Способ мониторинга стадии культивирования в технологии чумной вакцины

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для мониторинга стадии глубинного культивирования клеток в технологии чумной вакцины. Способ мониторинга стадии культивирования в технологии живой чумной вакцины предусматривает тестовое 5-минутное воздействие на клетки чумного микроба додецилсульфата натрия с последующей фотометрической регистрацией литического эффекта и определением показателя резистентности клеток. При этом определение показателя резистентности и оценку функционального состояния клеток осуществляют начиная с 12 ч каждые 3 ч с использованием специальных контрольных интервалов показателя резистентности 3,2±1,20; 5,1±1,11; 7,4±1,05; 9,2±0,99; 10,8±0,90; 11,7±0,84. Изобретение позволяет наблюдать за изменением функционального состояния культуры в ходе выращивания, характеризовать популяцию по степени ее физиологической зрелости и полноценности для дальнейшей переработки и повысить точность процесса культивирования чумного микроба. 1 ил., 3 табл., 3 пр.

 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способам мониторинга стадии культивирования при получении чумной живой вакцины. Способ позволяет оценить состояние растущей микробной культуры и момент достижения ей физиологической зрелости и функциональной полноценности.

Основным способом, используемым для оценки биопроцесса глубинного выращивания клеток в технологии чумной вакцины является способ, заключающейся в оценке потребления растущей культурой глюкозы [Промышленный регламент на производство вакцины чумной живой, лиофилизата для приготовления суспензии для инъекций, ингаляций и накожного скорификационного применения ПР 08461522-07-08]. Критерием интенсивности введения раствора глюкозы, так же служит величина рН, которая в процессе роста поддерживается в диапазоне 7,1±0,3 ед. рН. Способ предполагает периодический подсчет количества утилизированной клетками глюкозы. По соответствию получаемого значения установленным нормам судят о качестве технологического процесса. Недостатком данного способов является то, что параметры микробных клеток непосредственно не контролируются, оцениваются только изменения параметров культуральной среды, вызванные клетками.

Известен способ, позволяющий осуществлять визуальный контроль состояния клеток в популяции. Способ основан на использовании фазово-контрастной микроскопии для определения прижизненных морфометрических характеристик бактерий [Чернядьев А.В., Золотарев А.Г., Ковтун А.Л. Автоматизированная морфометрия бактерий, возможности и ограничения применения // Биотехнология. - 1996. - Вып. 3. - С. 56-61; Куимова Т.Ф. Влияние условий культивирования и фаз роста на морфологию и ультраструктуру различных микроорганизмов при ферментации // Итоги науки и техники ВИНИТИ. Микробиология. - 1980. - Т. 13. - С. 3-99]. Способ заключается в периодическом отборе проб, приготовлении агаровых препаратов для микроскопии, просмотре их на микроскопе-фотометре, определении морфометрических параметров и сравнение их с контрольными значениями. Недостатком данного способа является то, что линейные размеры и форма бактерий не всегда достоверно отражает их функциональное состояние, особенно при неблагоприятных условиях развития, а так же невозможность в силу того, что размеры клеток являются очень грубым критерием их возраста, точно определить момент наступления зрелости популяции.

Известен способ, основанный на определении гидрофильно-гидрофобных свойств клеток. Способ оценивает способность, суспендированных в 0,85% растворе хлористого натрия клеток, к адгезии к капелькам хлороформа [Fattom А., Shilo М. Hydrophobicity as an adhesion mechanism of benthic cyanobacteria // Appl. Environ. Microbiol. - 1984. - Vol. 47. - №1. - P. 135-143. Никовская Г.Н., Гордиенко A.C., Глоба Л.И. Гидрофильно-гидрофобные свойства микроорганизмов при различных условиях культивирования // Микробиология. - 1989. - Т. 58. - Вып. 3. - С. 448-451]. Способ заключается во внесении в суспензию клеток хлороформа, интенсивном встряхивании, регистрации оптической плотности пробы и определении показателя гидрофобности. Показатель гидрофобности отражает соотношение гидрофобных и гидрофильных компонентов в клетках, и хорошо согласуются с динамикой роста популяции. Недостатком данного способа является то, что на показатель гидрофобности оказывает влияние состав среды культивирования, качество посевной культуры, изменения в технологии, поэтому его сложно нормировать.

Известен способ оценки функционального состояния клеток по их дегидрогеназной активности. В качестве базового для этого способа использован биохимический метод, основанный на применении водорастворимых солей тетразолия, которые проникая в клетку, восстанавливаются клеточными ферментами - дегидрогеназами в окрашенный трифенилформазан [Сагатовский В.Н. Использование трифенилтетразолияхлорида для ускоренного определения количества живых клеток в чумной вакцине // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии.- 1961. - Вып 5. - С. 51-54]. При этом изменения дегидрогеназной активности происходит в соответствии с фазами развития и отражает динамику метаболических процессов в глубинной культуре чумного микроба [Способ оценки функционального состояния микробной популяции. Патент РФ 2195496].

Способ заключается в приготовлении инкубационной среды (перевар Хот-тингера с 0,1% бромида 3-(4,5диметилтиазолила-2)-2,5дефенилтетрозолия (МТТ) и 1% глюкозы), внесении в нее бактериальной суспензии и проведении реакции восстановления МТТ при температуре 37°С в течение 30 минут. После инкубации, 30 минутной фиксации гранул фармазана раствором формальдегида, готовят агаровые препараты для микроскопии типа «раздавленная капля» и подсчитывают отдельно количество клеток с одной, двумя, тремя, четырьмя и более гранулами формазана в клетках. По результатам цитохимического анализа рассчитывают коэффициент дегидрогеназной активности клеток.

Недостатком данного способа является его высокая трудоемкости и длительность определения показателя (около 3 часов), связанная с подготовкой пробы к анализу и просмотром не менее 500 клеток с гранулами для получения достоверных результатов, так же отсутствие контрольных пределов показателя на этапах культивирования, позволяющих судить о свойствах растущей культуры и характере процесса.

В качестве прототипа выбран способ предназначенный для прогнозирования устойчивости чумного микроба штамма EV к лиофилозации и позволяющий оценить структурно-функционального состояния клеток в культуре перед ее обезвоживанием [Способ прогнозирования устойчивости клеток чумного микроба штамма EV к лиофилизации. Патент РФ 2380420]. В основе способа лежит литический метод тестирования бактерий воздействием детергента - додецилсульфата натрия (ДСН).

Способ заключается в приготовлении суспензии клеток с оптической плотностью 0,6-0,8 ед. опт. пл., тестировании клеток воздействием ДСН в концентрацияях 3,21; 5,69; 11,19; 16,52 мМоль в течение 5 минут, фотометрической регистрации изменения оптической плотности, с последующим расчетом показателя резистентности клеток к воздействию ДСН (С50), соответствующего концентрации детергента, вызывающего 50% лизис клеток в суспензии.

Общим с заявленным способом является обработка клеток ДСН в указанных концентрациях с регистрацией изменения оптической плотности и последующий расчет показателя резистентности клеток к воздействию ДСН. Недостатком данного способа является отсутствие возможности интерпретировать результаты анализа с помощью определенных ранее нормативных показателей и оценивать культуру в динамике роста на стадии глубинного культивирования.

Задачей изобретения является разработка способа мониторинга процесса культивирования, обеспечивающего нетрудоемкое и экспрессное определение функционального статуса клеток без их опосредования средой культивирования и оперативный и объективный анализ состояния технологического процесса.

Поставленная задача решается благодаря тому, что в способе мониторинга предусмотрено воздействие на бактериальную суспензию различных концентраций ДСН, с последующей фотометрической регистрацией литического эффекта и определением показателя резистентности клеток, предусмотрены следующие отличия: определение показателя и оценка функционального состояния клеток проводится на стадии культивирования и состоит из 6 этапов, начиная с 12 часа с интервалом в 3 часа. Оценку функционального состояния клеток дают после сопоставления текущего значения показателя оптимальному на данном этапе. Оптимальным считают диапазон значений показателя (контрольные пределы), на каждом из этапов, обоснованный ранее в ходе предварительных исследований стадии культивирования при приготовлении нескольких серий вакцин.

Сущность предлагаемого способа заключается в следующем.

Из аппарата-культиватора на 12 часу роста, в начале экспоненциальной фазы, и каждые последующие 3 часа, отбирают пробы для анализа. Для каждой пробы определяют показатель резистентности клеток к воздействию ДСН. Для этого из почасовых проб культуры из аппарата готовили суспензии с оптической плотностью от 0,6 до 0,8 ед. опт. пл. Суспензии разливали в два ряда пробирок. В первый ряд, состоящий из 4 пробирок, вносили 346,7 мМоль раствор ДСН, создавая следующие концентрации: 3,2; 5,7; 11,2 и 16,5 мМоль (опытные пробы). Во второй ряд вместо ДСН вносили воду (контрольные пробы). После 5 минутной экспозиции определяли оптическую плотность всех проб и для каждой концентрации ДСН по формуле 1 рассчитывали литический эффект.

где: Li - литический эффект, процент;

ЕОПi - оптическая плотность опытной пробы с данной концентрацией ДСН, ед. опт. пл.;

EКi - оптическая плотность соответствующей контрольной пробы, ед. опт. пл.

Показатель резистентности находили, решая уравнение линейной регрессии (формула 2), характеризующее зависимость «доза-эффект».

где: С50 - показатель резистентности клеток к воздействию ДСН, соответствующий концентрации детергента, вызывающего 50% лизис клеток в суспензии, мМоль;

Дi - концентрация ДСН в опытной пробе, мМоль;

А - коэффициент уравнения линейной регрессии.

Для решения уравнения линейной регрессии, использовали метод наименьших квадратов и систему пробитов [Ашмарин И.П., Воробьев А.А. Статистические методы микробиологических исследования. - Л.: Медгиз, 1962].

Показатель резистентности, в данном случае, отражает уровень эквивокации (ненадежности структуры) клеток в популяции. Максимальное значение показателя указывает на высокую степень упорядоченности, организованности и сформированности клеточных структур и свидетельствует о ее зрелости. При правильном и стабильном течении технологического процесса, с каждым часом (начиная с 12), должно происходить постепенное возрастание значений показателя, что свидетельствует о накопления в среде культивирования зрелых, полноценных клеток.

Получаемое значение показателя, сопоставляют с контрольными пределами или для наглядности наносят на объединенную карту, анализируя результаты, делают выводы о соответствии текущего состояния культуры той фазе роста в какой она должна находится на данный момент. Если значения показателя находятся внутри контрольных пределов, то считают, что процесс проходит без нарушения технологии и завершится получение кондиционного материала. Если значение показателя меньше нижнего граничного значении, считают, что по каким-либо причинам процесс идет с отклонениями и может завершится получение не кондиционного материала, не годного для дальнейшей переработки. В этом случае возможно принятие оперативных мер, таких как, внесение дополнительно питательных субстратов, регулирование скорости аэрации среды культивирования воздухом и скорости вращения мешалки, а так же увеличение продолжительности процесса и т.п.

Расчет контрольных пределов проводили после накопления достаточной базы данных значения данного показателя в разнокачественных материалах, а так же культурах выращиваемых в соответствие с требованиям промышленного регламента на производство чумной живой сухой вакцины. Из каждой серии на 12, 15, 18, 21 и 27 часу культивирования отбирали по 5 проб (выборка), для каждой пробы определяли показатель резистентности клеток к ДСН. Далее, в ходе статистического анализа, для каждой выборки были определены выборочное среднее (арифметическое) и размах. Применяя метод построения экспериментальных контрольных карт [Электронный учебник. Статистика. Stat Soft, www Stat Soft. RU], по 20 сериям, были получены общие средние (), 3-сигмальные отклонения (3σ (стандартные отклонения выборочного распределения) от средней (в единицах измерения показателя резистентности клеток к воздействию ДСН) и определены контрольные интервалы и контрольные пределы, представленные в таблице 1.

Основанием для установления контрольных пределов в ± 3σ от общей средней, послужило то, что распределение значений случайных выборок, полученных из одной генеральной совокупности, стремиться к нормальному при объеме выборки равной или большей 4. При этом почти все значения общей средней (за исключением 0,27%) лежат внутри рассчитанного интервала. Представленные значения являются закономерными для культур, выращиваемых с соблюдением регламентированных условий. Тогда как отклонения от указанных значений должны рассматриваться как признак нарушения в технологии культивирования, которые в дальнейшем окажут влияние на качество приготовленных вакцин.

По данным таблицы 1 построен график (рис. 1) на котором средние значения показателя резистентности и контрольные пределы в 3σ и 2σ были соединены линиями, в результате чего получилась объединенная карта.

На контрольной карте показаны зоны А и В. Зона А определяется как область, расположенная между центральной линией по обе ее стороны и ограничена линией, проведенной на расстоянии 2σ от центральной. В этой зоне находится примерно 95% выборочных средних. На практике, часто отделяют эту зону для раннего выявления потери качества. Зона В определяется как область, отстоящая от центральной линии на расстоянии от 2σ до 3σ по обе стороны от центральной линии.

Наличие причинно-следственной связи между совокупностью существующих признаков заявляемого объекта и достигаемым техническим результатом показано в таблице 2.

Возможность осуществления заявленного изобретения показано следующими примерами.

Пример 1

В процессе культивирования чумного микроба, при приготовлении серии №1 вакцины, осуществляли мониторинг по показателю резистентности клеток к воздействию ДСН.

Из почасовых проб культуры готовили суспензии с оптической плотностью 0,6-0,8 ед. опт. пл. относительно дистиллированной воды. Разливали подготовленные суспензии клеток по 7,5 см3 в два ряда пробирок. В первый ряд пробирок вносили раствор ДСН с концентрацией 346,7 мМоль (опытная проба) в количествах: 0,07; 0,125; 0,250; 0,375 см3, что соответствовало концентрации ДСН в пробе: 3,21; 5,69; 11,19; 16,52 мМоль. Во второй ряд пробирок вносят дистиллированную воду (контрольная проба) в тех же количествах. Полученные пробы выдерживали 5 минут при температуре 18-22°С, затем замеряли оптическую плотность.

Для каждой концентрации ДСН по формуле рассчитывали литический эффект, а затем определяли показатель резистентности.

Результаты определения средних (по 5 пробам) значений показателя, по часам культивирования, представлены в таблице 3. Проведя сравнительную оценку полученных результатов и контрольных интервалов, сделали вывод, что процесс проходил в оптимальных условиях и завершился получением полноценной, кондиционной культуры, пригодной для последующей переработки.

Пример 2

В процессе культивирования чумного микроба, при приготовлении серии №2 вакцины, осуществляли мониторинг по показателю резистентности клеток к воздействию ДСН. Подготовку проб, анализ и оценку результатов проводили, как описано в примере 1.

Результаты определения средних значений показателя, по часам культивирования, представлены в таблице 3. Из представленных результатов видно, что первые два значения показателя лежат в зоне В, что свидетельствует о начинающемся разладе процесса, последующие четыре значения лежат за нижним контрольным пределом. Сделали вывод, что плохое качество посевного материала повлияло на то, что клетки задержались в логарифмической фазе и в установленное время не достигли зрелости. Незрелые клети, неустойчивые к внешним воздействиям, неизбежно погибнут на последующих стадиях переработки, таких как концентрирование и высушивание.

Пример 3

В процессе культивирования чумного микроба, при приготовлении серии №3 вакцины, осуществляли мониторинг по показателю резистентности клеток к воздействию ДСН. Подготовку проб, анализ и оценку результатов проводили, как описано в примере 1.

Результаты определения средних (по 5 пробам) значений показателя, по часам культивирования, представлены в таблице 3. Проведя сравнительную оценку полученных результатов и контрольных интервалов, сделали вывод, что процесс проходил в условиях близким к оптимальным и завершился получением полноценной, кондиционной культуры, пригодной для последующей переработки.

Способ мониторинга стадии культивирования в технологии чумной живой вакцины, включающий тестовое 5-минутное воздействие на клетки чумного микроба детергента - додецилсульфата натрия, количественный анализ реакции клеток и определение показателя резистентности бактерий к воздействию додецилсульфата натрия, отличающийся проведением анализа культуры в динамике глубинного культивирования на 12, 15, 18, 21, 24, 27 часах роста и использованием специальных контрольных интервалов показателя резистентности, представляющих собой оптимальные значения показателя: 3,2±1,20; 5,1±1,11; 7,4±1,05; 9,2±0,99; 10,8±0,90; 11,7±0,84, для оценки текущего состояния культуры на соответствие установленным требованиям.



 

Похожие патенты:

Группа изобретений относится к фармакологии, а именно к штамму лактобактерий, выделенному из свиньи, для лечения кишечного расстройства. Штамм лактобактерий, выделенный из свиньи, который выбран из: NCIMB 41846: Lactobacillus reuteri GGDK31; NCIMB 41847: Lactobacillus paraplantarum и Lactobacillus reuteri GGDK161; NCIMB 41848: Lactobacillus reuteri GGDK255; NCIMB41849: Lactobacillus plantarum/pentosus/helveticus/paraplantarum GGDK258; NCIMB 41850: Lactobacillus johnsonii и Lactobacillus reuteri GGDK2 66; NCIMB 42008 Lactobacillus johnsonii; NCIMB 42009 Lactobacillus reuteri; NCIMB 42010 Lactobacillus plantarum; NCIMB 42011 Lactobacillus reuteri; NCIMB 42012 Lactobacillus reuteri; штамма, составляющего по крайней мере 99,5% идентичность по 16S рРНК со штаммом, выбираемым из тех, которые были депонированы под номером доступа, указанным выше; и любой комбинации из двух или более указанных штаммов, где указанный штамм характеризуется: способностью к демонстрации противомикробной активности, направленной против Е.

Группа изобретений относится к биотехнологии. Предложены штамм Lactobacillus helveticus D75, депонированный в коллекции ФНБУ ВНИИСХМБ под номером RCAM04483, и штамм Lactobacillus helveticus D76, депонированный в коллекции ФНБУ ВНИИСХМБ под номером RCAM04484, предназначенные для использования в составе пробиотических препаратов.

Изобретение относится к области биотехнологии и биохимии, в частности к рекомбинантному штамму мицелиального гриба Aspergillus nidulans 031/pDHG25-SgrDI (pyrG-). Указанный штамм обладает стероид-11α-гидроксилирующей активностью, способностью конвертировать прогестерон в 11α-ацетоксипрогестерон, ацетилирующей активностью и способностью этерифицировать 11α-гидроксипрогестерон.

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ определения уровня биосовместимости штаммов бифидобактерий и/или лактобактерий.

Изобретение относится к области микробиологии. Штамм бактерий Lisinibacillus sp.ELA – 10к, обладающий способностью утилизировать нефть и нефтепродукты, депонирован во Всероссийской Коллекции Микроорганизмов ИБФМ им.

Изобретение относится к области биотехнологии и биохимии, в частности к рекомбинантной клетке-хозяину для получения диальдегида кроцетина, кроцетина и гидроксил-β-циклоцитраля.

Группа изобретений относится к области биотехнологии. Предложена плазмида pPICZαA-PhoA2-StV, определяющая синтез фосфолипазы А2, имеющая размер 3862 п.

Изобретение относится к области микробиологии. Штамм бактерий Bacillus simplex LER-11, обладающий способностью утилизировать нефть и нефтепродукты, депонирован во Всероссийской Коллекции Микроорганизмов ИБФМ им.

Изобретение относится к области микробиологии. Штамм бактерий Bacillus sp.

Изобретение относится к материаловедению, а именно к определению устойчивости материалов к биодеградации. Для этого подготавливают образцы с тестируемыми материалами, стерильную жидкую питательную среду (СЖПС) и питательную среду с тестовыми микроорганизмами (МЖПС).

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен прибор для биологических исследований.

Изобретение относится к медицинской микробиологии. Способ дифференциации штаммов Yersinia pestis на токсически активные и неактивные предусматривает выращивание клеток вакцинного штамма Yersinia pestis на плотной питательной среде с последующей подготовкой взвеси бактерий, ее инкубированием, осаждением клеток центрифугированием и заражением животных.

Группа изобретений относится к области биохимии. Предложен способ ультравысокопроизводительного скрининга клеток или микроорганизмов, а также представляющее собой биосовместимую двойную эмульсию вода-масло-вода средство для ультравысокопроизводительного скрининга клеток или микроорганизмов.

Изобретение относится к области оценки загрязнения водной среды. Предложен способ определения степени загрязнения морских прибрежных вод тяжелыми металлами с использованием водорослей.

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ определения способности микобактерий туберкулеза к размножению в альвеолярных макрофагах пациентов после противотуберкулезной терапии.

Предложенное изобретение относится к области биотехнологии. Предложен рекомбинантный аденовирус для обнаружения раковых клеток или диагностики рака, содержащий репликативную кассету, маркерную кассету, ген, который кодирует связывающий CD46 фибриллярный белок.

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен способ оценки эффективности работы сильвинитовых сооружений.

Изобретение относится к области биохимии, генной инженерии и биотехнологии, в частности к рекомбинантной плазмидной ДНК pClcRFP. Указанная плазмида pClcRFP кодирует продукцию гибридного флуоресцентного белка RFP для определения биодоступных хлорированных катехолов, их аналогов и тяжелых металлов.

Группа изобретений относится к области биохимии. Предложен штамм бактерий Escherichia coli BL21 DE3 pClcRFP для детекции ионов меди, биосенсор и способ детекции ионов меди в анализируемой жидкой среде.
Предложено применение молочного продукта, ферментированного бактериями, продуцирующими молочную кислоту, и содержащего молочную кислоту и/или лактат, для получения нутритивной композиции для профилактики анемии и/или профилактики дефицита железа у человеческих субъектов, для повышения абсорбции железа, повышения биоусвояемости железа и/или повышения биодоступности железа, а также для улучшения когнитивного развития, двигательных навыков и/или социоэмоционального развития у человеческого субъекта в возрасте от 0 до 36 месяцев, страдающего от дефицита железа или анемии или для профилактики когнитивных расстройств, расстройств двигательных навыков и/или социоэмоциональных расстройств у человеческого субъекта в возрасте от 0 до 36 месяцев, страдающего от дефицита железа или анемии.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для мониторинга стадии глубинного культивирования клеток в технологии чумной вакцины. Способ мониторинга стадии культивирования в технологии живой чумной вакцины предусматривает тестовое 5-минутное воздействие на клетки чумного микроба додецилсульфата натрия с последующей фотометрической регистрацией литического эффекта и определением показателя резистентности клеток. При этом определение показателя резистентности и оценку функционального состояния клеток осуществляют начиная с 12 ч каждые 3 ч с использованием специальных контрольных интервалов показателя резистентности 3,2±1,20; 5,1±1,11; 7,4±1,05; 9,2±0,99; 10,8±0,90; 11,7±0,84. Изобретение позволяет наблюдать за изменением функционального состояния культуры в ходе выращивания, характеризовать популяцию по степени ее физиологической зрелости и полноценности для дальнейшей переработки и повысить точность процесса культивирования чумного микроба. 1 ил., 3 табл., 3 пр.

Наверх