Способ оценки функциональной активности гликопротеина-p в гематоэнцефалическом барьере

Изобретение относится к медицине, а именно к фармакологии и клинической фармакологии, и может быть использовано с целью оценки функциональной активности гликопротеина-Р (Pgp) в гематоэнцефалическом барьере для осуществления эффективной и безопасной фармакотерапии ряда неврологических заболеваний. Способ оценки функциональной активности гликопротеина-P в гематоэнцефалическом барьере по фармакокинетике его маркерного субстрата фексофенадина включает внутривенное введение фексофенадина лабораторным животным с последующим расчетом отношения площади под кривой "концентрация фексофенадина в плазме − время" к площади под кривой "концентрация фексофенадина в коре головного мозга − время" − AUC0-t-мозг / AUC0-t-плазма. 1 ил.

 

Изобретение относится к медицине, а именно к фармакологии и клинической фармакологии, и может быть использовано с целью оценки функциональной активности гликопротеина-Р (Pgp) в гематоэнцефалическом барьере для осуществления эффективной и безопасной фармакотерапии ряда неврологических заболеваний.
Pgp − АТФ-зависимый белок-транспортер, удаляющий в мочу, желчь и просвет органов широкий спектр липофильных эндогенных и экзогенных, в том числе лекарственных, веществ. Локализуясь в гематоэнцефалическом барьере, он препятствует проникновению его субстратов в головной мозг, с чем связывают развитие лекарственно-резистентной эпилепсии, болезни Альцгеймера и неэффективности фармакотерапии острого нарушения мозгового кровообращения.
Известны модели для изучения проникновения веществ в центральную нервную систему на культурах капиллярных эндотелиальных клетках мозга [Naik P., Cucullo L. // J. Pharm. Sci. 2012. V. 101. P. 1337–1354.]. Однако эксперименты in vitro не дают возможности полноценно проанализировать функционирование транспортеров, в том числе Pgp, в гематоэнцефалическом барьере на организменном уровне. Следует также отметить, что для проведения исследований на культурах клеток необходимо дорогостоящее оборудование и материалы.
Известен способ определения функциональной активности Pgp на уровне целостного организма [RU2587780C1]. Сущность способа заключается в том, что в качестве маркерного субстрата кроликам однократно перорально вводится фексофенадин в дозе 67,5 мг/кг массы в форме суспензии, приготовленной на воде очищенной, далее 3 раза у животных производится забор крови с последующим анализом плазменной концентрации фексофенадина. Для оценки функционирования Pgp рассчитывают его максимальную концентрацию − Cmax, значение которой обратно пропорционально функциональной активности белка-транспортера. Однако данным способом возможно оценить активность Pgp во всем организме, а не локально в гематоэнцефалическом барьере.

Известен способ оценки функционирования Pgp в ГЭБ in vivo по анализу церебрального объема распределения R-11C-верапамила (субстрата Pgp) методом протонно-эмиссионной томографии [O.L. de Klerk, A.T.M. Willemsen, M. Roosink, A.L. Bartels, N.H. Hendrikse, F.J. Bosker. // Int. J. Neuropsychopharmacol.  2009. V.12. P.895–904]. Однако в связи с медленным поступлением указанного вещества в мозг, при повышенной функциональной активности белка-транспортера может наблюдаться большой шум сигнала, что затрудняет анализ [Syvanen S., Hammarlund-Udenaes M. Curr Top Med Chem. 2010. V. 10. P. 1799–1809]. Кроме того, оборудование для протонно-эмиссионной томографии является весьма дорогостоящим, а работа с радиоактивными изотопами, которые сами по себе являются весьма токсичными и небезопасными, требует наличия соответствующей лаборатории и высокой квалификации сотрудников.

Техническим результатом настоящего изобретения является разработка способа оценки функциональной активности Pgp локально в гематоэнцефалическом барьере, который был бы безопасен, информативен, не требовал бы дорогостоящего лабораторного оборудования, материалов и комплектующих.
Для решения поставленной задачи был выполнен эксперимент на 90 крысах-самцах вистар массой 200–350 г.
Оценку функциональной активности Рgp проводили по количественному анализу его маркерного субстрата – фексофенадина, фармакокинетика которого (всасывание, распределение, выведение и проникновение в головной мозг) зависит преимущественно от функционирования данного белка-транспортера. Введение индуктора белка-транспортера совместно с его субстратом приводит к снижению всасывания субстрата, уменьшению его проникновения через ГЭБ и ускорению выведения почками и печенью, а применение ингибитора Рgp – к обратному изменению фармакокинетики субстрата [Якушева Е.Н., Черных И.В., Щулькин А.В., Попова Н.М. Успехи физиологических наук. 2014. Т. 45 (4). С. 89-98]. Поэтому для подтверждения адекватности разработанного способа животным вводили фексофенадин после введения индуктора Pgp и его ингибитора.

Первой группе (n=30) в хвостовую вену вводили фексофенадин в дозе 10 мг/кг [Jaisue S.,  Gerber J.P.,  Davey A.K.  // Xenobiotica. 2010. V. 40. № 11. P. 743–750].

Первоначально для оценки активности Pgp в ГЭБ предполагалось вводить фексофенадин перорально [RU2587780C1], однако его фармакокинетика оказалась вариабельной, поэтому в дальнейшем применялось внутривенное введение субстрата, при котором его биодоступность составляет 100%.

В связи с отсутствием лекарственной формы фексофенадина для парентерального введения производилась экстракция лекарственного вещества из таблеток "Аллегра", "Sanofi", Франция (180 мг) следующим образом. Одна таблетка измельчалась и суспендировалась в 20 мл ацетонитрила, после чего взбалтывалась на приборе Shaker в течение 15 мин с последующим центрифугированием 15 мин при 3500 об/мин. Надосадочный слой упаривали на роторно-вакуумном испарителе и сухой остаток растворяли в 10 мл воды для инъекций. Для исследования полученный раствор вводили в хвостовую вену крыс в объеме 2 мл/кг. Концентрацию фексофенадина в полученном растворе определяли методом ВЭЖХ.

Второй группе животных (n=30) в течение 14 дней вводили индуктор Pgp − рифампицин перорально в дозе 20 мг/кг два раза в день, а затем на 15-й день внутривенно вводили фексофенадин в дозе 10 мг/кг.

Третьей группе животных (n=30) за 30 мин до введения фексофенадина (10 мг/кг) внутривенно вводили ингибитор Pgp − мексидол в дозе 50 мг/кг [Якушева Е.Н., Щулькин А.В. , Черных И.В. // Экспер. и клин. фармакол. 2015. Т.78. №5. С.19–23; Новиков В.Е., Крюкова Н.О., Новиков А.С. // Экспер. и клин. фармакол. 2010. Т.73. №5. С.15−18].
Крыс выводили из эксперимента под золетиловым наркозом через 5, 10, 15, 30, 45 и 60 мин после введения фексофенадина. Для анализа у них забирали кровь в объеме 4 мл из брюшной аорты в гепаринизированные пробирки, а также кору больших полушарий головного мозга. Для экстракции фексофенадина из плазмы крови и ткани коры больших полушарий применяли ацетонитрил.
Количественное определение фексофенадина в плазме крови крыс и в гомогенате головного мозга производили на хроматографической системе "Stayer" с колонкой Phenomenex Synergi 4u Polar-RP 80A (250х4,6), зернение 4 мкм, при t=35°С и длине волны 220 нм. Подвижная фаза состояла из ацетонитрила, воды деионизированной, триэтиламина, кислоты уксусной ледяной (pH=6,0).
Суммарное количество фексофенадина, попавшее в системный кровоток, оценивали по площади под кривой "концентрация фексофенадина в плазме− время" (AUC0-t-плазма); суммарное количество фексофенадина, попавшее в кору больших полушарий − по площади под кривой «концентрация фексофенадина в коре головного мозга − время" (AUC0-t-мозг), которые рассчитывали по методу трапеции [Каркищенко Н.Н., Хоронько В.В., Сергеева С.А., Каркищенко В.Н. // Ростов-на-Дону: Феникс. 2001. 384 с.]. Для оценки проницаемости ГЭБ был рассчитан показатель AUC0-t-мозг/AUC0-t-плазма − отношение площади под кривой "концентрация фексофенадина в плазме − время" к площади под кривой "концентрация фексофенадина в коре головного мозга − время" [Kerns E.H., Di L. Drug-like Properties: Concepts, Structure Design and Methods: from ADME to Toxicity Optimizati. Academic Press. 2016. 560 p.].

Статистическая обработка результатов проводилась с использованием программы "Statsoft Statistica 7.0" (США).

Характер распределения полученных данных определяли по критерию Шапиро-Уилка. Учитывая, что распределение большинства данных было отличным от нормального, межгрупповые различия оценивали по критерию Крускала-Уоллиса, попарные сравнения выполняли по критерию Манна-Уитни с поправкой Бонферрони.

Концентрация фексофенадина в плазме крови крыс через 5 мин после его внутривенного введения в дозе 10 мг/кг массы (контроль) составила 16,6 мкг/мл, затем постепенно снижалась и достигала значения 1,0 мкг/мл к 60 мин исследования. Введение рифампицина (индуктор Pgp) существенно не влияло на фармакокинетику фексофенадина: площадь под фармакокинетической кривой концентрация-время (AUC0-t-плазма) статистически значимо не отличалась от показателей контрольных животных. Курсовое применение мексидола (ингибитор Pgp) вызывало повышение AUC0-t-плазма фексофенадина на 81,2% (p=0,07).

При внутривенном введении фексофенадина крысам вистар в дозе 10 мг/кг массы препарат проникал через ГЭБ и фиксировался в коре больших полушарий уже через 5 мин после введения, достигал максимальной концентрации через 15 мин, а затем его уровень начинал снижаться.

Применение индуктора Pgp – рифампицина перед введением фексофенадина приводило к достоверному снижению AUC0-t-мозг, что свидетельствует об уменьшении концентрации фексофенадина в коре головного мозга (фиг. 1). На фиг. 1: * - показаны достоверные различия (p<0,05) по сравнению с контролем.

Применение ингибитора Pgp – мексидола перед иньекцией фексофенадина приводило к достоверному повышению AUC0-t-мозг по сравнению с данными контрольных животных, что свидетельствует об увеличении концентрации фексофенадина в коре головного мозга (фиг. 1).

Показано, что при введении рифампицина показатель AUC0-t-мозг / AUC0-t-плазма достоверно уменьшался (фиг. 1), а при введении мексидола статистически значимо не отличался от данных контрольных животных (фиг. 1). Это обусловлено тем, что концентрация фексофенадина в плазме при приеме рифампицина существенно не изменялась, а концентрация в коре головного мозга снижалась, то есть происходило локальное увеличение активности Pgp в ГЭБ.

При приеме мексидола содержание фексофенадина повышалось как в плазме, так и в коре головного мозга. Это свидетельствует о том, что увеличение содержания фексофенадина в коре мозга связано не с локальным ингибированием Pgp в изучаемом барьере, а с системным повышением концентрации фексофенадина в организме при отсутствии изменений проницаемости ГЭБ.

Таким образом, для адекватной оценки функциональной активности Pgp в гематоэнцефалическом барьере по фармакокинетике его маркерного субстрата фексофенадина целесообразно определять не AUC0-t-мозг, а именно отношение AUC0-t-мозг / AUC0-t-плазма, а также использовать внутривенное введение маркерного субстрата Pgp фексофенадина лабораторным животным.

Способ оценки функциональной активности гликопротеина-P в гематоэнцефалическом барьере по фармакокинетике его маркерного субстрата фексофенадина, включающий внутривенное введение фексофенадина лабораторным животным с последующим расчетом отношения площади под кривой "концентрация фексофенадина в плазме − время" к площади под кривой "концентрация фексофенадина в коре головного мозга − время" − AUC0-t-мозг / AUC0-t-плазма.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к медицине, педиатрии, аллергологии, детской гастроэнтерологии. Комплексную диагностику пищевой аллергии к белкам коровьего молока у детей грудного возраста проводят путем выявления диагностических критериев.

Группа изобретений относится к модуляции уровней белков сыворотки для лечения пациентов с синдромом хрупкой X-хромосомы (FXS) и нарушениями аутистического спектра (ASD).

Группа изобретений относится к модуляции уровней белков сыворотки для лечения пациентов с синдромом хрупкой X-хромосомы (FXS) и нарушениями аутистического спектра (ASD).

Изобретение относится к области медицины, а именно к детской кардиологии. Изобретение представляет собой способ прогнозирования риска развития приобретенной кардиомиопатии перед занятиями спортом, включающий определение в сыворотке крови у детей за 1 месяц до начала занятий спортом концентрации тропонина-Т, N-концевого натрийуретического пептида, интерлейкина-4 (ИЛ-4) и интерлейкина-6 (ИЛ-6), при этом прогнозируют высокий риск развития приобретенной кардиомиопатии при концентрации тропонина-Т от 0,37 до 0,48 нг/мл, при концентрации N-концевого натрийуретического пептида от 66,2 до 77,1 пг/мл, при концентрации ИЛ-4 от 2,6 до 3,1 пг/мл и при концентрации ИЛ-6 от 7,3 до 9,7 пг/мл и прогнозируют низкий риск развития вторичной кардиомиопатии при концентрации тропонина-Т от 0,21 до 0,36 нг/мл, при концентрации N-концевого натрийуретического пептида от 35,3 до 43,5 пг/мл, при концентрации ИЛ-4 от 3,4 до 4,58 пг/мл и при концентрации ИЛ-6 от 5,6 до 6,9 пг/мл.

Изобретение относится к области медицины, а именно к детской кардиологии. Изобретение представляет собой способ прогнозирования риска развития приобретенной кардиомиопатии перед занятиями спортом, включающий определение в сыворотке крови у детей за 1 месяц до начала занятий спортом концентрации тропонина-Т, N-концевого натрийуретического пептида, интерлейкина-4 (ИЛ-4) и интерлейкина-6 (ИЛ-6), при этом прогнозируют высокий риск развития приобретенной кардиомиопатии при концентрации тропонина-Т от 0,37 до 0,48 нг/мл, при концентрации N-концевого натрийуретического пептида от 66,2 до 77,1 пг/мл, при концентрации ИЛ-4 от 2,6 до 3,1 пг/мл и при концентрации ИЛ-6 от 7,3 до 9,7 пг/мл и прогнозируют низкий риск развития вторичной кардиомиопатии при концентрации тропонина-Т от 0,21 до 0,36 нг/мл, при концентрации N-концевого натрийуретического пептида от 35,3 до 43,5 пг/мл, при концентрации ИЛ-4 от 3,4 до 4,58 пг/мл и при концентрации ИЛ-6 от 5,6 до 6,9 пг/мл.

Изобретение относится к медицине, а именно к эндокринологии, и может быть использовано для снижения уровней глюкозы у субъекта. Способ включает обеспечение субъекта рационом с низким содержанием белков, содержащим менее 10% калорий, приходящихся на источники белков, в течение первого периода времени, составляющего от 5 до 14 дней.

Изобретение относится к области медицины, а именно к детской кардиологии. Изобретение представляет собой способ прогнозирования риска развития приобретенной кардиомиопатии у спортсменов, включающий определение у детей, занимающихся спортом в течение 2-3 лет, в сыворотке крови концентрации тропонина-Т, N-концевого натрийуретического пептида, интерлейкина-4 (ИЛ-4) и интерлейкина-6 (ИЛ-6), при этом прогнозируют высокий риск развития приобретенной кардиомиопатии при концентрации тропонина-Т от 0,76 до 0,91 нг/мл, при концентрации N-концевого натрийуретического пептида от 78,2 до 92,5 пг/мл, при концентрации ИЛ-4 от 1,8 до 2,5 пг/мл и при концентрации ИЛ-6 от 8,3 до 10,1 пг/мл; прогнозируют низкий риск развития приобретенной кардиомиопатии при концентрации тропонина-Т от 0,48 до 0,72 нг/мл, при концентрации N-концевого натрийуретического пептида от 44,3 до 71,5 пг/мл, при концентрации ИЛ-4 от 3,2 до 4,0 пг/мл и при концентрации ИЛ-6 от 7,1 до 8,1 пг/мл.

Изобретение относится к области медицины, а именно к детской кардиологии. Изобретение представляет собой способ прогнозирования риска развития приобретенной кардиомиопатии у спортсменов, включающий определение у детей, занимающихся спортом в течение 2-3 лет, в сыворотке крови концентрации тропонина-Т, N-концевого натрийуретического пептида, интерлейкина-4 (ИЛ-4) и интерлейкина-6 (ИЛ-6), при этом прогнозируют высокий риск развития приобретенной кардиомиопатии при концентрации тропонина-Т от 0,76 до 0,91 нг/мл, при концентрации N-концевого натрийуретического пептида от 78,2 до 92,5 пг/мл, при концентрации ИЛ-4 от 1,8 до 2,5 пг/мл и при концентрации ИЛ-6 от 8,3 до 10,1 пг/мл; прогнозируют низкий риск развития приобретенной кардиомиопатии при концентрации тропонина-Т от 0,48 до 0,72 нг/мл, при концентрации N-концевого натрийуретического пептида от 44,3 до 71,5 пг/мл, при концентрации ИЛ-4 от 3,2 до 4,0 пг/мл и при концентрации ИЛ-6 от 7,1 до 8,1 пг/мл.

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для выявления in vitro субъекта, нуждающегося в жидкостной реанимации или во введении сосудосуживающего агента, или выявления пациента с риском развития физиологического шока.

Изобретение относится к биомаркерам и параметрам, используемым для прогнозирования преэклампсии. Способ прогнозирования преэклампсии у субъекта включает измерение кровяного давления (BP) у субъекта на сроке беременности приблизительно 15 недель; измерение в образце, взятом у субъекта уровня плацентарного фактора роста (PIGF), уровня неустойчивой к действию кислоты субъединицы комплексного белка, связывающегося с инсулиноподобным фактором роста (IGFALS); уровня мультимерина-2 (MMRN2), уровня гликопротеина клеточной поверхности MUC18 (MCAM), уровня дезинтегрина и белка, содержащего домен металлопротеиназы 12 (ADAM12); сравнение уровней биомаркеров и величины кровяного давления со стандартными величинами, полученными на том же самом сроке беременности у субъектов, у которых отсутствует соответствующее заболевание или риск развития такого заболевания; выявление отклонений или отсутствия отклонений уровней биомаркеров и величины кровяного давления по сравнению со стандартными величинами; прогнозирование ПЭ у субъекта по указанному отклонению или отсутствию отклонения.
Изобретение относится к медицине, а именно к стоматологии, и может быть использовано для подбора индивидуальных средств гигиены полости рта. Для осуществления способа индивидуального подбора средств гигиены полости рта у пациента осуществляют забор ротовой жидкости, очищают зубы механически без использования средств гигиены полости рта, определяют гидрофобность эмали зубов пациента методом «сидячей капли», из банка зубов, удаленных по медицинским показаниям, подбирают зубы, гидрофобность эмали которых соответствует гидрофобности эмали зубов пациента, зубы, предназначенные для исследования средств гигиены полости рта, очищают зубной щеткой средней жесткости с использованием соответствующего исследуемого средства гигиены, в качестве контроля используют зуб, не очищенный средством гигиены полости рта, зубы погружают в ротовую жидкость пациента и термостатируют при температуре 37°С, с интервалом исследования 1 час определяют время появления зубной бляшки на зубах и измеряют гидрофобность эмали зубов методом «сидячей капли», об эффективности средства гигиены полости рта судят по времени появления зубной бляшки и значению гидрофобности эмали по сравнению с контролем.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к способу выбора реципиента при пересадке трупной почки, включающему выявление антигенов HLA-A, HLA-B и HLA-DR, сопоставление эпитопов антигенов HLA-A и HLA-B потенциального реципиента и донора, а также выбор реципиента по полученным данным.

Изобретение относится к области медицины, а именно к способам интерпретации результатов лабораторных анализов, и может быть использовано при раке яичников для улучшения результатов лечения путем увеличения количества курсов или изменения тактики адъювантной химиотерапии при неблагоприятных значениях маркеров.

Изобретение относится к области микробиологии и предназначено для идентификации дрожжей рода Pichia. Осуществляют предварительное обогащение дрожжей, осаждение их центрифугированием, выделение ДНК с проведением ПЦР в реальном времени.

Изобретение относится к материаловедению, а именно к определению устойчивости материалов к биодеградации. Для этого подготавливают образцы с тестируемыми материалами, стерильную жидкую питательную среду (СЖПС) и питательную среду с тестовыми микроорганизмами (МЖПС).

Группа изобретений относится к области техники, раскрывающей биологические или химические исследования. Биодатчик содержит основу устройства, имеющую матрицу светочувствительных датчиков и матрицу световодов.

Изобретение относится к области медицины, а именно к гинекологии, и представляет собой способ прогнозирования риска развития наружного генитального эндометриоза, заключающийся в том, что выделяют ДНК из периферической венозной крови с последующим исследованием полиморфных вариантов С-511Т гена IL1B, С-590Т гена IL4, G-174C гена IL6, С-592А гена IL10, С-509Т гена TGFB, -604Т/С гена KDR, 735G/A гена Ang-2 и A-4889G гена CYP1A1, С-734А гена CYP1A2 и рассчитывают значение Р по формуле: ,где Р - значение вероятности развития признака, Y - значение уравнения регрессии, рассчитываемое по формуле: Y = -45,807+k1+k2+k3+k4+k5+k7+k8+k9; где ki выбирают в зависимости от полиморфных вариантов генов; и в случае, если значение Р равно или больше 0,5, прогнозируют высокий риск развития наружного генитального эндометриоза, а если значение Р меньше 0,5, прогнозируют низкий риск развития наружного генитального эндометриоза.

Изобретение относится к почвоведению, а именно к изучению формирования микрорусла на склонах пахотного горизонта методом точечного источника. Для этого образцы сухие почвогрунта просеивают через сито и укладывают в съемный наклонный лоток с шероховатой поверхностью и перфорированным дном для отделения воды, просочившейся через образец в мерную емкость для сбора воды и смытой почвы.

Предложенная группа изобретений относится к области молекулярной биологии и медицины. Предложены способ и набор праймеров и зондов для идентификации иммуногенных несоответствий ДНК в парах донор - реципиент.

Изобретение относится к области экологии, в частности к оценке территории, загрязненной тяжелыми металлами (ТМ), и может найти применение при мониторинге окружающей среды.
Изобретение относится к области физико-химических исследований и может быть использовано для обнаружения и идентификации запрещенных или ограниченных к обороту взрывчатых, наркотических, а также сильнодействующих ядовитых веществ. Для этого используют систему обеспечения безопасности, которая содержит, по меньшей мере, один набор оборудования для проведения химических тестов для обнаружения и идентификации взрывчатых веществ, наркотических веществ и сильнодействующих препаратов, один портативный газовый экспресс-обнаружитель, блокиратор взрывных и передающих устройств, набор имитаторов и учебных реквизитов взрывчатых и наркотических веществ и кинологическую службу. Изобретение обеспечивает таможенный контроль несанкционированного ввоза/вывоза взрывчатых, наркотических, сильно действующих ядовитых веществ, контрабандных товаров, биологических объектов, а также трупов при одновременном повышении безопасности окружающего персонала и посторонних лиц при контроле помещений любого назначения. 2 з.п. ф-лы.

Изобретение относится к медицине, а именно к фармакологии и клинической фармакологии, и может быть использовано с целью оценки функциональной активности гликопротеина-Р в гематоэнцефалическом барьере для осуществления эффективной и безопасной фармакотерапии ряда неврологических заболеваний. Способ оценки функциональной активности гликопротеина-P в гематоэнцефалическом барьере по фармакокинетике его маркерного субстрата фексофенадина включает внутривенное введение фексофенадина лабораторным животным с последующим расчетом отношения площади под кривой концентрация фексофенадина в плазме − время к площади под кривой концентрация фексофенадина в коре головного мозга − время − AUC0-t-мозг AUC0-t-плазма. 1 ил.

Наверх