Способ оценки реперфузионного повреждения сосудистой стенки в эксперименте

Изобретение относится к медицине, а именно к сосудистой хирургии, и касается оценки реперфузионного повреждения сосудистой стенки в эксперименте. Для этого проводят оценку окислительной модификации белков сосудистой стенки и при определении кетон-динитрофенилгидразонов диагностируют реперфузионное поражение сосудистой стенки. Способ обеспечивает объективную оценку реперфузионного поражения сосудистой стенки после оперативного вмешательства. 4 ил.

 

Изобретение относится к медицине, а именно к сосудистой хирургии, и может быть использовано при лечении облитерирующего атеросклероза артерий нижних конечностей (ОААНК).

Ишемическое и реперфузионное повреждения тканей – это ежедневная проблема в практике сосудистых хирургов [Основы ангиологии : учебное пособие / Р.Е Калинин [и др.]; под ред. Р.Е.Калинина. – М.: // ГЭОТАР-Медиа, 2018. – 112с.]. Реперфузия ткани, находящейся ранее в состоянии ишемии, хотя и является необходимой для предотвращения необратимых повреждений, вызывает ответную реакцию в микрососудах, которая очень сходна с процессом воспаления, то есть протекает на фоне окислительного стресса (ОС).

Известен способ оценки реперфузионного повреждения сосудистой стенки – описание патоморфологической картины, которая при анализе аорт и подвздошных артерий животных показывает, что каскад патоморфологических изменений включает в себя несколько основных этапов и укладывается в традиционные представления о реактивности тканевых систем и не является специфическим для реперфузии. В этой связи для более тонкой дифференцировки различий патоморфогенеза при реперфузии применяются высокоразрешающие биохимические методы исследования.

Несмотря на многолетнюю историю исследовательских работ в области реперфузионного повреждения тканей, на сегодняшний день патофизиология данного феномена в хирургии магистральных артерий нижних конечностей остаётся не специфична. Многогранность патофизиологических процессов определяет важность проведения экспериментальных работ в изучении данного феномена с возможностью сопоставления биохимических и морфологических изменений.

Определение окисленных групп белков, как маркёров ОС, имеет ряд преимуществ [Protein carbonyl groups as biomarkers of oxidative stress/ I. Dalle – Donne [et al.] // Pubmed – 2003. – URL:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12589963.]. Так, карбонильные группы являются химически стабильными соединениями, и циркулируют в крови более продолжительный промежуток времени, чем конечные продукты свободно-радикального окисления липидов, например, малоновый диальдегид. Окисленные белки подвергаются разрушению в течение часов и дней, в то время как продукты окисления липидов нейтрализуются за считанные минуты.

Одним из перспективных направлений в науке стало практическое исследование окислительно-модифицированных белков в биологическом материале при патологических состояниях [Окислительная модификация белков: проблемы и перспективы исследования / Л. Е. Муравлева [и др.] // Фундаментальные исследования – 2010 - №1 – С. 74-78.].

Техническим результатом настоящего изобретения является определение биохимического маркера реперфузионного повреждения сосудистой стенки в эксперименте после операций на аорте.

Способ заключается в следующем: на лабораторных животных (крысах линии Wistar массой тела 250-300) создавалась модель реперфузии путем пережатия брюшного отдела аорты с последующим кондиционированием (на фиг.1 представлены основные этапы операции). Исследование выполнено на 40 лабораторных животных, которые содержались в стандартных условиях вивария, получали стандартный рацион питания и воду ad libitum, в соответствии с этическими нормами, изложенными в «Конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей» (Страсбург, 1986) и Приказе МЗ РФ №267 от 19.06.2003 г. «Об утверждении правил лабораторной практики».

Все операции осуществлялись под наркозом с использованием препаратов «Ксило» 1 мг/кг и «Золетил 50» 15 мг/кг. Вывод животных из эксперимента проводили передозировкой золетила (“Virbac Sante Animale”, Франция), вводимого внутримышечно в дозе 50мг/кг на 1, 3, 5, 7 сутки. Выделенный сосудистый ствол фиксировали в 10% растворе нейтрального забуференного формалина (фосфатный буфер, pH=7,2–7,4), обезвоживали в серии этанолов возрастающей концентрации, с применением изопропанола, заливали в парафин. Изготавливали тотальные серии срезов (10 мкм), которые окрашивали гематоксилином и эозином (“Biovitrum”, Россия). Гистологические срезы также окрашивали пикрофуксином по ван Гизону и по методу Маллори по общепринятой методике.

Морфологическое исследование проводили с помощью микроскопа Leica DMI 4000 B с видеозахватом камерой Leica.

Для проведения трансмиссионной электронной микроскопии, фрагменты сосудистой стенки фиксировали в 2,5% растворе глутаральдегида (“Fluka”, Швейцария) с постфиксацией в 1% растворе OsO₄ (“Fluka”, Швейцария). Контрастирование проводили 2,5% спиртовым раствором (70є этиловый спирт) уранила ацетата (“Fluka”, Швейцария). Подготовленные кусочки заливали в смесь смол Эпона и Аралдита М (“Fluka”, Швейцария). Полутонкие срезы окрашивали азуром II и эозином. Ультратонкие срезы дополнительно контрастировали солями свинца и уранилацетатом по Рейнольдсу (Уикли Б., 1975г.). Изучение препаратов проводили на трансмиссионном электронном микроскопе “Libra 120” с автоматическим сканированием изображений (“Carl Zeiss”, Германия).

Подсчет площади под кривой спектра поглощения продуктов окислительной модификации белков осуществляли по авторской методике [Патент на изобретение №2524667 РФ, МПК G01N33/52. / Способ комплексной оценки содержания продуктов окислительной модификации белков в тканях и биологических жидкостях / Фомина М.А. и др.; Ряз. гос. мед. ун-т им. И.П. Павлова. – 2013102618/15; заявл. 21.01.2013; опубл. 27.07.2014, Бюл. № 21. – 8 с.], полученное значение выражали в условных единицах/грамм белка.

Для оценки доли первичных маркеров окислительной модификации белков подсчитывалась сумма альдегид-динитрофенилгидразонов (АДНФГ), для оценки вторичных – сумма кетон-динитрофенилгидразонов (КДНФГ), и соотносилась с общим содержанием карбонильных производных белков (S_общ).

Статистический анализ результатов исследования проводился с использованием программы Statistica 10.0. Проверку нормальности распределения данных осуществляли с помощью критерия Шапиро-Уилка (W-критерий). Результаты представлены в формате Ме [min; max], где Ме- медиана, min - минимальное и max - максимальное значение. Для оценки статистической значимости различий независимых выборок использовали ранговый критерий Манна-Уитни (U-тест). Для проверки равенства медиан нескольких выборок использовали критерий Краскела-Уоллиса. Для оценки ранговой корреляции использовали коэффициент Спирмена. Критический уровень значимости нулевой гипотезы (р) принимали равным 0,05.

При исследовании ультраструктуры сосудистой стенки после моделирования реперфузии обнаружены адаптивные и патологические изменения эндотелиальных клеток. Получены данные, свидетельствующие о значительном нарушении микрогемодинамики в тканях при реперфузии: отмечается повреждение (альтерация) основных компонентов сосудистой стенки. Эндотелиоциты под воздействием этого фактора реагируют неспецифическим образом изменяя свою синтетическую активность, что проявляется совокупностью морфологических изменений, захватывающих ядро, кариолемму, цитоплазму и плазмалемму. В некоторых клетках изменения приобретают необратимый характер, сопровождаются разрывом мембран митохондрий, органелл общего назначения, плазмалеммы. Такие эндотелиоциты погибают и десквамируются. Субэндотелиальные структуры подвергаются отеку, что закономерно в связи с учетом нарушения барьерной функции эндотелия и незначительно выраженного воспалительного компонента (на фиг. 2, 3 представлены описанные морфологические изменения).

С целью оценки степени повреждения белковых молекул проводился анализ доли первичных и вторичных маркеров окислительного стресса. Из приведенных результатов следует, что при моделировании ишемии-реперфузии преобладают вторичные маркеры (КДНФГ) на 3-и и 5-е сутки в сосудистой стенке, а в плазме еще и на 7-е сутки, что свидетельствует об усугублении окислительного стресса и переходе в позднюю стадию.

На фиг. 4 представлены значения доли (%) вторичных маркеров окислительного стресса при реперфузии в сосудистой стенке и плазме (КДНФГ).

Полученные данные свидетельствуют о том, что при реперфузии активация свободно-радикальных процессов плазмы и сосудистой стенки стимулируется напряжением кислорода, что приводит к развитию окислительного стресса на 3-и, 5-е, 7-е сутки в сочетании с накоплением вторичных маркеров окислительного стресса (КДНФГ).

Необратимое окисление белков, то есть преобладание вторичных маркеров, свидетельствует об усугублении окислительного стресса, переходе его в позднюю стадию и приводит к утрате биологических свойств протеинов, а в дальнейшем к их агрегации или деградации, что наблюдается при моделировании реперфузии на 3-и, 5-е сутки в сосудистой стенке.

В ходе проведенного исследования доказано, что при экспериментальном моделировании реперфузии окислительный стресс развивается с 3-их суток в сосудистой стенке с преобладанием вторичных маркеров. Данные биохимические изменения подтверждаются морфологическими изменениями ультраструктуры сосудистой стенки. Таким образом, КДНФГ является маркером реперфузионного поражения сосудистой стенке после оперативного вмешательства на магистральных артериях.

Способ оценки реперфузионного повреждения сосудистой стенки в эксперименте после операций на аорте, заключающийся в оценке окислительной модификации белков, отличающийся определением кетон-динитрофенилгидразонов в сосудистой стенке в качестве маркера реперфузионного повреждения.