Способ получения инвертазы и лимонной кислоты



Владельцы патента RU 2676144:

Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Федеральный научный центр пищевых систем им. В.М. Горбатова" РАН (RU)

Предложен способ получения инвертазы и лимонной кислоты. Способ предусматривает выращивание при 36°С посевного мицелия Aspergillus niger - продуцента лимонной кислоты, и глубинную ферментацию среды при 32°С на основе гидролизата кукурузного крахмала, содержащей источник азота и минеральные соли. Выращивание посевного мицелия проводят при скорости перемешивания культуральной жидкости в первые 12 ч 120 об/мин, после 12 ч и до конца процесса 250 об/мин в условиях аэрации в первые 6 ч - 8 л/мин, с 6 ч до 12 ч - 16 л/мин, с 12 ч до 24 ч - 32 л/мин. Глубинную ферментацию проводят при перемешивании в первые сутки со скоростью 250 об/мин, во вторые сутки со скоростью 300 об/мин, в третьи сутки и до конца процесса со скоростью 400 об/мин в условиях аэрации в первые сутки 24-40 л/мин, во вторые сутки 32-48 л/мин, в третьи сутки и до конца процесса 40-56 л/мин. Разделяют культуральную жидкость на мицелий и ферментированный раствор, который затем разделяют ультрафильтрацией через мембрану, удерживающую молекулярную массу 15000, на раствор инвертазы и раствор лимонной кислоты. Способ позволяет получить одновременно инвертазу с активностью 1,31 ед./см3 и выходом 98,3% и лимонную кислоту с концентрацией 110 г/дм3 и выходом 92%. 1 табл., 4 пр.

 

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается способа получения инвертазы и лимонной кислоты ферментацией гидролизатов кукурузного крахмала грибом Aspergillus niger.

За рубежом промышленные препараты инвертазы обычно получают с помощью дрожжей. Впервые инвертаза была получена из культуры дрожжей в виде водного раствора Деберейнером и Мичерлихом в 1830 г. Бертле выделил инвертазу в чистом виде в 1860 г.

Известен способ получения препарата инвертазы, который включает автолитическую деструкцию клеток дрожжей, обладающих инвертазной активностью, центрифугирование полученного автолизата, промывку осадка и его центрифугирования до получения осадка, состоящего из изолированных стенок дрожжевых клеток (патент РФ, №2157844, 20.10.2000, Бюл. №29).

Недостатком этого способа является то, что препарат инвертазы состоит преимущественно из стенок дрожжевых клеток, что не позволяет получить чистый препарат инвертазы.

Наиболее близким предлагаемому изобретению является способ получения инвертазы, включающий глубинную ферментацию среды на основе гидролизата кукурузного крахмала грибом-продуцентом лимонной кислоты Aspergillus niger, содержащей источник азота и минеральные соли, при постоянном перемешивании в течение 5 суток (Шарова Н.Ю., Выборнова Т.В., Килеева А.И., Юшкаускайте А.Р. Инвертазная активность при культивировании продуцентов лимонной кислоты-штаммов Aspergillus niger на мелассе и гидролизатах крахмала // Вестник биотехнологии и физико-химической биологии имени Ю.А. Овчинникова. 2016. Т. 12. №4. С. 16-22.).

Известным способом в результате 120-часовой ферментации получают инвертазу с экстрацеллюлярной активностью 0,36 ед/см3.

Недостатком вышеуказанного способа является получение инвертазы с низкой ферментативной активностью.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является получение одновременно инвертазы с высокой ферментативной активностью за счет интенсификации биосинтеза инвертазы и обеспечение высокого выхода лимонной кислоты.

Технический результат предлагаемого изобретения достигается тем, что в известном способе получения инвертазы, включающим глубинную ферментацию среды на основе гидролизата кукурузного крахмала грибом-продуцентом лимонной кислоты Aspergillus niger, содержащей источник азота и минеральные соли, при постоянном перемешивании в течение 5 суток, согласно изобретению в первые сутки процесса перемешивание осуществляют со скоростью 250 оборотов мешалки в минуту, во вторые сутки со скоростью 300 оборотов мешалки в минуту, в третьи сутки и до конца процесса со скоростью 400 оборотов в минуту в условиях аэрации в первые сутки (24-40) литров в минуту, во вторые сутки (32-48) литров в минуту, в третьи сутки и до конца процесса (40-56) литров в минуту и далее проводят разделение культуральной жидкости гриба-кислотообразователя на мицелий и ферментированный раствор, который затем разделяют ультрафильтрацией через мембрану, удерживающую молекулярную массу 15000, на раствор инвертазы и раствор лимонной кислоты.

Микромицет Aspergillus niger является аэробным продуцентом и поэтому аэрирование глубинной культуры является важным фактором и его интенсивность по-разному влияет на продуцирующую способность гриба. Увеличение степени аэрирования среды приводит к интенсификации процесса биосинтеза фермента и повышению ее активности. Совокупность предлагаемых режимов операций и последовательность их проведения обеспечивает также достижение высокого выхода лимонной кислоты.

Сведения, подтверждающие возможность достижения технического результата предлагаемого изобретения, представлены в примерах.

В примерах используют ферментированный раствор, который получают ферментацией среды на основе гидролизата кукурузного крахмала грибом Aspergillus niger в ферментаторе вместимостью 30 дм3.

В примерах инвертазную активность оценивают с помощью колориметрического метода (Рухлядева А.П., Полыгалина Г.В. Методы определения активности гидролитических ферментов. Москва. Легкая и пищевая промышленность, 1981. - 288 с.). Концентрацию лимонной кислоты определяют титриметрическим методом (Муратова Е.И., Зюзина О.В., Шуняева О.Б. Биотехнология органических кислот и белковых препаратов: учебное пособие - Тамбов: Изд-во Тамб.гос.техн.ун-та, 2007. - 80 с.).

Для ультрафильтрации используют аппарат ВПУ НПК «Биотест», г. Кириши, Россия и мембрану на основе полых волокон, удерживающих молекулярную массу в пределах 1000-15000.

Пример 1.

Гидролиз кукурузного крахмала до степени гидролиза, обеспечивающей декстрозный эквивалент ДЕ=52,3% проводят в соответствии с (патент РФ №2294371, 27.02.2007, Бюл. №6).

Выращивание посевного мицелия: стерильную питательную среду на основе гидролизата кукурузного крахмала, содержащую: углеводный субстрат - 50 г/дм3, NH4NO3 - 2,5 г/дм3, KН2РO4 - 0,16 г/дм3, MgSO4⋅7Н2O - 0,25 г/дм3, засевают спорами гриба Aspergillus niger штамм ВКПМ F- 171, предварительно выдержанными в среде А4 следующего состава: сахароза - 50 г/дм3, NH4NO3 - 2,5 г/дм3, KН2РO4 - 0,16 г/дм3, MgSO4⋅7Н2O - 0,25 г/дм3.

Выращивание посевного мицелия проводят при температуре 36°С и скорости перемешивания культуральной жидкости в первые 12 ч 120 оборотов мешалки в минуту, после 12 ч и до конца процесса 250 оборотов в минуту в условиях аэрации в первые 6 ч - 8 л/мин, с 6 ч до 12 ч - 16 л/мин, с 12 ч до 24 ч - 32 л/мин. Возраст посевного мицелия составляет 24 часа.

Ферментация: в ферментатор вместимостью 30 дм3 вносят 10 дм3 питательной среды на основе гидролизата кукурузного крахмала следующего состава: углеводный субстрат - 150 г/дм3, NH4NO3 - 2,5 г/дм3, KН2РО4 - 0,16 г/дм, MgSO4⋅7Н2О - 0,25 г/дм3 и засевают посевным мицелием в количестве 10% от исходного объема среды. Ферментацию проводят при температуре 32°С в течение 5 суток.

В первые сутки процесса перемешивание культуральной жидкости осуществляют со скоростью 250 оборотов мешалки в минуту, во вторые сутки со скоростью 300 оборотов мешалки в минуту, в третьи сутки - 400 оборотов в минуту в условиях аэрации в первые сутки 24 л/мин, во вторые сутки 32 л/мин., в третьи сутки и до конца процесса 40 л/мин.

После окончания ферментации биомассу гриба отделяют на воронке Бюхнера и в ферментированном растворе определяют экстрацеллюлярную инвертазную активность и концентрацию лимонной кислоты.

Ферментированный раствор с концентрацией лимонной кислоты 100 г/дм3 и инвертазной активностью 1,14 ед/см3 разделяют ультрафильтрацией, пропуская через мембрану, удерживающую молекулярную массу 15000, на раствор инвертазы и раствор лимонной кислоты.

Данные опыта представлены в таблице.

Пример 2

Гидролиз кукурузного крахмала, выращивание посевного мицелия, ферментацию и перемешивание ферментационной среды проводят согласно примеру 1. Аэрирование глубинной культуры в первые сутки составляет 32 л/мин, во вторые сутки 40 л/мин., в третьи сутки и до конца процесса 48 л/мин. Ферментированный раствор с концентрацией лимонной кислоты 110 г/дм3 и инвертазной активностью 1,31 ед./см3 разделяют согласно примеру 1.

Данные опыта представлены в таблице.

Пример 3

Гидролиз кукурузного крахмала, выращивание посевного мицелия, ферментацию и перемешивание ферментационной среды проводят согласно примеру 1. Аэрирование глубинной культуры в первые сутки составляет 40 л/мин, во вторые сутки 48 л/мин., в третьи сутки и до конца процесса 56 л/мин. Ферментированный раствор с концентрацией лимонной кислоты 105 г/дм3 и инвертазной активностью 1,25 ед./см3 разделяют согласно примеру 1.

Данные опыта представлены в таблице.

Пример 4 (по прототипу)

Гидролиз кукурузного крахмала, выращивание посевного мицелия и ферментацию проводят согласно примеру 1. Ферментацию осуществляют при постоянном перемешивании.

Данные опыта представлены в таблице.

Таким образом, как видно из результатов таблицы, предлагаемый способ позволяет одновременно получить инвертазу с высокой ферментативной активностью 1,31 ед./см3 и выходом 98,3% и лимонную кислоту с высоким выходом 92%.

Способ получения инвертазы и лимонной кислоты, включающий выращивание посевного мицелия при температуре 36°С и глубинную ферментацию среды при температуре 32°С на основе гидролизата кукурузного крахмала грибом-продуцентом лимонной кислоты Aspergillus niger, содержащей источник азота и минеральные соли, отличающийся тем, что выращивание посевного мицелия проводят при скорости перемешивания культуральной жидкости в первые 12 ч 120 оборотов мешалки в минуту, после 12 ч и до конца процесса 250 оборотов в минуту в условиях аэрации в первые 6 ч - 8 литров в минуту, с 6 ч до 12 ч - 16 л/мин, с 12 ч до 24 ч - 32 литров в минуту, а глубинную ферментацию осуществляют при перемешивании в первые сутки со скоростью 250 оборотов мешалки в минуту, во вторые сутки со скоростью 300 оборотов в минуту, в третьи сутки и до конца процесса со скоростью 400 оборотов в минуту в условиях аэрации в первые сутки 24-40 литров в минуту, во вторые сутки 32-48 литров в минуту, в третьи сутки и до конца процесса 40-56 литров в минуту и далее проводят разделение культуральной жидкости гриба-кислотообразователя Aspergillus niger на мицелий и ферментированный раствор, который затем разделяют ультрафильтрацией через мембрану, удерживающую молекулярную массу 15000, на раствор инвертазы и раствор лимонной кислоты.



 

Похожие патенты:

Группа изобретений относится к биотехнологии. Предложен микроорганизм рода Escherichia, продуцирующий О-ацетилгомосерин, где активность белка, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, повышена по сравнению с немодифицированным микроорганизмом, продуцирующим О-ацетилгомосерин, и где активность цистатионинсинтазы инактивирована по сравнению с немодифицированным микроорганизмом, продуцирующим О-ацетилгомосерин.

Группа изобретений относится к области биотехнологии. Предложен способ получения L-валина путем ферментации микроорганизмов из рода Corynebacterium, содержащих в реплицируемой форме полинуклеотид с операторной активностью, последовательность которого по меньшей мере на 85% идентична последовательности от положения 1 до 121 согласно SEQ ID NO: 1, 2 или 3, с которым связывается активатор PrpR, и функционально ниже которого на 3’-конце находится второй полинуклеотид, характеризующийся промоторной активностью, а также гены ilvB и ilvN, и который регулирует транскрипцию генов ilvBN в зависимости от добавления активатора PrpR в среду, к которой после первой фазы (фазы роста), проходящей без индуктора, во второй фазе в качестве индуктора добавляют пропионат или 2-метилцитрат.

Группа изобретений относится к биохимии. Предложена нуклеиновая кислота, кодирующая люциферазу или ее функциональный фрагмент и выбранная из группы, состоящей из нуклеиновой кислоты, кодирующей белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32 или 34, нуклеиновой кислоты, кодирующей белок, имеющий последовательность, которая по крайней мере на 65% идентична аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32 или 34, и нуклеиновой кислоты, кодирующей белок, в состав которого входит консенсусная последовательность SEQ ID NO: 35.

Группа изобретений относится к биотехнологии. Предложен микроорганизм из рода Escherichia, обладающий способностью продуцировать О-сукцинилгомосерин или янтарную кислоту, в котором активность α-кетоглутаратдегидрогеназного комплекса (KGDHC) повышена по сравнению с уровнем его эндогенной активности, активность гомосерин-О-сукцинилтрансферазы дополнительно повышена по сравнению с уровнем ее эндогенной активности и активность по меньшей мере одной из цистатионин-гамма-синтазы и гомосеринкиназы устранена.

Изобретение относится к фармацевтической промышленности и представляет собой диетическую добавку, содержащую аспергиллоглутамил-пептидазу из Aspergillus niger, пролил-эндопептидазу и диетически пригодные вспомогательные вещества, а также фармацевтическую композицию для лечения непереносимости глютена у человека, содержащую аспергиллоглутамил-пептидазу из Aspergillus niger, пролил-эндопептидазу и фармацевтически пригодные вспомогательные вещества.

Группа изобретений относится к области биотехнологии. Предложен вариант протеазы, содержащий замену в положении 171 SEQ ID NO: 3, где вариант содержит последовательность, которая идентична SEQ ID NO: 3 по меньшей мере на 75% и меньше чем на 100%, и вариант обладает протеазной активностью, где аминокислота в положении, соответствующем положению 171 SEQ ID NO: 3, выбрана из группы, состоящей из Trp, Lys, Glu и Asn.

Изобретение относится к области биотехнологии и биохимии, в частности к проникающему в клетки пептиду. Указанный пептид состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 и обладает способностью опосредовать внутриклеточную доставку легкой цепи ботулотоксина.

Группа изобретений относится к рекомбинантной плазмиде, обеспечивающей синтез химерного белка прохимозина В Bos Taurus, и рекомбинантному штамму Е. coli - продуценту химерного белка прохимозина В Bos taurus в клетках E.

Предложены модифицированный белок орнитиндекарбоксилаза (ODC), обладающий улучшенной продуктивностью по путресцину, и его применение. Изолейцин в положении 163 от N-конца ODC, имеющей аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1, заменен на аминокислотный остаток, меньший, чем изолейцин, и/или глутаминовая кислота в положении 165 от N-конца ODC, имеющей аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1, заменена на аминокислотный остаток, меньший, чем глутаминовая кислота.

Группа изобретений относится к биотехнологии, а именно к получению сопряженных диенов методом ферментативной дегидратации. Способ получения сопряженного диена включает стадию ферментативного превращения соединения общей формулы СnН2nO в соединение общей формулы CnH2n-2+Н2О, где 3<n<7, с использованием линалоол-дегидратазы (ЕС 4.2.1.127).
Изобретение относится к биотехнологии. Штамм гриба Aspergillus niger В-6 является продуцентом лимонной кислоты.

Изобретение относится к способу стерилизации питательной среды и ферментатора для производства лимонной кислоты. Способ предусматривает очистку ферментатора, загрузку в ферментатор питательной среды и дальнейшую стерилизацию питательной среды и ферментатора антисептиком под избыточным давлением 0,08-0,10 МПа в течение 10-30 мин и при температуре 20-25°С.

Изобретение относится к биотехнологии. .

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается способа получения из крахмалосодержащего сырья лимонной кислоты и кислотоустойчивых ферментов: -амилазы и глюкоамилазы, которые используются в хлебопечении, пивоварении, крахмалопаточной промышленности, медицине, т.е.
Изобретение относится к микробиологической промышленности. .

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается способа получения лимонной кислоты и комплекса кислотостабильных амилолитических ферментов, обладающих -амилазной и глюкоамилазной активностями.

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается получения лимонной кислоты и кислотоустойчивых ферментов -амилазы и глюкоамилазы. .
Изобретение относится к получению органических кислот, в частности лимонной кислоты. .

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается способа очистки растворов лимонной кислоты и сопутствующих ее биосинтезу кислотостабильных амилолитических ферментов, обладающих декстриногенной и сахарогенной активностями.

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается способа получения из крахмалосодержащего сырья лимонной кислоты и кислотоустойчивых ферментов: -амилазы и глюкоамилазы.

Группа изобретений относится к биотехнологии. Предложен микроорганизм рода Escherichia, продуцирующий О-ацетилгомосерин, где активность белка, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, повышена по сравнению с немодифицированным микроорганизмом, продуцирующим О-ацетилгомосерин, и где активность цистатионинсинтазы инактивирована по сравнению с немодифицированным микроорганизмом, продуцирующим О-ацетилгомосерин.

Предложен способ получения инвертазы и лимонной кислоты. Способ предусматривает выращивание при 36°С посевного мицелия Aspergillus niger - продуцента лимонной кислоты, и глубинную ферментацию среды при 32°С на основе гидролизата кукурузного крахмала, содержащей источник азота и минеральные соли. Выращивание посевного мицелия проводят при скорости перемешивания культуральной жидкости в первые 12 ч 120 обмин, после 12 ч и до конца процесса 250 обмин в условиях аэрации в первые 6 ч - 8 лмин, с 6 ч до 12 ч - 16 лмин, с 12 ч до 24 ч - 32 лмин. Глубинную ферментацию проводят при перемешивании в первые сутки со скоростью 250 обмин, во вторые сутки со скоростью 300 обмин, в третьи сутки и до конца процесса со скоростью 400 обмин в условиях аэрации в первые сутки 24-40 лмин, во вторые сутки 32-48 лмин, в третьи сутки и до конца процесса 40-56 лмин. Разделяют культуральную жидкость на мицелий и ферментированный раствор, который затем разделяют ультрафильтрацией через мембрану, удерживающую молекулярную массу 15000, на раствор инвертазы и раствор лимонной кислоты. Способ позволяет получить одновременно инвертазу с активностью 1,31 ед.см3 и выходом 98,3 и лимонную кислоту с концентрацией 110 гдм3 и выходом 92. 1 табл., 4 пр.

Наверх