рофекоксиб (виокс) и целекоксиб (целебрекс), NSAID, такие как ибупрофен (мотрин, адвил), фенопрофен (налфон), напроксен (напросин), сулиндак (клинорил), диклофенак (волтарен), пироксикам (фелден), кетопрофен (орудие), дифлунизал (долобид), набуметон (релафен), этодолак (лодин), оксапрозин (дейпро) и индометацин (индоцин).

В другом варианте осуществления такие терапевтические средства включают средства, приводящие к истощению или функциональной инактивации регуляторных Т-клеток, такие как циклофосфамид в низкой дозе, анти-CLDN4 антитела, анти-IL2 или анти-IL2-рецепторные антитела.

В другом варианте осуществления такие терапевтические средства включают одно или более химиотерапевтических средств, таких как производные таксола, таксотер, гемцитабин, 5-фторурацил, доксорубицин (адриамицин), цисплатин (платинол), циклофосфамид (цитоксан, процитокс, неосар). В другом варианте осуществления антитела настоящего изобретения могут вводиться в комбинации с химиотерапевтическими средствами, предпочтительно демонстрирующими терапевтическую эффективность у пациентов, страдающих от рака, например, описанных здесь типов рака.

В другом варианте осуществления антитела изобретения могут вводиться в сочетании с радиотерапией и/или аутологичной периферической стволовой клеткой или трансплантацией костного мозга.

При использовании в описании "фармацевтически приемлемый носитель" включает все и любые растворители, дисперсионные среды, покрытия, антибактериальные и противогрибковые средства, изотонические средства и средства, задерживающие всасывание, и т.п., которые являются физиологически совместимыми. Предпочтительно носитель является пригодным для внутривенного, внутримышечного, подкожного, парентерального, спинального или эпидермального введения (например, с помощью инъекции или вливания). В зависимости от способа введения активное соединение, например, антитело, биспецифическая и мультиспецифическая молекула, может быть покрыто веществом, защищающим соединение от действия кислот и других естественных условий, которые могут инактивировать соединение.

"Фармацевтически приемлемая соль" относится к соли, сохраняющей желательную биологическую активность исходного соединения и не оказывающей каких-либо нежелательных токсических воздействий (см. например, Berge, S. М., et al. (1977) J. Pharm. Sci. 66: 1-19).

Примеры таких солей включают соли присоединения кислоты и соли присоединения основания. Соли присоединения кислоты включают соли, полученные из нетоксичных неорганических кислот, таких как соляная кислота, азотная кислота, фосфорная, серная, бромисто-водородная кислота, йодистоводородная кислота, фосфористая и тому подобные, а также из нетоксичных органических кислот, таких как алифатические моно- и дикарбоновые кислоты, фенил-замещенные алкановые кислоты, гидрокси-алкановые кислоты, ароматические кислоты, алифатические и ароматические сульфоновые кислоты и тому подобные. Соли присоединения основания включают соли полученные из щелочноземельных металлов, таких как, натрий, калий, магний, кальций и т.п., а также из нетоксичных органических аминов, таких как N,N'-дибензилэтилендиамин, N-метилгюкамин, хлорпрокаин, холин, диэтаноламин, этилендиамин, прокаин и тому подобного.

Композиция настоящего изобретения может быть введена с помощью целого ряда способов, известных в данной области техники. Специалисту в данной области понятно, что путь и/или способ введения будет варьировать в зависимости от желаемых результатов. Активные соединения можно приготовить вместе с носителями, которые будут защищать соединение от быстрого высвобождения, например, в виде композиций с контролируемым высвобождением, включая имплантаты, чрескожные пластыри и микроинкапсулированные системы доставки. Можно использовать биодеградируемые, биосовместимые полимеры, такие как этиленвинилацетат, полиангидриды, полигликолиевая кислота, коллаген, полиортоэфиры и полимолочная кислота. Как правило, способы приготовления таких композиций известны специалистам в данной области техники. См., например, Sustained и Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978.

Для введения соединения изобретения определенными способами может потребоваться покрыть соединение веществом, или совместно ввести соединение с веществом, предотвращающим его инактивацию. Например, соединение можно ввести субъекту в соответствующем носителе, например, липосомах, или разбавителе. Фармацевтически приемлемые разбавители включают солевые и водные буферные растворы. Липосомы включают CGF эмульсии вода-в-масле-в-воде, а также обычные липосомы (Strejan et al. (1984) J. Neuroimmunol. 7: 27).

Фармацевтически приемлемые носители включают стерильные водные растворы или дисперсии и стерильные порошки для экстемпорального приготовления стерильных инъецируемых растворов или дисперсий. Использование таких сред и компонентов для фармацевтически активных веществ известно в данной области техники. За исключением случаев, когда любая обыкновенная среда или средство является несовместимым с активным соединением, рассматривается их использование в фармацевтических композициях изобретения. Кроме того, в композиции могут быть включены дополнительные активные соединения.

Как правило, терапевтические композиции должны быть стерильными и стойкими при условиях производства и хранения. Композиции могут быть составлены в виде раствора, микроэмульсии, липосомы или другой упорядоченной структуры, подходящей для высокой концентрации лекарственного средства. Носитель может быть растворителем или дисперсионной средой, содержащей, например, воду, этанол, полиол (например, глицерин, пропиленгликоль и жидкий полиэтиленгликоль и т.п.) и их подходящие смеси. Надлежащую текучесть можно сохранить, например, используя покрытия, такое как лецитин, сохраняя желательный размер частиц в случае дисперсии и используя поверхностно-активные вещества. Во многих случаях предпочтительным является включение в композицию изотонических средств, таких как, сахара, полиспирты, такие как маннитол, сорбитол или хлорид натрия. Продолжительное всасывание инъецируемых композиций может достигаться включением в композицию средства, задерживающего всасывание, например, моностеарата и желатина.

Стерильные инъецируемые растворы можно приготовить путем введения в подходящий растворитель активного соединения в необходимом количестве с одним или комбинацией ингредиентов, перечисленных выше, как потребуется, с последующей стерилизацией микрофильтрацией.

Как правило, дисперсии готовят путем введения активного соединения в стерильный носитель, содержащий основную дисперсионную среду и другие необходимые ингредиенты, из числа перечисленных выше. В случае стерильных порошков для приготовления стерильных инъецируемых растворов, предпочтительными способами приготовления являются вакуумная сушка и сублимационная сушка (лиофилизация), которые дают порошок активного ингредиента плюс любой дополнительный желательный ингредиент из его предварительно стерильно-профильтрованного раствора.

Режимы дозирования подбирают так, чтобы обеспечить оптимальный желательный ответ (например, терапевтический ответ). Например, может быть введена единственная доза, может быть введено несколько отдельных доз в течение некоторого времени или дозировка может быть пропорционально уменьшена или увеличена, как диктует острая необходимость терапевтической ситуации. Особенно выгодно разрабатывать парентеральные композиции в стандартной лекарственной форме для простоты введения и единообразия дозировки. Стандартная лекарственная форма при использовании здесь относится к физически отдельным единицам, пригодным в качестве единичных дозировок для субъектов, которых необходимо лечить; каждая единица содержит заранее определенное количество активного соединения, подсчитанного так, чтобы получить желаемый терапевтический эффект, в сочетании с необходимым фармацевтическим носителем.

Примеры фармацевтически приемлемых антиоксидантов включают: (1) водорастворимые антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота, цистеин гидрохлорид, бисульфат натрия, натрий метабисульфит, сульфит натрия и тому подобное; (2) маслорастворимые антиоксиданты, такие как, аскорбилпальмитат, бутилированный гидроксианизол (ВНА), бутилированный гидрокситолуол (ВНТ), лецитин, пропилгаллат, альфа-токоферол и тому подобное; и (3) металлические хелатирующие агенты, такие как лимонная кислота, этилендиаминтетрауксусная кислота (EDTA), сорбитол, винная кислота, фосфорная кислота и т.п.

Композиции настоящего изобретения включают терапевтические композиции, подходящие для орального, назального, местного, (включая щечное и подъязычное), ректального, вагинального и/или парентерального введения. Композиции могут быть удобно представлены в стандартной лекарственной форме и могут быть приготовлены любыми известными в области фармацевтики способами. Количество активного ингредиента, которое необходимо объединить с носителем для получения стандартной лекарственной формы, будет варьировать в зависимости от субъекта, которого необходимо лечить, и конкретного способа введения. Количество активного ингредиента, которое необходимо объединить с носителем для получения стандартной лекарственной формы, в большинстве случаев будет представлять собой количество композиции, дающее терапевтический эффект.

Композиции настоящего изобретения, пригодные для вагинального применения, также включают вагинальные суппозитории, тампоны, кремы, гели, пасты, пены или спрэи, содержащие носители, известные в данной области техники, как пригодные. Лекарственные формы для местного или чрескожного введения композиций данного изобретения включают порошки, спрэи, мази, пасты, кремы, лосьоны, гели, растворы, пластыри и средства для ингаляции. Активное соединение может быть смешано в стерильных условиях с фармацевтически приемлемым носителем и с любыми консервантами, буферами или пропеллентами, которые могут потребоваться.

Фразы "парентеральное введение" и "введенный парентерально" при использовании в описании означают отличные от энтерального и местного введения способы введения, обычно с помощью инъекции и включают, без ограничения, внутривенную, внутримышечную, внутриартериальную, подоболочечную, внутрикапсульную, внутриглазничную, внутрисердечную, внутрикожную, внутрибрюшинную, транстрахеальную, подкожную, внутрикожную, внутрисуставную, подкапсулярную, субарахноидальную, интраспинальную, эпидуральную и внутригрудинную инъекцию и вливание.

Примеры подходящих водных и неводных носителей, которые могут применяться в фармацевтических композициях изобретения, включают воду, этанол, полиолы (такие как, глицерин, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль и т.п.) и их подходящие смеси, растительные масла, такие как оливковое масло, и инъецируемые сложные органические эфиры, такие как этилолеат.Надлежащую текучесть можно сохранить, например, используя покрытия, такое как лецитин, сохраняя желательный размер частиц в случае дисперсии и используя поверхностно-активные вещества.

Эти композиции также могут содержать адъюванты, такие как консерванты, увлажняющие средства, эмульгирующие вещества и диспергирующие вещества. Предотвращение присутствия микроорганизмов можно обеспечить методами стерилизации, а также включением различных антибактериальных и противогрибковых средств, например, парабена, хлорбутанола, фенолсорбиновой кислоты и т.п.Также может быть желательным включение в композиции изотонических средств, таких как сахара, хлорид натрия и т.п.Кроме того, длительное всасывание инъецируемой фармацевтической формы может достигаться включением средств, задерживающих всасывание, таких как алюминий моностеарат и желатин.

Независимо от выбранного способа введения соединения настоящего изобретения, которые могут использоваться в подходящей гидратной форме, и/или фармацевтические композиции настоящего изобретения заключаются в состав фармацевтически приемлемых лекарственных форм с помощью обычных методов, известных специалистам в данной области техники.

Фактические уровни дозировок активных ингредиентов в фармацевтических композициях настоящего изобретения могут варьировать так, чтобы получить количество активного ингредиента, которое является эффективным для достижения желательного терапевтического ответа для отдельного пациента, композиции и способа введения, но не является токсичным для пациента. Выбранный уровень дозирования будет зависеть от целого ряда фармакокинетических факторов, включая активность отдельных применяемых композиций настоящего изобретения, способ введения, время введения, скорость выведения конкретного используемого соединения, продолжительность лечения, другие лекарственные средства, соединения и/или вещества, используемые в комбинации с конкретными применяемыми соединениями, возраст, пол, вес, состояние, общее состояние здоровья и предыдущую историю болезни пациента, которого необходимо лечить, и подобных факторов, хорошо известных в медицине.

Врач или ветеринар, являющийся специалистом в данной области, может легко определить и назначить нужное эффективное количество фармацевтической композиции. Например, врач или ветеринар может начать дозирование соединений изобретения, применяемых в фармацевтической композиции, с уровней ниже, чем необходимые для достижения желательного терапевтического эффекта, и постепенно увеличивать дозировку до достижения желательного результата. В общем, подходящая ежедневная доза композиции изобретения будет представлять собой количество соединения, которое является самой низкой дозировкой, эффективной для получения терапевтического эффекта. Как правило, такая эффективная доза будет зависеть от факторов, описанных выше. Предпочтительно, что введение является внутривенным, внутримышечным, внутрибрюшинным или подкожным введением, предпочтительно введением, расположенным проксимально относительно местоположения мишени. При необходимости эффективная ежедневная доза терапевтической композиции может быть введена в виде двух, трех, четырех, пяти, шести или более субдоз, введенных отдельно с соответствующими интервалами на протяжении всего дня, необязательно в стандартных лекарственных формах. Несмотря на то, что возможно введение соединения настоящего изобретения отдельно, предпочтительным является введение соединения в виде фармацевтической композиции (состава).

В одном варианте осуществления антитела изобретения могут быть введены с помощью вливания (инфузии), предпочтительно медленного непрерывного вливания в течение длительного периода, например, более 24 часов, для того, чтобы уменьшить токсичные побочные воздействия. Введение также может осуществляться путем непрерывного вливания в течение периода от 2 до 24 часов, например, от 2 до 12 часов. Такой режим может повторяться один или более раз, по необходимости, например, через 6 месяцев или 12 месяцев. Дозировки можно определить и отрегулировать, измеряя количества циркулирующих моноклональных анти-CLDN6 антител после введения в биологическом образце, используя анти-идиотипические антитела, нацеленные на анти-CLDN6 антитела.

В другом варианте осуществления антитела вводятся как поддерживающая терапия, например, один раз в неделю в течение периода из 6 месяцев или более.

В другом варианте осуществления антитела согласно изобретению могут вводиться с помощью режима, включающего одно вливание антител против CLDN6, а затем вливание антител против CLDN6, конъюгированного с радиоизотопом. Этот режим можно повторить, например, через 7-9 дней.

В одном варианте осуществления изобретения терапевтические соединения изобретения заключаются в липосомы. В более предпочтительном варианте осуществления липосомы включают нацеливающий фрагмент (частицу). В наиболее предпочтительном варианте осуществления терапевтические соединения в липосомах доставляются путем болюсного вливания в место, расположенное проксимально относительно желательной области, например, местоположения опухоли. Композиция может быть текучей до такой степени, чтобы легко вводиться с помощью шприца. Композиция должна быть устойчивой в условиях производства и хранения и должна быть сохранена от загрязняющего действия микроорганизмов, таких как бактерии и грибы.

В дополнительном варианте осуществления антитела изобретения могут быть разработаны так, чтобы предотвратить или уменьшить их транспорт через плаценту. Это можно сделать с помощью известных в данной области техники методов, например, путем ПЕГилирования антитела или путем использования F(ab)2' фрагментов. В качестве дополнительных ссылок можно упомянуть "Cunningham-Rundles С, Zhuo Z, Griffith В, Keenan J. (1992) Biological activities of polyethylene-glycol immunoglobulin conjugates. Resistance to enzymatic degradation. J. Immunol. Methods, 152: 177-190; и to "Landor M. (1995) Maternal-fetal transfer of immunoglobulins, Ann. Allergy Asthma Immunol. 74: 279-283.

"Терапевтически эффективную дозу" для лечения опухолей можно оценить (определить) по реальному ответу опухоли, при этом ответ может быть полным или частичным. Полный ответ (CR) определяется как отсутствие клинического, радиологического или иного наглядного подтверждения болезни. Частичный ответ (PR) -это уменьшение общего размера опухоли больше, чем на 50%. Среднее время прогрессирования является мерой, которая характеризует продолжительность объективного ответа опухоли.

"Терапевтически эффективную дозу" для лечения опухолей можно также оценить по ее возможности стабилизировать прогрессирование болезни. Способность соединения ингибировать (приостановить) рак можно оценить с помощью животной модели, предсказывающей эффективность на опухолях человека. Альтернативно, это свойство композиции можно оценить, изучив возможность соединения ингибировать клеточный рост или (вызывать) апоптоз с помощью методов исследования in vitro, известных квалифицированным практикам. Терапевтически эффективное количество терапевтического соединения может уменьшить размер опухоли или иным образом улучшить симптомы у субъекта. Специалист в данной области будет способен определить такие количества, исходя из таких факторов, как размер субъекта, тяжесть симптомов у субъекта и выбранной конкретной композиции или способа введения.

Композиция должна быть стерильной и текучей до такой степени, чтобы ее можно было ввести с помощью шприца. Кроме воды, носитель может быть изотоническим, забуференным солевым раствором, этанолом, полиолом (например, глицерином, пропиленгликолем и жидким полиэтиленгликолем и т.п.) и их подходящими смесями. Надлежащую текучесть можно сохранить, например, используя покрытия, такие как лецитин, сохраняя желательный размер частиц в случае дисперсии и используя поверхностно-активные вещества. Во многих случаях предпочтительным является включение в композицию изотонических средств, таких как, сахара, полиспирты, такие как маннитол, сорбитол или хлорид натрия. Продолжительное всасывание инъецируемых композиций может достигаться включением в композицию средства, задерживающего всасывание, например, алюминия моностеарата и желатина.

Когда активное соединение соответствующим образом защищено (предохранено), как описано выше, соединение можно вводить перорально, например, с инертным разбавителем или усвояемым съедобным носителем.

IV. Применение и способы изобретения

Антитела (включая иммуноконъюгаты, биспецифические/мультиспецифические молекулы, композиции и другие производные, описанные здесь) настоящего изобретения имеют многочисленные возможности терапевтического применения, касающиеся лечения нарушений, затрагивающих клетки, экспрессирующие CLDN6 и характеризующиеся соединением CLDN6 с клеточной поверхностью. Например, антитела могут быть введены в клетки в культуре, например, in vitro или ex vivo, или субъекту-человеку, например, in vivo, с целью лечить или предотвратить целый ряд нарушений, таких как описанные здесь. Предпочтительные субъекты включают пациентов-людей, имеющих нарушения, которые можно скорректировать или улучшить, уничтожив пораженные болезнью клетки, в частности, клетки, характеризующиеся измененной экспрессией CLDN6 и/или измененным соединением CLDN6 с клеточной поверхностью по сравнению с нормальными клетками.

Например, в одном варианте осуществления антитела настоящего изобретения можно использовать для лечения субъекта с онкогенным нарушением, например, нарушением, характеризующимся наличием опухолевых клеток, экспрессирующих CLDN6 и характеризующихся соединением CLDN6 с клеточной поверхностью. Примеры онкогенных болезней, которые можно лечить и/или предотвратить, включают все виды рака, экспрессирующие CLDN6, и опухолевые формы, включая, описанные здесь.

Фармацевтические композиции и способы лечения, описанные согласно изобретению, также могут использоваться для иммунизации или вакцинации с целью предотвратить болезнь, описанную здесь.

В других вариантах осуществления антитела изобретения могут использоваться для установления уровней CLDN6 или конкретных форм CLDN6, или уровней клеток, содержащих CLDN6 на поверхности мембран, причем затем уровни можно связать с определенными болезнями или симптомами болезней, таких как описанные выше. Альтернативно, антитела можно использовать для истощения или влияния на функционирование клеток, экспрессирующих CLDN6 и характеризующихся соединением CLDN6 с клеточной поверхностью, показывая тем самым, что эти клетки являются важными посредниками болезни. Это может достигаться путем контактирования образца и контрольного образца с анти-CLDN6 антителом при условиях, допускающих образование комплекса между антителом и CLDN6. Любые образованные антителом и CLDN6 комплексы обнаруживают и сравнивают в образце и в контрольном образце, т.е. эталонном образце.

В начале антитела изобретения можно протестировать относительно их активности связывания, соотносимой с терапевтическим или диагностическим применением in vitro. Например, антитела можно протестировать с помощью проточной цитометрии, как описано здесь. Антитела изобретения можно использовать для выявления in vivo или in vitro одной или более из следующих биологических активностей: ингибировать рост и/или дифференцировку клеток, экспрессирующих CLDN6 и характеризующихся соединением CLDN6 с клеточной поверхностью; уничтожать клетки, экспрессирующие CLDN6 и характеризующиеся соединением CLDN6 с клеточной поверхностью; опосредовать фагоцитоз или ADCC клеток, экспрессирующих CLDN6 и характеризующихся соединением CLDN6 с клеточной поверхностью, в присутствии эффекторных клеток; опосредовать CDC клеток, экспрессирующих CLDN6 и характеризующихся соединением CLDN6 с клеточной поверхностью, в присутствии комплемента; опосредовать апоптоз клеток, экспрессирующих CLDN6 и характеризующихся соединением CLDN6 с клеточной поверхностью; индуцировать гомотопическую адгезию и/или вызывать перемещение в липидные «плоты» после связывания CLDN6.

В отдельном варианте осуществления антитела используются in vivo или in vitro для того, чтобы лечить, предотвратить или диагностировать ряд болезней, связанных с CLDN6. Примеры болезней, связанных с CLDN6, включают, в числе других, типы рака, такие как описанные здесь.

Как описано выше, анти-CLDN6 антитела изобретения могут быть введены совместно с одним или более другими терапевтическими средствами, например, цитотоксическим средством, радиотоксическим средством, антиангиогенным средством или и иммуносупрессорным средством, чтобы уменьшить индукцию иммунных ответов против антител изобретения. Антитело может быть связанным со средством (как иммунокомплекс) или может вводиться отдельно от средства. В последнем случае (отдельное введение) антитело может быть введено до, после или одновременно со средством или может быть введено совместно с другими известными методами лечения, например, противораковой терапией, например, облучением. Такие терапевтические средства включают, среди прочих, анти-неопластические средства, как перечисленные выше. Совместное введение aнти-CLDN6 антител настоящего изобретения с химиотерапевтическими средствами предоставляет два противораковых средства, действующих с помощью разных механизмов, оказывающих цитотоксический эффект на опухолевые клетки. Такое совместное введение может решить проблемы, связанные с развитием резистентности к лекарственным средствам или изменением антигенности опухолевых клеток, когда они не вступают в реакцию с антителом.

Композиции (например, антитела, мультиспецифические и биспецифические молекулы и иммуноконъюгаты) изобретения, имеющие сайты связывания комплемента, такие как части IgGl, -2 или -3 или IgM, которые связывают комплемент, также могут использоваться в присутствии комплемента. В одном варианте осуществления обработка ex vivo популяции клеток, содержащих клетки-мишени, связывающим средством изобретения и соответствующих эффекторных клеток может дополняться добавлением комплемента или сыворотки, содержащей комплемент.Фагоцитоз клеток-мишеней, покрытых связывающим агеном изобретения, может быть улучшен связыванием белков комплемента. В другом варианте осуществления клетки-мишени, покрытые композициями изобретения, также могут быть лизированы комплементом. В еще одном варианте осуществления композиции изобретения не активируют комплемент.

Кроме того, композиции изобретения также могут быть введены вместе с комплементом. Соответственно, в рамках изобретения находятся композиции, содержащие антитела, мультиспецифические или биспецифические молекулы и сыворотку или комплемент.Эти композиции выгодны тем, что комплемент располагается в непосредственной близости к антителам, мультиспецифическим или биспецифическим молекулам.

Альтернативно, антитела, мультиспецифические или биспецифические молекулы изобретения и комплемент или сыворотка могут быть введены отдельно. Связывание композиций настоящего изобретения с клетками-мишенями может вызвать перемещение комплекса CLDN6 антиген-антитело в липидные «плоты» клеточной мембраны. Такое перемещение создает высокую плотность комплексов антиген-антитело, что может эффективно активировать или усилить CDC.

Кроме того, в рамках настоящего изобретения находятся наборы, содержащие композиции антител изобретения (например, антитела и иммуноконъюгаты) и инструкции по их применению. Набор может дополнительно содержать один или более дополнительных реагентов, таких как иммуносупрессорное средство, цитотоксическое средство или радиотоксическое средство, или одно или более дополнительных антител изобретения (например, антитело, имеющее комплементарную активность).

Соответственно, пациентам, которых лечат композициями антител изобретения, дополнительно может вводиться (до, одновременно или после введения антитела изобретения) другое терапевтическое средство, такое как цитотоксическое или радиотоксическое средство, усиливающее или повышающее терапевтический эффект антител изобретения.

В других вариантах осуществления субъекта можно дополнительно лечить средствами, модулирующими, например, усиливающими или ингибирующими, экспрессию и активность Fc-гамма или Fc-альфа рецепторов, например, лечить субъекта цитокинами. Предпочтительные цитокины включают гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (G-CSF), гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF), интерферон-γ (IFN-γ) и фактор некроза опухолей (TNF). Другими важными средствами для повышения терапевтической эффективности антител и фармацевтических композиций, описанных здесь, являются β-глюканы, представляющие собой гомополисахариды разветвленных остатков глюкозы и продуцируемые целым рядом растений и микроорганизмов, например, бактериями, водорослями, грибами, дрожжами и хлебными злаками. Также могут использоваться фрагменты β-глюканов, продуцируемых организмами. Предпочтительно β-глюкан является полимером β(1,3) глюкозы, в котором, по меньшей мере, некоторые из глюкозных единиц остова, например, 3-6% глюкозных остатков остова, имеют ветви, такие как β-(1,6) ответвления.

В отдельном варианте осуществления изобретение предоставляет способы обнаружения наличия CLDN6 антигена в образце, или измерения количества CLDN6-антигена, включающие контактирование образца и контрольного образца с антителом, которое специфически связывается с CLDN6, при условиях, допускающих образование комплекса между антителом или его частью и CLDN6. Затем определяется образование комплекса, при этом различие между образованием комплекса в образце по сравнению с контрольным образцом служит признаком наличия CLDN6-антигена в образце.

В другом варианте осуществления изобретение предоставляет способ определения наличия или определения количества клеток, экспрессирующих CLDN6 и характеризующихся соединением CLDN6 с клеточной поверхностью in vivo или in vitro. Способ включает (i) введение субъекту композиции изобретения, соединенной с обнаружимым маркером, и (ii) проведение обнаружения у субъекта указанного обнаружимого маркера с помощью средств обнаружения, чтобы установить области, содержащие клетки, экспрессирующие CLDN6 и характеризующиеся соединением CLDN6 с клеточной поверхностью. Описанные выше способы являются пригодными, в частности, для диагностирования болезней, связанных с CLDN6, и/или локализации болезней, связанных с CLDN6, таких как раковые болезни. Предпочтительно количество CLDN6 в образце, более высокое, чем количество CLDN6 в контрольном образце, служит признаком наличия болезни, связанной с CLDN6, у субъекта, в частности человека, от которого получен данный образец.

При использовании в описанных выше способах описанное здесь антитело может быть предоставлено с меткой, функционирующей чтобы: (i) предоставить обнаружимый сигнал; (ii) взаимодействовать со второй меткой, чтобы модифицировать обнаружимый сигнал, предоставляемый первой или второй меткой, например, FRET (флуоресцентный резонансный перенос энергии); (Hi) влиять на подвижность, например, электрофоретическую подвижность, с помощью заряда, гидрофобности, формы или других физических параметров, или (iv) обеспечить захват частицы, например, аффинность (сродство), антител о/антиген или ионное комплексообразование. Подходящими в качестве метки являются такие структуры, как флуоресцентные метки, люминесцентные метки, хромофорные метки, радиоизотопные метки, изотопные метки, предпочтительно стабильные изотопные метки, изобарные метки, ферментные метки, метки в виде частиц, в частности металлических частиц, магнитных частиц, полимерных частиц, небольшие органические молекулы, такие как биотин, лиганды рецепторов или связывающие молекулы, такие как белки клеточной адгезии или лектины, меченые последовательности, содержащие нуклеиновокислотные и/или аминокислотные остатки, которые можно обнаружить, используя связывающие агенты, и т.д. Метки включают, без ограничения, сульфат бария, йоцетамовую кислоту, иопаноевую кислоту, иподат кальция, натрия диатризоат, меглумин диатризоат, метризамид, натрия тиропаноат и радиодиагностические, включая излучатели позитронов, такие как фтор-18 и углерод-11, гамма-излучатели, такие как иод-123, технеций-99m, иод-131 и индий-111, нуклиды для ядерного магнитного резонанса, такие как фтор и гадолиний.

В другом варианте осуществления иммуноконъюгаты изобретения могут использоваться для нацеливания соединений (например, терапевтических средств, меток, цитотоксинов, радиотоксинов, иммуносупрессоров и т.д.) на клетки, имеющие CLDN6, соединенный с поверхностью, путем связывания таких соединений с антителом. Таким образом, изобретение также предоставляет способы локализации ex vivo или in vitro клеток, экспрессирующих CLDN6 и характеризующихся соединением CLDN6 с клеточной поверхностью, например, циркулирующих опухолевых клеток.

Настоящее изобретение дополнительно проиллюстрировано с помощью следующих примеров, которые не следует истолковывать как ограничивающие рамки изобретения.

Примеры

Использованные здесь процедуры и методы описываются и осуществляются по существу известным способом и как описано, например, в Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. Все методы, включая использование наборов и реагентов, осуществляются в соответствии с инструкциями производителя, если специально не указано иное.

Пример 1. Количественное определение экспрессии CLDN6 в нормальных тканях, раковых тканях и линиях клеток при помощи ПЦР с обратной транскрипцией в масштабе реального времени (RT-ПЦР)

Общую клеточную РНК экстрагировали из замороженных образцов ткани и линий раковых клеток при помощи набора RNeasy Mini Kit (Qiagen), гибридизовали (primed with) dT₁₈ олигонуклеотидом и подвергали реакции обратной транскрипции с Superscript II (GIBCO/Lifetech) в соответствии с рекомендациями производителя. Целостность полученной кДНК проверяли путем амплификации транскриптов р53 в течение 30 циклов ПЦР. После нормирования по HPRT количественно определили экспрессию CLDN6 с помощью вычисления ΔΔСТ.

Был протестирован каждый нормальный тип ткани от трех индивидуумов. В нормальных тканях можно было обнаружить только следовые количества транскриптов CLDN6 после проведения 40 циклов RT-ПЦР. Единственной нормальной тканью, незначительно превосходящей минимальную экспрессию, была плацента.

В отличие от нормальных тканей, высокая экспрессия CLDN6 была обнаружена в образцах карциномы яичника (аденокарциномы), рака легких (NSCLC, с самой высокой частотой и уровнями экспрессии в аденокарциноме), рака желудка, рака молочной железы, рака печени, рака поджелудочной железы, рака кожи (базальноклеточная карцинома и плоскоклеточная карцинома), злокачественной меланомы, рака головы и шеи (злокачественная плеоморфная аденома), саркомы (синовиальная саркома и карциносаркома), рака желчных протоков, почечноклеточного рака (светлоклеточная карцинома и папиллярная карцинома), рака матки и раковых клеточных линий А2780 (карцинома яичника), NIH-OVCAR3 (карцинома яичника), НСТ-116 (рак толстого кишечника), EFO-27 (карцинома яичника), CPC-N (SCLC), NCI-H552 (NSCLC), SNU-1 (рак желудка), КАТОIII (рак желудка), YAPC (рак поджелудочной железы), AGS (рак желудка), FU97 (рак желудка), MKN7 (рак желудка).

Пример 2. Количественное определение экспрессии CLDN6 в нормальных тканях, тканях рака и линиях клеток с помощью Вестерн-блоттинга

Для Вестерн-блоттинга использовали 20 мкг общего белка, выделенного из клеток, лизированных с помощью лизирующего буфера Лэмли. Экстракты разводили в восстанавливающем буфере для образца (Roth), проводили SDS-PAGE и потом переносили электроблоттингом на PVDF-мембрану (Pall). Иммуноокрашивание проводили с использованием поликлональных антител к CLDN6 (ARP) и бета-актину (Abcam) с последующим обнаружением первичных антител с помощью коньгированных с пероксидазой хрена козьих антимышиных и козьих антикроличьих вторичных антител (Dako).

Был протестирован лизат каждой нормальный ткани от пяти индивидуумов. Экспрессия белка CLDN6 не была обнаружена ни в одной из исследованных нормальных тканей. В отличие от нормальных тканей, высокая экспрессия белка CLDN6 была обнаружена в образцах карциномы яичника и рака легкого. Экспрессия CLDN6 была обнаружена в NIH-OVCAR3 (карцинома яичника), MKN7 (рак желудка), AGS (рак желудка), CPC-N (SCLC), НСТ-116 (рак толстой кишки), FU97 (рак желудка), NEC8 (эмбриональная карцинома яичка), JAR (плацентарная хориокарцинома), JEG3 (плацентарная хориокарцинома), BEWO (плацентарная хориокарцинома) и РА-1 (тератокарцинома яичника).

Пример 3. Иммуногистохимический (IHC) анализ экспрессии CLDN6 в нормальных тканях и раковых тканях

Срезы тканей (4 мкм), заключенных в парафин, инкубировали в течение 1 часа при 58°С на платформе с подогревом (HI 1220, Leica). Парафин удаляли из срезов, инкубируя срезы в Roticlear (Roth) в течение 2×10 минут при комнатной температуре. Потом срезы регидратировали в наборе спиртов со ступенчатой концентрацией (99%, 2×96%, 80% и 70%, 5 минут в каждом). Извлечение антигена осуществляли кипячением микроскопических препаратов (слайдов) при 120°С (15 psi) в течение 15 минут в 10 мМ цитратном буфере (рН 6,0) +0,05% Твин-20. Сразу после кипячения препараты инкубировали в PBS в течение 5 минут.Активность эндогенной пероксидазы блокировали 0,3%) пероксидом водорода в МеОН в течение 15 минут при комнатной температуре. Чтобы избежать неспецифического связывания, препараты блокировали 10% козьей сывороткой в PBS в течение 30 минут при комнатной температуре. После этого, препараты инкубировали с CLDN6-специфическими поликлональными антителами (1 мкг/мл) (ARP) в течение ночи при 4°С.На следующий день препараты промыли PBS при комнатной температуре (3×5 минут) и инкубировали со 100 мкл вторичных антител (PowerVision поли HRP-анти-кролик IgG, готовые к использованию (ImmunoLogic)) в течение 1 часа при комнатной температуре. После этого, препараты промыли PBS при комнатной температуре (3×5 минут). Окончательное окрашивание проводили, используя набор VECTOR NovaRED Substrate Kit SK-4800 от Vector Laboratories (Burlingame). Срезы докрашивали гематоксилином в течение 90 сек при комнатной температуре. После обезвоживания в наборе спиртов с увеличивающейся концентрацией (70%, 80%, 2×96% и 99%, 5 минут в каждом) и 10 минутной инкубации в ксилоле препараты покрывали с помощью набора X-tra Kit (Medite Histotechnic).

Экспрессия белка CLDN6 не была обнаружена в нормальных тканях легкого, яичника, желудка, толстой кишки, поджелудочной железы, печени, двенадцатиперстной кишки или почки. В отличие от нормальных тканей, сильное или, по меньшей мере, значительное окрашивание наблюдалось в срезах пораженных тканей, таких как ткани с карциномой яичника, раком легкого, раком кожи, раком поджелудочной железы, раком желудка, раком молочной железы, раком мочевого пузыря (переходно-клеточная карцинома), раком шейки матки, раком яичка (семинома) и раком матки. Отчетливо акцентированное окрашивание наблюдалось на плазматических мембранах эпителиальных клеток злокачественной популяции, тогда как прилежащие стромальные и незлокачественные эпителиальные клетки не окрашивались. Эти результаты показывают, что белок CLDN6 располагается на плазматической мембране злокачественных клеток.

Пример 4. Получение мышиных антител к CLDN6

а. Получение векторов экспрессии, кодирующих полноразмерный CLDN6 и фрагменты CLDN6

Искусственная кодон-оптимизированная последовательность ДНК (SEQ ID NO: 3), кодирующая полноразмерный CLDN6 (NCBI регистрационный номер NP_067018.2, SEQ ID NO: 2), была получена с помощью химического синтеза (GENEART AG, Германия) и клонирована в вектор pcDNA3.1/myc-His (Invitrogen, США), давая вектор р3953. Вставка стоп-кодона давала возможность экспрессии белка CLDN6 без соединения с вектором, кодирующим myc-His tag. Экспрессию CLDN6 проверили с помощью Вестерн-блоттинга, проточной цитометриии и иммунофлуоресцентного анализа с использованием коммерчески доступных анти-CLDN6 антител (ARP, 01-8865; R&D Systems, МАВ3656).

Кроме того, была получена кодон-оптимизированная последовательность ДНК (SEQ ID NO: 4), кодирующая предполагаемый внеклеточный фрагмент домена 2 (ЕС2) CLDN6 (SEQ ID NO: 6) при объединении с N-концевой Ig каппа лидерной последовательностью, полученной от сигнального пептида, а потом 4 дополнительными аминокислотами, чтобы обеспечить соответствующий участок рестрикции сигнальной пептидазы (SEQ ID NO: 5), и клонирована в pcDNA3.1/myc-His вектор, давая вектор р3974. До иммунизации экспрессия фрагмента ЕС2 была подтверждена с помощью иммунофлуоресцентной микроскопии на транзиентно трансфицированных и фиксированных параформальдегидом (PFA) клетках СНО-К1 с помощью коммерчески доступных анти-myc антител (Cell Signaling, МАВ 2276).

b. Получение клеточных линий, стабильно экспрессирующих CLDN6 Клеточные линии НЕК293 и P3X63Ag8U.l, стабильно экспрессирующие CLDN6, были получены с помощью стандартных методов с использованием вектора р3953.

c. Иммунизация.

Мышей Balb/c иммунизировали 25 мкг плазмидной ДНК р3974 вместе с 4 мкл PEI-маннозы (PEI-Man; in vivo-jetPEI™-Man от компании PolyPlus Transfection) (150 мМ PEI-Мап в Н₂О с 5% глюкозы) путем внутрибрюшинной инъекции в 0, 16 и 36 дни. В день 48 и день 62 мышей иммунизировали путем внутрибрюшинной инъекции миеломными клетками P3X63Ag8U.l, трансфицированными вектором р3953 для стабильной экспрессии CLDN6. Клетки, введенные на 62 день, до инъекции облучали 3000 рад. Наличие антител против CLDN6 в сыворотке мышей контролировали с помощью иммунофлуоресцентной микроскопии между днями 20 и 70, используя СНО-К1 клетки, ко-трансфицированные нуклеиновыми кислотами, кодирующими CLDN6 и GFP. Для этого через 24 часа после трансфекции PFA-фиксированные или нефиксированные клетки инкубировали с сывороткой от иммунизированных мышей при разведении 1:100 в течение 45 минут при комнатной температуре (RT). Клетки промыли, инкубировали с мечеными А1еха555 антимышиными Ig антителами (Molecular Probes) и исследовали с помощью флуоресцентной микроскопии.

В образцах сыворотки, полученной от мыши, на основе которой была получена гибридома F3-6C3-H8, были обнаружены aнти-CLDN6 специфические антитела; см. фиг.2.

Для получения моноклональных антител мышей с обнаруженными анти-CLDN6 иммунными ответами стимулировали за четыре дня до спленэктомии с помощью внутрибрюшинной инъекции 2×10⁷ клеток НЕК293, стабильно трансфицированных вектором р3953.

d. Получение гибридом, продуцирующих мышиные моноклональные антитела к CLDN6

Спленоциты (6×10⁷), выделенные из иммунизированной мыши, были соединены с клетками (3×10⁷)миеломы мышей P3X63Ag8.653 (АТСС, CRL 1580) с помощью PEG 1500 (Roche, CRL 10783641001). Клетки высевали приблизительно 5×10⁴ клеток на лунку в титрационные микропланшеты с плоским дном и культивировали примерно в течение двух недель в селективной среде RPMI, содержащей 10% инактивированной нагреванием эмбриональной телячьей сыворотки, 1% добавки для роста клеток (hybridoma fusion and cloning supplement) (HFCS, Roche, CRL 11363735), 10 мМ HEPES, 1 мМ пирувата натрия, 4,5% глюкозы, 0,1 мМ 2-меркаптоэтанол, 1 х пенициллин/стрептомицин и 1 х HAT добавки (Invitrogen, CRL 21060). Через 10-14 дней отдельные лунки скринировали с помощью проточной цитометриии на анти-CLDN6 моноклональные антитела. Секретирующие антитела гибридомы были субклонированы методом серийных разведений и снова протестированы на анти-CLDN6 моноклональные антитела. Стабильные субклоны культивировали в среде для культуры ткани, чтобы получить небольшие количества антител для характеристики. От каждой гибридомы был выбран, по меньшей мере, один клон, который сохранил реакционную способность материнских клеток (проверенную с помощью проточной цитометрии). Для каждого клона были созданы панели из девяти ампул, которые хранили в жидком азоте.

Пример 5. Характеристики связывания супернатантов, полученных от гибридом, и моноклональных антител.

а. Контроль качества временно трансфицированных клеток НЕК293Т с помощью (I) Вестерн-блоттинга и (ii) проточной цитометрии

(i) Клетки НЕК293Т были трансфицированы нуклеиновыми кислотами, кодирующими CLDN3, CLDN4, CLDN6, и CLDN9, соответственно, или фиктивно-трансфицированы. Экспрессию CLDN3, CLDN4, CLDN6 или CLDN9 в клетках НЕК293Т определяли с помощью Вестерн-блоттинга. Для этого клетки собирали через 24 часа после трансфекции и лизировали. Лизат подвергали ДСН-электрофорезу (SDS-PAGE), переносили на нитроцеллюлозную мембрану и окрасили aнти-CLDN3 (A) (Invitrogen, 34-1700), анти-CLDN4(А) (Zymed, 32-9400), aнти-CDLN6(A) (ARP, 01-8865) или анти-CLDN6(А) (Santa Cruz, sc-17672) антителами, которые специфически связывались с С-концом соответствующего клаудина в денатурирующих условиях. После инкубирования с мечеными пероксидазой вторичными антителами и проявления реагентом ECL использовали краситель LAS-3000 (Fuji) для визуализации. Полосы предполагаемых молекулярных весов CLDN3, CLDN4, CLDN6 и CLDN9, соответственно, наблюдались только в трансфицированных клетках, но не в контрольных клетках (фиг.3), показывая, что клетки НЕК293Т не экспрессируют эндогенно какой-либо из исследованных клаудинов и, таким образом, являются подходящим инструментом для определения перекрестной реактивности CLDN6-антител.

(ii) Клетки НЕК293Т из (i) были дополнительно проанализированы методом проточной цитометрии с использованием aнти-CLDN-антител, распознающих нативные эпитопы (aнти-CLDN3 IgG2a мыши (R&D, МАВ4620), анти-CLDW IgG2a мыши (R&D, МАВ4219), aHTH-CLDN6 IgG2b мыши (R&D, МАВ3656)). Антитела, полученные от компании Sigma под серийными номерами М9144 и М8894, служили в качестве контролей изотипа. Специфичность этих анти-CLDN-антител была проанализирована при помощи клеток НЕК293Т, временно трансфицированных нуклеиновыми кислотами, кодирующими CLDN3, CLDN4, CLDN6, и CLDN9, соответственно. Aнти-CLDN6 антитела проявляли перекрестную реактивность к CLDN3, CLDN4 и CLDN9. Aнти-CLDN4 антитела проявляли перекрестную реактивность к CLDN3, CLDN6 и CLDN9. Aнти-CLDN3 антитела специфически связывались с CLDN3 (фиг.4).

b. Определение специфичности моноклональных антител, полученных согласно изобретению, с помощью проточной цитометрии

Клетки НЕК293Т были ко-трансфицированы вектором, кодирующим разные белки CLDN, и вектором, кодирующим флуоресцентный маркер. Через 24 часа после трансфекции клетки собрали при помощи 0,05% раствора трипсин/ЭДТА и промыли буфером FACS (PBS, содержащим 2% FCS и 0,1% азида натрия). Клетки перенесли в титрационные микропланшеты с U-образным дном в количестве 2×10⁵ клеток на лунку и инкубировали в течение 60 минут при 4°С с супернатантами от гибридомы. После промывки буфером FACS (три раза) клетки инкубировали с коньгированными с аллофикоцианином (АРС) анти-мышь IgG 1+2a+2b+3 специфичными вторичными антителами (Dianova, 115-135-164). После этого клетки дважды промыли, а величину связывания оценили методом проточной цитометрии при помощи BD FACSArray (фиг.5). Экспрессию флуоресцентного маркера наносили на ось абсцисс относительно связывания антител по оси ординат.В качестве положительного контроля служили коммерчески доступные aнти-CLDN6 IgG2b антитела мыши (R&D, МАВ3656), а антитела от компании Sigma под серийным номером М8894 служили как контроль изотипа.

Антитела в супернатантах от моноклональных субклонов гибридомы F3-6C3-H2, F3-6C3-H8, F3-6C3-H9, F3-6C3-D8 и F3-6C3-G4, все полученные от гибридомы F3-6C3, были специфичны к CLDN6 и не связывались с CLDN9, CLDN3 и CLDN4. Например, фиг.5А показывает результаты для моноклонального субклона гибридомы F3-6C3-H8. Антитела в супернатантах от моноклонального субклона гибридомы F3-6C3-H8 также связывались с клетками, трансфицированными вариантом (1143V)-SNP CLDN6. Антитела в супернатанте от моноклонального субклона гибридомы F4-4F7-F2 связывались как с CLDN6, так и с CLDN9 (фиг.5А). Антитела в супернатанте от моноклонального субклона гибридомы F3-7B3-B4 связывались с CLDN6, CLDN3 и CLDN9 (фиг.5В). Антитела в супернатанте от моноклонального субклона гибридомы F3-3F7-A5 связывались с CLDN6, CLDN4 и CLDN9 (фиг.5 В).

Пример 6: Получение и тестирование моноклональных антител к CLDN6

a. Получение вектора экспрессии, кодирующего внеклеточный домен CLDN6

Кодон-оптимизированная последовательность ДНК (SEQ ID NO: 12), кодирующая предполагаемый внеклеточный фрагмент домена 1 (ЕС1) CLDN6 (SEQ ID NO: 7), объединенная с N-концевой Ig каппа лидерной последовательностью, полученной от сигнального пептида, а потом 4 дополнительными аминокислотами, чтобы обеспечить соответствующий участок рестрикции сигнальной пептидазы (SEQ ID NO: 13), была получена и клонирована в pcDNA3.1/myc-His вектор, давая вектор р3973. До иммунизации экспрессия фрагмента ЕС1 была подтверждена с помощью иммунофлуоресцентной микроскопии на временно трансфицированных и фиксированных параформальдегидом (PFA) клетках СНО-К1 с помощью коммерчески доступных анти-myc антител (Cell Signaling, МАВ 2276).

b. Иммунизация

Мышей Balb/c иммунизировали 25 мкг плазмидной ДНК р3973 вместе с 4 мкл PEI-маннозы (PEI-Man; in vivo-jetPEI™-Man от компании PolyPlus Transfection) (150 мМ PEI-Маn в Н₂О с 5% глюкозы) с помощью внутрибрюшинной инъекции в 0 и 14 дни. На 28 и 44 дни мышей иммунизировали подкожно KLH-конъюгированными пептидами SEQ ID NO: 14 и SEQ ID NO: 15 (100 мкг каждого в PBS, JPT Peptide Technologies GmbH, Германия) вместе с очищенным при помощи ВЭЖХ PTO-CpG-ODN (25 мкг в PBS; 5'-TCCATGACGTTCCTGACGTT; Eurofins MWG Operon, Германия). На 64, 77 и 97 дни мышей иммунизировали с помощью внутрибрюшинной инъекции 2×10⁷ P3X63Ag8U.l клеток миеломы, трансфицированных вектором р3953 для стабильной экспрессии CLDN6. Перед введением клетки были обработаны митомицином С (2,5 мкг/мл, Sigma-Aldrich, М4287). На 64 и 97 дни клетки были введены вместе с очищенным при помощи ВЭЖХ PTO-CpG-ODN (50 мкг в PBS), а на 77 день вместе с неполным адъювантом Фрейнда. Для выработки моноклональных антител, мышей с детектируемым анти-СЫЖб иммунным ответом стимулировали за четыре дня до спленэктомии с помощью внутрибрюшинной инъекции 2×10⁷ клеток НЕК293, стабильно трансфицированных вектором р3953.

c. Тестирование моноклональных антител к CLDN6 Проточная цитометрия

Для тестирования связывания моноклональных антител к CLDN6 и его гомологам, клетки НЕК293Т были временно трансфицированы соответствующей кодирующей клаудин плазмидой, при этом экспрессию анализировали проточной цитометрией. Чтобы различить трансфицированные и нетрансфицированные клетки, клетки НЕК293Т были котрансфицированы флуоресцентным маркером в качестве репортера. Через 24 часа после трансфекции клетки собирали с помощью 0,05% трипсин/EDTA, промывали буфером FACS (PBS, содержащий 2% FCS и 0,1% азида натрия) и ресуспендировали в FACS-буфере в концентрации 2×10⁶ клеток/мл. 100 мкл клеточной суспензии инкубировали с соответствующими антителами в указанных концентрациях в течение 30 минут при 4°С.Антитела, обладающие перекрестной реакционной способностью, использовали для детекции экспрессии CLDN6 и CLDN9. Коммерчески доступные мышиные анти-клаудин антитела aнти-CLDN3 (R&D, МАВ4620) и анти-CLDN4 (R&D, МАВ4219) служили в качестве положительного контроля, тогда как мышиные IgG2a (Sigma, М9144) и IgG2b (Sigma, М8894), соответственно, служили как контроль изотипа. Клетки трижды промывали FACS-буфером и инкубировали с АРС-конъюгированными анти-мышь IgG 1+2a+2b+3a специфическими вторичными антителами (Dianova, 115-135-164) в течение 30 минут при 4°С.Клетки дважды промывали и ресуспендировали в FACS-буфере. Связывание анализировали при помощи проточной цитометрии с использованием BD FACSArray. Экспрессию флуоресцентного маркера наносили на график по оси абсцисс против связывания антитела по оси ординат.

CDC

Комплемент-зависимую цитотоксичность (CDC) определяли путем измерения содержания внутриклеточного АТФ в нелизированных клетках после добавления человеческого комплемента к клеткам-мишеням, инкубированным с aнти-CLDN6 антителами. Для измерения АТФ использовали люминесцентную реакцию люциферазы, как очень чувствительный аналитический метод.

Клетки СНО-К1, стабильно трансфицированные CLDN6 (CHO-K1-CLDN6), собирали с помощью 0,05% трипсин/EDTA, дважды промывали средой Х-Vivo 15 (Lonza, BE04-418Q) и ресуспендиировали в концентрации 1×10⁷ клеток/мл в среде Х-Vivo 15. 250 мкл клеточной суспензии переносили в 0,4 см кювету для электропорации и смешивали с 7 мкг in vitro транскрибированной РНК, кодирующей люциферазу (luciferase IVT RNA). Клетки электропорировали при 200 В и 300 мкФ при помощи Gene Pulser Xcell (Bio Rad). После электропорации клетки ресуспендировали в 2,4 мл теплой среды D-MEM/F12 (1:1) с GlutaMax-I (Invitrogen, 31331-093), содержащей 10% (об./об.) FCS, 1% (об./об.) пенициллина/стрептомицина и 1,5 мг/мл G418. Высевали 50 мкл клеточной суспензии на лунку в прозрачный 96-луночный РР-планшет и инкубировали при 37°С и 7,5% СО₂.Через 24 часа после электропорации к клеткам добавляли 50 мкл моноклональных мышиных анти-CLDN6 антител в 60% RPMI (содержащем 20 мМ HEPES) и 40%) человеческой сыворотки (смесь сывороток, полученная от шести здоровых доноров) при определенных концентрациях. 10 мкл 8% (об./об.) Тритона Х-100 в PBS на лунку добавили к контролям общего лизиса, тогда как к контролям максимума жизнеспособных клеток и к текущим образцам добавили 10 мл PBS на лунку. После инкубации в течение 80 минут при 37°С и 7,5% СО₂ добавили 50 мкл люцифериновой смеси (3,84 мг/мл D-люциферина, 0,64 U/мл АТФазы и 160 мМ HEPES в ddH₂О) на лунку. Планшет инкубировали в темноте в течение 45 мин при комнатной температуре. Люминесценцию измеряли с помощью люминометра (Infinite М200, TECAN). Результаты даны в виде интегрированных численных относительных световых единиц (RLU).

Клетки NEC8 электропорировали при 200 В и 400 мкФ и культивировали в RPMI 1640 в среде GlutaMAX-I (Invitrogen, 61870), содержащей 10% (об./об.) FCS.

Специфический лизис вычисляли следующим образом:

Специфический лизис [%]=100 - [(образец - общий лизис) / (максимум жизнеспособных клеток - общий лизис) х 100]

максимум жизнеспособных клеток: 10 мкл PBS, без антител общий лизис: 10 мкл 8% (об./об.) Тритон Х-100 в PBS, без антител

Раннее лечение

Для раннего лечения антителами 2×10⁷ NEC8 клеток в 200 мкл PBS подкожно инокулировали в бок бестимусных мышей Nude-Foxnl^nu. Каждая экспериментальная группа состояла из самок мышей 6-8 недельного возраста. Через три дня после инокуляции в течение 46 дней вводили 200 мкг очищенных мышиных моноклональных антител muMAB 59А, 60A,61D, 64А, 65А, 66В и 67А два раза в неделю с помощью чередующихся внутривенных и внутрибрюшинных инъекций. Экспериментальные группы, обработанные PBS, служили отрицательным контролем. Объем опухоли (TV = (длина х ширина²) /2) измеряли два раза в неделю. TV выражался в мм³, что давало возможность построить кривые роста опухоли в зависимости от времени. Когда опухоль достигала объема больше чем 1500 мм³, мышей забивали,

d. Результаты

Мышиные моноклональные антитела muMAB 59А, 60А, 6ID, 64А, 65А, 66В и 67А показали сильное связывание с человеческим CLDN6 и CLDN6 SNP (одиночный нуклеотидный полиморфизм) вариантом I143V, но не наблюдалось связывания с CLDN3, 4 и 9 (фиг.6).

MuMAB 59А, 60А, 6ID, 64А, 65А, 66В и 67А показали очень низкие значения ЕС50 (ЕС50 200-500. нг/мл), при этом насыщение связывания достигалось при низких концентрациях (фиг.7).

MuMAB 59А, 60А, 6ID, 64А, 65А, 66В и 67А продемонстрировали дозозависимую CDC-активность и вызывали CDC при низких концентрациях (фиг.8). Aнти-CLDN6 антитела muMAB 65А и 66 В вызывали CDC на клетках NEC8 дозозависимым образом (фиг.9). Специфичность к мишени muMAB 65А и 66 В улучшалась при использовании клеток NEC8 LVTS2 54 (CLDN6 нокаутные).

Кроме того, muMAB 59А, 60А, 6ID, 64А, 65А, 66В и 67А показали ингибирование роста опухоли у мышей с привитыми клетками NEC8 (фиг.10).

Пример 7. Получение и тестирование химерных моноклональных антител к CLDN6

а. Получение мышиных/человеческих химерных моноклональных антител

Для химеризации вариабельную область мышиной тяжелой цепи и легкой цепи, включая лидерные последовательности, амплифицировали с помощью ПЦР и праймеров, перечисленных в таблице ниже. Мышиные тяжелые цепи объединили с помощью сайта рестрикции ApaI (5'-GGGCCC-3') с N-концевой частью человеческой цепи Fcгамма1, которая кодируется вектором экспрессии. Вариабельные домены мышиной каппа цепи, включая лидерные последовательности, клонировали впереди константной области с использованием сайта рестрикции BsiWI. Соответствующую ориентацию константной области в векторе, т.е. подходящую для предшествующего промотора вектора, подтвердили секвенированием. Вследствие положения сайта рестрикции ApaI, любая амплификация вариабельной области, включая лидерную последовательность, для этой цели должна включать первые 11 нуклеотидов последовательности человеческой гамма-1 константной области в дополнение к последовательности сайта Apal. Нуклеотидная последовательность человеческой константной области гамма-1 тяжелой цепи числится как SEQ ID NO: 24, аминокислотная последовательность экспрессированной человеческой гамма-1 константной области числится как SEQ ID NO: 25. Нуклеотидная последовательность, кодирующая константную часть каппа легкой цепи, числится как SEQ ID NO: 26, соответствующая аминокислотная последовательность числится как SEQ ID NO: 27.

Таблица 1.
Мышиные линии клеток гибридомы, использованные для клонирования антител
	muMAB	Изотип	Праймер SEQ ID NO:
Тяжелая цепь	64А	IgG2a	17,18
	89А	IgG2a	17,19
	61D	IgG2a	17,20
67А	IgG2a	17,20
Легкая цепь	64А	IgK	21,22
	89А	IgK	21,23
	61D	IgK	21,22
67А	IgK	21,22

В соответствии с мышиными аналогами химерные моноклональные антитела называются, например, chimAB 64А, т.е добавляется префикс "chim".

Амплификация мышиных вариабельных областей легкой и тяжелой цепей, включая лидерные последовательности, проводится согласно методу "step-out ПЦР" описанному в Matz et al. (Nucleic Acids Research, 1999, Vol.27, No. 6). Для этого получают общую РНК из моноклональных гибридомных клеточных линий (см. таблицу 1) стандартными способами, известными специалистам в данной области техники, например, с использованием набора RNeasy Mini Kit (Qiagen). Одноцепочечную кДНК получают согласно методу "переключения матрицы (template-switch)" также описанному в Matz et al. (Nucleic Acids Research, 1999, Vol.27, No. 6, 1558). В дополнение к (dT) 30 олигомеру (SEQ ID NO: 28), она включала ДНК/РНК гибридный олигомер (SEQ ID NO: 29), служащий как 5' адаптор для переключения матрицы во время полимеризации нити кДНК. В этом адапторном олигомере последние три нуклеотида представляли собой рибо- вместо дезоксирибонуклеотидов. Последующая "step-out ПЦР" использовала антисмысловой олигомер, нацеленный на константную область мышиной каппа цепи или на константную область подкласса 2а гамма цепи (SEQ ID NO: 30 и 31, соответственно). Подкласс IgG мышиных моноклональных антител, продуцируемых линией клеток гибридомы, был прежде иммунологически проанализирован при помощи IsoStrip (Roche), и таким образом был выбран соответствующий антисмысловой олигомер (см. таблицу 1). Смесь праймеров служила как смысловой олигомер в "step-out ПЦР", причем она содержала два олигомера, относящиеся к SEQ ID NO: 32 и 33.

Установленные мышиные вариабельные области, включая лидерные последовательности, затем были амплифицированы с помощью ПЦР, не включая 5' UTR и 3' мышиную константную область, с добавлением сайтов рестрикции к концам, которые давали возможность субклонирования в полученные векторы экспрессии, несущие человеческие константные области. Кроме того, смысловые олигомеры, обеспечившие консенсусную последовательность Козак (5'-GCCGCCACC-3') и антисмысловых олигомеров для вариабельных областей тяжелой цепи, включали первые 11 нуклеотидов человеческой гамма-1 константной области в дополнение к сайту рестрикции ApaI (см. таблицу 1, SEQ ID NOs: 17 to 23). Вариабельные области каппа легкой цепи, включая лидерные последовательности, были клонированы с помощью ферментов рестрикции HindIII и BsiWI, вариабельные области гамма тяжелой цепи требовали HindIII и ApaI ферменты рестрикции.

Кроме того, были амплифицированы мышиные вариабельные области легкой и тяжелой цепей, включая лидерные последовательности, и были получены дополнительные химерные моноклональные антитела к CLDN6 в соответствии с протоколом, раскрытым выше.

b. Получение химерных моноклональных анти-CLDN6 антител

Химерные моноклональные антитела временно экспрессировались в клетках НЕК293Т (АТСС CRL-11268), трансфицированных плазмидной ДНК, кодирующей легкую и тяжелую цепи соответствующего антитела. За 24 часа до трансфекции 8×10 клеток высевали на 145 мм чашки для культур клеток и культивировали в 25 мл среды НЕК293Т (DMEM/F12+GlutaMAX-I, 10% FCS, 1% пенициллин/стрептомицин). 20 мкг плазмидной ДНК растворили в 5 мл среды НЕК293Т без добавок на чашку. После добавления 75 мкл линейного полиэтиленимина (PEI) (1 мг/мл) (Polyscience, 23966) (ДНК:РЕI)-смесь инкубировали 15 минут при комнатной температуре. После этого к клеткам добавили смесь для трансфекции по каплям. Через 24 часа после трансфекции НЕК293Т-среду заменили Рrо293а-средой (Lonza, BE12-764Q), содержащей 1% пенициллин/стрептомицина. Для оптимальной экспрессии трансфицированные клетки культивировали при 37°С и 7,5% СО₂ в течение дополнительных 96-120 часов. Супернатант собирали, очищали химерные антитела с помощью FPLC, используя белок-А-колонки. Концентрацию антител определяли при помощи SDS-PAGE.

c. Тестирование химерных моноклональных антител к CLDN6

Проточная цитометрия

Чтобы проверить специфичность и аффинность связывания CLDN6-специфических химерных моноклональных антител с клетками НЕК293, стабильно трансфицированными:CLDN3, 4, 6 или 9, соответственно, линии опухолевых клеток, эндогенно экспрессирующих CLDN6, были исследованы с помощью проточной цитометрии. Для этого клетки собирали 0,05% трипсином/EDTA, промывали FАСS-буфером (PBS содержащий 2% FCS и 0,1% азида натрия) и ресуспендировали в FACS-буфере при концентрации 2×10⁶ клеток/мл. 100 мкл клеточной суспензии инкубировали с соответствующим антителом при указанных концентрациях в течение 60 минут при 4°С.Химерное перекрестно-реактивное антитело (chimAB 5F2D2) использовали для определения экспрессии CLDN6 и CLDN9. Коммерчески доступные мышиные анти-клаудин антитела анти-CLDN3 (R&D, МАВ4620) и анти-CLDN4 (R&D, МАВ4219) служили положительными контролями, тогда как человеческий IgG1-каппа (Sigma, 15154) служил отрицательным контролем. Клетки три раза промывали FACS-буфером и инкубировали в течение 30 минут при 4°С с АРС-конъюгированным козьим анти-человек IgG Fc-гамма (Dianova, 109-136-170) или АРС-конъюгированными анти-мышь IgG 1+2a+2b+3a (Dianova, 115-135-164) специфическими вторичными антителами, соответственно. Клетки два раза промывали и ресуспендировали в FACS-буфере. Связывание анализировали с помощью проточной цитометрии, используя BD FACSArray.

CDC

Комплемент-зависимую цитотоксичность (CDC) определяли путем измерения содержания внутриклеточного АТФ в нелизированных клетках после добавления человеческого комплемента к клеткам-мишеням, инкубированным с aнти-CLDN6 антителами. Для измерения АТФ использовали люминесцентную реакцию люциферазы, как очень чувствительный аналитический метод.

В этом исследовании использовали клетки дикого типа NEC8 (CLDN6 положительные) и NEC8 CLDN6-нокаутные клетки (CLDN6 отрицательные), которые и те и другие были стабильно трансдуцированы конструктом экспрессии люциферазы. Клетки собирали 0,05% трипсином/EDTA и доводили до концентрации 2×10⁵ клеток/мл в RPMI средой GlutaMax-I (Invitrogen, 61870-010), содержащей 10% (об./об.) FCS. 1×10⁴ клеток высевали в прозрачные 96-луночные РР-планшеты и инкубировали в течение 24 часов при 37°С и 5% СО₂.После инкубации к клеткам добавили 50 мкл моноклональных химерных анти-CLDN6-антител в 60% RPMI (содержащем 20 мМ HEPES) и 40% человеческой сыворотки (смесь сывороток, полученная от шести здоровых доноров) при определенных концентрациях. 10 мкл 8% (об./об.) Тритона Х-100 в PBS на лунку добавили к контролям общего лизиса, тогда как к контролям максимума жизнеспособных клеток и к текущим образцам добавили 10 мл PBS на лунку. После инкубации в течение 80 минут при 37°С и 5% СО₂ добавили 50 мкл люцифериновой смеси (3,84 мг/мл D-люциферина, 0,64 U/мл АТФазы и 160 мМ HEPES в ddH₂O) на лунку. Планшет инкубировали в темноте в течение 45 мин при комнатной температуре. Люминесценцию измеряли с помощью люминометра (Infinite М200, TECAN). Результаты даны в виде интегрированных численных относительных световых единиц (RLU).

Специфический лизис вычисляли следующим образом:

Специфический лизис [%]=100 - [(образец - общий лизис) / (максимум жизнеспособных клеток - общий лизис) х 100]

максимум жизнеспособных клеток: 10 мкл PBS, без антител общий лизис: 10 мкл 8% (об./об.) Тритон Х-100 в PBS, без антител ADCC

Антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) определяли путем измерения содержания внутриклеточного АТФ в нелизированных клетках после добавления человеческого РВМС к клеткам-мишеням, инкубированным с aнти-CLDN6 антителами. Для измерения АТФ использовали люминесцентную реакцию люциферазы, как очень чувствительный аналитический метод.

В этом исследовании использовали клетки дикого типа NEC8 (CLDN6 положительные) и NEC8 CLDN6-нокаутные клетки (CLDN6 отрицательные), которые и те и другие были стабильно трансдуцированы конструктом экспрессии люциферазы. Клетки собирали 0,05% трипсином/EDTA и доводили до концентрации 2×10⁵ клеток/мл в RPMI средой GlutaMax-I (Invitrogen, 61870-010), содержащей 10% (об./об.) FCS и 20 мМ Hepes. 1×10⁴ клеток высевали в прозрачные 96-луночные РР-планшеты и инкубировали 4 часа при 37°С и 5% СО₂.

РВМС (мононуклеарные клетки периферической крови) выделяли из образцов человеческой донорской крови центрифугированием в градиенте плотности с использованием Ficoll Hypaque (GE Healthcare, 17144003). Были выделены РМВС, содержащие интерфазу, клетки два раза промывали PBS/EDTA (2 мМ). 1×10⁸ РВМС высевали в 50 мл среды Х-Vivo 15 (Lonza, BE04-418Q), содержащей 5% инактивированной нагреванием человеческой сыворотки (Lonza, US14-402E), и инкубировали в течение 2 часов при 37°С и 5% СО₂.

Через 4 часа после высевания клеток-мишеней (NEC-8) к клеткам добавили 25 мкл моноклональных химерных aнти-CLDN6 антител в PBS в указанных концентрациях. Неприкрепленные РВМС, которые отделились от прикрепленных моноцитов в течение 2 часов инкубации, собрали и отрегулировали концентрацию до 8×10⁶ клеток/мл в среде X-vivo 15. 25 мкл этой клеточной суспензии добавили к клеткам-мишеням и моноклональным химерным aнти-CLDN6 антителам. Планшеты инкубировали в течение 24 часов при 37°С и 5% СО₂.

Через 24 часа инкубации 10 мкл 8% (об./об.) Тритона Х-100 в PBS на лунку добавили к контролям общего лизиса, тогда как к контролям максимума жизнеспособных клеток и к текущим образцам добавили 10 мл PBS на лунку. Добавили 50 мкл люцифериновой смеси (3,84 мг/мл D-люциферина, 0,64 U/мл АТФазы и 160 мМ HEPES в ddH₂О) на лунку. Планшет инкубировали в темноте в течение 30 мин при комнатной температуре. Биолюминесценцию измеряли с помощью люминометра (Infinite М200, TECAN). Результаты даны в виде интегрированных численных относительных световых единиц (RLU).

Специфический лизис вычисляли следующим образом:

Специфический лизис [%]=100 - [(образец - общий лизис)/(максимум жизнеспособных клеток - общий лизис) х 100]

максимум жизнеспособных клеток: 10 мкл PBS, без антител общий лизис: 10 мкл 8% (об./об.) Тритон Х-100 в PBS, без антител

d. Результаты

Aнти-CLDN6 химерные моноклональные антитела chimAB 61D, 64А, 67А и 89А показали сильное связывание с человеческим CLDN6, в то время как связывание с CLDN3, 4 и 9 не наблюдалось (фиг.11).

Что касается связывания с человеческим CLDN6, стабильно экспрессированным на поверхности клеток НЕК293, aнти-CLDN6 химерные моноклональные антитела chimAB 64А и 89А продемонстрировали очень низкие значения ЕС50 (ЕС50 450-600 нг/мл) и насыщение связывания достигалось при низких концентрациях. ChimAB 67А и 61D показали низкое (ЕС50 1000 нг/мл) и среднее (ЕС50 2300 нг/мл) значения ЕС50, соответственно (фиг.12).

Что касается связывания с CLDN6, эндогенно экспрессированным на клетках NEC8, aнти-CLDN6 химерные моноклональные антитела chimAB 64А и 89А продемонстрировали очень низкие значения ЕС50 (ЕС50 600-650 нг/мл), причем насыщение связывания достигалось при низких концентрациях, в то время как chimAB 61D и 67А показали среднее (ЕС50 1700 нг/мл) и высокое (ЕС50 6100 нг/мл) значения ЕС50, соответственно (фиг.13).

Что касается связывания с CLDN6, эндогенно экспрессированным на клетках OV90, анти-CLDN6 химерные моноклональные антитела chimAB 64А и 89А продемонстрировали очень низкие значения ЕС50 (ЕС50 550-600 нг/мл), а насыщение связывания достигалось при низких концентрациях. ChimAB 61D и 67А показали средние значения ЕС50 (ЕС50 1500 нг/мл и ЕС50 2300 нг/мл, соответственно) (фиг.14).

Анти-CLDN6 химерные моноклональные антитела chimAB 61D, 64А, 67А и 89А продемонстрировали дозозависимую CDC-активность на клетках NEC-8 (фиг.15).

Анти-CLDN6 химерные моноклональные антитела chimAB 61D, 64А, 67А и 89А продемонстрировали дозозависимую ADCC-активность на клетках NEC-8 и вызывали ADCC даже при низких концентрациях антител (фиг.16).

Эти результаты показывают специфичность этих химерных моноклональных антител к CLDN6.

Пример 8. Лечение с помощью моноклональных антител к CLDN6

Раннее лечение

Для исследования раннего лечения антителами 2×10⁷ NEC8 клеток в 200 мкл PBS (Gibco) подкожно инокулировали в бок бестимусных мышей Nude-Foxnl^nu. Каждая экспериментальная группа состояла из самок мышей 6-8 недельного возраста. Через три дня после инокуляции в течение семи недель вводили 200 мкг очищенных мышиных моноклональных антител muMAB 89А два раза в неделю с помощью чередующихся внутривенных и внутрибрюшинных инъекций. Экспериментальная группа, обработанная PBS, служила отрицательным контролем. Объем опухоли (TV=(длина х ширина²)/2) измеряли два раза в неделю. TV выражался в мм³, что давало возможность построить кривые роста опухоли в зависимости от времени. Когда опухоль достигала объема больше чем 1500 мм³, мышей забивали.

Лечение на прогрессирующей стадии

Для лечения с помощью антител развитых ксенотрансплантатов опухолей 2×10⁷ клеток NEC8 в 200 мкл среды RPMI (Gibco) подкожно инокулировали в бок самок бестимусных мышей Nude-Foxnl^nu 6-8 недельного возраста. Объем опухоли (TV=(длина х ширина²)/2) измеряли два раза в неделю. TV выражался в мм³, что давало возможность построить кривые роста опухоли в зависимости от времени. Через 15-17 дней после инокуляции клеток опухоли мышей разделили на лечебные группы по восемь животных в группе с однородными размерами опухолей выше 80 мм³. 200 мкг очищенных мышиных моноклональных антител muMAB 61D, 64А, 67А и 89А применяли в течение пяти недель, чередуя внутривенные и внутрибрюшинные инъекции, два раза в неделю. Экспериментальные группы, обработанные PBS и неспецифическими антителами, служили в качестве отрицательных контролей. Когда опухоли достигали объема больше чем 1500 мм, мышей забивали.

На мышиной модели ксенотрансплантата опухоли, привитого линией опухолевых клеток NEC8 было показано, что при раннем лечении мышиными моноклональными антителами muMAB 61D, 64А и 67А, не наблюдалось какого-либо роста опухоли у мышей даже после прекращения иммунотерапии (фиг.17).

На мышиной модели ксенотрансплантата опухоли, привитого линией опухолевых клеток NEC8 было показано, что раннее лечение muMAB 89А вызывает ингибирование роста опухоли, при этом у мышей, которых лечили muMAB89A, в конце исследования опухоль не была обнаружена (фиг.18).

При лечении на прогрессирующей стадии мышиного ксенотрансплантата опухоли, привитого линией опухолевых клеток NEC8, muMAB 64А продемонстрировали ингибирование роста опухоли (фиг.19).

При лечении на прогрессирующей стадии мышиного ксенотрансплантата опухоли, привитого линией опухолевых клеток NEC8, у мышей, которых лечили muMAB 64А, наблюдалось увеличение продолжительности жизни (фиг.20).

При лечении на прогрессирующей стадии мышиного ксенотрансплантата опухоли, привитого линией опухолевых клеток NEC8, ингибирование роста опухоли достигалось с помощью мышиных моноклональных анти-CLDN6 антител muMAB 61D, 67А и 89А (фиг.21).

При лечении на прогрессирующей стадии мышиного ксенотрансплантата опухоли, привитого линией опухолевых клеток NEC8, у мышей, которых лечили CLDN6-специфическими антителами muMAB 6ID или 67А, наблюдалось увеличение продолжительности жизни (фиг.22).

При лечении на прогрессирующей стадии мышиного ксенотрансплантата опухоли, привитого клетками NEC8 дикого типа и клетками NEC8 со стабильным нокаутным CLDN6, muMAB 64А и 89А показали терапевтический эффект только на мышах, привитых клетками NEC8 дикого типа, но не у мышей, привитых NEC8 CLDN6-нокаутными клетками, что показывает CLDN6-специфичность антител in vivo (фиг.23).

Пример 9. Высокоразрешающее картирование эпитопов моноклональных антител к CLDN6

CLDN6 специфические моноклональные антитела показали только очень слабое (при его наличии) связывание с линейными пептидами в ELISA-исследовании картирования эпитопов, подразумевая что их эпитопы являются конформационными. Чтобы проанализировать взаимодействие между антителами, описанными здесь, и CLDN6 в его нативной конформации в качестве метода картирования эпитопов использовали сайтнаправленный мутагенез на культуре клеток млекопитающих. Был проведен аланин-сканирующий мутагенез аминокислот 27-81 и 137-161 в первом и втором внеклеточном домене, соответственно. После транзиентной экспрессии в клетках НЕК293Т, мутанты CLDN6 были оценены по их способности связываться со специфическими моноклональными антителами. Уменьшенное связывание специфических моноклональных антител с CLDN6-мутантом означает, что мутировавшая аминокислота является важным связывающим и/или конформационным остатком. Связывание проанализировали с помощью проточной цитометрии. Для того, чтобы различить трансфицированные и нетрансфицированные клеточные популяции, клетки ко-трансфицировали флуоресцентным маркером.

Аминокислотные остатки CLDN6, являющиеся важными для взаимодействия с CLDN6-специфическими химерными антителами, были методично установлены с помощью сканирования аланином. Мутации аланина и глицина были вызваны с помощью сайтнаправленного мутагенеза (GENEART AG, Германия). Чтобы проверить связывание моноклональных химерных антител с CLDN6 дикого типа и его мутантами, клетки НЕК293Т были транзиентно трансфицированы соответствующей клаудин-кодирующей плазмидой, а экспрессию анализировали с помощью проточной цитометрии. Для того, чтобы различить трансфицированные и нетрансфицированные клетки НЕК293Т клетки ко-трансфицировали флуоресцентным маркером как репортером. Через 24 часа после трансфекции клетки собрали 0,05% трипсином/EDTA; промыли FACS-буфером (PBS, содержащий 2% PCS и 0,1% азид натрия) и ресуспендировали в FACS-буфере при концентрации 2×10⁶ клеток/мл. 100 мкл клеточной суспензии инкубировали с 10 мкг/мл антител в течение 45 минут при 4°С.Коммерчески доступные мышиные aнти-CLDN6 (R&D, МАВ3656) использовали как контроль для определения экспрессии на клеточной поверхности мутантов CLDN6. Клетки три раза промывали FACS-буфером и инкубировали с АРС-конъюгированным козьим анти-человек IgG Fc-гамма (Dianova, 109-136-170) или АРС-конъюгированным анти-мышь IgG 1+2a+2b+3a специфическим вторичным антителом (Dianova, 115-135-164) в течение 30 минут при °С.Клетки промыли два раза и ресуспендировали в FACS-буфере. Связывание с трансфицированной клеточной популяцией анализировали при помощи проточной цитометрии с использованием BD FACSArray. Соответственно, экспрессию флуоресцентного маркера наносили на графике по оси абсцисс против связывания антител по оси ординат.Средняя интенсивность сигнала связывания моноклонального химерного CLDN6-специфического антитела с мутантным CLDN6 была выражена в виде процента от связывания с диким типом. Аминокислоты, необходимые для связывания, не показали связывания после мутирования, в то время как аминокислоты, поддерживающие связывание, показали только уменьшенное связывание по сравнению с диким типом.

Высокоразрешающее картирование эпитопов показало, что аминокислоты F35, G37, S39 и возможно ТЗЗ первого внеклеточного домена CLDN6 являются важными для взаимодействия с CLDN6-специфичными химерными антителами chimAB 61D, 64А, 67А и 89А. Остаток 140 является необходимым для связывания chimAB 89А, и он способствует связыванию chimAB 61D и 67А. Кроме того, LI51 второго внеклеточного домена CLDN6 является важным для взаимодействия с chimAB 67А (фиг.24).

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> ЖЕНЕНТЕК и др.

<120> Модуляция дегенерации аксона

<130> 50474/020WO4

<150> 61/254,190

<151> 2009-10-22

<160> 17

<170> Patent In версия 3.5

<210> 1

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Ингибирующая последовательность нуклеиновой кислоты

<400> 1

gcactgaatt ggacaactct t 21

<210> 2

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Ингибирующая последовательность нуклеиновой кислоты

<400> 2

gagttgtcca attcagtgct t 21

<210> 3

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Ингибирующая последовательность нуклеиновой кислоты

<400> 3

ggacatcgcc tccgctgatt t 21

<210> 4

2

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Ингибирующая последовательность нуклеиновой кислоты

<400> 4

atcagcggag gcgatgtcct t 21

<210> 5

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Ингибирующая последовательность нуклеиновой кислоты

<400> 5

gcaagacccg tcaccgaaat t 21

<210> 6

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Ингибирующая последовательность нуклеиновой кислоты

<400> 6

tttcggtgac gggtcttgct t 21

<210> 7

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Ингибирующая последовательность нуклеиновой кислоты

<400> 7

gcggtgtcct ggtctactat t 21

<210> 8

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

3

<220>

<223> Ингибирующая последовательность нуклеиновой кислоты

<400> 8

tagtagacca ggacaccgct t 21

<210> 9

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Нацеленная на JNK1 последовательность нуклеиновой кислоты

<400> 9

ttggatgaag ccattagact a 21

<210> 10

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Нацеленная на JNK2 последовательность нуклеиновой кислоты

<400> 10

acctttaatg gacaacatta a 21

<210> 11

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Нацеленная на JNK2 последовательность нуклеиновой кислоты

<400> 11

aaggattagc tttgtatcat a 21

<210> 12

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Нацеленная на JNK3 последовательность нуклеиновой кислоты

<400> 12

4

cccgcatgtg tctgtattca a 21

<210> 13

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Пептидная последовательность DLK1

<220>

<221> иной признак

<222> (8)..(8)

<223> Xaa может быть любой аминокислотой природного происхождения

<220>

<221> MOD_RES

<222> (9)..(9)

<223> фосфорилированный треонин

<220>

<221> MOD_RES

<222> (12)..(12)

<223> фосфорилированный серин

<400> 13

Cys Lys Glu Leu Ser Asp Lys Xaa Thr Lys Met Xaa Phe Ala Gly

1 5 10 15

<210> 14

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Пептидная последовательность DLK1

<220>

<221> MOD_RES

<222> (3)..(3)

<223> фосфорилированный серин

<400> 14

Lys Met Xaa Phe Ala Gly Thr Val Ala Trp Met Ala Lys Lys Cys

1 5 10 15

5

<210> 15

<211> 14

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Пептидная последовательность DLK1

<220>

<221> MOD_RES

<222> (12)..(12)

<223> фосфорилированный треонин

<400> 15

Cys Gly Thr Ser Lys Glu Leu Ser Asp Lys Ser Xaa Lys Met

1 5 10

<210> 16

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Прямой праймер DLK1

<400> 16

catcatctgg ggtgtgggaa g 21

<210> 17

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Обратный праймер DLK1

<400> 17

agttgcagca tgagggcatt c

1. Антитело для осуществления взаимодействия антиген-антитело с клаудином 6 (CLDN6), находящимся на поверхности клеток, экспрессирующих CLDN6, при этом по существу неспособное к взаимодействию антиген-антитело с другими высокогомологичными клаудинами, где антитело способно связываться с CLDN6, соединенным с поверхностью клетки, экспрессирующей CLDN6,

при этом антитело характеризуется содержанием тяжелой цепи, включающей набор трех HCDR, и легкой цепи, включающей набор трех LCDR, причем набор HCDR и LCDR выбирают из группы, состоящей из:

(а) HCDR1 аминокислотной последовательности GYSFTGYT, идентифицированной в SEQ ID NO: 34,

HCDR2 аминокислотной последовательности INPYNGGT, идентифицированной в SEQ ID NO: 34,

HCDR3 аминокислотной последовательности ARDYGYVLDY, идентифицированной в SEQ ID NO: 34, и

LCDR1 аминокислотной последовательности SSVSY, идентифицированной в SEQ ID NO: 35,

LCDR2 аминокислотной последовательности STS, идентифицированной в SEQ ID NO: 35, и

LCDR3 аминокислотной последовательности QQRSIYPPWT, идентифицированной в SEQ ID NO: 35;

(b) HCDR1 аминокислотной последовательности GYSFTGYT, идентифицированной в SEQ ID NO: 36,

HCDR2 аминокислотной последовательности INPYNGGT, идентифицированной в SEQ ID NO: 36,

HCDR3 аминокислотной последовательности ARDYGFVLDY, идентифицированной в SEQ ID NO: 36, и

LCDR1 аминокислотной последовательности SSVSY, идентифицированной в SEQ ID NO: 37,

LCDR2 аминокислотной последовательности STS, идентифицированной в SEQ ID NO: 37, и

LCDR3 аминокислотной последовательности QQRSNYPPWT, идентифицированной в SEQ ID NO: 37;

(c) HCDR1 аминокислотной последовательности GYSFTGYT, идентифицированной в SEQ ID NO: 38,

HCDR2 аминокислотной последовательности INPYNGGI, идентифицированной в SEQ ID NO: 38,

HCDR3 аминокислотной последовательности ARDFGYVLDY, идентифицированной в SEQ ID NO: 38, и

LCDR1 аминокислотной последовательности SSVSY, идентифицированной в SEQ ID NO: 39,

LCDR2 аминокислотной последовательности STS, идентифицированной в SEQ ID NO: 39, и

LCDR3 аминокислотной последовательности QQRSTYPPWT, идентифицированной в SEQ ID NO: 39; а также

(d) HCDR1 аминокислотной последовательности GYSFTGYT, идентифицированной в SEQ ID NO: 40,

HCDR2 аминокислотной последовательности INPYNGGS, идентифицированной в SEQ ID NO: 40,

HCDR3 аминокислотной последовательности ARDYGYVFDY, идентифицированной в SEQ ID NO: 40, и

LCDR1 аминокислотной последовательности SSVNY, идентифицированной в SEQ ID NO: 41,

LCDR2 аминокислотной последовательности STS, идентифицированной в SEQ ID NO: 41, и

LCDR3 аминокислотной последовательности QQRNNYPPWT, идентифицированной в SEQ ID NO: 41.

2. Антитело по п. 1, которое практически не способно связываться с CLDN9, соединенным с поверхностью клетки, экспрессирующей CLDN9.

3. Антитело по любому из пп. 1 или 2, которое практически не способно связываться с CLDN4, соединенным с поверхностью клетки, экспрессирующей CLDN4, и/или практически не способно связываться с CLDN3, соединенным с поверхностью клетки, экспрессирующей CLDN3.

4. Антитело по любому из пп. 1-3, которое является специфическим к CLDN6.

5. Антитело по любому из пп. 1-4, причем указанная клетка является интактной клеткой, в частности непермеабилизированной клеткой.

6. Антитело по любому из пп. 1-5, способное связываться с эпитопом, расположенным во внеклеточной части CLDN6.

7. Антитело по любому из пп. 1-6, причем связывание антитела с CLDN6 включает связывание с эпитопом, расположенным в пределах аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 6 или SEQ ID NO: 7.

8. Антитело по любому из пп. 1-7, причем CLDN6 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2 или аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8.

9. Антитело по любому из пп. 1-8, которое способно связываться с CLDN6, имеющим аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, и способно связываться с CLDN6, имеющим аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8.

10. Антитело по любому из пп. 1-9, которое имеет одну или более из следующих функций:

(i) уничтожение клетки, экспрессирующей CLDN6,

(ii) ингибирование пролиферации клетки, экспрессирующей CLDN6,

(iii) ингибирование колониеобразования клетки, экспрессирующей CLDN6,

(iv) опосредование ремиссии развившихся опухолей,

(v) предотвращение образования или повторного образования опухолей, и

(vi) ингибирование метастазирования клетки, экспрессирующей CLDN6.

11. Антитело по любому из пп. 1-9, которое проявляет одну или более иммунных эффекторных функций против клетки, несущей CLDN6 в нативной конформации.

12. Антитело по п. 11, при этом одну или более иммунных эффекторных функций выбирают из группы, состоящей из комплементзависимой цитотоксичности (CDC), антителозависимой клеточной цитотоксичности (ADCC), индукции апоптоза и ингибирования пролиферации, предпочтительно эффекторные функции являются ADCC и/или CDC.

13. Антитело по любому одному из пп. 10-12, когда указанная одна или более активностей или одна или более иммунных эффекторных функций индуцируются связыванием указанного антитела с эпитопом, расположенным в пределах внеклеточной части CLDN6.

14. Антитело по п. 13, причем указанная внеклеточная часть CLDN6 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6 или SEQ ID NO: 7.

15. Антитело по любому из пп. 1-14, когда указанная клетка, экспрессирующая CLDN6, или клетка, несущая CLDN6 в нативной конформации, является опухолевой клеткой.

16. Антитело по любому из пп. 1-15, когда указанная клетка, экспрессирующая CLDN6, или клетка, несущая CLDN6 в нативной конформации, является раковой клеткой.

17. Антитело по п. 16, причем раковая клетка происходит от рака, выбранного из группы, состоящей из рака яичника, в частности аденокарциномы яичника и тератокарциномы яичника, рака легких, включая мелкоклеточный рак легкого (SCLC) и немелкоклеточный рак легкого (NSCLC), в частности плоскоклеточного рака легкого и аденокарциномы, рака желудка, рака молочной железы, рака печени, рака поджелудочной железы, рака кожи, в частности базальноклеточной карциномы и плоскоклеточной карциномы, злокачественной меланомы, рака головы и шеи, в частности злокачественной плеоморфной аденомы, саркомы, в частности синовиальной саркомы и карциносаркомы, рака желчного протока, рака мочевого пузыря, в частности переходно-клеточной карциномы и папиллярного рака, рака почки, в частности почечноклеточного рака, включая светлоклеточный рак почки и папиллярную карциному почки, рака толстой кишки, рака тонкой кишки, включая рак подвздошной кишки, в частности аденокарциномы тонкой кишки и аденокарциномы подвздошной кишки, эмбриональной карциномы яичка, плацентарной хориокарциномы, рака шейки матки, рака яичка, в частности семиномы яичка, тератомы яичка и эмбрионального рака яичка, рака матки, герминомы, такой как тератокарцинома или эмбриональная карцинома, в частности эмбрионально-клеточной опухоли яичка и их метастатических форм.

18. Антитело по любому из пп. 1-17, которое является моноклональным или химерным антителом.

19. Антитело по любому из пп. 1-18, которое способно связываться с одним или более эпитопами CLDN6 в нативной конформации.

20. Антитело по любому из пп. 1-19, выбранное из группы, состоящей из антител, выработанных или полученных от клонов, депонированных в DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH под регистрационными номерами DSM ACC3069, DSM ACC3070, DSM ACC3073 и DSM ACC3090.

21. Гибридома, предназначенная для продуцирования антитела по п. 1, содержащего последовательности, представленные в SEQ ID NO:s: 34 и 35, причем указанная гибридома задепонирована в DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH под регистрационным номером DSM ACC3069.

22. Гибридома, предназначенная для продуцирования антитела по п. 1, содержащего последовательности, представленные в SEQ ID NOs: 36 и 37, причем указанная гибридома задепонирована в DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH под регистрационным номером DSM ACC3070.

23. Гибридома, предназначенная для продуцирования антитела по п. 1, содержащего последовательности, представленные в SEQ ID NOs: 38 и 39, причем указанная гибридома задепонирована в DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH под регистрационным номером DSM ACC3073.

24. Гибридома, предназначенная для продуцирования антитела по п. 1, содержащего последовательности, представленные в SEQ ID NOs: 40 и 41, причем указанная гибридома задепонирована в DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH под регистрационным номером DSM ACC3090.

25. Иммуноконъюгат для нацеливания терапевтического средства к CLDN6 экспрессирующим клеткам, содержащий антитело по любому из пп. 1-20, соединенное с терапевтическим средством.

26. Иммуноконъюгат по п. 25, в котором терапевтическое средство является токсином, радиоизотопом, лекарственным средством или цитотоксическим средством.

27. Фармацевтическая композиция для лечения или профилактики рака, вовлекающего клетку, экспрессирующую CLDN6, где фармацевтическая композиция содержит антитело по любому из пп. 1-20 и/или иммуноконъюгат по п. 25 или 26 в эффективном количестве(ах) и фармацевтически приемлемый носитель.

28. Способ ингибирования роста клетки, экспрессирующей CLDN6, включающий контактирование клетки с антителом по любому из пп. 1-20 и/или иммуноконъюгатом по п. 25 или 26.

29. Способ уничтожения клетки, экспрессирующей CLDN6, включающий контактирование клетки с антителом по любому из пп. 1-20 и/или иммуноконъюгатом по п. 25 или 26.

30. Способ лечения или предотвращения рака, вовлекающего клетку, экспрессирующую CLDN6, у субъекта, включающий введение указанному субъекту антитела по любому из пп. 1-20, иммуноконъюгата по п. 25 или 26 или фармацевтической композиции по п. 27.

31. Способ по п. 30, согласно которому рак выбирают из группы, состоящей из рака яичника, в частности аденокарциномы яичника и тератокарциномы яичника, рака легких, включая мелкоклеточный рак легкого (SCLC) и немелкоклеточный рак легкого (NSCLC), в частности плоскоклеточного рака легкого и аденокарциномы, рака желудка, рака молочной железы, рака печени, рака поджелудочной железы, рака кожи, в частности базальноклеточной карциномы и плоскоклеточной карциномы, злокачественной меланомы, рака головы и шеи, в частности злокачественной плеоморфной аденомы, саркомы, в частности синовиальной саркомы и карциносаркомы, рака желчного протока, рака мочевого пузыря, в частности переходно-клеточной карциномы и папиллярного рака, рака почки, в частности почечноклеточного рака, включая светлоклеточный рак почки и папиллярную карциному почки, рака толстой кишки, рака тонкой кишки, включая рак подвздошной кишки, в частности аденокарциномы тонкой кишки и аденокарциномы подвздошной кишки, эмбриональной карциномы яичка, плацентарной хориокарциномы, рака шейки матки, рака яичка, в частности семиномы яичка, тератомы яичка и эмбрионального рака яичка, рака матки, герминомы, такой как тератокарцинома или эмбриональная карцинома, в частности эмбрионально-клеточной опухоли яичка и их метастатических форм.

32. Способ ингибирования метастатического распространения клетки, экспрессирующей CLDN6, включающий контактирование клетки с антителом по любому из пп. 1-20 и/или иммуноконъюгатом по п. 25 или 26.