Блок ультрафильтрации для непрерывной замены буферного раствора или среды из раствора белка

Изобретение касается блока ультрафильтрации для непрерывной замены буферного раствора или среды, способа непрерывной замены буферного раствора или соответственно среды в этом блоке ультрафильтрации, а также установки, в частности, для (полу)непрерывного производства биофармацевтических и биологических макромолекулярных продуктов, в частности, таких как белки, например моноклональных антител и прививочных препаратов, включающей блок ультрафильтрации согласно изобретению. Блок для непрерывной ультрафильтрации потока поступающего материала, который содержит биофармацевтические и биологические макромолекулярные продукты, включающий по меньшей мере один капиллярный ультрафильтрационный модуль, причем по меньшей мере один насос перемещает поток поступающего материала в капилляры ультрафильтрационного модуля, насос вытесняющего действия перемещает поток поступающего материала из капилляров и по меньшей мере один дополнительный насос создает ток промывочной жидкости по внешней стороне капилляров, указанный блок свободен от мер для циркулирующего течения потока поступающего материала и промывочной жидкости в ультрафильтрационный модуль и ультрафильтрационный модуль свободен от пузырьков со стороны капилляров и боковой стороны, причем свобода от пузырьков достигается через процесс первичного заполнения, при котором как сторона поступающего материала, так и боковая сторона промывается посредством буферного раствора, пока из диализного модуля больше не будут выделяться пузырьки газа. Технический результат - регулирование потока продукта, в частности регулирование концентрации, рН и/или электрической проводимости непрерывного потока продукта, при помощи замены буферного раствора. 2 н. и 5 з.п. ф-лы, 3 ил., 2 табл.

 

Изобретение касается блока ультрафильтрации для непрерывной замены буферного раствора или среды, способа непрерывной замены буферного раствора или соответственно среды в этом блоке ультрафильтрации, а также установки, в частности, для (полу)непрерывного производства биофармацевтических и биологических макромолекулярных продуктов, в частности, таких как белки, например, моноклональных антител и прививочных препаратов, включающей блок ультрафильтрации согласно изобретению.

Непрерывное производство согласно этой заявке обозначает, что подведение потока поступающего материала в биореактор и отвод потока продукта из производственной установки осуществляется безостановочно, причем некоторые стадии могут быть полунепрерывными.

Жестко регулируемое фармацевтическое производство требует больших затрат по времени, технологии и персоналу для подготовки очищенных и стерилизованных биореакторов и гарантии стерильного продукта. Чтобы надежно предотвратить перекрестную контаминацию при замене продукта в многоцелевой установке или между двумя партиями продукта, кроме очистки, требуется очень дорогостоящее квалификационное испытание, которое при адаптации процесса при необходимости должно повторяться.

Это справедливо как для технологического процесса наращивания биомассы (англ. Upstream-Processing, USP), то есть, получения биологических продуктов в ферментерах, так и для технологического процесса выделения и очистки продукта (англ. Downstream-Processing, DSP), то есть, очистки продуктов ферментации.

Именно в случае ферментации незаменимой для благоприятного культивирования является стерильная окружающая обстановка. Для стерилизации ферментеров периодического действия или подпитываемых ферментеров, как правило, применяется технология стерилизации на месте (англ. SIP = sterilization-in-place).

Время простоя реакторов, обусловленное процедурами подготовки, в частности, при коротких периодах использования и частой смене продукта, может лежать в области величин времени готовности реактора к использованию. От этого страдают в процессе наращивания массы биотехнологической продукции (USP), например, стадии процесса приготовления среды и ферментации, а в процессе выделения и очистки (DSP) - солюбилизации, замораживания, оттаивания, регулирования рН, выделения продукта, такого как, например, с помощью хроматографии, осаждения или кристаллизации, замены буферного раствора и вирусной инактивации.

Чтобы отвечать требованиям быстрой и гибкой новой загрузки производственной установки при соблюдении максимальной чистоты и стерильности, на рынке постоянно возрастающим интересом пользуются концепции непрерывного производства, предпочтительно, имеющие одноразовую технологию.

Международная заявка WO 2012/078677 описывают способ и установку для непрерывной подготовки биофармацевтических продуктов при помощи хроматографии и ее интеграции в производственную установку, в частности, в одноразовой установке. Несмотря на то, что международная заявка WO 2012/078677 предоставляет подходы для непрерывного производства биофармацевтических и биологических продуктов, раскрытое решение на практике не является достаточным.

Обычно способ получения биофармацевтических и биологических продуктов включает следующие стадии получения, которые объединяются друг с другом:

1. Перфузионное культивирование

2. Систему задерживания клеток,

альтернативой стадиям 1 и 2 является культивирование с подпиткой.

3. Отделение клеток

4. Замена буферного раствора или соответственно среды, предпочтительно с концентрированием

5. Осветляющая фильтрация микроорганизмов, предпочтительно при помощи стерилизующего фильтрования

6. Хроматография с задерживанием.

Обычно для дальнейшей очистки потока продукта проводятся дополнительные стадии, в частности:

7. Вирусная инактивация

8. Нейтрализация

9. При желании дополнительная осветляющая фильтрация микроорганизмов (стерилизующее фильтрование).

Ввиду высоких стандартов качества при получении биофармацевтических продуктов, кроме этого, обычно далее идут следующие стадии:

10. Хроматографическая промежуточная и тонкая очистка

11. Осветляющая фильтрация микроорганизмов, например, стерилизующее фильтрование

12. Фильтрация вирусов

13. Замена буферного раствора и предпочтительно концентрирование

14. Стерилизующее фильтрование.

При описанном выше получении клетки в ферментере с питательным раствором производят биологический продукт. При этом питательный раствор также является идеальной средой для роста для микроорганизмов, таких как бактерии и споры.

Поэтому задачей является сократить риск загрязнений на последующих стадиях процесса. Решение этой задачи является тем более срочным, чем дольше длится процесс, особенно при непрерывном процессе. При получении белков по меньшей мере на одной стадии процесса проводится замена буферного раствора или соответственно среды (= замене буферного раствора) в растворе продукта.

Кроме того, для некоторых стадий процесса требуются в некоторой мере дорогостоящие регулировки одного или нескольких параметров потока поступающего материала/потока продукта, в частности, концентрации, объема/интенсивности потока, рН и электрической проводимости. В частности, различные хроматографические стадии могут требовать различных новых установок одного или нескольких параметров потока поступающего материала. К тому же, для непрерывного процесса предпочтительно должно быть найдено непрерывное решение для способа.

Международная заявка WO 2012/078677 не останавливается на замене буферного раствора или соответственно среды или на регулировании потока поступающего материала, в частности, перед хроматографическим блоком, так что применимость раскрытой установки непрерывного действия ограничивается видами хроматографии, которые не требуют никакой особенной регулировки, в частности, в отношении концентрации, рН и электрической проводимости.

В качестве операции для регулирования параметров поступающего сырья в периодическом процессе в уровне техники известна замена буферного раствора. Обычно применяется периодическая диафильтрация посредством мембраны для ультрафильтрации. При этом раствор продукта помещается в резервуар. Этот раствор прокачивается через мембрану для ультрафильтрации в цикле, причем продукт в как можно большей степени задерживается мембраной, в то время как соли/буферный раствор отделяются посредством мембраны в качестве пермеата. Уровень заполнения в резервуаре для продукта обычно поддерживают постоянным, заменяя количество пермеата посредством промывочной жидкости. Тогда остаточная концентрация соли в продукте в идеальном случае рассчитывается следующим образом:

С=Со*ехр (количество промывочной жидкости/количество раствора продукта), причем Со является начальной концентрацией соли. Этот процесс в литературе, чаще всего ошибочным образом, называется непрерывной диафильтрацией, хотя он является периодическим процессом, поскольку в резервуар не подается непрерывно никакого потока поступающего материала, а из резервуара не отводится непрерывно потока продукта. Это связано с тем обстоятельством, что буферный раствор непрерывно подается в систему, пока загрузка не будет полностью подвергнута процессу [Alois Jungbauer, ((Continuous downstream processing of biopharmaceuticals», Trends in Biotech., 2013 (8), 479-492, международная заявка WO 2009017491].

Ультрафильтрационные модули также используются в гемодиализе, гемофильтрации и гемодиафильтрации. Гемодиализ отличается от других способов ультрафильтрации тем, что речь идет о чисто диффузионном, а не работающем под давлением процессе. Однако технологически гемодиализ также представляет собой периодический процесс, при котором человеческое тело может рассматриваться как резервуар с продуктом, а кровь пациента, как правило, должна промываться более нескольких часов. Кроме того, диализ известен в уровне техники в лабораторных условиях для обессоливания и замены буферного раствора в растворах белков. При этом диализ по причине предположительно медленной диффузии является способом только для меньших лабораторных количеств [ThermoScientific http://www.piercenet.com/browse.cfm?fld I D=5753AFD9-5056-8A 76-4E 13-5F9E9B4324DA, китайский патент CN 102703550].

Динамический диализ применяет гидродинамику, чтобы повысить как скорость, так и эффективность диализа. В результате циркуляции образца и/или диализата возникает максимально возможный градиент концентраций, чтобы значительно сократить время диализа. Другими преимуществами набегающего потока является то, что предотвращается загрязнение мембраны, в то время как в некоторых случаях получается разность давлений. Эта дополнительная движущая сила повышает гипоосмотическую скорость переноса вещества через полупроницаемую мембрану и создает возможность концентрирования образца во время процесса диализа. В зависимости от применения, существует два основных способа, в которых диализат создает поток, а образец может быть или неподвижным или текущим. Эти способы применяются в динамическом диализе из различных соображений и для различных целей. Если образец движется в потоке, то он в уровне техники вводится в систему циркуляции, включающую резервуар для продукта http://de.spectrumlabs.com/dialysis/Dynamic.html]. Этот способ также является периодическим способом.

Непрерывная диафильтрация согласно этой заявке обозначает, что поток поступающего материала и промывочной поток подаются в конструктивную единицу ультрафильтрации непрерывно. Полунепрерывная эксплуатация согласно этой заявке обозначает, что, как правило, в качестве загрузки или партии понимают очистку, то есть, что одна или несколько партий раствора белка из одного или нескольких резервуаров непрерывно подаются в конструктивную единицу ультрафильтрации, причем здесь промывочная жидкость также подается непрерывно.

Настоящая непрерывная диафильтрация в уровне техники может реализоваться в результате того, что несколько стадий диафильтрации соединяют друг с другом в прямотоке или соответственно в противотоке. Однако аппаратурные затраты в этом случае являются соответственно большими [Alois Jungbauer, ((Continuous downstream processing of biopharmaceuticals», Trends in Biotech., 2013 (8), 479-492].

Простое непрерывное решение для регулирования параметров поступающего сырья и, в частности, для замены буферного раствора в потоке продукта, до сих пор не известно.

Патент США US 4963264 А раскрывает конструктивную единицу и способ диализа, который может применяться для очистки антител. Применяется модуль с полыми волокнами. Растворы - продукта и промывочной, подаются в противоточном процессе, причем эти растворы не вводятся в циркуляцию. С помощью аффинных адсорбентов целевое химическое вещество экстрагируется на другой стороне мембраны и, следовательно, находится в пермеате. В одном отдельном варианте исполнения патент США US 4963264 А описывает, что для некоторых экспериментов применялось средство для противодавления, чтобы использовать различное давление, без указания дополнительных подробностей.

Патент США US 3582488 A раскрывает конструктивную единицу и способ для диализа, замены буферного раствора и/или концентрирования биологических химических веществ, например, белков. Для этого применяется плоскомембранный модуль и потоки вводятся в маленькие каналы, которые также могут рассматриваться как капилляры. Эта конструктивная единица работает в противоточном процессе. Патент США US 3582488 A в качестве устройства, отвечающего за давление на выходе, описывает зажим, чтобы добиваться концентрирования продукта в результате создания собственно потока вещества, однако не для того, чтобы способствовать улучшению замены буферного раствора.

KURNIK с соавт. раскрывает замену буферного раствора белков посредством противоточного диализа с применением нескольких соединенных в серию половолоконных мембранных модулей, без регулирования выходного потока для контроля собственно потока вещества. Может достигаться 100-кратное обеднение по содержанию (KURNIK RONALD Т с соавт.: «Buffer exchange using size exclusion chromatography, countercurrent dialysis, and tangential flow filtration: Models, development, and industrial application)), BIOTECHNOLOGY AND BIOENGINEERING - COMBINATORIAL CHEMISTRY, WILEY, NEW YORK, NY, US, Bd. 45, Nr. 2, 1. Januar 1995 (1995-01-01), страницы 149-157, XP002311649).

Следовательно, первая задача состояла в том, чтобы предоставить решение, которое делает возможным регулирование потока продукта, в частности, регулирование концентрации, рН и/или электрической проводимости непрерывного потока продукта, при помощи замены буферного раствора. В частности, это решение должно быть гибким и позволять настройку потока продукта для требований одной или нескольких различных хроматографических стадий очистки.

Задача была решена при помощи использования в блоке ультрафильтрации по меньшей мере одного, работающего в прямотоке, противотоке или перекрестном токе, предпочтительно в противотоке, половолоконного ультрафильтрационного модуля (= капиллярного ультрафильтрационного модуля), предпочтительно модуля для гемодиализа, в котором протекают поток продукта (= потоку поступающего материала) и промывочная жидкость (= диализату), причем замена буферного раствора осуществляется без циркуляционного течения потока продукта и промывочной жидкости в этом половолоконном ультрафильтрационном модуле.

Поток продукта, который подается в капилляры, как обычно в мембранной технологии, в этой заявке также называется потоком поступающего материала или поступающим сырьем. Поток продукта, который извлекается из капилляров, как обычно в мембранной технологии, в этой заявке также называется ретентатом.

Промывочная жидкость, которая подается в капилляры, как обычно в мембранной технологии, в этой заявке также называется диализатом, диализным буферным раствором или пермеатом. Промывочная жидкость, которая извлекается из капилляров, в этой заявке также называется потоком отходов.

Обычно применяются коммерчески доступные половолоконные ультрафильтрационные модули / капиллярные ультрафильтрационные модули. При этом номинальное отсечение по молекулярной массе (англ. Molecular Weight Cut-off (MWCO)) мембраны для ультрафильтрации следует выбирать так, что мембрана задерживает целевой продукт в полых волокнах/капиллярах таким образом, что не превышается потеря выхода ≤90%, предпочтительно ≤30%, и особенно предпочтительно ≤10%. При этом молекулы и ионы меньшего размера не задерживаются мембраной. Под потерей выхода подразумевается потеря продукта, проходящего сквозь мембрану, в соотношении с продуктом в потоке поступающего материала и обычно измеряется или соответственно анализируется при помощи измерений для образца посредством известных методов, таких как, например, хроматографические методы, твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA), и т.д.

Преимуществом является то, что капиллярные ультрафильтрационные модули, стерилизованные паром или соответственно стерилизованные гамма-излучением, в соответствии с требованиям фармацевтической промышленности, являются коммерчески доступными. Например, в испытательной установке использовались модули для гемодиализа Revaclear 300 Capillary Dialyzer фирмы Gambro, включающие капилляры из смеси полимеров из простого полиарилэфирсульфона (ПАЭС) и поливинилпирролидона (ПВП) с внутренним диаметром 190 мкм и с толщиной стенки 35 мкм. (http://www.gambro.com/PageFiles/21256/Revaclear%20White%20Paper.pdf?e pslanguage=en). В качестве альтернативы также может применяться половолоконный модуль, такой как, например, Process Scale Ultrafiltration Hollow Fiber Cartridge (UFP-750-E-55A) фирмы GE Healthcare.

Согласно изобретению поток поступающего материала контролируемо подается в полые волокна/капилляры ультрафильтрационного модуля, а промывочная жидкость контролируемо подается с боковой стороны. Ретентат контролируемо выводится из полых волокон/капилляров и подается дальше в установку. Неожиданным образом было установлено, что замена буферного раствора может успешно проводиться без циркулирующего течения потока продукта. Это происходит уже при использовании одного единственного ультрафильтрационного модуля. Однако может быть предпочтительным соединять несколько ультрафильтрационных модулей в серию или параллельно. При этом способе промывочная жидкость закачивается или в прямотоке, в перекрестном токе или в противотоке, предпочтительно в перекрестном токе, особенно предпочтительно в противотоке к потоку поступающего материала. Эксплуатация в противотоке, при которой поток продукта (например, раствор белка в буферном растворе А) при этом течет снизу вверх сквозь полые волокна/капилляры ультрафильтрационного модуля, в то время как промывочная жидкость (буферный раствор S) проводится с боковой стороны, обычно сверху вниз, проходя около полых волокон/капилляров, делает возможной более высокую чистоту (эффективность замены буферного раствора) при меньшем количестве промывочной жидкости. Так же поток продукта может протекать сверху вниз через капилляры модуля для гемодиализа, в то время как промывочная жидкость с боковой стороны, снизу вверх, проводится мимо около капилляров. Неожиданным образом было установлено, что это простое решение делает возможной эффективную замену буферного раствора потока продукта также при непрерывной работе.

Для перемещения потока продукта (= потоку поступающего материала) и промывочной жидкости (= пермеату) в каждом случае применяется насос. Для контролируемого отвода потока продукта из капилляров (= ретентату) обычно в качестве средства для регулируемого отвода потока продукта применяется другой насос или регулирующий вентиль. В результате применения насоса для контролируемого отвода ретентата (= насосу для ретентата) упрощается регулирование отвода ретентата. Именно при использовании стерильной одноразовой технологии (англ. disposable) это является предпочтительным, особенно при небольших интенсивностях потока, поскольку в данном случае не имеется адекватных датчиков расхода, которые достоверно измеряют меньшие интенсивности потока (≤100 мл/мин). Особенно предпочтительно здесь могут использоваться перистальтические насосы, с тем преимуществом, что перистальтические одноразовые насосы являются коммерчески доступными, так что доступными являются стерильность и также одноразовая технология.

Если применяются только три насоса - то есть, два насоса для перемещения потока поступающего материала (= насосу для поступающего сырья) и пермеата (= насосу для пермеата) и насос для ретентата, то четвертый поток является неконтролируемым. Возможные нарушения в случае одного из трех насосов могут остаться незамеченными. Поэтому для контролируемого отвода промывочной жидкости устанавливается соотношение давлений между стороной капилляров и боковой стороной (= внешней стороной). Это обычно так же осуществляется посредством применения в качестве средства для регулируемого отвода промывочной жидкости дополнительного насоса или регулирующего вентиля для отвода промывочной жидкости. Блоки ультрафильтрации согласно изобретению, включающие капиллярный ультрафильтрационный модуль, в качестве примера представлены на Фиг. 1 и 2 без того, чтобы ими ограничиваться.

Движение потока поступающего материала и движение потока промывочной жидкости (= диализному буферному раствору) осуществляются посредством насосов. Движение потока ретентата предпочтительно осуществляется посредством нагнетательного поршневого насоса, такого как перистальтический насос (Фиг. 1), или соответственно в качестве альтернативы, посредством регулирующего вентиля и управления потоком (вариант исполнения не представлен).

Предпочтительно соотношение давлений входящих потоков (Фиг. 1, поступающего сырья и диализного буферного раствора) регулируется, чтобы предотвратить проскакивание потока с одной стороны мембраны к другой. Для этого, как представлено на Фигуре 1, может использоваться дополнительный четвертый насос на выходе пермеата (Фиг. 1) или предпочтительно выход пермеата ограничивается при помощи вентиля или гидростатического давления (Фиг. 2).

В случае варианта исполнения с четырьмя насосами, предпочтительно три насоса - два насоса для перемещения потока поступающего материала и промывочной жидкости (= насосу для пермеата) и насос для ретентата - работают регулируемо, в то время как насос для контролируемого отвода промывочной жидкости (= насосу для отходов) управляется посредством датчика давления. Точнее говоря, насос для отходов управляется так, что давление в модуле для гемодиализа устанавливается, например, на 200 мбар, при измерении на стороне пермеата. Тогда этот управляемый давлением насос для отходов должен перемещать в точности объемный поток/интенсивность потока насоса для поступающего материала. При более низкой интенсивности потока один из перемещающих внутрь насосов - насос для поступающего материала или для пермеата, или из перемещающих наружу насосов (насос для ретентата или для отходов) является неисправным. Таким образом можно без измерения потока наблюдать, все ли насосы перекачивают исправно.

Предпочтительно для регулирования давления на выходе пермеата применяются вентиль или гидростатическое давление.

Другой вариант исполнения блока ультрафильтрации схематично представлен на Фиг. 3, без того, чтобы им ограничиваться. Насос М0303 перемещает объемный поток в один или несколько модулей для гемодиализа (диализные модули). Предпочтительно один или несколько модулей для гемодиализа соединены в серию. Датчик давления Р0303 предпочтительно осуществляет контроль давления поступающего материала в блок ультрафильтрации. Если это давление превышает максимальное давление, стадия отключается. После блока ультрафильтрации насос M0304 предпочтительно перекачивает точно так же быстро, как и M0303, чтобы предотвратить изменение концентрации продукта в модуле для гемодиализа и образование слоя геля на мембране. Насос M0304 перемещает ретентат после диализа в промежуточную емкость В0302. Промывочная жидкость посредством насоса M0305 с более быстрой интенсивностью потока, чем у M0303, закачивается на сторону пермеата модуля для гемодиализа (= боковой стороне капилляров). При этом интенсивность потока насоса М0303 устанавливается настолько высокой, чтобы в ретентате достигались желаемые концентрации буферного раствора. Отработанная промывочная жидкость собирается в емкости В0304.

Первым объектом настоящей заявки является блок для непрерывной ультрафильтрации потока поступающего материала, который содержит биофармацевтические и биологические макромолекулярные продукты, который включает по меньшей мере один капиллярный ультрафильтрационный модуль, причем

- по меньшей мере один насос перемещает поток поступающего материала в капилляры ультрафильтрационного модуля,

- насос вытесняющего действия перемещает поток поступающего материала из капилляров и

- по меньшей мере один дополнительный насос создает ток промывочной жидкости по внешней стороне капилляров,

- указанный блок свободен от мер для циркулирующего течения потока поступающего материала и промывочной жидкости в ультрафильтрационный модуль.

Предпочтительно применяется средство для регулируемого отвода промывочной жидкости из ультрафильтрационного модуля.

Другим объектом заявки является способ непрерывной ультрафильтрации потока поступающего материала, содержащего биофармацевтические и биологические макромолекулярные продукты, в блоке для непрерывной ультрафильтрации согласно изобретению, причем поток поступающего материала посредством промывочной жидкости промывается посредством по меньшей мере одной капиллярной мембраны для ультрафильтрации капиллярного ультрафильтрационного модуля, посредством подачи указанного потока поступающего материала в капилляр, а промывочная жидкость протекает по внешней стороне этих капилляров, причем поток поступающего материала и промывочная жидкость непрерывно подаются в ультрафильтрационный модуль и непрерывно отводятся из ультрафильтрационного модуля, причем поток поступающего материала и промывочная жидкость перемещаются через ультрафильтрационный модуль без циркуляции.

Чтобы достичь эффективного обмена небольших молекул и ионов между сторонами мембраны, чистый объемный поток над мембраной максимально возможно минимизируется, так что транспорт, как в процессе диализа, в максимальной мере осуществляется диффузионно. В частности, диффузионный транспорт достигается, когда разбавление или концентрирование не проходящих сквозь мембрану веществ осуществляется максимально в 1 до 5 раз, предпочтительно в 1 до 2 раз, особенно предпочтительно в 1 раз.

Согласно изобретению несколько ультрафильтрационных модулей могут соединяться в серию или параллельно. При этом количество ультрафильтрационных модулей в серии следует выбирать так, чтобы общая потеря давления в ультрафильтрационных модулях не превышала 1 бар. Число параллельно подключенных ультрафильтрационных модулей следует выбирать так, чтобы течение потока поступающего материала в капиллярах не превышало максимальной интенсивности потока, рекомендованной изготовителем, предпочтительной является интенсивность потока, составляющая от 0,1 до 15% от рекомендованной интенсивности потока, особенно от 0,1 до 5% от этой интенсивности потока.

Например, в испытательной установке применялись модули для гемодиализа Revaclear 300 Capillary Dialyzer фирмы Gambro. В этих модулях не должен был превышаться поток поступающего сырья 500 мл/мин, предпочтительно 75 мл/мин, еще лучше 25 мл/мин, на каждый модуль. Модули могут объединяться в серию таким образом, что общая разность давлений между входом и выходом модулей (= потере давления на мембранах капиллярного ультрафильтрационного модуля) не превышает рекомендованную интенсивность потока, составляющую 1 бар.

Чтобы достичь как можно более высокого обеднения по содержанию загрязнений в ретентате, соотношение потока промывочной жидкости (= потоку диализата) и потока поступающего материала обычно выбирается как можно более высоким. Точная величина этого соотношения зависит от требуемого минимального обеднения по содержанию, а также от скорости диффузии молекулы. При этом поток диализата в модуле также не должен превышать максимального, рекомендованного изготовителем потока. С экономической точки зрения также является полезным ограничивать поток диализата. Обычной практикой для работающего в периодическом режиме процесса диафильтрации является устанавливать соотношение количества промывочной жидкости и количества жидкости поступающего сырья, равное 3-6, в отдельных случаях 10. В способе согласно изобретению в качестве первой отправной точки может выбираться сравнимое регулирование соотношения потока диализата и потока поступающего материала, составляющее 3-6, и, как правило, экспериментально подстраивается под свойства продукта.

Неожиданно оказалось, что первичное заполнение (ввод в эксплуатацию при помощи промывки и удаления воздуха) модуля для диализа имеет решающее значение для качества промывки, поскольку в противном случае используются не все капилляры. По причине предпочтительно низких интенсивностей потока особенной сложностью является удалить воздух из модуля для диализа, как со стороны капилляров, так и с боковой стороны.

Согласно изобретению каждый модуль для диализа перед вводом в эксплуатацию, как со стороны поступающего материала, так и с боковой стороны, предпочтительно промывается посредством буферного раствора, составляющего по меньшей мере от 10% до 100%, предпочтительно от 15 до 100%, и особенно предпочтительно от 30 до 100%, от рекомендованной производителем скорости тока крови, пока из диализного модуля больше не будут выделяться пузырьки газа. При этом критично, чтобы как сторона поступающего материала, так и боковая сторона, не имели пузырьков.

Согласно изобретению поток поступающего материала и поток диализата регулируются таким образом, что эти потоки являются четко определенными, то есть, не может произойти никакого нежелательного потока собственно вещества из пространства поступающей смеси (= внутренней части капилляров) в пространство диализата (= внешней стороне капилляров/боковой стороне) или наоборот. Для этого могут приниматься следующие меры:

- наблюдение за потоком продукта при помощи фиксируемых автономно/в режиме реального времени УФ-сигналов, электрической проводимости, рН, измерения потока или автономных измерений для определения качества продукта, таких как высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ), твердофазный ИФА и т.д.

- может быть предпочтительным, подвергать действию давления боковую сторону (= пространству диализата) или сторону поступающего материала (= пространству поступающего материала). Для этой цели на соответствующих местах выхода может использоваться средство для регулируемого отвода соответствующей жидкости, или насос или вентиль.

Блок для контролируемой ультрафильтрации согласно изобретению в соответствии с изобретением встраивается в производственную установку, в частности, в производственную установку для непрерывного или полунепрерывного проведения одной или нескольких из указанных выше стадий производства.

Поэтому другим объектом заявки является производственная установка, которая включает по меньшей мере один блок согласно изобретению для контролируемой ультрафильтрации потока продукта, который содержит содержащиеся биофармацевтические и биологические продукты.

Кроме того, в некоторых из приведенных выше стадий производства для получения биофармацевтических и биологических продуктов имеет место последовательность разбавлений и концентрирований потока продуктов, которые представляют собой сложную задачу для непрерывного проведения процесса.

Предпочтительно производственная установка согласно изобретению до или после одного из блоков для непрерывной ультрафильтрации потока продукта включает блок для концентрирования потока продукта (также называемый блоком концентрирования). Предпочтительно блок для непрерывной ультрафильтрации согласно изобретению в производственной установке соединен с выходным трубопроводом блока для концентрирования. Согласно изобретению блок для концентрирования, как примерно представлено на Фиг. 3, включает циркуляционный контур (= контуру концентрирования), а в этом концентрационном контуре один или несколько мембранных модулей с выходом для пермеата, насос M0302 для регулирования циркуляционного течения в контуре концентрирования и емкость для удаления воздуха (без нумерации). В контуре концентрирования поток продукта непрерывно концентрируется. Насос М0301 перемещает поток продукта обычно из промежуточной емкости в контур концентрирования. В качестве мембранного модуля обычно применяются один или несколько ультрафильтрационных ФТП-модулей (фильтрации в тангенциальном потоке, англ. CFF - Cross Flow Filtration), в качестве альтернативы ультрафильтрационных модулей ATF (фильтрации в переменном тангенциальном потоке - англ. Alternating Tangential Flow), однако предпочтительно модуль ФТП. Например, в испытательной установке применялись ФТП-модули RTF UFP-30-C-5S фирмы GE Healthcare LifeScience.

Интенсивность подачи М0302 обычно устанавливается по меньшей мере на минимальную скорость перетока, которая приводится изготовителем мембраны. Например, для модуля RTP UFP-30-C-5S устанавливают по меньшей мере 2 л/мин.

Насос М0303 перемещает поток продукта из контура концентрирования. При этом интенсивность подачи насоса M0303 устанавливается в соотношении с интенсивностью подачи насоса М301. Это соотношение соответствует желаемому коэффициенту концентрирования. При этом на датчиках давления Р0301 и Р0302 устанавливается давление, которое способствует тому, что жидкость из контура концентрирования проходит через мембрану, однако биологический продукт при этом в максимальной мере задерживается. Обычно применяется мембрана, которая задерживает по меньшей мере 90%, предпочтительно 90-95%, особенно предпочтительно 95-100%, биологического продукта. В описанной конструкции применяется один насос, который также может поддерживать исходное давление без того, чтобы жидкость протекала через насос и не через мембрану. Предпочтительно здесь применяется шланговый перистальтический насос. В качестве альтернативы также может использоваться комбинация регулирующего вентиля и измерителя расхода, посредством которой регулируется поток пермеата.

Протекающий через мембрану мембранного модуля пермеат собирается через выходное устройство для пермеата в резервуаре В0304. Датчик давления Р0301 между насосом M0301 и контуром концентрирования контролирует давление перед мембранным модулем и может приводить к отключению М0302, если превышается максимальное давление. В этом случае мембранный модуль должен заменяться. Предпочтительно контур концентрирования в этом случае, как целое, заменяется на новый, стерилизованный. Однако при использовании мембранных кассет совершенно обычным является использовать кассеты параллельно. Мембранные кассеты могут быть расположены серией или параллельно, предпочтительно параллельно. Обычно датчик давления Р0302 измеряет давление за контуром концентрирования, благодаря чему может определяться трансмембранное давление. Обычно датчик расхода F0301 (не представлен) измеряет объемный поток в контуре концентрирования. Насос М0303 с фиксированным соотношением с интенсивностью подачи M0301 передает объемный поток из контура концентрирования в конструктивную единицу ультрафильтрации.

Соблюдение стерильности представляет собой еще одну сложность и задачу для (полу)непрерывной производственной установки. В производственной установке согласно изобретению все элементы соединены друг с другом трубопроводами, в частности, одноразовыми трубопроводами. Например, используются биосовместимые трубки Pharmed ВРТ® (устойчивые к температуре силиконовые шланги). Другие элементы установки также предпочтительно являются одноразовыми элементами; в частности, применяются элементы, выбранные из группы одноразовых реакторов, одноразовых фильтрующих элементов, одноразовых вентилей, одноразовых датчиков (потока, рН, электрической проводимости, УФ, давления), одноразовые системы удерживания клеток, одноразовые шланги, одноразовые мембраны, одноразовые соединительные детали, одноразовые хроматографические колонки, одноразовые резервуары, одноразовые системы отбора проб. Также средства для перемещения жидкости, в частности, насосы, предпочтительно являются одноразовыми насосами.

Для замены мембранного модуля и/или ультрафильтрационного модуля обычно поток продукта прерывается и на время замены наполняется промежуточная емкость (промежуточная емкость В0301 на Фиг. 3).

В результате применения блока стерилизующего фильтрования для дополнительной осветляющей фильтрации микроорганизмов продолжительность службы соответствующего модуля может улучшаться таким образом, что может быть допустимо прерывание и задерживание (= выдерживанию) потока продукта в промежуточной емкости на время замены.

Как альтернатива контуру концентрирования, в качестве блока для концентрирования потока продукта может применяться одна или несколько фильтрационных кассет тангенциального потока Cadence™ Single-Pass Tangential Flow фирмы Pall Corp (патент США US 7.682.511 B2, http://www.pall.com/main/biopharmaceuticals/product.page?id=52742).

В результате стадии концентрирования объемный поток заметно снижается, а концентрация продукта повышается.

Пример и испытательная установка:

Для исследования применимости решения согласно изобретению для замены буферного раствора потока продуктов из ферментативного бульона в качестве примера была сконструирована испытательная установка согласно Фиг. 3. В качестве трубопроводов этой испытательной установки применялись трубки Pharmed ВРТ® с внутренним диаметром 3,2 мм. Помимо элементов Фиг. 3, эта испытательная установка включала резервуар объемом 10 л, заполненный в качестве тестового потока продуктов освобожденным от клеток ферментативным бульоном. Первый насос (M0301), соединенный посредством трубопроводов с резервуаром (не представлен) передавал поток продуктов, как представлено на Фиг. 3, поначалу в блок концентрирования. В качестве молекулы для испытаний было выбрано антитело иммуноглобулина G (IgG-антитело).

Блок концентрирования включал насос M0302 для

рециркуляции/протекания в контуре концентрирования, емкость для удаления воздуха (без нумерации), соединенные посредством трубопроводов и управляемых вручную шланговых задвижек АВ0301, АВ0302 и АВ0303 с контуром концентрирования и мембранным модулем (UF-Modul 3.1). В качестве мембранного модуля для примера применялся ультрафильтрационный ФТП-модуль RTP UFP-30-C-5S фирмы GE Healthcare LifeScience.

Интенсивность подачи M0302 была установлена на минимальную скорость перетока, которая приводится изготовителем мембраны. Например, для модуля RTP UFP-30-C-5S было установлено по меньшей мере 2 л/мин. Перед непосредственным концентрированием сначала из контура концентрирования удаляется воздух путем частичного открытия АВ0301 и АВ0303 и АВ0302. Когда контур концентрирования не содержит пузырьков газа, АВ0302 открывается полностью, а АВ0301 и АВ0303 закрываются.

Насос М0303 перемещал поток продукта из контура концентрирования. При этом интенсивность подачи насоса М0303 устанавливалась в соотношении с интенсивностью подачи насоса М0301, которая соответствовала желаемому коэффициенту концентрирования. На датчиках давления Р0301 и Р0302 устанавливалось давление, которое способствовало тому, что жидкость из контура концентрирования проходила сквозь мембрану, однако биологический продукт при этом в максимальной мере задерживался.

Протекающий через мембрану мембранного модуля пермеат собирался в резервуаре В0304. Датчик давления Р0301 между насосом М0301 и контуром концентрирования контролировал давление перед мембранным модулем и мог приводить к отключению M0302, если превышалось максимальное давление. В этом случае мембранный модуль должен был заменяться. Датчик давления Р0302 измерял давление за контуром концентрирования, благодаря чему могло определяться трансмембранное давление. Датчик расхода F0301 (не представлен) измерял объемный поток в контуре концентрирования.

Насос M0303 с фиксированным соотношением с интенсивностью подачи M0301 передавал объемный поток из контура концентрирования в следующий затем блок ультрафильтрации.

В испытательной установке, включающей блок ультрафильтрации, как представлено на Фиг. 3, применялся модуль для гемодиализа (Dialyse Modul) Revaclear 300 Capillary Dialyzer фирмы Gambro, включающий капилляры из смеси полимеров из простого полиарилэфирсульфона (ПАЭС) и поливинилпирролидона (ПВП) с внутренним диаметром 190 мкм и толщиной стенки 35 мкм (http://www.gambro.com/PageFiles/21256/Revaclear%20White%20Paper.pdf?e pslanguage=en).

Насос M0303 перемещал объемный поток в модуль для гемодиализа. Датчик давления Р0303 отслеживал давление поступающего сырья блока ультрафильтрации.

Перед запуском в работу модуля для гемодиализа как сторона поступающего сырья, так и боковая сторона, промывались посредством буферного раствора (= промывочной жидкости) с 80-100 мл/мин скорости тока крови, пока больше никакие пузырьки газа не выделялись из модуля (первичное заполнение). При этом было критичным, чтобы как сторона подаваемого сырья, так и боковая сторона, не имели пузырьков.

Тогда для замены буферного раствора потока продуктов поток поступающего сырья устанавливали на 3 мл/мин на каждый модуль.

Диализный буферный раствор (промывочная жидкость) посредством насоса М0305 с интенсивностью потока 3 или соответственно 6 мл/мин, как поток из М0303, закачивался в противотоке к потоку поступающего сырья на сторону пермеата модуля или соответственно модулей для гемодиализа. При этом интенсивность потока в M0303 была установлена настолько высокой, чтобы в продукте достигались желаемые концентрации буферного раствора. Отработанная промывочная жидкость собиралась в емкости В0304.

Потоки поступающего сырья и диализата регулировались/устанавливались таким образом, что эти потоки являлись четко определенными, то есть, не могло произойти никакого нежелательного потока собственно вещества из пространства поступающего сырья (= внутренней части капилляров) в пространство диализата (= внешней стороне капилляров) или наоборот.

Для этого принимались следующие меры:

наблюдение за потоком продукта при помощи фиксируемых автономно/в режиме реального времени сигналов, таких как УФ, электрическая проводимость, рН, измерения потока, или автономных измерений для определения качества продукта, таких как высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ), твердофазный ИФА.

После блока ультрафильтрации насос М0304, точно так же быстро, как и М0303, чтобы предотвратить изменение концентрации продукта в модуле для диализа и образование слоя геля на мембране, перекачивал концентрированный и подвергнутый диализу поток продукта в промежуточную емкость В0302, наполнение которой контролировалось посредством весоизмерительного датчика W0302.

Потери выхода и успешная замена буферного раствора потока продуктов подтверждались при помощи определения концентраций продукта, глюкозы и соли.

В первом эксперименте испытывали ионный обмен с помощью потока продуктов без биологического продукта.

Таблица А показывает измерения электрической проводимости поступающего сырья (ЭП сырья) и ретентата (ЭП ретентата) при различных целевых интенсивностях соответствующих насосов.

В другом эксперименте тестировали ионный обмен с помощью потока продуктов с антителами IgG (измеренный посредством ВЭЖХ Prot А).

Таблица В показывает измерения электрической проводимости ретентата (ЭП ретентата) при различных целевых интенсивностях соответствующих насосов и концентрацию антител IgG в ретентате, измеренную посредством ВЭЖХ Prot А.

Также была определена концентрация IgG в пермеате, в средней пробе при повышенной интенсивности потока посредством вышеуказанного метода для расчета потери выхода. Потеря выхода в пермеате в соответствии с этим составила 1,4%.

Измерение концентрации ацетата натрия посредством ионной хроматографии показывает успешную замену буферного раствора потока продукта.

Работы, которые проводились для данной заявки, были поддержаны в соответствии с соглашением о финансовой поддержке «Bio.NRW: MoBiDiK - Modulare Bioproduktion - Disposable und Kontinuierlich» в рамках Европейского фонда регионального развития (European Regional Development Fund).

1. Блок для непрерывной ультрафильтрации потока поступающего материала, который содержит биофармацевтические и биологические макромолекулярные продукты, включающий по меньшей мере один капиллярный ультрафильтрационный модуль, причем

- по меньшей мере один насос перемещает поток поступающего материала в капилляры ультрафильтрационного модуля,

- насос вытесняющего действия перемещает поток поступающего материала из капилляров и

- по меньшей мере один дополнительный насос создает ток промывочной жидкости по внешней стороне капилляров,

- указанный блок свободен от мер для циркулирующего течения потока поступающего материала и промывочной жидкости в ультрафильтрационный модуль и

- ультрафильтрационный модуль свободен от пузырьков со стороны капилляров и боковой стороны, причем свобода от пузырьков достигается через процесс первичного заполнения, при котором как сторона поступающего материала, так и боковая сторона промывается посредством буферного раствора, пока из диализного модуля больше не будут выделяться пузырьки газа.

2. Блок по п. 1, включающий дополнительно средство для регулируемого отвода промывочной жидкости из ультрафильтрационного модуля.

3. Блок по одному из пп. 1 или 2, причем несколько капиллярных ультрафильтрационных модулей соединены в серию или параллельно.

4. Способ непрерывной ультрафильтрации потока поступающего материала, содержащего биофармацевтические и биологические макро-молекулярные продукты в блоке для непрерывной ультрафильтрации, причем поток поступающего материала промывают промывочной жидкостью посредством по меньшей мере одной капиллярной мембраны для ультрафильтрации капиллярного ультрафильтрационного модуля посредством подачи указанного потока поступающего материала в капилляр, а промывочную жидкость перемещают по внешней стороне капилляра, причем поток поступающего материала и промывочную жидкость непрерывно подают в ультрафильтрационный модуль и нерерывно отводят из ультрафильтрационного модуля, причем поток поступающего материала и промывочную жидкость перемещают в ультрафильтрационный модуль без циркуляции, а отвод потока поступающего материала (содержащего ретентат) регулируют таким образом, что нежелательные результирующие потоки из внутренней части капилляра не могут пройти на внешнюю сторону капилляра или наоборот и где свобода от пузырьков в ультрафильтрационном модуле достигается через процесс первичного заполнения, в котором как сторона поступающего материала, так и боковая сторона промывается посредством буферного раствора, пока из диализного модуля больше не будут выделяться пузырьки газа.

5. Способ по п. 4, причем в блоке для непрерывной ультрафильтрации продукт в потоке поступающего материала концентрируют максимально в 2 раза или соответственно разбавляют в 2 раза.

6. Способ по п. 4, причем промывочную жидкость подают в перекрестном токе или противотоке, предпочтительно в противотоке, к потоку поступающего материала.

7. Способ по любому из пп. 4-6, причем несколько капиллярных ультрафильтрационных модулей соединяют в серию или параллельно и максимальная потеря давления в мембранах капиллярных ультрафильтрационных модулей не превышает 1 бар.