Способ прогнозирования гематогенного метастазирования при инвазивной карциноме неспецифического типа молочной железы на основе определения различных популяций циркулирующих опухолевых клеток в крови до лечения

Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, и касается прогнозирования гематогенного метастазирования при инвазивной карциноме неспецифического типа молочной железы. Для этого проводят определение различных популяций циркулирующих опухолевых клеток (ЦОК) до лечения пациента. Методом многоцветной проточной цитометрии определяют уровень популяций ЦОК с помощью молекулярной панели маркеров, включающей EpCam, CD45, CD44, CD24 и N-Cadherin, и меченных разными флюорохромами моноклональных антител против данных маркеров. Оценивают в баллах следующие показатели: наличие порогового уровня ЦОК с признаком стволовости и ЕМТ до биопсии; наличие порогового уровня EpCam-отрицательных ЦОК с признаками стволовости в состоянии ЕМТ до биопсии; наличие порогового уровня ЦОК без признаков стволовости в состоянии ЕМТ до биопсии, а также определяют размер первичной опухоли. Полученные данные обрабатывают методом математического анализа с использованием уравнения регрессии, разработанного заявителем. И при значении вероятности развития метастазов Р≥50% определяют высокий риск развития гематогенных метастазов у указанной категории пациентов, а при P <50% - низкий риск. Изобретение позволяет повысить точность и информативность прогноза до лечения заболевания. 5 ил., 2 табл., 2 пр.

 

Изобретение относится к области медицины, конкретно к онкологии, и может быть использовано для прогнозирования возникновения гематогенных метастазов при инвазивной карциноме неспецифического типа молочной железы.

Рак молочной железы является самым распространенным злокачественным заболеванием среди женщин [1]. В настоящее время одним из общепризнанных параметров, ассоциированных с частотой гематогенного и лимфогенного метастазирования при раке молочной железы, является размер опухоли. Известно, что по мере увеличения размера новообразования риск метастатического поражения возрастает. Так, при размере новообразования более 5 мм частота регионарного метастазирования увеличивается до 46%, опухоли менее 5 мм метастазируют в 18% [2, 3]. Основными факторами, связанными с лимфогенным и гематогенным метастазированием, являются распространенность опухоли, ее гистологическая структура, степень дифференцировки и биологическая агрессивность [4]. По данным ESMO (2009) отмечено, что при низкодифференцированных опухолях частота отдаленного метастазирования выше, чем при умеренно - или высокодифференцированных (р<0,01) [5]. Другим гистологическим параметром, связанным с риском гематогенного метастазирования является опухолевая эмболия в сосудах новообразования [6, 7].

Известно, что одним из значимых прогностических признаков, ассоциированных с высоким риском гематогенного метастазирования при раке молочной железы, является метастатическое поражение лимфатических узлов. Отмечено, что гематогенная диссеминация возникает не у всех женщин, имеющих метастазы в регионарных лимфатических узлах, и наоборот, заболевание может прогрессировать при отсутствии метастатического поражения лимфоузлов [8]. Ряд авторов на основе результатов собственных исследований указывают на такой факт, что при раке молочной железы существует определенная взаимосвязь между выраженностью лимфогенного метастазирования, а именно количеством лимфатических узлов с метастатическим поражением, и риском возникновения гематогенной диссеминации [8-10].

Известен способ прогнозирования гематогенного метастазирования при инвазивной карциноме неспецифического типа молочных желез, предложенный Завьяловой М.В. с соавторами. Способ включает проведении гистологического исследование на светооптическом уровне препаратов ткани всех регионарных лимфатических узлов, полученных после оперативного вмешательства, и определение количества лимфоузлов с наличием метастазов. [11]. Недостатком этого способа является ограниченная область применения, обусловленная тем, что он предназначен для больных с двухсторонней метахронной инвазивной карциномой неспецифического типа молочных желез.

Наиболее близким к предлагаемому является способ прогнозирования гематогенного метастазирования при трипл негативной инвазивной карциноме неспецифического типа молочной железы основанный на определении молекулярно-генетического типа рака молочной железы с помощью иммуногистохимического исследования препаратов ткани первичной опухоли, оценки наличия лимфогенных метастазов и подсчета количества разных типов структур в инфильтративном компоненте опухоли с оценкой выраженности гиалиноза стромы опухоли [12].

Наличие ЦОК (циркулирующих опухолевых клеток) не всегда сопровождается формированием метастазов, по-видимому, потому, что не все опухолевые клетки, попавшие в циркуляцию, обладают необходимыми для этого свойствами. ЦОК - гетерогенная популяция: часть клеток являются стволовыми опухолевыми клетками, часть опухолевых клеток находятся в состоянии ЕМТ (epithelial-mesenchymaltransition), и большая часть ЦОК не имеют признаков стволовости и ЕМТ [13, 14]. Мета-анализ 24 исследований (3701 пациентов), среди которых 13 проспективных и 11 ретроспективных, посвященных определению прогностической значимости выявления ЦОК у больных РМЖ, показал, что большое количество ЦОК сопряжено с плохим ответом на лечение, укорочением сроков общей и безрецидивной выживаемости у больных [15].Однако, существующие исследования не дают достаточной информации о том, с какими субпопуляциями ЦОК связано гематогенное метастазирование и плохой прогноз.

Недостатком существующих способов является то, что все они основаны на исследовании операционного материала опухолевой ткани и не дают возможности оценить риск гематогенного метастазирования до начала лечения.

Таким образом, известные на сегодняшний день способы прогнозирования течения рака молочной железы, его метастатического потенциала не многочисленны и связаны с поиском молекулярных маркеров опухолевой прогрессии.

Новый технический результат - получение точного и информативного прогноза до проведения лечения.

Для достижения нового технического результата в способе прогнозирования гематогенного метастазирования при инвазивной карциноме неспецифического типа молочной железы на основе определения различных популяций циркулирующих опухолевых клеток в крови до лечения, включающий исследование пациента и последующий расчет диагностического показателя, до лечения методом многоцветной проточной цитометрии определяют уровень различных популяций циркулирующих опухолевых клеток (ЦОК) с помощью молекулярной панели маркеров, включающей EpCam, CD45, CD44, CD24 и N-Cadherin, и меченных разными флюорохромами моноклональных антител против данных маркеров, и оценивают в баллах: наличие порогового уровня ЦОК с признаком стволовости и ЕМТ до биопсии, при этом, если уровень клеток с фенотипом EpCam+CD45-CD44+CD24-Ncadherin+ ≥0,63 клеток/мкл оценивают в 1 балл, если уровень клеток с фенотипом EpCam+CD45-CD44+CD24-Ncadherin+ <0,63 клеток/мкл оценивают в 0 баллов, также определяют наличие порогового уровня EpCam-отрицательных ЦОК с признаками стволовости в состоянии ЕМТ до биопсии, если уровень клеток с фенотипом EpCam-CD45-CD44+CD24-Ncadherin+ ≥0,26 клеток/мкл оценивают в 1 балл, если уровень клеток с фенотипом EpCam-CD45-CD44+CD24-Ncadherin+<0,26 клеток/мкл оценивают в 0 баллов, определяют наличие порогового уровня ЦОК без признаков стволовости в состоянии ЕМТ до биопсии, при этом, если количество клеток с фенотипом EpCam+CD45-CD44-CD24-Ncadherin+ ≥0,17 клеток/мкл оценивают в 1 балл, если количестве клеток с фенотипом EpCam+CD45-CD44-CD24-Ncadherin+ <0,17 клеток/мкл оценивают в 0 баллов, также определяют размер первичной опухоли: до 2 см оценивают в 1 балл, при 2-5 см оценивают в 2 балла, более 5 см оценивают в 3 балла, далее рассчитывают признак Y в уравнении регрессии по формуле:

Y=-107,3-7,09*Х1+68,63*Х2+71,04*Х3+5,74*Х4

-107,3 - значение коэффициента регрессии свободного члена;

X1 - наличие порогового уровня ЦОК с признаком стволовости и ЕМТ до биопсии, Х1=1, если уровень клеток с фенотипом EpCam+CD45-CD44+CD24-Ncadherin+ ≥0,63 клеток/мкл; Х1=0, если уровень клеток с фенотипом EpCam+CD45-CD44+CD24-Ncadherin+ <0,63 клеток/мкл;

-7,09 - значение коэффициента регрессии этого признака;

Х2 - наличие порогового уровня EpCam-отрицательных ЦОК с признаками стволовости в состоянии ЕМТ до биопсии Х2=1, если уровень клеток с фенотипом EpCam-CD45-CD44+CD24-Ncadherin+ ≥0,26 клеток/мкл; X2=0, если уровень клеток с фенотипом EpCam-CD45-CD44+CD24-Ncadherin+ <0,26 клеток/мкл);

68,63 - значение коэффициента регрессии этого признака;

Х3 - наличие порогового уровня ЦОК без признаков стволовости в состоянии ЕМТ до биопсии, Х3=1, если количество клеток с фенотипом EpCam+CD45-CD44-CD24-Ncadherin+ ≥0,17 клеток/мкл; Х3=0, если количество клеток с фенотипом EpCam+CD45-CD44-CD24-Ncadherin+ <0,17 клеток/мкл;

71,04 - значение коэффициента регрессии этого признака;

Х4 - размер первичной опухоли, Х4=1 при размере опухоли до 2 см; Х4=2 при размере опухоли от 2 до 5 см; Х4=3 при размере опухоли более 5 см,

5,74 - значение коэффициента регрессии этого признака,

далее определяют значение вероятности развития гематогенных метастазов Р по формуле: Р=e^Y/(1+e^Y), где е - математическая константа, равная 2,72

и при Р≥50% определяют высокий, а при Р<50% - низкий риск развития гематогенных метастазов.

Способ осуществляют следующим образом.

Материалом для исследования служит венозная стабилизированная гепарином кровь, взятая до начала лечения (до биопсии). С помощью молекулярной панели маркеров, включающей EpCam, CD45, CD44, CD24 и N-Cadherin и меченные разными флюорохромами моноклональные антитела против данных маркеров, определяют различные популяции и уровень циркулирующих опухолевых клеток (ЦОК) методом многоцветной проточной цитометрии и оценивают в баллах: наличие порогового уровня ЦОК с признаком стволовости и ЕМТ до биопсии, при этом, если уровень клеток с фенотипом EpCam+CD45-CD44+CD24-Ncadherin+ ≥0,63 клеток/мкл оценивают в 1 балл, если уровень клеток с фенотипом EpCam+CD45-CD44+CD24-Ncadherin+ <0,63 клеток/мкл оценивают в 0 баллов, также, определяют наличие порогового уровня EpCam-отрицательных ЦОК с признаками стволовости в состоянии ЕМТ до биопсии, если уровень клеток с фенотипом EpCam-CD45-CD44+CD24-Ncadherin+ ≥0,26 клеток/мкл оценивают в 1 балл, если уровень клеток с фенотипом EpCam-CD45-CD44+CD24-Ncadherin+ <0,26 клеток/мкл оценивают в 0 баллов, определяют наличие порогового уровня ЦОК без признаков стволовости в состоянии ЕМТ до биопсии, при этом, если количество клеток с фенотипом EpCam+CD45-CD44-CD24-Ncadherin+ ≥0,17 клеток/мкл оценивают в 1 балл, если количество клеток с фенотипом EpCam+CD45-CD44-CD24-Ncadherin+ <0,17 клеток/мкл оценивают в 0 баллов, также определяют размер первичной опухоли: до 2 см оценивают в 1 балл, при 2-5 см оценивают в 2 балла, более 5 см оценивают в 3 балла, далее рассчитывают значение уравнения регрессии Y по формуле:

Y=-107,3-7,09*Х1+68,63*Х2+71,04*Х3+5,74*Х4

(-107,3) - значение коэффициента регрессии свободного члена;

X1 - наличие порогового уровня ЦОК с признаком стволовости и ЕМТ до биопсии (X1=1, если уровень клеток с фенотипом EpCam+CD45-CD44+CD24-Ncadherin+ ≥0,63 клеток/мкл; Х1=0, если уровень клеток с фенотипом EpCam+CD45-CD44+CD24-Ncadherin+ <0,63 клеток/мкл;

(-7,09) - значение коэффициента регрессии этого признака;

Х2 - наличие порогового уровня EpCam-отрицательных ЦОК с признаками стволовости в состоянии ЕМТ до биопсии (Х2=1, если уровень клеток с фенотипом EpCam-CD45-CD44+CD24-Ncadherin+ ≥0,26 клеток/мкл; Х2=0, если уровень клеток с фенотипом EpCam-CD45-CD44+CD24-Ncadherin+ <0,26 клеток/мкл);

(68,63) - значение коэффициента регрессии этого признака;

Х3 - наличие порогового уровня ЦОК без признаков стволовости в состоянии ЕМТ до биопсии (Х3=1, если количество клеток с фенотипом EpCam+CD45-CD44-CD24-Ncadherin+ ≥0,17 клеток/мкл; Х3=0, если количество клеток с фенотипом EpCam+CD45-CD44-CD24-Ncadherin+ <0,17 клеток/мкл;

(71,04) - значение коэффициента регрессии этого признака);

Х4 - размер первичной опухоли (1 - до 2 см; 2 - 2-5 см; 3 - более 5 см),

(5,74) - значение коэффициента регрессии этого признака,

далее определяют значение вероятности развития гематогенных метастазов Р по формуле:

Р=e^Y/(l+e^Y), где

е - математическая константа, равная 2,72

и при Р≥50% определяют высокий, а при Р<50% - низкий риск развития гематогенных метастазов.

Модель имеет высокую степень достоверности (х2=20,016; р=0,00050). Чувствительность 100%, специфичность 100%.

Сущность предлагаемого способа иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Больная М., 40 лет с инвазивной карциномой неспецифического типа молочной железы, с размером опухоли 1,5 см (1). При определении уровня различных популяций циркулирующих опухолевых клеток в крови до лечения (до биопсии) были выявлены следующие параметры:

уровень ЦОК с признаком стволовости и ЕМТ до биопсии (EpCam+CD45-CD44+CD24-Ncadherin+) составил 0,73 клеток/мкл (1);

уровень EpCam-отрицательных ЦОК с признаками стволовостии ЕМТ (EpCam-CD45-CD44+CD24-Ncadherin+) составил 3,307 клеток/мкл (1);

уровень ЦОК без признаков стволовости в состоянии ЕМТ до биопсии (EpCam+CD45-CD44-CD24-N-cadherin+) составил 0,232 клеток/мкл (1).

Риск развития гематогенных метастазов оценивался по формуле: Y=-107,3-7,09*Х1+68,63*Х2+71,04*Х3+5,74*Х4=31,02. Значение вероятности развития гематогенных метастазов определялось по формуле: Р=e^Y/(1+e^Y)=2,72^31,02/(1+2,72^31,02)=0,9999. Вероятность развития гематогенных метастазов составила 99,9%.

Через 6 месяцев после постановки диагноза и начала лечения было обнаружено метастатическое поражение скелете.

Пример 2. Больная K., 44 лет, с инвазивной карциномой неспецифического типа молочной железы, с размером опухоли 2,8 см (2). При определении уровня различных популяций циркулирующих опухолевых клеток в крови до лечения (до биопсии) были выявлены следующие параметры:

уровень ЦОК с признаком стволовости и ЕМТ до биопсии (EpCam+CD45-CD44+CD24-Ncadherin+) составил 0,036 клеток/мкл (0);

уровень EpCam-отрицательных ЦОК с признаками стволовостии ЕМТ (EpCam-CD45-CD44+CD24-Ncadherin+) составил 0,04 клеток/мл (0);

уровень ЦОК без признаков стволовости в состоянии ЕМТ до биопсии (EpCam+CD45-CD44-CD24-Ncadherin+) составил 0,084 клеток/мкл (0)

Риск развития гематогенных метастазов оценивался по формуле: Y=-107,3-7,09*Х1+68,63*Х2+71,04*Х3+5,74*Х4=-95,82. Значение вероятности развития гематогенных метастазов определялось по формуле: Р=e^Y/(1+e^Y)=2,72^-95,82/(1+2,72^-95,82)=0,000. Вероятность развития гематогенных метастазов составила 0%. В удаленных во время операции аксиллярных лимфоузлах метастатического поражения не было, после лечения была отмечена полная морфологическая регрессия опухоли, при трехлетнем сроке наблюдения отмечается отсутствие гематогенных метастазов.

Предлагаемый способ основан на анализе результатов клинических наблюдений, данных исследования крови методом проточной цитометрии.

В проспективном исследовании изучалась кровь 27 пациенток с инвазивной карциномой неспецифического типа молочной железы, взятая до начала лечения. Все пациентки проходили лечение в НИИ онкологии Томского НИМЦ. Средний возраст больных составил 50,0±9,8 лет, стадии T1-4N0-3M0.13 пациенток на предоперационном этапе получили 2-6 курсов полихимиотерапии по схеме FAC (5-фторурацил 500 мг/м2 в 1-й день, адриамицин 50 мг/м2 в 1-й день, циклофосфамид 500 мг/м2в 1-й день, внутривенно; проведение курсов через 21 день), по схеме САХ (циклофосфан 100 мг/м² внутримышечно в течение 14 дней, адриамицин 30 мг/м² внутривенно в 1-й и 8-й дни, кселода 1000 мг/м² 2 раза в день, peros, в течение 14 дней; проведение курсов через 21 день), 15 пациенток не получали неоадъювантную терапию. Операция выполнялась в объеме радикальной мастэктомии или радикальной резекции молочной железы.

С помощью меченных различными флюорохромами моноклональных антител к EpCam, CD45, CD44, CD24 и Ncadherin методом многоцветной проточной цитометрии на аппарате BD FACSCanto II (США) и программного обеспечения BD FACSDiva в крови больных измеряли уровень различных популяций циркулирующих опухолевых клеток (ЦОК) до начала лечения (до биопсии). На основе определения мембранной экспрессии EpCam, CD44, CD24, CD45 и Ncadherin определяли 6 популяций ЦОК:ЦОК-1 - клетки без признаков стволовости и ЕМТ (EpCam+CD45-CD44-CD24-NCadherin-); ЦОК-2 - клетки без признаков стволовости, с признаками ЕМТ (EpCam+CD45-CD44-CD24-Ncadherin+); ЦОК-3 - стволовые опухолевые клетки без признаков ЕМТ (EpCam+CD45-CD44+CD24-Ncadherin-); ЦОК-4 - стволовые опухолевые клетки с признаками ЕМТ (EpCam+CD45-CD44+CD24-Ncadherin+); ЦОК-5 - стволовые опухолевые клетки с потерей мембранной экспрессии EpCam без ЕМТ (EpCam-CD45-CD44+CD24-Ncadherin-); ЦОК-6 - стволовые опухолевые клетки с потерей мембранной экспрессии EpCam с признаками ЕМТ (EpCam-CD45-CD44+CD24-Ncadherin+).

Уровень разных популяций циркулирующих опухолевых клеток в крови выражали в количестве клеток/мкл.

Статистическая обработка результатов выполнялась с помощью пакета программ «Statistica 8.0 for Windows» и «IBM SPSS Statistics 22». Обсуждаются результаты с достоверностью различий при р<0,05, и с тенденцией при р<0,1.

Для предсказания риска развития гематогенных метастазов использовался метод логистической регрессии и ROC анализ. Была определена формула:

Y=-107,3-7,09*Х1+68,63*Х2+71,04*Х3+5,74*Х4

Y - значение уравнения регрессии; (-107,3) - значение коэффициента регрессии свободного члена;

X1 - наличие порогового уровня ЦОК с признаком стволовости и ЕМТ до биопсии (Х1=1, если уровень клеток с фенотипом EpCam+CD45-CD44+CD24-Ncadherin+ ≥0,63 клеток/мкл; Х1=0, если уровень клеток с фенотипом EpCam+CD45-CD44+CD24-Ncadherin+ <0,63 клеток/мкл; (-7,09) - значение коэффициента регрессии этого признака;

Х2 - наличие порогового уровня EpCam - отрицательных стволовых ЦОК с признаками ЕМТ до биопсии (Х2=1, если уровень клеток с фенотипом EpCam-CD45-CD44+CD24-Ncadherin+ ≥0,26 клеток/мкл; Х2=0, если уровень клеток с фенотипом EpCam-CD45-CD44+CD24-Ncadherin+ <0,26 клеток/мкл); (68,63) - значение коэффициента регрессии этого признака;

Х3 - наличие порогового уровня ЦОК без признаков стволовости в состоянии ЕМТ до биопсии (Х3=1, если количество клеток с фенотипом EpCam+CD45-CD44-CD24-Ncadherin+ ≥0,17 клеток/мкл; Х3=0, если количество клеток с фенотипом EpCam+CD45-CD44-CD24-Ncadherin+ <0,17 клеток/мкл; (71,04) - значение коэффициента регрессии этого признака);

Х4 - размер первичной опухоли (1 - до 2 см; 2 - 2-5 см; 3 - более 5 см), (5,74) - значение коэффициента регрессии этого признака.

Значение вероятности развития гематогенных метастазов определяется по формуле: Р=e^Y/(1+e^Y), где Р (значение вероятности развития признака), Y - значение уравнения регрессии; е - математическая константа, равная 2,72. При вероятности Р≥50% определяется высокий риск развития гематогенных метастазов, при вероятности Р<50% - низкий риск развития гематогенных метастазов.

При сравнении уровней различных популяций циркулирующих опухолевых клеток в крови до начала лечения было выявлено, что у пациенток, у которых наблюдались ранние гематогенные метастазы (в первые 3 года от постановки диагноза) уровень циркулирующих опухолевых клеток с признаком ЕМТ и стволовых ЦОК с различным проявление ЕМТ был значимо выше, по сравнению с группой пациенток, у которых не были выявлены гематогенные метастазыв первые 3 года от постановки диагноза инвазивной карциномы молочной железы (Табл. 1).

Изолированно, вне прогностической модели, связи гематогенного метастазирования с размером опухоли обнаружено не было (Табл. 2).

ROC-анализ полученных результатов выявил, что ЦОК с признаком ЕМТ и стволовые ЦОК с разной степенью проявления ЕМТ являются хорошими предикторами для предсказания развития гематогенных метастазов инвазивной карциномы молочной железы (Фиг. 1-5). Значение уровня ЦОК с признаком стволовости и ЕМТ (EpCam+CD45-CD44+CD24-Ncadherin+) в точке cut-off составило 0,63 клеток/мкл (100% - чувствительность, 87,5% - специфичность), площадь под ROC-кривой (AUC) составила 0,896, что говорит об очень хорошем качестве данного предиктора.

Значение уровня ЦОК без признаков стволовости, но в состоянии ЕМТ (EpCam+CD45-CD44-CD24-N-cadherin+) в точке cut-off составило 0,17 клеток/мкл (100% - чувствительность, 68,7% - специфичность). Значение уровня стволовых ЦОК с потерей мембранной экспрессии EpCam и с признаком ЕМТ (EpCam-CD45-CD44+CD24-N-cadherin+) в точке cut-off составило 0,26 клеток/мкл (100% - чувствительность, 87,5% - специфичность). Площадь под ROC-кривой данного признака имеет высокое значение (AUC=0,913; р=0,006) (фиг. 5).

При построении ROC-кривой прогностической модели, значение AUC составило 1,000 (р=0,007), что говорит об отличном качестве полученной модели.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет с большей точностью и информативностью прогнозировать риск развития гематогенного метастазирования при инвазивной карциноме неспецифического типа молочных желез, что является крайне необходимым для определения тактики ведения и создания персонализированного подхода при лечении таких пациенток. Получены достоверные числовые показатели, характеризующие степень риска возникновения гематогенной диссеминации у конкретной больной, отражающие прогноз течения онкологического заболевания.

Источники информации, принятые во внимание при составлении описания:

1. Аблицова Н.В., Ермаков А.В., Рассказова Е.А. и др. Билатеральный синхронный рак молочной железы // Онкология. - 2014. - №1. - С. 14-18.

2. Завьялова, М.В. Зависимость лимфогенного метастазирования от морфологического строения первичного опухолевого узла при уницентическом инфильтрирующем протоковом раке молочной железы у больных с разным состоянием менструальной функции / М.В. Завьялова, В.М. Перельмутер, Е.М. Слонимская, С.В. Вторушин / Сибирский онкологический журнал. - 2008. - №3 (27). - С. 5-9.

3. Page, D.L. Prognosis and breast cancer. Recognition of lethal and favourable prognostic types / D.L. Page // The American journal of surgical pathology. - 1991. - Vol. 15. - P. 334-346.

4 Demicheli R., Fornili M., Ambrogi F., et. al. Recurrence dynamics for non-small-cell lung cancer: effect of surgery on the development of metastases // Ann. Oncol. - 2010. Vol. 21. - P. 116-119.

5. G., FelipE. Non-small-cell lung cancer: ESMO Clinical Recommendations for diagnosis, treatment and follow-up // Ann. Oncol. - 2009. Vol. 20. - P. 68-70. https://findpatent.ru/patent/248/2489718.html© FindPatent.ru - патентный поиск, 2012-2017

6. Занкин В.В., Лазаревский М.М., Кометова В.В. Клинико-морфологические факторы прогноза (на примере рака молочной железы) // Тезисы научно-практической конференции «Модниковские чтения». Ульяновский государственный университет. 2009. Режим доступ: http://ulniti.ru/lib/tezis/9

7. Mascarel, I. D2-40 in breast cancer: should we detect more vascular emboli? / I. Mascarel, G. MacGrogan, M. Debled, G. Sierankowskil, V. Brouste, L. Mauriac // Modern Pathology. - 2009. - №22. - P. 216-222.

8. Weigelt B. Breast cancer molecular profiling with single sample predictors: a retrospective analysis / B. Weigelt, A. Mackay, R. Natrajan, D.S.P. Tan, M. Dowsett, A. Ashworth, J.S. Reis-Fillo // The Lancet Oncology. - 2010. - Vol. 11. - N4. - P. 339-349.

9. Телегина H.C. Связь гематогенной диссеминации с лимфогенным метастазированием при различных молекулярно-генетических вариантах рака молочной железы / Н.С. Телегина, О.Д. Братина, К.Ю. Христенко, М.В. Завьялова, С.В. Вторушин, В.М. Перельмутер, Е.М. Слонимская, Е.В. Денисов, Н.В. Чердынцева // Бюллетень сибирской медицины. - 2013. - №6. - С. 62-69.

10. Гидранович А.В. Прогнозирование исхода рака молочной железы на основании биохимических показателей сыворотки крови / А.В. Гидранович // Новости хирургии. - 2012. - Том 20. - №4. - С. 64-69.

11. Способ прогнозирования гематогенного метастазирования при двусторонней метахромной инвазивной карциноме неспецифического типа молочной железы / Завьялова М.В., Фесик Е.А., Крахмаль Н.В., Вторушин С.В., Слонимская Е.М., Христенко К.Ю., Телегина Н.С. // Патент РФ на изобретение №0002580639 от 07.06.2017.

12. Способ прогнозирования гематогенного метастазирования при трипл негативной инвазивной карциноме неспецифического типа молочной железы / Завьялова М.В., Слонимская Е.М., Перельмутер В.М., Вторушин С.В., Телегина Н.С., Братина О.Д., Крахмаль Н.В. // Патент РФ на изобретение №2558863 от 28.11.2016.

13. Кайгородова Е.В. Циркулирующие опухолевые клетки: клиническое значение при раке молочной железы (обзор литературы). Вестник РАМН. 2017; 72 (6): 450-457. doi: 10.15690/vramn833)

14. Kaigorodova, E.V.; Tarabanovskaya, N.A.; Staheeva, M.N.; Savelieva, О.E.; Tashireva, L.A.; Denisov, E.V.; Perelmuter V.M. Effect of minor and major surgical injury on the level of different populations of circulating tumor cells in the blood of breast cancer patients. Neoplasma. 2017; 64(3): 437-443. doi: 10.4149/neo_2017_315.

15. Lv, Q.B.; Fu, X.; Jin, H.M.; Xu, H.C.; Huang, Z.Y.; Xu, H.Z.; Chi, Y.L.; Wu, A.M. The relationship between weight change and risk of hip fracture: meta-analysis of prospective studies. Sci Rep. 2015 Nov 2; 5:16030. doi: 10.1038/srep 16030.

Приложение

Таблица 1 Уровень различных популяций ЦОК до биопсии в зависимости от появления гематогенных метастазов (Me (Q1-Q3)), клеток/мкл

Таблица 2 Частота гематогенного метастазирования при инвазивной карциноме неспецифического типа в зависимости от размера опухоли Фиг. 1 ROC-кривая для уровня циркулирующих опухолевых клеток без признаков стволовости и ЕМТ (EpCam+CD45-CD44-CD24-N-cadherin-) в крови до биопсии в качестве предиктора развития гематогенных метастазов (AUC=0,635; р=0,304)

Фиг. 2 ROC-кривая для уровня циркулирующих опухолевых клеток с признаком ЕМТ без признаков стволовости (EpCam+CD45-CD44-CD24-Ncadherin+) в крови до биопсии в качестве предиктора развития гематогенных метастазов (AUC=0,844; р=0,038)

Фиг. 3 ROC-кривая для уровня стволовых циркулирующих опухолевых клеток с признаком ЕМТ (EpCam+CD45-CD44+CD24-N-cadherin+) в крови до биопсии в качестве предиктора развития гематогенных метастазов (AUC=0,896; р=0,034)

Фиг. 4 ROC-кривая для уровня стволовых циркулирующих опухолевых клеток с потерей мембранной экспрессии EpCam без признаков ЕМТ (EpCam-CD45-CD44+CD24-N-cadherin-) в крови до биопсии в качестве предиктора развития гематогенных метастазов (AUC=0,659; р=0,226)

Фиг. 5 ROC-кривая для уровня стволовых циркулирующих опухолевых клеток с потерей мембранной экспрессии EpCam с признаком ЕМТ (EpCam-CD45- CD44+CD24-N-cadherin+) в крови до биопсии в качестве предиктора развития гематогенных метастазов (AUC=0,913; p=0,006)

Способ прогнозирования гематогенного метастазирования при инвазивной карциноме неспецифического типа молочной железы на основе определения различных популяций циркулирующих опухолевых клеток в крови до лечения, включающий исследование пациента и последующий расчет диагностического показателя, отличающийся тем, что до лечения методом многоцветной проточной цитометрии определяют уровень различных популяций циркулирующих опухолевых клеток (ЦОК) с помощью молекулярной панели маркеров, включающей EpCam, CD45, CD44, CD24 и N-Cadherin, и меченных разными флюорохромами моноклональных антител против данных маркеров и оценивают в баллах: наличие порогового уровня ЦОК с признаком стволовости и ЕМТ до биопсии, при этом, если уровень клеток с фенотипом EpCam+CD45-CD44+ CD24-Ncadherin+ ≥0,63 клеток/мкл, оценивают в 1 балл, если уровень клеток с фенотипом EpCam+CD45-CD44+CD24-Ncadherin+ < 0,63 клеток/мкл, оценивают в 0 баллов, также определяют наличие порогового уровня EpCam-отрицательных ЦОК с признаками стволовости в состоянии ЕМТ до биопсии, если уровень клеток с фенотипом EpCam-CD45-CD44+CD24-Ncadherin+ ≥ 0,26 клеток/мкл, оценивают в 1 балл, если уровень клеток с фенотипом EpCam-CD45-CD44+CD24-Ncadherin+ <0,26 клеток/мкл, оценивают в 0 баллов, определяют наличие порогового уровня ЦОК без признаков стволовости в состоянии ЕМТ до биопсии, при этом, если количество клеток с фенотипом EpCam+CD45-CD44-CD24-Ncadherin+≥ 0,17 клеток/мкл, оценивают в 1 балл, если количестве клеток с фенотипом EpCam+CD45-CD44-CD24-Ncadherin+ < 0,17 клеток/мкл, оценивают в 0 баллов, также определяют размер первичной опухоли: до 2 см оценивают в 1 балл, при 2-5 см оценивают в 2 балла, более 5 см оценивают в 3 балла, далее рассчитывают признак Y в уравнении регрессии по формуле

Y=-107,3-7,09*Х1+68,63*Х2+71,04*Х3+5,74*Х4,

-107,3 - значение коэффициента регрессии свободного члена;

X1- наличие порогового уровня ЦОК с признаком стволовости и ЕМТ до биопсии, Х1=1, если уровень клеток с фенотипом EpCam+CD45-CD44+CD24-Ncadherin+ ≥0,63 клеток/мкл; Х1=0, если уровень клеток с фенотипом EpCam+CD45-CD44+CD24-Ncadherin+ < 0,63 клеток/мкл;

-7,09 - значение коэффициента регрессии этого признака;

Х2 - наличие порогового уровня EpCam-отрицательных ЦОК с признаками стволовости в состоянии ЕМТ до биопсии Х2=1, если уровень клеток с фенотипом EpCam-CD45-CD44+CD24-Ncadherin+ ≥ 0,26 клеток/мкл; X2=0, если уровень клеток с фенотипом EpCam-CD45-CD44+CD24-Ncadherin+ <0,26 клеток/мкл);

68,63 - значение коэффициента регрессии этого признака;

Х3 - наличие порогового уровня ЦОК без признаков стволовости в состоянии ЕМТ до биопсии, Х3=1, если количество клеток с фенотипом EpCam+CD45-CD44-CD24-Ncadherin+ ≥ 0,17 клеток/мкл; Х3=0, если количество клеток с фенотипом EpCam+CD45-CD44-CD24-Ncadherin+ < 0,17 клеток/мкл;

71,04 - значение коэффициента регрессии этого признака;

Х4 - размер первичной опухоли, Х4=1 при размере опухоли до 2 см; Х4=2 при размере опухоли от 2 до 5 см; Х4=3 при размере опухоли более 5 см,

5,74 - значение коэффициента регрессии этого признака,

далее определяют значение вероятности развития гематогенных метастазов Р по формуле Р=e^Y/(1+e^Y), где е - математическая константа, равная 2,72,

и при Р ≥ 50% определяют высокий, а при Р < 50% - низкий риск развития гематогенных метастазов.